JP2006516743A - Ｈｉｖ診断関連用途のためのマイクロチップをベースとしたシステム - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＨＩＶウイルスに感染した被験者から採取したサンプルにおけるＨＩＶ関連の対象検体（例えば、ＣＤ４リンパ球、ＨＩＶ−ＲＮＡ、及び肝酵素）を測定するためのマイクロチップをベースとするアッセイに関する。本発明の方法は資源の乏しい環境でのＨＩＶ疾患モニタリング時における使用に最適である。
Description
本出願では、２００３年２月５日に出願された米国特許出願番号６０／４４５，１４３、２００３年２月１３日に出願された米国特許出願番号６０／４４７，０７０、及び２００３年７月２４日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／２３１３１に対する優先権の利益を主張するものである。
上記各出願において引用或いは参照した各文献、及び上記各出願及び全引用文献において引用或いは言及された如何なる製品に関する如何なる製造業者の説明書又はカタログも、参照することによりここに含まれているものとする。さらに、本文において引用した全ての文献、本文において引用した文献において引用又は参照した全ての文献、及び本文又は本文に組み込まれた如何なる文献において引用或いは言及された如何なる製品に関する製造業者の説明書又はカタログは、参照することによりここに組み込まれる。参照されることにより組み込まれた文献又はそこでの教示を、本発明の実施に際して使用することができる。参照により本文に組み込まれた文献を先行技術であると認めるものではない。
上記各出願において引用或いは参照した各文献、及び上記各出願及び全引用文献において引用或いは言及された如何なる製品に関する如何なる製造業者の説明書又はカタログも、参照することによりここに含まれているものとする。さらに、本文において引用した全ての文献、本文において引用した文献において引用又は参照した全ての文献、及び本文又は本文に組み込まれた如何なる文献において引用或いは言及された如何なる製品に関する製造業者の説明書又はカタログは、参照することによりここに組み込まれる。参照されることにより組み込まれた文献又はそこでの教示を、本発明の実施に際して使用することができる。参照により本文に組み込まれた文献を先行技術であると認めるものではない。
本発明は、ＨＩＶウイルスに感染した被験者におけるＨＩＶ関連の対象検体（例えば、ＣＤ４リンパ球、ＨＩＶ-ＲＮＡ及び肝酵素）を測定するためのマイクロチップをベースとするアッセイに関する。本発明の方法は、資源の乏しい環境でＨＩＶ疾患モニタリング時に使用するのに最適である。
米国政府は、国立衛生研究所からの認可番号Ｒ２１ ＡＩ０５３９１１‐０１及びＲ３７ ＡＩ２８５６８‐１３に基づいて、本発明において一定の権利を有するかも知れない。
ヒト免疫不全ウイルス、即ちＨＩＶは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因であり、極めて深刻な世界的な健康問題である。ＡＩＤＳは１９８０年代初めに初めて報告され、日和見感染症、腫瘍、中枢神経変性などの様々な臨床的特徴を伴う、重度の免疫機能障害を特徴とする。ウイルスの分子的特徴やＡＩＤＳ関連の症状に対する治療法については目覚しい進歩が見られるが、ＨＩＶ感染者の根絶に向けてなすべきことは多い。今のところ有効なワクチンは製造されておらず、現在市販されている薬剤では、ＨＩＶの頻繁で急速な突然変異率に関する問題を解決できてはいない。
ＨＩＶはレンチウイルス科に属するレトロウイルスである。ＨＩＶには少なくとも２つのサブタイプ（ＨＩＶ‐１及びＨＩＶ‐２）がある。ＨＩＶ‐１は米国内で圧倒的に多いサブタイプであり、一方ＨＩＶ‐２は西アフリカで蔓延している。感染性ＨＩＶ粒子は２つのプラス鎖ＲＮＡ分子で構成され、それぞれ９．３キロベースのゲノムから成る。ＨＩＶゲノムはウイルス蛋白のコアに内包され、宿主細胞から生成されたリン脂質二重層膜によって囲まれている。このリン脂質二重層膜には、ウイルスによりコード化された細胞膜のタンパク質の他、宿主細胞から発生するタンパク質を含む。ＨＩＶゲノムの構造はｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖと呼ばれるヌクレオチド配列に基づいている。ｇａｇは、タンパク質を分解してＨＩＶウイルス粒子のコア構造タンパク質を産生するポリタンパク質を、コード化する。ｇａｇはウイルス粒子中に最も多量に含まれているタンパク質であり、ウイルス粒子の構造タンパク質の９０パーセント近くを占めている。ｇａｇはまた感染粒子の形成に必要とされる唯一のタンパク質であり、そのため、宿主細胞の原形質膜でのｇａｇの会合がウイルス粒子形成の推進力となる。ｇａｇがコード化するのは成熟タンパク質基質（”ＭＡ”）、カプシド（”ＣＡ”）、スペーサーペプチド１（”ＳＰ1”）、ヌクレオカプシド（”ＮＣ”）、ＳＰＩ、ｐ６ｇａｇである。ポリタンパク質はｐｏｌによりコード化されるプロテアーゼにより切断される。ｐｏｌ配列は、ウイルスゲノムの複製に必要な逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、ウイルスのプロテアーゼ酵素をコード化する。ｐｏｌは、ｇａｇ翻訳の間に−１フレームシフトにより発現し、ｇａｇ-ｐｏｌポリタンパク質を合成し、該ポリタンパク質が処理されると、出芽後ウイルス粒子の構造を再編する。ｅｎｖ配列は、ウイルス粒子のエンベロープに存在する糖タンパク質ｇｐ1２０及びｇｐ４１をコード化する。
さらに、ウイルス粒子形成に関与する別の遺伝子として、ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｕがＨＩＶゲノムに含まれる。ｔａｔはＨＩＶ全遺伝子の発現を促す転写、転写後、翻訳活性を有する１４ｋＤのタンパク質である。ｒｅｖはｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子をコード化すると同時にｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ自体の発現を抑制するウイルスメッセンジャーＲＮＡ分子を安定、処理、移送する２０ｋＤのタンパク質である。ｎｅｆはその作用のメカニズムが不明であるプレニル化タンパク質をコード化する。同様に、ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕによってコード化されるタンパク質の性質は知られていないが、ウイルス粒子の感染力において一定の役割を果たす可能性がある。
ＨＩＶ-１とＨＩＶ-２はいくつかの点で異なる。例えば、ＨＩＶ-２サブタイプでは追加遺伝子であるｖｐＸが発現し、ｖｐｕ遺伝子が欠如している。ｖｐｕと同様に、ｖｐＸも十分に特徴づけされていない。さらにＨＩＶ‐２のｒｅｖ遺伝子はＨＩＶ-１と比べ大きな挿入部を含む。最後に、ＨＩＶ-１とＨＩＶ-２でｅｎｖ遺伝子が相異するため、抗体の識別法も異なってくる。従って、ＨＩＶに関する診断テストがこれら２ウイルス型間で異なる必要がある。さらに、ＨＩＶ-１、ＨＩＶ-２共、免疫システム又は抗レトロウイルス薬の作用に対してかなりの突然変異を起こす。診断テストでも、そうした突然変異による無限にあるウイルスのサブタイプの種類を識別可能にする必要がある。
ＨＩＶは、最初に細胞表面抗原ＣＤ４を発現するＴリンパ球に感染するだけでなく、抗原提示細胞として機能するリンパ節のマクロファージ及び濾胞樹状細胞にも感染する。ＣＤ４タンパク質はＨＩＶのｇｐ１２０糖タンパク質に高親和性で結合するが、これにより膜融合イベントが促進され、ＨＩＶゲノムが細胞から細胞へと感染するようになる。膜融合やウイルス粒子の細胞への内在化はｇｐ４１タンパク質を介して促される。複数の宿主細胞因子によってもウイルス粒子の細胞への侵入は左右される。侵入すると、核タンパク複合体内の酵素が活性化され、ＨＩＶのＲＮＡゲノムが逆転写されてそれに対応するＤＮＡ分子が産生され、ウイルスによってコード化されたインテグラーゼによって宿主細胞ゲノムに組み込まれる。組み込みはウイルス侵入に対するＴ細胞の同時活性化によっても促進されるが、プロウイルスは数ヶ月或いは数年もの間転写的に不活性なままであることもある。
２つの長い末端反復配列（ＬＴＲ）が構造遺伝子を挟んで両端に存在することで、組み込まれたＤＮＡプロウイルスの転写がアップレギュレーションされる。核因子κＢ（ＮＦ-κＢ）及び転写因子ＳＰ１などの宿主タンパク質によってこれらのシス作用配列は識別される。ウイルスのインターナリゼーションにおける他の重要な過程と同様に、ウイルスタンパク質の転写は宿主タンパク質及び宿主シグナル変換メカニズムにより促進される。例えば、サイトカインとして知られる小細胞因子をアップレギュレーションすることにより、転写が増強される。こうしたシグナル伝達分子は、血液細胞分化、細胞表面抗原の発現、アポトーシス、抗体抗原の認識など、しかしこれらに限定されないが、様々な細胞的事象に関与することにより、免疫システム機能を調節する。サイトカインには腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ウイルス抑制因子（ＩＦＮ α、β、及びγ）、インターロイキンを含む。別の観点からは、ＣＤ４-発現細胞の増殖及び維持を導くのと同じメカニズムがＨＩＶ複製も導くと言えるだろう。
抗レトロウイルス療法は否定できない事実、すなわちＨＩＶが引き起こすＨＩＶゲノムの急速で頻繁な突然変異に悩まされてきた。多くの治療は１つの特定のウイルスタンパク質に対して行なわれるが、ウイルス複製及びプロセッシングを併用療法によって強力に抑制している間、ＨＩＶは数箇所の異なる身体区画において徐々に複製する力を蓄えている。このように、ＨＩＶゲノムは突然変異を起こし、最後には薬剤を回避することができてしまう。現在の薬剤や治療計画による防御では、ウイルス複製を長期的に制御するには究極的には不十分である。しかし、まだ探求されていないウイルスのライフサイクルという別の研究対象が存在する。主に２種類の薬剤が現在使用可能である：逆転写酵素を標的とするヌクレオチド阻害物質、及びウイルスゲノムによりコード化されるポリタンパク質のタンパク質分解プロセッシングを阻害するプロテアーゼ阻害物質。(メネンデス-アリアス・エル．２００２年「トレンド・イン・ファーマコロジィ・サイエンス」第２３号（８）：ｐ．３８１-３８８(Menendez-Arias, L. 2002. Trends Pharm. Sci. 23 (8): 381-388））。３種類目の薬剤として、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）で承認された薬剤の処方集に、ＨＩＶウイルス粒子がＣＤ４-発現細胞の膜と融合するのを阻害する侵入阻害剤が最近加えられた。
ＨＩＶ逆転写酵素（”ＲＴ”）の阻害剤には、ヌクレオシド類似体阻害剤（”ＮＲＴＩ”すなわちジドブジン一リン酸）、非環式ヌクレオシドホスホン酸（すなわちテノホビル）、非ヌクレオシド系ＲＴ阻害剤（”ＮＮＲＴＩ”、すなわちネビラピン）、及びピロリン酸類似体を含む。ヌクレオシド阻害剤はＨＩＶ-ＲＴ基質の競合阻害剤として働き、リン酸化反応時には、これらの薬剤は連鎖停止剤として働き、成長するＤＮＡ鎖の伸長を防ぐ。この種類の阻害剤に対する抵抗は、ＨＩＶ-ＲＴのヌクレオチド結合部位に近い残基の突然変異によってもたらされるが、ジドブジン一リン酸（”ＡＺＴ”）などの鎖伸長を停止させる薬剤を、ＡＴＰ又はピロリン酸を介した加リン酸分解を通して阻害されたＤＮＡプライマーから、排除しようとする突然変異からも発生する。突然変異とアミノ酸は、様々なＨＩＶ-ＲＴ阻害剤間で異なるものの、これら全てのタイプのＲＴ阻害剤の作用メカニズムを避けられることは明らかである。
別の薬剤作用の標的として、ＨＩＶプロテアーゼ（”ＰＲ”）がある。上記で説明したように、プロテアーゼは、ＨＩＶゲノムによりコード化されるタンパク質のタンパク質分解プロセッシングに関与している。ＨＩＶ-ＰＲ阻害剤はタンパク質分解反応の競合阻害剤として作用する。例としてインディナビル及びサクイナビルが挙げられる。主な耐性突然変異は一般的に基質結合ポケットに含まれる残基において認められる。こうした突然変異によってプロテアーゼの触媒作用が減少し、最終的にはウイルスの複製が減少する。しかしながら、追加の突然変異によりこの酵素のタンパク質分解機能が補われてしまう。ＰＲ及びＲＴ両阻害剤を組み合わせた治療はウイルスの複製抑制に関して限定的な成功に留まっているが、複数の薬剤との併用療法は、ただ1つの薬剤又は1種類の薬剤での治療と比べると、異なる範囲の突然変異に有効である。ウイルスのライフサイクルに関する別の標的として、ｇｐ４１タンパク質及びインテグラーゼなどが、重要な研究テーマとしてが挙げられる。ｇｐ４１／ｇｐ１２０分子を標的とし、融合を防ぐ１つの薬剤として現在使用できるのが、侵入阻害剤である（エンフュービルタイド：ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）である。
世界の最貧国への効果的な抗レトロウイルス治療の導入に関して近年進展が見られるものの、そうした国々の殆どはＨＩＶの蔓延によって大きな被害を受けている。２００２年５月世界ＡＩＤＳ・結核・マラリア対策基金として６億１，６００万ドルが提供され３７カ国で５８のプロジェクトが支援されたが、其の内７０％がＨＩＶ／ＡＩＤＳを対象とするものであった（世界ＡＩＤＳ・結核・マラリア対策基金「グローバル・ファンド・アップデート」２００２年６月(Global Fund to Fight AIDS, Tuberculosis, and Malaria, Global Fund Update, June 2002)）。その他、現地主導の取り組みとして、中央ハイチでのＣｌｉｎｉｑｕｅ Ｂｏｎ Ｓａｖｅｕｒなどがあり、最遠隔地域においてでさえもＨＩＶ感染者に対する標準的な医療としてＨＩＶ治療を施すことが可能であり、施すべきであることを証明している（ファーマー・ピー．イー．２００２年、第１４回国際エイズ会議（Farmer, P. E. 2002.１４th International AIDS Conference））。にもかかわらず、抗レトロウイルス治療を必要とする発展途上国のおよそ２５００万人の内僅か５万人が現在治療を受けており、あと４万人だけが２００３年度の世界基金プロジェクトにより対象となると予測される（世界ＡＩＤＳ・結核・マラリア対策基金「グローバル・ファンド・アップデート」２００２年６月（Global Fund to Fight AIDS, Tuberculosis, and Malaria, Global Fund Update, June 2002））。
世界基金や殆どの発展途上国におけるＨＩＶ治療プログラム支持者が解決していない重要な問題は、治療経過をモニタリングするのに必要な安価なＨＩＶ臨床検査が不足していることである。ＨＩＶ臨床検査を資源の乏しい環境で実施するには財政・構造的障害がまずあるために、薬剤調達プログラムの直面する障害が時として些細なもの見えてしまう。治療プログラムでは一人当たりの年間総医療費の平均額が４５ドルの環境（ムスグローブ・ピー．他、２００２年「ブリティン・オブ・ワールド・ヘルス・オーガニゼーション」第８０号；ｐ．１３４‐１４６（Musgrove, P. et al, 2002. Bull. World Health Organ. 80: 134-146））において高額な薬剤の入手に骨を折る中、ＨＩＶ臨床検査に掛ける費用は、発展途上国で患者１人当たり年間およそ１４０ドルから１，５００ドルの範囲と見られている（フロイド・ケー．及びシー．ギルクス、１９９７年、世界保健機構；スチワートランダー・ビー．他、２００１年「サイエンス」第２９２号：ｐ．２４３４‐６（Floyd, K. and C. Gilks, 1997. World Health Organization; Schwartlander, B. et al, 2001.Science 292: 2434-6））。その上、現行のＨＩＶ臨床検査には高度な研究用機器、訓練を受けた技術スタッフ、及び安定した電力や冷蔵が必要で、それら全てはＨＩＶ感染が深刻な国々の大半では希少な資源である。資源の乏しい環境で治療プログラムを効果的に実施するなら、如何にして世界中のＨＩＶ感染患者をモニタリングするかという問いにも等しく注意を払うことが重要である。
ＨＩＶ抗体を検出する血清学的分析が、ＨＩＶ感染を診断する手段として、依然として唯一広く普及しているＨＩＶ検査となっている。年間２，４００万を超えるＨＩＶ血清検査が米国では行なわれており（疾病管理予防センター、「１９９７‐１９９８年報」２００１年６月（Centers for Disease Control and Prevention, Annual Report 1997-1998. June 2001））、そして莫大な数の検査が世界中で実施されている。米国や発展途上国では、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるスクリーニングを実施後、ＥＬＩＳＡで陽性の場合にはウエスタンブロット法による確認が行なわれている。資源の乏しい環境ではより安価で迅速な血清検査が必要とされることから、迅速ＥＬＩＳＡが開発された。ＥＬＩＳＡは患者１人当たりの総費用が３ドル〜５ドルで実施できる。
ＨＩＶを診断する血清検査は１９８０年代中頃に標準化されてきたが、ＨＩＶ感染進行の臨床検査でのモニタリングはより困難であることが判明している。当初、体重の減少や日和見感染症の進行などの臨床的指標がＨＩＶ疾患の段階付けに使用されたが、無症候のままで症状の進行したＡＩＤＳ患者の多くを識別できなかった（ムライ・エイチ．ダブリュー．他、１９８９年 「アメリカン・ジャーナル・オブ・メディスン」第８６号：ｐ．５３３‐８；カプラン・ジェー．イー．他、１９９２年「ジャーナル・オブ・アクワイアード・イミューン・デフィシエンシー・シンドローム」第５号：ｐ．５６５-７０ （Murray, H. W. et al, 1989. Am. J. Med. 86: 533-8; Kaplan, J. E. et al, 1992. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 5: 565-70））。予防的抗生剤や抗レトロウイルス療法を使った効果的な診断が利用可能になると、有用なＨＩＶ疾患状態の臨床マーカーが必要になった。
血清マーカーのいくつかの候補が１９８０年代後半及び１９９０年代初頭に研究されたが、その中に含まれたのはＨＩＶｐ２４抗原（ランジ・ジェー．エム．他、１９８７年「エイズ」第１号：ｐ．１５５‐９（Lange, J. M. et al, 1987. AIDS 1: 155-9））、抗ＨＩＶ抗体、血清ＩｇＡ（免疫グロブリンＡ；スチワートランダー・ビー．他、１９９３年「エイズ」第７号：ｐ．８１３-２２（immunoglobulin A; Schwartlander, B. et al, 1993. AIDS 7: 813-22））、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Β−２ミクログロブリン（アンダーソン・アール．イー．他、１９９０年「アーカイブス・オブ・インターナル・メディスン」第１５０号：ｐ．７３-７（Anderson, R. E. et al, 1990. Arch. Intern.Med. 150: 73-7））、ネオプトリン（ボグナー・ジェー．アール．他、１９９８年「クリニシェ．ヴォヘンシュリフト（Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ）」第６６号：ｐ．１０１５‐８（Bogner, J. R. et al, 1988. Klin. Wochenschr. 66: 1015-8））、アデノシン・デアミナーゼ及び可溶性インターロイキン２受容体（ＩＬ-２Ｒ）レベル（ランジ・ジェー．エム．他、１９８８年、「アナル・メディスン・インターン（パリ）」第１３９号：ｐ．８０-３」；ファフェイ・ジェー．エル．他、１９９０年「ザ・ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン」第３２２号：ｐ．１６６-７２；サビン・シー．エー．他、１９９４年「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヒマトロジー」第８６（２）号：ｐ．３６６-７１；ザベイ・ジェー．エム．他、１９９５年、「ジャーナル・オブ・アクワイアード・イミューン・デフィシエンシー・シンドローム・アンド・ヒューマン・レトロバイロロジー」第８号：ｐ．２６６−７２；プラネラ・ティー．他、１９９８年「クリニカル・ケミストリ・アンド・ラボラトリ・メディスン」第３６号：ｐ．１６９−７３（Lange, J. M. et al, 1988. Ann. Med. Interne (Paris) 139: 80-3; Fahey, J. L. et al, 1990. N. Engl. J. Med. 322: 166-72; Sabin, C. A. et al, 1994. Br. J. Haematol. 86 (2): 366-71; Zabay, J. M. et al, 1995. Acquir. Immun. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 8: 266-72; Planella, T. et al, 1998. Clin. Chem. Lab. Med. 36: 169-73））であった。これら全てのマーカーは特定の環境で有用であることが認められたが、進行する疾患との直接的な定量化可能な相関関係を示せなかった。こうしたマーカーを使用した定期的測定の臨床的有用性はまだ証明されておらず、技術的に限界がありいくつかのアッセイが困難であった。ｐ２４検査を除いて、実際の臨床ではこれらのマーカーを広く採用していなかった。
臨床的にＡＩＤＳと決定される基準を満たした殆どの患者でｐ２４の血清濃度が無症状の患者よりかなり高かったため、ｐ２４抗原検査を一時的に導入した研究室もあった。しかしながら、抗ｐ２４抗体反応が多くの患者で生じ、その後ｐ２４が抗体結合免疫複合体として身体中を循環できるようになる。これらの免疫複合体は検査前に酸又は熱変性されなければ、民間のアッセイではｐ２４のレベルを過小評価してしまうので、ｐ２４の臨床的利用が限定されていた（ナダル・ディー．他、１９９９年「ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジーズ」第１８０号：ｐ．１０８９−９５（Nadal, D. et al, 1999. J. Infect. Dis. 180: 1089-95））。さらに、免疫複合体の解離後でも、理由は不明だが、多くの進行したＡＩＤＳ患者らのｐ２４レベルは極わずかである（エルコリ・エル．他、１９９５．１１：ｐ．１２０３−７（Ercoli, L. , et al 1995.11 : 1203-7））。ｐ２４測定が有するこうした問題のため、そしてアッセイに手間がかかるため、疾患との直接相関関係がある-とりわけ、ＣＤ４数及びＨＩＶ‐ＲＮＡレベル-より信頼性の高い検査が望ましい予後マーカーとされた。
ＨＩＶ‐１感染についての初期の研究で、臨床疾患の最も安定した指標がＣＤ４陽性Ｔ細胞カウントであることが証明された。長期に渡る研究では、１年で最大５０のＣＤ４陽性細胞／μＬの割合でゆっくりだが安定したＣＤ４数の減少とともに、ＣＤ４数２００細胞／μＬ未満と死亡との明確な相関関係についても示された（ファヘイ・ジェー．エル．他、１９９０年、「ザ・ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン」第３２２号：ｐ．１６６−７２（Fahey, J. L. et al, 1990. N. Engl. J. Med. 322: 166-72））。これらの研究成果に基づいて、疾病管理予防センターではＡＩＤＳの定義を分類し直し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数が２００細胞未満に減少した患者をＡＩＤＳに含め（疫病管理予防センター「モービディティ・アンド・モータリティ・ウィークリー・レポート（ＭＭＷＲ）」１９９２年；４１（ＲＲ−１７）号：ｐ．１−１９（Centers for Disease Control MMWR 1992; 41 (RR-17): 1-19））、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数は急速にＨＩＶ臨床検査室でのトーテムになった。付随研究では、ＣＤ４絶対数、ＣＤ４陽性（”ＣＤ４パーセント”）であったリンパ球総数の百分率、及びＣＤ４：ＣＤ８の割合は全て疾病進行に関する有用なマーカー（疫病管理予防センター「モービディティ・アンド・モータリティ・ウィークリー・レポート（ＭＭＷＲ）」１９９７年；４６号：ｐ．１−２９ （Centers for Disease Control and Prevention MMWR 1997; 46: 1-29））、特に幼児及び子供において、であると示唆された。
１９９５年及び１９９６年に、メロールズ氏他による一連の発表により、発展途上国におけるＨＩＶ臨床検査の性質が大幅に変化した（ラブデー・シー．及びエー．ヒル １９９５年「ラセント」第３４５号：ｐ．７９０−１；メロールス・ジェー．ダブリュー．他、１９９５年「アナルズ・オブ・インターナル・メディスン」第１２２号：ｐ．５７３−９；メロールス・ジェー．ダブリュー．他、１９９７年「サイエンス」１９９６．２７２：ｐ．１１６７−７０［エラトゥム・アピアーズ・イン・サイエンス２７５：１４］；メロールス・ジェー．ダブリュー．他、１９９７年「アナルズ・オブ・インターナル・メディスン」第１２６：ｐ．９４６−５４（Loveday, C. and A. Hill. 1995. Lancet 345: 790-1; Mellors, J. W. et al, 1995. Ann. Intern. Med. 122: 573-9; Mellors, J. W. et al, 1997. Science 1996.272: 1167-70 [Erratum appears in Science 275: 14]; Mellors, J. W. et al, 1997. Ann. Intern. Med. 126: 946-54））。 血清中に存在するＨＩＶ‐ＲＮＡの量−”ウイルス量”−が直接に臨床疾患と確実に相関していることが認められた。付随研究により、血清中のＨＩＶ‐ＲＮＡレベルが個々の患者におけるその後のＨＩＶ感染経過に関する唯一の最も重要な指標になることが確認された（クームス・アール．ダブリュー．他 １９９６年「ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジーズ」第１７４号：ｐ．７０４−１２；オブライエン・ダブリュー．エー．他１９９７年「アナルズ・オブ・インターナル・メディスン」第１２６号：ｐ．９３９−４５；オブライエン・ダブリュー．エー．他１９９６年「ザ・ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン」第３３４号：ｐ．４２６−３１；イェーリィ・エス．他１９９８年「アーカイブス・オブ・インターナル・メディスン」第１５８：ｐ．２４７−５２ （Coombs, R. W. et al, 1996. J Infect. Dis. 174: 704-12; O'Brien W. A. et al, 1997. Ann. lntern. Med. 126: 939-45; O'Brien, W. A. et al, 1996. N. Engl. J. Med. 334: 426-31; Yerly, S. et al.1998. Arch. Intern. Med. 158: 247-52））。ウイルス量の測定は瞬く間に治療の標準になり、抗レトロウイルス薬を使用した治療の判断基準になった。１９９６年までには、公式なＨＩＶ治療ガイドラインでＨＩＶ感染患者に３ヵ月毎にＣＤ４数及びＨＩＶ‐ＲＮＡレベルの測定を薦めるようになった（カーペンター・シー．シー．ジェー．他１９９６年「ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソーシエーション」第２７６号：ｐ．１４６−５４；サーグ・エム．エス．他１９９６年「ネイチャー・メディスン」第２号：ｐ．６２５−６２９（Carpenter, C. C. J. , et al. 1996. JAMA 276: 146-54; Saag, M. S. et al. 1996. Nat. Med. 2: 625- 629））。
肝酵素の作用、特にその肝酵素の内アラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは、ＡＩＤＳ患者やＨＩＶ血清反応が陽性の人々では増加し、そうした肝酵素の作用が疾患進行の適切な指標になることも示された（ファン・シー．エム．他１９８８年「クリニカル・ケミストリ」第３４巻（１２）：ｐ．２５７４−６（Huang, C. M. et al, 1988. Clin. Chem. 34 (12): 2574-6））。さらに、ＨＩＶ治療に使用される薬剤の多く、そしてＨＩＶを伴う感染の多くが肝臓障害の原因になっている。アミノトランスファーゼはＬアミノ酸からのαアミノ基除去を引き起こすもので、上記のように、主に肝臓中に存在する。これらのαアミノ基は酸化的分解反応中に除去され、アミノ酸生合成で使用するため再循環される、或いは尿素となって排出される。アミノ基転移により、異なるアミノ酸から全てのアミノ基が収集されてＬグルタミン酸になる。グルタミン酸はアミノ基を生合成経路又は排出経路（すなわち、ヒトの尿素回路）のどちらかに導く。これら２酵素は、ＨＩＶ進行の診断だけでなく、肝臓障害の診断にも重要であり、殆どのＨＩＶ感染患者で定期的にモニタリングされている。
様々なＨＩＶ診断検査の検出感度、特異性及び臨床的有用性に勝るのがその検査コストである。ＨＩＶ抗体、ｐ２４抗原、β‐２ミクログロブリンなどの血清タンパク質に対する免疫測定のための費用は、典型的には１検査当たり３ドル〜１５ドルの範囲であり、より新しい簡易検査は１検査当たり１ドルほどでよい。しかしながら、免疫測定では分光光度計での読み取りが必要で、光度計１台におよそ８，０００ドル掛かり、しかも安定した電力供給が要求される。免疫測定により測定可能な信頼できる予後マーカーが開発されたとしても、資源の乏しい国で使用するにはこうした費用が阻害要因になる。
米国や欧州でＨＩＶ治療のモニタリングに使用している標準治療検査は、上述した検査とは著しく異なっている。ＣＤ４カウントは免疫測定よりかなり高額であり、１検査当たり２０ドル〜１００ドル掛かる。ＣＤカウントには、フローサイトメータと呼ばれる、レーザを搭載した典型的には３万ドル〜１０万ドルし、多量の電力とメンテナンスが要求される機械も必要となる。ウイルス量計測用に３種類のＨＩＶ‐ＲＮＡ検査の使用が現在認められている。全て増幅に基づいて行なうもので（例、ＰＣＲ、ｂＤＮＡ、ＮＡＳＢＡ）、１検査当たり１００ドルを超え、高度な研究環境や高度な技術を要する人材を必要とする。核酸増幅も、サーモサイクラーという８万ドルもし、安定した電力と温度制御が要求される装置を必要とする。
ＨＩＶによって荒廃した資源の乏しい環境では、これらの存在する技術を使ったＣＤ４数やＨＩＶウイルス量の定期的な測定を行なう余裕-財政的、構造的、技術的にも-が全くない。そのため、ＨＩＶに対する投薬が無料になり、病院、診療所、又はコミュニティ・ベースでの治療プログラムが実施されたとしても、どの患者が治療を受けるべきなのか、又はそうして受けている治療はどのようにモニタリングされるべきなのかを判断するのに広く適用できるシステムは現在存在しない。昨年、臨床検査科学者、ＨＩＶ臨床医学者、国際的な保健政策立案者、各国の保健大臣らが出席した会議で、発展途上国での無理なく買える価格のＨＩＶ診断及び治療モニタリングツールに関する差し迫った必要性について検討された。これらの会議から３つの方法が浮上した：ＨＩＶ疾患の新たな代用マーカーの検証（例、ヘモグロビンレベル）；既存の検査及びアッセイの資源の乏しい環境に合わせた改良；及びＣＤ４数、ＨＩＶ‐ＲＮＡ測定及び先進国世界の標準治療に照らしたその他の検査のための新技術の開発。
新代用マーカー-診断基準、リンパ球総数カウント、ヘモグロビンレベル-を識別する取り組みは限定的な成功は収めたものの、１９８０年代後期の米国や欧州でのこうした方法の限界を繰り返したにとどまった。ウイルス量に対する代用として逆転写酵素の働きを測定するアッセイはいくらか期待を持てるものであったが、まだ費用や技術的に問題がある。より効果的な方法としてｐ２４アッセイを改良して、熱変性したｐ２４抗原（ＨＤｐ２４）に関する安価で迅速な免疫測定が策定された（レデルゲルベール・ビー．他、２０００年「ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジーズ」第１８１号：ｐ．１２８０−８；パスカル・エー．他、２００２年「ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー」第４０巻：ｐ．２４７２−５；世界保健機関エイズ対策プログラム、１９９４年「エイズ」８：ＷＨＯ１−ＷＨ０４（Ledergerber, B. , et al. 2000. A Infect. Dis. 181: 1280-8; Pascual, A. , et al. 2002. J. Clin. Microbiol. 40: 2472-5; World Health Organization Global Programme on AIDS. 1994. AIDS 8 : WH01- WH04））。資源の乏しい環境での予備調査では、このアッセイは感度８５％、特異度１００％、費用８ドルであり、ＨＩＶ‐ＲＮＡレベルと相関している（パスカル・エー．他、２００２年「ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー」第４０号：ｐ．２４７２‐５（Pascual, A. et al. 2002. J. Clin. Microbiol. 40: 2472-5））。ＨＤｐ２４アッセイは現時点では治療モニタリングに直ぐに導入できる免疫測定の最良の候補だが、費用や処理に関する技術的複雑さが懸案事項であるため、さらなるアッセイの改良や検証調査が必要である。
安価なＣＤ４数計数用の入手可能な価格のフローサイトメータの開発の試みも同様に限定された成功にとどまっている（世界保健機関エイズ対策プログラム、１９９４年「エイズ」８：ＷＨＯ１−ＷＨ０４； リャムヤ・イー．・エフ．他 １９９６年「ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッド」第１９５号：ｐ．１０３−１２；シャーマン・ジー．ジー．他、１９９９年「ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッド」第２２２号：ｐ．２０９−１７；ジャノシィ・ジー．他、２００２年「サイトメトリ」第５０号：ｐ．７８−８５（World Health Organization Global Programme on AIDS. 1994. AIDS 8: WHO1-WH04 ; Lyamuya, E. F. , et al. 1996. J. Immunol. Methods 195: 103-12; Sherman, G. G. et al.1999. J Immunol. Methods. 222: 209-17; Janossy, G. , et al. 2002. Cytometry 50: 78- 85））。磁気ビーズ分離（ダイナビーデ、ダイナル社製（Dynabeade(R), Dynal）、オスロ、ノルウェー）及び手作業による細胞数カウントを使用した別のＣＤ４カウント方法は、西アフリカの主要なリファレンス研究施設での小規模な研究では実用的であると証明された（ディアグボウガ・エス．他、２００２年、口頭による発表Ｎｏ．ＷｅＯｒＢ１３４２、第１４回国際エイズ会議（Diagbouga, S. et al, 2002. Oral Presentation #WeOrB1342, ＸIVth International AIDS Conference））。この方法を地方及び地域レベルでの国家的治療プログラムにまで規模を拡大できるか、またアッセイの最終的費用についてもまだ不明である。現在、ダイナビーデ法（Ｄｙｎａｂｅａｄｅ ｍｅｔｈｏｄ）（米国特許第４，９１０，１４８）が妥当な費用で直ぐに実施可能なＣＤ４カウントの唯一の方法のようだが、アッセイの技術的要件（すなわち、ダイナビーデ法ではＣＤ４陽性Ｔ細胞を磁性ミクロスフェアで標識しマグネチックセパレータで分離した抗体により定量化する必要がある）のためにその使用が困難である。ダイナビーデ法ＣＤ４カウントは現在利用可能であるが、その費用はおそらく１アッセイ当たり３ドル〜１５ドルの範囲で、技術的限界から資源の乏しい環境での将来的なＨＩＶ臨床検査は新しい技術に委ねることになるだろう。
別の技術も認識され積極的に探求されてきており、行く行くは利用可能になるかも知れない。免疫クロマトグラフィ技術における全般的改良がＨＩＶ検査にも反映されてきた。ワンステップの側方向流動形式でＨＩＶ診断用にＨＩＶ-１抗体を測定するカートリッジ及びディップスティック検査が使用可能である（ケテマ・エフ．他、２００１年「ジャーナル・オブ・アクワイアード・イミューン・デフィシエンシー・シンドローム」第２７号：ｐ．６３−７０（Ketema, F. et al, 2001. J. Acquir. Immune Defic. Syzdr. 27: 63-70））。ＨＩＶ抗体だけでなく臨床のＨＩＶ疾患の代用マーカーになり得る血清タンパク質も測定する同様なアッセイは現在評価段階である。シングルチューブを用いた核増幅検査は、資源の乏しい環境でのＨＩＶモニタリングを含め多くのアプリケーション用に積極的に開発されている。こうした検査にはまだ高度な技術が必要とされるがＨＩＶ‐ＲＮＡ測定費用が１０ドル未満に減少するかも知れない（デ・バール・エム．ピー．他、２００１年「ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー」第３９号：ｐ．１８９５−９０２； オー・シー-ワイ．「モニタリング・アンド・ダイアグノスティック・ツールズ・フォー・ザ・マネージメント・オブ・アンチレトロバイラル・セラピー・イン・リソース‐プーア・セッティングス」 於メリーランド州ベセスダ２００１年１１月１１‐１３日（de Baar, M. P. et al, 2001. J. Clin. Microbiol. 39: 1895-902 ; Oh, C-Y. Monitoring and Diagnostic Tools for the Management of Antiretroviral Therapy in Resource-Poor Settings, Bethesda, Md. , Noveber 11-13, 2001））。
市販されている装置、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｎ２０００（Ｒ）及び４Ｔ８カートリッジ（Ｒ）（オゴーマン・エム．１９９８年「コンフェレンス・オン・ザ・ラボラトリ・サイエンス・オブ・エイチ・アイ・ブイ」９７−１１１（O'Gorman, M. 1998 Conference on the Laboratory Science of HIV 97-111））を使用した別の自動化された方法でも厄介な技術的要件が伴う。例えば、検体捕捉を遠心分離で実施し、検出にはさらに処理が要求されるピーク発光プロファイルを作成するレーザ走査が必要となる。
世界の注目はＨＩＶ薬剤入手不足に適切に注がれてきたが、それに伴って必要とされる手ごろな価格のＨＩＶ診断技術には殆ど手付かずのままである。抗レトロウイルス治療のための資金を工面できるとすると、後は、資源の乏しい環境用に設計されたＨＩＶ臨床検査が至急必要だということである。新しい検査は厳しいコスト的制約だけでなく、世界中の４千万のＨＩＶ感染者の大部分が生活している資源の乏しい環境では冷蔵、電力、技術支援が不足しているという点も考慮する必要がある。
上述したように、ＨＩＶが免疫システムに与える損傷の程度、及びＡＩＤＳの臨床的進展リスクに関する最も安定した指標はＣＤ４陽性Ｔ細胞絶対数（ＣＤ４陽性であるリンパ球総数のパーセンテージ）及びＣＤ４：ＣＤ８比（メロールズ・ジェー．ダブリュー．他１９９５年（Mellors JW et al., 1995））である。ＨＩＶ-１進展をモニタリングするためのこれらのマーカーの意義は米国のガイドラインで補足されているが、同ガイドラインではＣＤ４陽性細胞数が３５０細胞／ｍｍ３未満の全ての患者で治療を開始し、ＣＤ４陽性カウントは治療中３ヵ月から６ヶ月毎に測定すべきであると勧めている。
この１０年間、資源の乏しい環境での適切なＣＤ４陽性カウント方法開発の取り組みは成功していない。成功にまで至らない理由は、一部には、従来のアッセイが高度で高価な設備、安定した電力、高度な専門的技術を必要とするからである。特に、入手可能な価格で、感度のよい、信頼できる、電力に依存しないマイクロチップをベースとするＨＩＶ感染をモニタリングするアッセイは大変望ましい。
ＨＩＶ検体のマイクロチップベースのスクリーニング方法についてここで説明する。本発明の方法では改良型のマイクロチップフローセルを使用して、細胞（例えば、ＣＤ４細胞）、核酸（例えば、ＨＩＶ‐ＲＮＡ）、タンパク質（例えば、肝酵素）などのＨＩＶに関連する”対象検体”を全血から直接捕捉する。捕捉した検体を、ＣＣＤデジタルカメラなどの静止画像撮影用システムと安定した蛍光信号伝達とを組み合わせた高度な蛍光検出システムを使用して撮像する。正確な検体の定量化を、フィンガースティックで採血したサンプルの全血から、追加の処理又はサンプル増幅の必要なく、行なうことが出来る。
現行の検体スクリーニング方法では、しばしばフローサイトメトリを採用している。フローサイトメトリでは、対象検体を含む動的な流体の流れを利用した処理を必要とする。本発明の方法では、捕捉作用因子を配置して捕捉を行なう１つ又は複数の空洞部を備える独自のフローセルを経由して、対象検体を通し、それにより全血及び／又は血漿の別の容相から検体を分離する。捕捉された検体を、その後、光源、１つ又は複数のダイクロイックフィルタ、及び固定化された検体（すなわち”静止画像”）を撮像可能な検出器を使い、光学的に撮像する。このようにして、本発明の方法は対象となる小分子検体の効率的な捕捉及び静止画像撮影を提供する。
１つの実施例では、ＣＣＤデジタル撮像を使用して静止画像撮影を行なう。小分子の検出は、効率的な捕捉、静止画像撮影、安定した蛍光信号伝達の組み合わせにより促進される。小分子は容易に捕捉、検出できるので、血液サンプルの容量、試薬、所要電力をかなり削減できる。フローサイトメトリは、それに対して、流動流を通って移動する検体から信号を捕捉することに依存しているため、扱いにくい処理方法や検出設備がより必要とする。
１つの実施例において、本発明ではマイクロチップベースのＨＩＶ診断方法を提供するが、その方法では、多様な検体（例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＨＩＶ‐ＲＮＡ、ｐ２４抗原、肝酵素）に対するアッセイを、携帯型電池式のマイクロチップ・リーダーで光学的に読取り可能な単独のマイクロチップで実施する。
したがって、本発明は血液サンプルのＨＩＶ関連検体を検出する方法に関し、該方法は、
ａ）蛍光発光コンジュゲートと結合したＨＩＶ関連検体を１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルを通すことであって、該１つ又は複数の空洞部にはフィルタ備え、それにより検体を該フィルタ上で固定化して血液から検体を分離し、
ｂ）コンジュゲートの励起に適した波長で検体に光を当てること、
ｃ）蛍光信号を発するコンジュゲートを、検出器を使用してデジタル処理で撮像すること、
を含む。
ａ）蛍光発光コンジュゲートと結合したＨＩＶ関連検体を１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルを通すことであって、該１つ又は複数の空洞部にはフィルタ備え、それにより検体を該フィルタ上で固定化して血液から検体を分離し、
ｂ）コンジュゲートの励起に適した波長で検体に光を当てること、
ｃ）蛍光信号を発するコンジュゲートを、検出器を使用してデジタル処理で撮像すること、
を含む。
１つの実施例において、フィルタはポリカーボネート多孔性膜である。
本発明はサンプル血液中におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞対ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を決定する方法に関し、該方法は、
ａ）其々異なる蛍光発光コンジュゲートと結合したＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔリンパ球を、１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに、通すことであって、該１つ又は複数の空洞部にはフィルタを備え、それによりＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔリンパ球をフィルタ上で固定化し、
ｂ）各コンジュゲートの励起に適した波長でリンパ球に光を当てること、
ｃ）検出器を使い蛍光信号を発した各コンジュゲートをデジタル処理で撮像すること、及び
ｄ）ＣＤ４陽性細胞対ＣＤ８陽性細胞の割合を判定すること、を含む。
ａ）其々異なる蛍光発光コンジュゲートと結合したＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔリンパ球を、１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに、通すことであって、該１つ又は複数の空洞部にはフィルタを備え、それによりＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔリンパ球をフィルタ上で固定化し、
ｂ）各コンジュゲートの励起に適した波長でリンパ球に光を当てること、
ｃ）検出器を使い蛍光信号を発した各コンジュゲートをデジタル処理で撮像すること、及び
ｄ）ＣＤ４陽性細胞対ＣＤ８陽性細胞の割合を判定すること、を含む。
本発明は血液サンプルにおいてＨＩＶ‐ＲＮＡを検出する方法に関し、該方法は、
ａ）１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに、ＨＩＶ-ＲＮＡを含む血液サンプルを通すことであって、該１つ又は複数の空洞部には蛍光発光化合物と結合した相補的なヌクレオチド配列を有するフィルタを含み、
ｂ）前記フィルタ上の前記ＨＩＶ-ＲＮＡと前記相補的なヌクレオチド配列間で結合複合体を形成することであって、前記結合複合体の形成により蛍光発光化合物より発せられる信号を強化し、
ｃ）蛍光発光化合物の励起に適した波長で該複合体に光を当てること、及び
ｄ）検出器を使い、複合体が発する蛍光信号をデジタル処理で撮像すること、を含む。
ａ）１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに、ＨＩＶ-ＲＮＡを含む血液サンプルを通すことであって、該１つ又は複数の空洞部には蛍光発光化合物と結合した相補的なヌクレオチド配列を有するフィルタを含み、
ｂ）前記フィルタ上の前記ＨＩＶ-ＲＮＡと前記相補的なヌクレオチド配列間で結合複合体を形成することであって、前記結合複合体の形成により蛍光発光化合物より発せられる信号を強化し、
ｃ）蛍光発光化合物の励起に適した波長で該複合体に光を当てること、及び
ｄ）検出器を使い、複合体が発する蛍光信号をデジタル処理で撮像すること、を含む。
本発明は、血液サンプルにおけるＨＩＶ関連検体を検出する方法であって、該方法は、
ａ）蛍光発光コンジュゲートと結合したＨＩＶ関連検体を、１つ又は複数を備えるフローセルに、通すことであって、該１つ又は複数を備えるフローセルには該検体に対して結合親和力を有する適切な生物因子を有するアガロースビーズを含み、それにより該検体をビーズ上で固定化して、検体を血液から分離し、
ｂ）コンジュゲートの励起に適する波長で検体に光を当てること、
ｃ）検出器を使い蛍光信号を発したコンジュゲートをデジタル処理で撮像すること、を含む。
ａ）蛍光発光コンジュゲートと結合したＨＩＶ関連検体を、１つ又は複数を備えるフローセルに、通すことであって、該１つ又は複数を備えるフローセルには該検体に対して結合親和力を有する適切な生物因子を有するアガロースビーズを含み、それにより該検体をビーズ上で固定化して、検体を血液から分離し、
ｂ）コンジュゲートの励起に適する波長で検体に光を当てること、
ｃ）検出器を使い蛍光信号を発したコンジュゲートをデジタル処理で撮像すること、を含む。
本発明は血液サンプル中におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞対ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を判定する方法に関し、該方法は、
ａ）其々異なる蛍光発光コンジュゲートと結合したＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔリンパ球を、１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに、通すことを含み、該１つ又は複数の空洞部にはＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔリンパ球のいずれかに対して結合親和力を有するアガロースビーズを含み、それによりビーズ上でリンパ球を固定化して、血液から検体を分離する。
ａ）其々異なる蛍光発光コンジュゲートと結合したＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔリンパ球を、１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに、通すことを含み、該１つ又は複数の空洞部にはＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔリンパ球のいずれかに対して結合親和力を有するアガロースビーズを含み、それによりビーズ上でリンパ球を固定化して、血液から検体を分離する。
本発明はサンプル血液中においてＨＩＶ‐ＲＮＡを検出する方法に関し、該方法は、
ａ）ＨＩＶ-ＲＮＡを含む血液サンプルを、１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに通すことであって、該１つ又は複数の空洞部には、蛍光発光化合物と結合した相補的なヌクレオチド配列を有するアガロースビーズを含み、
ｂ）ビーズ上でＨＩＶ-ＲＮＡと相補的なヌクレオチド配列間の結合複合体を形成することであって、ＨＩＶ-ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列が結合することにより、蛍光発光化合物から発せられる信号が強化され、
ｃ）蛍光発光化合物の励起に適した波長で該複合体に光を当てること、及び
ｄ）検出器を使い、複合体が発した蛍光信号をデジタル処理で撮像すること、を含む。
ａ）ＨＩＶ-ＲＮＡを含む血液サンプルを、１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに通すことであって、該１つ又は複数の空洞部には、蛍光発光化合物と結合した相補的なヌクレオチド配列を有するアガロースビーズを含み、
ｂ）ビーズ上でＨＩＶ-ＲＮＡと相補的なヌクレオチド配列間の結合複合体を形成することであって、ＨＩＶ-ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列が結合することにより、蛍光発光化合物から発せられる信号が強化され、
ｃ）蛍光発光化合物の励起に適した波長で該複合体に光を当てること、及び
ｄ）検出器を使い、複合体が発した蛍光信号をデジタル処理で撮像すること、を含む。
本発明の他の態様は以下の開示において記載され、又は以下の開示から（及び本発明の範囲内において）明らかである。
ここでは、１つ又は複数の対象検体を含む流体の分析に関するシステム及び方法について説明する。ここで使用しているように、”検体”は、このシステムを使用して効率的に固定化、検出、定量化される生物因子を指し、核酸、タンパク質、細胞を含む。１つの実施例では、本発明における検体はＨＩＶ感染（即ち、検体の定量化により被験者におけるＨＩＶ感染の存在又は重症度を示す）に関連する。
システムを、液体の又は気体の流体のどちらかに対して使用してもよい。システムでは、実施例によっては、個々の検体及び検体の混合物両方に対する診断を示すパターンを生成してもよい。実施例によっては、システムは複数の化学的に反応する粒子でできており、該粒子は秩序配列を形成し、多くの異なる種類の検体を同時に迅速に検出可能である。システムの１態様としてマイクロ加工処理を施して配列を形成してもよく、それにより費用を掛けずシステムの製造が可能である。
１つの実施例の検体検出システムにおいて、システムは、実施例によっては、光源、センサーアレイを有するフローセル、検出器を含む。該センサーアレイは、実施例によっては、秩序配列において化学的に反応する粒子（ここでは”粒子”と称す）などの様々な捕捉作用因子を保持するよう構成される支持部材の形状を成す。粒子の例としては、これに限定されないが、官能化高分子ビーズ、アガロースビーズ、デキストロースビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、多孔質ガラスビーズ、金属酸化物粒子（例えば、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）又は酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３））、高分子薄膜、金属の量子粒子（例えば、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓなど）を含む。
検出器（例えば、電荷結合素子”ＣＣＤ”、フォトダイオード、ＣＭＯＳイメージャ、その他の光に反応する装置）をセンサーアレイの下に配置し、データ取得を可能にしてもよい。別の実施例では、検出器をセンサーアレイの上に配置して粒子又は他の捕捉作用因子から発せられた光の反射からデータを取得してもよい。
光源から発せられた光はセンサーアレイを通過しセンサーアレイの底側を抜ける。粒子により変調された光がセンサーアレイを通過し、近位に離れて配置した検出器上に届くようにしてもよい。光学的変化の評価は、目視検査又は検出器自体又は検出器を光学顕微鏡と組み合わせて使用して完了してもよい。マイクロプロセッサを検出器又は顕微鏡に連結してもよい。流体供給システムをセンサーアレイの支持部材に連結してもよい。この流体供給システムは、実施例によっては、サンプルをセンサーアレイ内に、及びセンサーアレイ外に導くよう構成されている。
粒子は、実施例によっては、対象検体に結合し、変調信号を生成する両能力を有する。これらの粒子は、実施例によっては、検体の存在時に検出可能な信号を生成する要素である。粒子は光学的な（例えば、吸光度又は反射率）信号又は蛍光／発光信号を、検体への照射時に発生してもよい。粒子を、対象検体と結合し変調信号を生成する両能力を有する生物因子と結び付けることが可能である。生物因子を、標識（例えば、蛍光発光化合物で標識化した相補的ＨＩＶ配列）に結合させることができる。生物因子は対象検体に結合する能力を有してもよい。生物因子は対象検体と結合すると、標識に光が当たると変調信号を発生させるようにしてもよい。生物因子は、自然発生の又は人造のもので、論理的設計又は組み合わせ的手法により形成されてもよい。例としては、これに限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、酵素、オリゴペプチド、抗原、抗体が挙げられる。自然又は人造の生物因子かどちらにするかは、特定の方法で検体との結合能力で選択してもよい。
１つの実施例では、生物因子を、フルオロフォアなどの発光化合物と結合させる。別の実施例では、検体自身を発光化合物と結合させることができる。これらのコンジュゲートされた実体はここでは”蛍光発光検出コンジュゲート”と称す。
１つの実施例では、センサーアレイシステムには多くの粒子を含み、そこでは粒子に１つ又は複数の高分子ビーズ又はアガロースビーズと結合した生物因子（例えば、受容体、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ配列）を有してもよい。生物因子は、実施例によっては、検体への相互作用能力で選択される。この相互作用は、例えば検体との、結合／会合の形をとってもよい。支持部材を、粒子を支持しながら適切な光の波長を通せるいかなる材料で製作してもよい。
１つの実施例では、生物因子及び標識を高分子樹脂と結合させてもよい。捕捉時に、構造変化が検体の存在で起こり、それにより標識の局部的な微小環境における変化が起こる。この変化により標識の分光学的特性に変化が生じてもよい。標識との相互作用で、使用する信号伝達プロトコルによって様々に異なる信号が生成されてもよい。かかるプロトコルには、吸光度、蛍光共鳴エネルギー移動、及び／又は蛍光消光を含めてもよい。
１つの実施例において、センサーアレイシステムには、個々の空洞部内に収容された多くの粒子を含む。粒子には高分子又はアガロースビーズに結合した生物因子を有してもよい。適した生物因子を対象検体との相互作用で選択することができる。この相互作用は、検体との、結合／会合の形をとってもよい。支持部材を、粒子を支持しながら適切な光の波長を通せるいかなる材料で製作してもよい。支持部材には、複数の空洞部を備えてもよい。空洞部を、少なくとも１つの粒子を実質的に空洞部内に収容するように形成してもよい。
支持部材には、複数の空洞部を有してもよく、該空洞部をここでは”マイクロウェル”とも称す。空洞部は従来技術で既知のマイクロマシニング技術で形成可能である。空洞部は、例えばピラミッド形の穴に形成して、それにより少なくとも１つの捕捉作用因子を空洞部内に収容するようにしてもよい。１つの実施例では、捕捉作用因子は、其々が生物因子と結合可能なアガロースビーズ又はフィルタを有する粒子である。
センサーアレイにはカバー層を含んでもよい。カバー層はセンサーアレイ上に少し離れて位置し、それによりセンサーアレイ表面とカバー層の間に経路を形成してもよい。カバー層を少し離れて配置してもよく、それによりカバー層が、センサーアレイ内の空洞部から粒子が脱落するのを防ぐと共に、流体をセンサーアレイとカバー層間に形成された経路を通して空洞部に流入可能にする。
実施例によっては、空洞部を、使用中に空洞部を流体が通過できるように構成してもよくする一方、空洞部を流体の空洞部通過時に空洞部内に捕捉作用因子を保持するよう構成する。例えば、空洞部には、対象のＨＩＶ検体に対して特定の結合親和力を有する生物因子（例えば、ＨＩＶｇｐ４１及び／又はｇｐ１２０抗原、ＨＩＶｐ２４抗原、及びＢ型肝炎表面抗原）と結合したアガロースビーズを含んでもよい。
吸引機を空洞部に取付けてもよい。吸引機をセンサーアレイ全体に適用してもよい。或いは、吸引装置を空洞部に取付けて、空洞部を真空状態にしてもよい。吸引装置は、圧力差を設け流体を移動させられるいかなる装置でもよい。吸引装置は空洞部内のいかなる流体に吸引力を適用してもよい。吸引装置の例としては、予め密封した真空チャンバ、真空ポンプ、真空ライン、吸引型ポンプが挙げられる。
実施例において、光学検出器を、独立した検出装置を利用するよりはむしろ、支持部材の底部内に一体化してもよい。光学検出器にマイクロプロセッサを取付けて、独立した検出コンポーネントを利用することなく流体評価を行なえるようにしてもよい。さらに、流体供給システムも支持部材に組み込んでもよい。検出器及び流体供給システムを支持部材と一体化させることにより、コンパクトで持ち運び可能な検体感知システムの形成が可能になる。
高感度のセンサーアレイ（例えば、ＣＣＤ又はＣＭＯＳ）を使い生物／化学的因子の結合時に起こる光学的特性の変化を測定してもよい。このアレーを、フィルタ、光源、流体供給及びマイクロマシニングされた粒子容器に連結させて、それにより機能的なセンサーアレイを作成してもよい。１つの実施例では、データ取得及び処理を既存のＣＣＤ又はＣＭＯＳ技術を利用して行なってもよい。ＣＣＤ又はＣＭＯＳ検出器が、白色光、紫外線、蛍光を測定できるよう構成してもよい。その他の検出器として、光電子倍増管、電荷誘導装置、フォトダイオード、フォトダイオード・アレイ、マイクロチャンネル部材などを使用してもよい。
１つの実施例では、自然発生又は人造の生物因子を高分子又はアガロースビーズに結び付けて、粒子を作成する。粒子は、実施例によっては、対象検体との結合、及び検出可能な信号の生成という両能力を有する。実施例によっては、粒子は、対象検体と結合すると光学信号を生成する。
様々な自然及び人造の生物因子は、ポリヌクレオチド（例えば、アプタマー）、ペプチド（例えば、酵素及び抗体）、及び受容体を含むが、これに限定せず、使用してもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列の連続した構築により得られるかも知れない比較的小さなＤＮＡの断片である。ペプチドは、抗体又は酵素などの天然ペプチドを含む、又はアミノ酸から合成してもよい。
１つの実施例では、粒子は、天然のバイオポリマーに基づくが、非天然の連結ユニットで構成される化学構造である、非天然のバイオポリマーを有してもよい。例えば、ポリチオ尿素及びポリグアニジンは、ペプチドと類似した構造を持つが、アミノ酸よりむしろ、ジアミン（即ち、少なくとも２つのアミン官能基を含む化合物）から合成してもよい。
１つの実施例では、生物因子を高分子樹脂と結合させてもよい。捕捉時に、検体が存在すると化学反応が起こり、信号が生成される。標識を生物因子又は高分子ビーズに結合させてもよい。化学反応により、標識の局部的微小環境で変化を起こして、標識の分光学的特性を変化させてもよい。この信号を、様々な信号伝達プロトコルを使用して生成してもよい。かかるプロトコルには、吸光度、蛍光共鳴エネルギー移動、及び／又は蛍光消光を含んでもよい。組み合わせ例としては、以下に限定されないが、ペプチド‐プロテアーゼ、ポリヌクレオチド−ヌクレアーゼ、オリゴ糖−オリゴ糖切断剤が挙げられる。
これらシステムに関するさらなる詳細は、以下の米国特許出願において述べられており、全ては引用することによりここに組み込まれる：米国特許出願第０９／２８７，２４８、発明の名称「フルーイド・ベースト・アナリシス・オブ・マルチプル・アナリツ・バイ・ア・センサーアレイ （Fluid Based Analysis of Multiple Analytes by a Sensor Array）」；米国特許出願第０９／３５４，８８２、発明の名称「センサーアレイズ・フォー・ザ・メジャメント・アンド・アイデンティフィケーション・オブ・マルチプル・アナリツ・イン・ソリューションズ（Sensor Arrays for the Measurement and Identification of Multiple Analytes in Solutions）」；米国特許出願第０９／６１６，３５５、発明の名称「デテクション・システム・ベースト・オン・アン・アナリテ・リアクティブ・パーティクル（Detection System Based on an Analyte Reactive Particle）」；米国特許出願第０９／６１６，４８２、発明の名称「ジェネラル・シグナリング・プロトコルズ・フォー・ケミカル・レセプターズ・イン・インモビライズド・メイトレシーズ（General Signaling Protocols for Chemical Receptors in Immobilized Matrices）」；米国特許出願第０９／６１６，７３１、発明の名称「メソッド・アンド・アパラタス・フォー・ザ・デリバリー・オブ・サンプルズ・ツー・ア・ケミカル・センサーアレイ（Method and Apparatus for the Delivery of Samples to a Chemical Sensor Array）」；米国特許出願第０９／７７５，３４２、発明の名称「マグネティック-ベースト・プレイスメント・アンド・リテンション・オブ・センサーエレメンツ・イン・ア・センサーアレイ（Magnetic-Based Placement and Retention of Sensor Elements in a Sensor Array）」；米国特許出願第０９／７７５，３４０、発明の名称「メソッド・アンド・システム・フォー・コレクティング・アンド・トランスミティング・ケミカル・インフォメーション（Method and System for Collecting and Transmitting Chemical Information）」；米国特許出願第０９／７７５，３４４、発明の名称「システム・アンド・メソッド・フォー・ザ・アナリシス・オブ・ボディリイ・フルーイズ（System and Method for the Analysis of Bodily Fluids）」；米国特許出願第０９／７７５，３５３、発明の名称「メソッド・オブ・プリペアリング・ア・センサーアレイ（Method of Preparing a Sensor Array）」；米国特許出願第０９／７７５，０４８、発明の名称「システム・フォー・トランスファーリング・フルーイド・サンプルズ・スルー・ア・センサーアレイ（System for Transferring Fluid Samples Through A Sensor Array）」（米国特許出願公開第２００２−００４５２７２−Ａ１）；米国特許出願第０９／７７５，３４３、発明の名称「ポータブル・センサーアレイシステム（Portable Sensor Array System）」；及び、米国特許出願第１０／０７２，８００、発明の名称「メソッド・アンド・アパラタス・フォー・ザ・コンファインメント・オブ・マテリアル・イン・ア・マイクロマシーンド・ケミカル・センサーアレイ（Method and Apparatus for the Confinement of Materials in a Micromachined Chemical Sensor Array）」。
別の実施例では、捕捉作用因子は、流体工学装置内の空洞部が流体工学装置内に配置されたフィルタを収容するように構成される膜ベースのフローセンサを備える。検体、特に、リンパ球及び他の白血球などの細胞は、その大きさが濾過孔より大きいため、フローセルで捕捉され、膜上で固定化される。捕捉された検体を直接分析、又は撮像に先立ち視覚化化合物で処理してもよい。
ここで記述するように、様々な検体を膜ベースのフローセンサを使い捕捉及び分析してもよい。検出の特に対象となる検体として、リンパ球、単球、他の免疫システム細胞が挙げられる。
図1は、膜ベースのフローセンサ１００の拡大図である。フローセンサ１００には、少なくとも２つの部材１４０及び１５０の間に挟まれた膜１１０を含む。部材１４０及び１５０は流体が膜１１０に流入し通過できるよう構成されている。部材１４０及び１５０は、検体を検出する前に、膜１１０で検体を捕捉するようにも構成されている。ニュクリポア（製品名：Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ（Ｒ））トラックエッチング膜、ニトロセルロース、ナイロン、セルロースアセテートなど、これらに限定されないが、多様な異なる材料を、膜１１０に使用してもよい。一般的に、膜１１０に使用する材料は、視覚化及び検出プロセス中に使用する染色液と抗体の非特異的結合に抵抗力を持つべきである。さらに、膜１１０は様々な試薬、緩衝液、溶媒に対して不活性である材料から成る。膜１１０には正確に均一に配された複数のサブミクロンの孔を有してもよい。均一に配置された孔を有する膜を使用することで、流体の流れや検体の分離より確実に制御できる。
部材１４０及び１５０は、検体検出に使用する光線の波長に対してほぼ透過性を有する材料から成る。例えば、検体検出方法で紫外線を使用になければならない場合、部材１４０は紫外線に対してほぼ透過性を有する材料から成るのが望ましい。部材１４０は、検出方法の基準を満たすのに適した材料であればいかなる材料から成ってもよい。部材１４０の形成に使用してもよい透明な材料としては、ガラス、石英ガラス、及びアクリレート重合体（例えば、ポリメタクリル酸メチル）などの重合体を含むが、これに限定されない。実施例によっては、上部部材１４０及び下部部材１５０は両方とも透明な材料から成る。上部部材及び下部部材に透明な材料を使用することで、膜ベースのフローセンサを経由して検出を行なえる。
図1に示すように、膜１１０は上部部材１４０及び下部部材１５０間に挟まれる。下部部材１５０及び／又は上部部材１４０には膜を保持するよう構成された窪部を有してもよい。例えば、図1では、下部部材１５０には、膜１１０を受けるよう構成された窪部１５２を含み、膜１１０の支持又は封入に使用する他の付随する部品を伴う。窪部又は空洞部は、標準的なエッチング技術で上部部材１４０及び／又は下部部材１５０にエッチングしてもよい。
図１を参照すると、下部部材１５０には、部材支持体１３０を受けるよう構成されている第１窪部１５２を含む。下部部材には第２窪部１５４も含む。第２窪部は、部材支持体１３０が第２窪部へ入らないよう構成されている。第２窪部には、部材支持体１３０の近傍に配置されるリッジ部を有し、それにより部材支持体１３０がリッジ部上に置かれるようしてもよい。或いは、図1で示したように、第２窪部のサイズを部材支持体１３０のサイズより小さくしてもよい。どちらの場合も、組立て時には、部材支持体１３０の第２窪部１５４への進入が防がれ、それにより部材支持体１３０の下に空洞部が設けられる。第２窪部１５４を使用して、部材支持体１３０を通過する流体を、システムから排出する前に、収集してもよい。
部材支持体１３０を使用中に膜１１０を支持するよう構成する。部材支持体１３０を多孔質材から形成して、流体が部材支持体を通過できるようしてもよい。部材支持体１３０の孔のサイズは、流体が膜１１０を通過できる速度以上の速度で流体が部材支持体１３０を通過できるサイズとすべきである。１つの実施例では、部材支持体１３０の孔は膜１１０における孔より大きいが、その孔は大き過ぎてはならない。部材支持体１３０の１機能として、膜１１０を支持する機能が挙げられる。そのため、部材支持体１３０の孔は、使用中に膜１１０が撓わないよう十分に小さくするのが望ましい。部材支持体１３０を、高分子材料、金属、及びガラスなど、これに限定されないが、様々な材料から形成してもよい。１つの実施例では、高分子材料（例えば、セルコン・アクリル（ｃｅｌｃｏｎ ａｃｒｙｌｉｃ））を、部材支持体１３０用材料としてもよい。さらに、部材支持体１３０は、使用中に膜を平面的に維持するのに役立つ。膜を平面的に維持することで、単一の焦点面上で検体の捕捉及び検出が可能になり、検体の検出を簡素化できる。
前述したように、膜ベースのフローセンサ１００を組立てる場合、膜１１０を部材支持体１３０上に置いてもよい。実施例によっては、ガスケット１２０を膜１１０の頂部に配置してもよい。 ガスケットを、部材１３０及び部材１４０と膜１１０の間で流体漏れ防止シールとして使用してもよい。ガスケットは使用中システムからの流体漏れを防ぐかも知れない。
上部部材１４０には、流体入口部１６０を備えてもよい。分析の対象となる流体を流体入口部１６０経由で装置１００に導入する。流体入口部１６０は上部部材１４０の一部分を貫通してもよい。実施例によっては、経路１６２を上部部材１４０内に形成して、管１６４を経路１６２に挿入するようにしてもよい。経路１６２を上部部材の中心部付近で戻して、膜１１０の上部表面に流体を供給してもよい。
下部部材１５０には、流体出口部１７０を備えてもよい。流体入口部１６０経由で装置１００に導入した流体は、上部部材１４０を通過し、膜１１０を通過する。流体はその後窪部１５４で収集される。流体出口部１７０を下部部材１５０の一部に貫通させてもよい。実施例によっては、経路１７２を下部部材１５０に形成して、管１７４を経路１７２に挿入してもよい。経路１７２を、使用中に空洞部１５４内に収集された流体を受容するよう配置してもよい。
状況に応じて、洗浄流体出口１８０を上部部材１４０に形成してもよい。洗浄流体出口１８０を、洗浄操作中に膜１１０を通過又は横切る流体を受けるよう構成する。洗浄流体出口１８０を上部部材１４０の一部に貫通させてもよい。実施例によっては、経路１８２を上部部材１４０に形成して、管１８４を経路１８２に挿入するようにしてもよい。経路１８２を、使用中に膜１１０を洗浄するのに使用した流体を受けるよう配置してもよい。
膜１１０は流体の流れから対象検体を濾過できる材料から選択される。例えば、リンパ球が対象検体であるとすると、フィルタは流体の流れからリンパ球を除去できるものが望ましい。適切な膜には、対象検体のサイズよりかなり小さな複数の孔を備えてもよい。
膜を従来技術で既知である様々な材料から形成してもよい。１つの実施例では、膜１１０はトラックエッチングを施したニュクリポア（商標名：Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ（ＴＭ））ポリカーボネート多孔質膜でもよい。ニュクリポア膜はワットマン社（Ｗｈａｔｍａｎ ｐｌｃ．）から発売されている。膜１１０の厚さは約５〜１０ミクロンである。膜１１０には複数の孔を有する。孔径は約０．２μｍ〜約１２μｍの範囲である。多孔質膜フィルタを、プラスチック製のスクリーン・ディスク（商標名：Ｃｅｌｃｏｎ（Ｒ））で支持できる。
対象検体が白血球（例えば、ＣＤ４リンパ球）の場合、使い捨ての膜フィルタが捕捉に関しては望ましい。例えば、３μｍの孔を有するポリカーボネート製のトラックエッチング膜をフローセルの空洞部内に固定し、表面積約８０ｍｍ２、内部容量約２０μＬを有するリンパ球補足手段を作成する。かかる条件下では、変形赤血球（リンパ球と同様の径を有するが、典型的には数量が１０００倍超）は、適切な流体の流れのもとでは孔を容易に通過する一方、白血球は捕捉され単一の撮像焦点面に堆積する。赤血球の分離により自己蛍光が減少し、追加のサンプル処理を実施せずに、直接全血から採取した白血球の撮像を調節できる。
図２はハウジング２００に配設した膜ベースのフローセンサの実施例を示す。上部部材１４０、ガスケット１２０、膜１１０、部材支持体１３０、及び下部部材１５０をハウジング２００内部に組付けて設置してもよい。ハウジング２００に膜ベースの流体センサを包含してもよい。キャップ２１０を使いハウジング２００内に膜ベースの流体センサを保持してもよい。キャップ２１０には窓を備えて膜１１０を観察できるようにしてもよい。流体入口部１６０、流体出口部１７０、及び洗浄流体出口１８０を、ハウジング２００内に位置させると、ハウジング２００から伸長して膜ベースの流体センサ１００へ容易に接近できるようになる。
図３は膜ベースの分析システムの全体概略図を示す。分析システムには、複数のポンプ（ｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ４）を備える。ポンプは、使用中にサンプル（ｐ１）、視覚化試薬（ｐ２及びｐ３）、及び膜洗浄流体（ｐ４）を膜ベース流体センサ１００に供給するよう構成されている。試薬、洗浄流体、及び可視化剤をプレフィルタ（ｆ１、ｆ２、ｆ３、ｆ４）に通した後、流体を膜ベース流体センサ１００に送る。プレフィルタを、膜１１０を詰まらせる可能性のある大きな粒子状物質を排除するために使用する。各プレフィルタの性質及びサイズについては、大きな塵粒又は詰まりを防ぐ間に堆積する粒子状物質を効率的に捕捉するよう最適化してもよい。プレフィルタｆ１は、サンプルを濾過後、サンプルが膜ベース流体センサ１００に到達するよう構成されている。プレフィルタｆ１は、対象検体と無関係の一部の粒子の流入を阻止しながら、対象検体を通過させるよう構成されている。例えば、プレフィルタｆ１の孔より小さなサイズの胞子はプレフィルタを通過し膜ベース流体センサ１００で捕捉される。流体はプレフィルタｆ１−ｆ４を通過後、マニホルドを通過する。実施例によっては、膜ベース流体センサ１００には単独の流入線を備える。マニホルドで、異なる複数の流体線をこの単独の膜ベース流体センサ１００の流入線に連結する。
流体を、マニホルド通過後、膜ベース流体センサ１００の流体入口部に導入する。適時、検出器２５０を使い、膜ベース流体センサ１００が検体を捕捉しているか否かを判定する。 図５に示すように、検出器を、膜ベース流体センサ１００の一部分を覆うように設置し、それにより検出器で膜の画像を取込むようにしてもよい。例えば、検出器を、膜ベース流体センサ１００内の窓を通して膜の画像を撮影できるように設置してもよい。検出器２５０を使用して、膜１１０上に捕捉された粒子状物質の画像を取得してもよい。画像の取得には、画像の”デジタルマップ”の生成を含んでもよい。ある実施例では、検出器２５０には高感度のセンサーアレイ（例えば、ＣＣＤ又はＣＭＯＳ）を備えてもよい。このセンサーアレイを、フィルタ、光源、流体供給部と連結させ、機能的なセンサーアレイとしてもよい。１つの実施例では、データ取得及び処理を既存のＣＣＤ又はＣＭＯＳ技術を使用して実施してもよい。実施例によっては、光を３色の構成要素である、赤、緑、青に分解する。光学的変化の評価を目視検査（例えば、顕微鏡で）で、又はマイクロプロセッサ（”ＣＰＵ”）を使用して完遂してもよい。蛍光測定に関しては、フィルタを検出器２５０と膜１１０の間に設置して励起波長を除去してもよい。図３で示したように、マイクロプロセッサを使用してポンプ及びバルブを制御してもよい。また、マイクロプロセッサを使用して、例えば、ＬＥＤ又は他の光源、ＣＭＯＳ又はＣＣＤ撮像コンポーネント及び撮像処理ソフトウェアを制御してもよい。
検体検出システムを、バルブの開閉に基づいて異なるモードで動作させてもよい。”流入”モードのシステム構成が図３に示されている。このモードでは、流体をマニホルドから膜ベース流体センサ１００へと移動させ、検体の捕捉又は現像剤の添加を可能にする。分析用の流体を流体入口部１６０経由で膜ベース流体センサ１００に導入してもよい。”流入”モードの動作中、バルブｖ１は閉位置にあり、洗浄流体出口１８０を通る流体の流れを抑制する。そのため、流体は、強制的に膜ベース流体センサ１００を通過させられ、流体出口部１７０経由でセンサの外に出されるかも知れない。バルブｖ２は開位置にあり、流体が物容器に流れるようにしている。バルブｖ３は閉位置にあり、流体が洗浄流体供給線へ流れるのを抑制している。
検体検出システムを、図４に示すように、”横方向膜洗浄”モードで動作させてもよい。このモードでは、流体を膜の収集面上に流して膜を洗浄する。これにより、次の検査に膜を再利用できる。膜洗浄用の流体を流体入口部１６０経由でセンサ１００に導入してもよい。”横方向膜洗浄”動作中、出口バルブｖ２及びｖ３は閉位置にあり流体出口部１７０を通る流体の流れを抑制する。また出口バルブｖ２及びｖ３を閉じることにより、センサ１００の膜を通る流体の流れを抑制する。そのため、センサ１００に流入する流体は、強制的に洗浄流体出口１８０を経由してセンサ１００の外に出される。バルブｖ２は開位置にあり、流体が洗浄流体出口１８０を経由して排液溜めに流入するようになっている。流体が膜を経由して流れないよう抑制されているので、膜で収集した検体及び他の粒子が膜から洗浄され、膜がさらに使用可能になる。
検体検出システムを、図５に示すように、”逆洗浄”モードで動作させてもよい。逆洗浄動作中、流体出口部１７０を使用して流体を検体検出システムに導入し、一方で洗浄流体出口１８０を使用して流体を装置外に出せるようにする。このセルを経由する流体の”逆”の流れにより、膜が掃除される。ある実施例では、バルブは図５に示すように流体出口部１７０経由で導入される洗浄流体を伴って構成してもよい。具体的には、バルブｖ１及びｖ３を開き、バルブｖ３を閉じる。
横方向膜洗浄又は逆流処理のどちらかを使用して、膜から検体及び他の粒子を除去してもよい。膜表面の両清掃方法を、超音波又は機械的撹拌を使い強化してもよい。使用中、流体サンプル中の検体は膜の穴より大きいため、膜にトラップされる。使用後、検体が膜全体に渡って不規則に分布する傾向がある。膜上で孔間に位置する検体については、逆洗浄流体の力がその検体に当たらない可能性があるため、膜の孔上又は付近に位置する検体より除去が困難である。逆洗浄及び横方向洗浄の動作中、トラップされた検体の除去の強化に機械的撹拌である超音波を使用してもよい。両洗浄方法では検体を膜表面上で移動させるので、検体が孔の１つを通過する洗浄流体柱に当たる機会が増える。
検体検出システムを使用して流体システムにおける検体の存在を判定してもよい。流体サンプルにおける検体判定プロセスの１実施例を図６のフローチャートで示す。
サンプルを分析する前に、バックグランドサンプルを収集及び分析してもよい。固形検体を通常、収集し液状流体で保存する。サンプル作製に使用する液状流体を分析して、流体内に検体が存在するかを判定してもよい。１つの実施例では、固形検体の収集に使用する液状流体のサンプルを検体検出装置に導入して、流体により発生するバックグランド”ノイズ”を判定する。バックグランド収集中、膜で収集した粒子を観察し、液状流体中の粒子状物質のレベルを判定する。実施例によっては、収集段階で膜によって収集された粒子を可視化剤で処理し、液状流体中に検体が存在するかを判定してもよい。バックグランド検査で収集された情報を、収集したサンプルの分析時に使用して、誤った陽性表示を減少させてもよい。
ここで説明するように、バックグランドサンプル収集後、逆流洗浄又は横方向洗浄のどちらかを利用して膜を清掃してもよい。膜の清掃後、このシステムを使用して固体検体に関するサンプルを分析してもよい。
収集したサンプルが多孔質膜を通過するとき、多孔質膜はその孔のサイズより大きなサイズのあらゆる検体をトラップする。所定の時間、又は収集したサンプルの全てが膜を通過するまで、粒子の収集を継続してもよい。
収集後、膜で収集された検体を検出器で分析してもよい。実施例によっては、検出器は膜の画像を取り込むカメラでもよい。例えば、検出器はＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラでもよい。膜で捕捉された粒子の分析を、粒子のサイズ及び／又は形状を分析することで行なってもよい。膜で捕捉された粒子のサイズ及び／又は形状を既知の粒子のサイズ及び／又は形状と比較することで、所定の検体の存在を指摘してもよい。また、検体は様々な可視化剤（例えば、着色色素及び蛍光色素）に反応する。膜で捕捉された検体を適切な検出器で分析する。該当する色及び／又は蛍光を有する粒子の存在により、検査目的の検体の存在を示しているかも知れない。
１つの実施例では、全血中のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８細胞を検出するのが望ましい。フローセルにかける前に、全血サンプルを適当な期間（例えば、８分間）フルオロフォアとコンジュゲートした抗ＣＤ３及び抗ＣＤ４抗体と培養することができる。事前に培養することで検出力を高めることができる。検査サンプルのフローセルへの供給は流体工学のコントローラ（例えば、蠕動ポンプ）を使用して調整可能である。
リンパ球捕捉膜の１領域からのデジタル画像を、２つの異なる吸収フィルタ、例えば、ＡｌｅＸａ４８８とコンジュゲートした抗体用フィルタ（ＣＤ４陽性Ｔリンパ球を識別し、緑色の信号を発する）及びＡｌｅＸａ６４７とコンジュゲートした抗体用の別のフィルタ（ＣＤ３陽性Ｔリンパ球を識別し、赤色の信号を発する）を使い取得する。その後、この２つの画像を自動的にデジタル形式で合成して、対象のＣＤ３陽性／ＣＤ４陽性Ｔリンパ球（即ち、黄色で表示されるＣＤ４細胞）を、ＣＤ４陽性／ＣＤ３陰性単球（緑色で表示）、及びＣＤ３陽性／ＣＤ４陰性Ｔリンパ球（赤色で表示）と識別する。
粒子を分析することで、対象検体のサンプル中での存在を指摘できるかも知れない。この場合、粒子を膜から洗い流してシステム外に送出し、さらに検査してもよい。追加検査では、特定の検体の存在をより正確に判定できる、培養又はＥＬＩＳＡ技術などの技術を利用してもよい。或いは、粒子をセンサーアレイに送り、ここで説明するように、さらに検査してもよい。膜上に有効な量の検体がなければ、膜を洗浄して他のサンプルを分析してもよい。
ユーザ定義の閾値基準を設定して、１つ又は複数の特定の検体が膜上に存在する確率を示してもよい。この基準を、画像の様々な特徴の内の１つ又は複数に基づいて設定してもよい。実施例によっては、この基準を特定の検体に対して予め設定した画素又は色のフィンガープリント（指紋）に基づいて設定してもよい。使用可能な特徴としては、以下に限定されないが、画像上の物質の部分のサイズ、形状、色、物質が作る集合部分、物質の蛍光強度などが、挙げられる。
膜システムには、コンピュータ・システム（図示せず）を備えてもよい。コンピュータ・システムには、検出器を使用して生成されたデジタルマップを処理できるソフトウェア・アプリケーションを１つ又は複数備えてもよい。例えば、コンピュータ・システムで使用可能なソフトウェア・アプリケーションを使用して検査画像と予め定義した光学的フィンガープリントと比較してもよい。或いは、コンピュータ・システム上で使用可能なソフトウェアを使用して、カウントが予め定義した閾値限界を超えているかを判定してもよい。
検出器を使用して、膜上で捕捉した検体及び他の粒子状物質の画像を取得してもよい。検出器で取得した画像を予め設定した基準に基づいて分析してもよい。結果が陽性であれば細菌の存在を示す可能性がある。検査基準は、画像の一部又は部分のサイズ、形状、アスペクト比、色など、これらに限定されないが、の画像の様々な特徴に基づいてもよい。検査基準を適用することで、対象検体をバックグランド粒子状物質と識別できるかも知れない。分析中、流体供給システムから連続してサンプルを流してもよい。
実施例によっては、陽性の結果から流体が特定の検体を含むと推定できるかも知れない。画像が検査基準に関して陽性の結果を示した場合、流体のサンプルを確認検査又は特定の検査にかけてもよい。一方、画像が検査基準に関して陰性の結果を示した場合、膜を濯ぎ、前述の方法を別サンプルからの流体に対して実施してもよい。
検体検査中、サンプルを検体検出装置に導入してもよい。トリガパラメータを測定して、可視化剤を検体検出装置に導入する時期を判定してもよい。トリガパラメータの測定は継続的に行なっても、又はユーザが開始してもよい。或いは、サンプルを導入した後すぐに、染色液を検体検出装置に導入してもよい。
１つの実施例では、トリガパラメータを、流体を検体検出装置に制御された流量で導入を開始してから経過した時間としてもよい。例えば、染色液を、流体サンプルを毎分１ｍｌの流量で検体検出装置に導入開始後、２０秒で導入してもよい。別の実施例では、トリガパラメータを、膜全体の圧力低下としてもよい。膜全体の圧力低下を、膜の両側に圧力トランスデューサを使い判定してもよい。
別の実施例では、トリガパラメータを、膜により捕捉した検体の自己蛍光としてもよい。検出器は、検体の自己蛍光からの信号が予め定義したレベルに達するまで、スイッチを入れた状態にしてもよい。さらに別の実施例では、フィルタリング・ソフトウェアを使用して、青又は赤のスペクトル域の色を含む画素を除いて、膜上の物質の自己蛍光データマップを作成してもよい。データマップを使用して、可視スペクトルの”純緑”部分だけの自己蛍光の粒子に関する値を計算してもよい。
実施例によっては、トリガパラメータが、染色液を添加することなく、一定の値を超えた場合には、陽性の結果を推定できるかも知れない。例えば、自己蛍光値が染色液を添加したことを示唆する値の２倍を超える場合には、陽性の結果を推定できるかも知れない。そのような場合には、染色液の添加なしで済ましてもよく、そして確認検査をサンプルに関して行なってもよい。
トリガパラメータの値が、直接確認検査に進むことを示唆する値より低いが、染色液添加を行なうとして設定した値を超える場合には、検体検出装置へ染色液を導入してもよい。
流体のサンプル収集には、固体、液体、又は気体からのサンプル採集を含んでもよい。実施例によっては、サンプルを、エアロゾル形状で対象環境から採取した空気から抽出して、その後、エアロゾルをヒドロゾルに変化させてもよい。例えば、５００Ｌの空気サンプルから粒子を収集し、約０．５ｍＬの液体に沈殿させてもよい。米国特許第６，２１７，６３６、発明者マックファーランド（McFarland）、発明の名称「トランスピレイテド・ウォール・エアロゾル・コレクション・システム・アンド・メソッド（TRANSPIRATED WALL AEROSOL COLLECTION SYSTEM AND METHOD）」は、完全にここに示すかのごとく引用によりここに組み込まれているが、孔壁を使用して気体流から粒子状物質を液体中に収集するシステムについて記載している。
以下の実施例では、本発明についてより詳細に記載し、説明するが、本発明を限定するものではない。
実施例
実施例１
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の測定及び定量化のためのマイクロチップをベースとするアッセイ
フローセル分析チャンバの設計及び開発
シングル・シリコン又はプラスチック製マイクロチップ上の個別に指定可能なマイクロウェルから成るチップベースのセンサーアレイが開発されている。マイクロウェルは、プラスチック成形法で制作し、最適化し、そうして得られた構造に異方性エッチングを施して、小型の反応容器及び分析チャンバとして機能させるものであった。各マイクロウェルの容量は約３０ナノリットル（ｎＬ）；１マイクロリットル（μＬ）の流体で多数のアッセイを実施するのに十分なサンプルが得られる。マイクロウェルは、ピラミッド型の窪み形状をしており、開口部を有することで、分析チャンバを経由して流体を流すことを可能にすると共に、マイクロウェル底部で、又はマイクロウェル内に置かれたマイクロビーズ又は膜フィルタで発生する反応の光学的分析を可能にしている。現在のチップには、１つの極小サイズのチップ上にマイクロウェルを１００個まで含む（図７及び８）。
実施例１
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の測定及び定量化のためのマイクロチップをベースとするアッセイ
フローセル分析チャンバの設計及び開発
シングル・シリコン又はプラスチック製マイクロチップ上の個別に指定可能なマイクロウェルから成るチップベースのセンサーアレイが開発されている。マイクロウェルは、プラスチック成形法で制作し、最適化し、そうして得られた構造に異方性エッチングを施して、小型の反応容器及び分析チャンバとして機能させるものであった。各マイクロウェルの容量は約３０ナノリットル（ｎＬ）；１マイクロリットル（μＬ）の流体で多数のアッセイを実施するのに十分なサンプルが得られる。マイクロウェルは、ピラミッド型の窪み形状をしており、開口部を有することで、分析チャンバを経由して流体を流すことを可能にすると共に、マイクロウェル底部で、又はマイクロウェル内に置かれたマイクロビーズ又は膜フィルタで発生する反応の光学的分析を可能にしている。現在のチップには、１つの極小サイズのチップ上にマイクロウェルを１００個まで含む（図７及び８）。
マイクロチップは微小流体フローセル内に固定されている。フローセルの修正版は、平坦なプラットフォームを備えるスリーピース型のステンレス鋼製ケーシングに内包され、永久的に円形の垂直支持部に取付けられ、該垂直支持部は入れ替わり交換可能な（ネジ式の）キャップに連結されている（図９）。金属製のケーシング内には、円形のポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）製の上及び下挿入部を備えている。これらの挿入部により、流体が、一体化したステンレス鋼製の管（マイクログループ社（Ｍｉｃｒｏｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．）、メドウェー、マサチューセッツ州）を通り、流体供給システム経由して流体のフローセルへ導入（左上の入口）及び排出（右上及び下の出口）される（図９）。 排出管を備える他に、ＰＭＭＡ製下挿入部には、リンパ球捕捉膜（例として、３．０ｍ微小孔フィルタ（製品名：ニュクリポア（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ（Ｒ））、ワットマン社（Ｗｈａｔｍａｎ ｐｌｃ．）、クリフトン、ニュージャージー州）の支持体としての機能するプラスチック製のスクリーン・ディスクも備えている。膜と上挿入部間のガスケットにより漏れを防ぎ、確実にサンプル全てをフローセルに供給して膜で濾過できるようになっている。頂部出口は、横方向の流体流れと連絡して使用し、必要に応じて、気泡を除去する。
流体供給システム
初期の研究では、蠕動ポンプを使いサンプル及び洗浄緩衝液の両方をフローセルに供給していた。その後の設計では、部分的に自動化された流体供給システムが使用された。同バージョンでは、ＯＥＭ製造された２つのプラスチック製ポンプを備えたプラットフォームを使用しており、各ポンプ（其々ｖ１及びｖ２）は、０．０３１”シリコーン管を用い流量毎分０．０４６〜０．９２ｍＬでフローセルに供給可能なピンチバルブと連結している。統合ソフトで、ポンプとバルブの適切な組み合わせを用い、着色済み血液サンプルの供給及び洗浄サイクルを指示する。捕捉膜で濾過したサンプル及び洗浄流体は、赤血球を含んでおり、排液溜めに集められる。第３バルブ（ｖ３）はフローセルの頂部出口の後に配置されｐ２と共に使用して、アッセイ中に形成された気泡を除去する。
初期の研究では、蠕動ポンプを使いサンプル及び洗浄緩衝液の両方をフローセルに供給していた。その後の設計では、部分的に自動化された流体供給システムが使用された。同バージョンでは、ＯＥＭ製造された２つのプラスチック製ポンプを備えたプラットフォームを使用しており、各ポンプ（其々ｖ１及びｖ２）は、０．０３１”シリコーン管を用い流量毎分０．０４６〜０．９２ｍＬでフローセルに供給可能なピンチバルブと連結している。統合ソフトで、ポンプとバルブの適切な組み合わせを用い、着色済み血液サンプルの供給及び洗浄サイクルを指示する。捕捉膜で濾過したサンプル及び洗浄流体は、赤血球を含んでおり、排液溜めに集められる。第３バルブ（ｖ３）はフローセルの頂部出口の後に配置されｐ２と共に使用して、アッセイ中に形成された気泡を除去する。
フローセルのマイクロ流体工学を最適に機能させ、リンパ球の保持及び赤血球の除去を行なうのに、その後の研究では、３．０ミクロンの捕捉膜が使用された。図１０に示すように、これらの膜で保有するリンパ球を失うことなく赤血球を効果的に濾過した。
光学ステーション及び画像取り込み及び分析
分析フローセルを、４Ｘ対物レンズ及び光源として高圧水銀ランプを備えるオリンパス社（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製ＢＸ２顕微鏡のステージ上に置いた。アッセイの全期間中、膜上の一定面に焦点を維持した。ＡｌｅＸａ６４７で染色された（赤色）リンパ球の可視化をＣｙ５ＴＭフィルタキューブ（６２０ｎｍ励起、６６０ロングパス・ビームスプリッタ・ダイクロイックミラー、７００ｎｍ蛍光、オリンパス社製）を使用して行ない、一方ＡｌｅＸａ４８８で染色された（緑色）リンパ球の可視化をフルオチオシアネート（ＦＩＴＣ）フィルタキューブ（４８０ｎｍ励起、５０５ロングパス・ビームスプリッタ・ダイクロイックミラー、５３５±２５ｎｍ蛍光、オリンパス社製）を使用して行なった。電動ステージにより膜の異なる領域で多数の画像を撮影した。
分析フローセルを、４Ｘ対物レンズ及び光源として高圧水銀ランプを備えるオリンパス社（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製ＢＸ２顕微鏡のステージ上に置いた。アッセイの全期間中、膜上の一定面に焦点を維持した。ＡｌｅＸａ６４７で染色された（赤色）リンパ球の可視化をＣｙ５ＴＭフィルタキューブ（６２０ｎｍ励起、６６０ロングパス・ビームスプリッタ・ダイクロイックミラー、７００ｎｍ蛍光、オリンパス社製）を使用して行ない、一方ＡｌｅＸａ４８８で染色された（緑色）リンパ球の可視化をフルオチオシアネート（ＦＩＴＣ）フィルタキューブ（４８０ｎｍ励起、５０５ロングパス・ビームスプリッタ・ダイクロイックミラー、５３５±２５ｎｍ蛍光、オリンパス社製）を使用して行なった。電動ステージにより膜の異なる領域で多数の画像を撮影した。
各研究対象に関して、フローセルのリンパ球捕捉膜の全部で５つの非重複領域を、顕微鏡に搭載した１２ビット・デジタルビデオカメラ（ＤＶＣ）１３１２Ｃ（ＤＶＣ社（ＤＶＣ Ｃｏｍｐａｎｙ）、オースチン、テキサス州）電荷結合素子（ＣＣＤ）で撮像した。各領域を２度撮像し、内ＡｌｅＸａ４８８による蛍光検出用Ｃｙ５ＴＭフィルタキューブを1度、ＡｌｅＸａ６４７による蛍光検出用ＦＩＴＣフィルタキューブを1度使用した。用量反応実験を除き、分析に先立ち、これら２つの画像を合成して単独のデジタル画像を作成した。
画像を、市販の画像処理ソフトウェアパッケージ（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ、メディアサイバネティクス社（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．））で開発したカスタムアルゴリズムを使い分析した。このアルゴリズムでは、赤、緑、青色の強度に関する閾値を設定し、バックグランド蛍光に対するリンパ球の最適な定義付け；リンパ球を外形（サイズ及び形状）によっても特徴付した。バックグランドの補正を行い、自己蛍光を除去し、陽性と推定される細胞として識別されたオブジェクトを標準的な画像処理プロトコルにより強調して鋭い縁部をぼかした。このようにして識別した細胞を、その後自動化した方法でカウントし、その結果を表計算ソフト（エクセル、マイクロソフト社（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、レッドモンド、ワシントン州）で、ＣＤ４＋ＣＤ３−、ＣＤ４＋ＣＤ３＋、ＣＤ８＋ＣＤ３−、ＣＤ８＋ＣＤ３＋、及びＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞など、使用した抗体の組み合わせごとに、その数として記録した。
ＣＤ４陽性リンパ球検出
上述したように、３．０μｍの多孔質フィルタを有するマイクロチップシステムを最適なリンパ球捕捉に適応させて、マイクロチップＣＤ４陽性カウントに関する基準を設定した。これらの研究は、健康な被験者から採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使い実施された。これらの実験用に、軟膜（全血中のリンパ球画分）を採取し、ＰＢＭＣをフィコール密度勾配遠心法により分離した。Ｔリンパ球サブセットを、免疫磁気分離装置（ミルテーニバイオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．）、オーバーン、カリフォルニア州）赤血球ロゼット形成（ステムセルテクノロジ社（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．））によりＰＢＭＣから＞９８％純度で採取した。サブセットを、保存濃度１０６細胞／ｍＬでＲＰＭＩ液中に再懸濁し、作製後２４時間以内に使用した。また、細胞を１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のＲＰＭＩ液中で凍結保存し、使用直前に解凍した。全ての場合、細胞をカウントし、使用直前に生死を評価した。
上述したように、３．０μｍの多孔質フィルタを有するマイクロチップシステムを最適なリンパ球捕捉に適応させて、マイクロチップＣＤ４陽性カウントに関する基準を設定した。これらの研究は、健康な被験者から採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使い実施された。これらの実験用に、軟膜（全血中のリンパ球画分）を採取し、ＰＢＭＣをフィコール密度勾配遠心法により分離した。Ｔリンパ球サブセットを、免疫磁気分離装置（ミルテーニバイオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．）、オーバーン、カリフォルニア州）赤血球ロゼット形成（ステムセルテクノロジ社（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．））によりＰＢＭＣから＞９８％純度で採取した。サブセットを、保存濃度１０６細胞／ｍＬでＲＰＭＩ液中に再懸濁し、作製後２４時間以内に使用した。また、細胞を１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のＲＰＭＩ液中で凍結保存し、使用直前に解凍した。全ての場合、細胞をカウントし、使用直前に生死を評価した。
精製したＣＤ４細胞を、ＡｌｅＸａ４８８とコンジュゲートした抗ＣＤ４抗体で（モレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）、ユージーン、オレゴン州）、室温で５分間標識化した後、毎分０．３ｍＬの制御した速さで、フローチャンバに、様々な希釈（０〜２００，０００ＣＤ４陽性細胞／ｍＬの範囲）で導入した。サンプルを手で、又はＵｎｉｃｏｒｎバージョン３．０ソフトウェア（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社）で駆動する高速／圧力液体クロマトグラフィ（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）を使用して自動処理して、フローチャンバに注入した。
サンプル導入後、チャンバを２〜５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、毎分１．２ｍｏｌで導入した。この容量は１０，０００デッドボリュームであり、血小板及び赤血球などの血液の不要な構成要素を除去し、バックグランド信号も大幅に減少させるものである。その後蛍光顕微鏡検査でチャンバを撮像した。図１０Ａは、ＣＤ４細胞数を０〜２００，０００細胞／ｍＬまで（これは症状の進行したＡＩＤＳ患者に見られる生理学的範囲に相当する）増加させて得た原画像を示している。図１０Ｂは、サンプル中の細胞数とピクセル分析でデジタル画像から測定した時の光度との線形相関（Ｒ２＝０．９９９）を示す。これにより、マイクロチャンバ及びデジタル画像分析システムを使い、蛍光マーカーで標識化したリンパ球の個体数を正確に測定及び検出できることが証明された。
実施例２
全血からのＣＤ４：ＣＤ8比及びＣＤ４陽性割合の測定
実施例１で説明したマイクロチップに基づいて、ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性細胞の検出、及びＣＤ４：ＣＤ８比の判定を短時間で行なう全血アッセイ（赤血球溶解、緩衝液追加、又はサンプルの追加処理を行わない）が開発された。フローパラメータ及びサンプルの希釈を調整して、最適な流速である毎分０．８ｍＬ及び１：２０の全血希釈を示した。
全血からのＣＤ４：ＣＤ8比及びＣＤ４陽性割合の測定
実施例１で説明したマイクロチップに基づいて、ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性細胞の検出、及びＣＤ４：ＣＤ８比の判定を短時間で行なう全血アッセイ（赤血球溶解、緩衝液追加、又はサンプルの追加処理を行わない）が開発された。フローパラメータ及びサンプルの希釈を調整して、最適な流速である毎分０．８ｍＬ及び１：２０の全血希釈を示した。
マサチューセッツ総合病院及びボツワナ共和国ハバローネのボツワナ・ハーバード研究所において健康な被験者又はＨＩＶ感染被験者から静脈穿刺により採血を行なった。ＣＤ４：ＣＤ8比及びＣＤ４陽性割合の測定に関して、３３マイクロリットルの全血を３マイクロリットルの染色用のフルオロフォアとコンジュゲートしたＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８に対する抗体と混合した。最適な染色プロトコルを、試験管内反応及び結果をスライド上で観察することにより、本研究で使用した抗体其々に対して設定した。抗体を使用前に微小遠心管にかけ（室温で、３，０００Ｘｇで２分間）、上清反応物を染色に使用した。このプロセスにより、膜によって捕捉され、そのため撮像を妨害する可能性がある蛍光粒子状物質を確実に除去した。染色された血液サンプルをＰＢＳで５００μＬまで懸濁し、直接フローセルに導入し、続いて２ｍＬのＰＢＳで洗浄した。その後、膜上で捕捉された標識化された細胞の画像を、先に述べたように、取得し分析した。サンプルのサブセットでは、フィルタに保持されなかった細胞を排液溜めに集め、カウントして、捕捉効率を判定した。いくつかの実験に関しては、画像を取得後、固定液（２％パラホルムアルデヒド／２．５％グルタルアルデヒド）をフローセルに導入し、次にＰＢＳで濯いだ。フィルタをフローセルから取り除き、酸化オスミウム（ＯＳＯ４）蒸気で９０秒固定し、その後エタノール（ＥｔＯＨ）／ヘキアサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）で脱水し、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）にかけた。
採血から画像取得、分析、結果までの総合所要時間は１５分を下回った。フルオロフォアに関する初期の研究では、光安定性及びｐＨがこのシステムにおいて蛍光信号の重要な決定要因であることが示唆された。そのため、様々なフルオロフォア抗体の組み合わせをパイロット・スタディで評価したが、全てのそれ以降の研究に関しては、ＡｌｅＸａクラス（種類）のフルオロフォアのみ使用した。ＣＤ抗原に対してＡｌｅＸａ４８８及びＡｌｅＸａ６４７とコンジュゲートした抗体のみ使用可能であったので、このシステムでは２色撮像に制限された。図１１では、全血アッセイを使用してＨＩＶ感染被験者から収集した一連の代表的な原画像を示す。図１１Aでは、ＡｌｅＸａ４８８とコンジュゲートした抗体が、フローサイトメトリによって判定されたＣＤ４数が９６１細胞／ｍLのＨＩＶ感染サブジェクトである、サブジェクトＢ３８において、ＣＤ４陽性細胞を緑色に標識化している。第２発光フィルタを使用してマイクロチップの同じ領域に焦点を当てるため、全てのTリンパ球がＡｌｅＸａ６４７とコンジュゲートしたＣＤ３に対する抗体で赤色に着色される（図１１B）。自動的に画像を合成することで、このシステムは、黄色で表示される、対象のＣＤ３陽性ＣＤ４陽性Ｔリンパ球を、ＣＤ４陽性ＣＤ３陰性単球（緑色）及びＣＤ３陽性ＣＤ４陰性Ｔリンパ球（赤色）と識別できる（図１１Ｃ）。不要な細胞を自動的にマスキングすることで、図１１Ｄ示すように、カウント対象であるＣＤ４陽性ＣＤ３陽性細胞のみを残すことができる。
システムの画像処理ソフトウェア環境内で開発したカスタムアルゴリズムを使用して、各サブタイプのリンパ球の総数を原画像から自動的に算出してデータファイルに送信した。
このアルゴリズムでは、赤、緑、青色の強度に関する閾値を、バックグランド蛍光に対するリンパ球の最適定義のために設定した；リンパ球の外形（サイズ及び形状）による特徴付けも行なわれた。バックグランドの補正を行い、自己蛍光を除去し、陽性と推定される細胞として識別されたオブジェクトを標準的な画像処理プロトコルにより強化して鋭い縁部をぼかした。このようにして識別した細胞を、その後自動化した方法でカウントし、その結果を表計算ソフト（エクセル、マイクロソフト社（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、レッドモンド、ワシントン州）で、ＣＤ４＋ＣＤ３−、ＣＤ４＋ＣＤ３＋、ＣＤ８＋ＣＤ３−、ＣＤ８＋ＣＤ３＋、及びＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞など、使用した抗体の組み合わせごとに、その数として記録した。
各研究サブジェクトに関して、５つの非重複画像を取得し使用して、細胞数のカウント、サンプル細胞個体数量の増大、及び精度の向上を図った。
フローサイトメトリとの相関関係
図１２に示すように、マイクロチップシステムから得られたＴリンパ球総数（ＣＤ４陽性ＣＤ３陽性細胞数／ＣＤ３陽性細胞総数）に対するＣＤ４細胞の割合及びＣＤ４：ＣＤ８比（ＣＤ４細胞の百分率／ＣＤ８細胞の百分率）の結果を、フローサイトメトリにより並行して得た結果とを、各研究サブジェクトに関して、比較した。
図１２に示すように、マイクロチップシステムから得られたＴリンパ球総数（ＣＤ４陽性ＣＤ３陽性細胞数／ＣＤ３陽性細胞総数）に対するＣＤ４細胞の割合及びＣＤ４：ＣＤ８比（ＣＤ４細胞の百分率／ＣＤ８細胞の百分率）の結果を、フローサイトメトリにより並行して得た結果とを、各研究サブジェクトに関して、比較した。
２方法間で、ＨＩＶ感染で見られる、ＣＤ４細胞絶対数の範囲、ＣＤ４細胞の全Ｔリンパ球数に対する割合、及びＣＤ４／ＣＤ８比全てに極めて一致した。ＣＤ４絶対数に関しては、Ｐａｓｓｉｎｇ‐Ｂａｂｌｏｋ２３法により方法を比較して、フローサイトメトリとの優れた相関関係が（図１２Ａ）、Ｂｌａｎｄ-Ａｌｔｍａｎプロット２４ではゼロバイアス及び９５％と良好な一致限界が（図１２Ｂ）が其々示された。計算されたピアソン相関関係はｒ＝０．９２であった。同様な結果が、ＣＤ４細胞の全ＣＤ３陽性Ｔリンパ球の百分率として報告されたＣＤ４数（図１２Ｃ‐Ｄ）とＣＤ４／ＣＤ８比（図１２Ｅ-Ｆ）の両方から得られた。一致限界はＣＤ４細胞百分率及びＣＤ４：ＣＤ８比の評価に関してが、ＣＤ４絶対数に関してより密集していた。これは多分、プロトタイプにおける予想されるサンプル供給容量の変動を反映したもので、絶対計数には影響するが比率には影響しない。それに加え、マイクロチップ・アッセイではなく、フローサイトメトリに関してサンプルによっては処理にかなり遅延があったため、マイクロチップの結果の中には実際にフローサイトメトリの結果より”真”の値に近いものもあるかも知れない。１５サブジェクトのサブセットと２００細胞／ｍＬを下回るＣＤ４絶対数との相関関係において、２方法間でほぼ一致が見られる。
実施例３
マイクロビーズ免疫測定
アガロース・マイクロビーズを、ＨＩＶｇｐ４１／ｇｐ１２０、ＨＩＶｐ２４、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原などの様々な病原体に特異的な抗原で被覆した。特定の抗原に対する抗体で被覆したビーズをシリコンマイクロチップのウェルに入れ、その後、既知の抗体力価を有する血清サンプルをマイクロチップシステムに流し、Ｃｙ２標識した二次抗体を使い蛍光顕微鏡で検出した。図１３では、１つのそうした実験結果；マイクロチップによる方法を使用して容易に検出したＨＩＶ及びＢ型肝炎に対する抗体を有する血清を示している。
マイクロビーズ免疫測定
アガロース・マイクロビーズを、ＨＩＶｇｐ４１／ｇｐ１２０、ＨＩＶｐ２４、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原などの様々な病原体に特異的な抗原で被覆した。特定の抗原に対する抗体で被覆したビーズをシリコンマイクロチップのウェルに入れ、その後、既知の抗体力価を有する血清サンプルをマイクロチップシステムに流し、Ｃｙ２標識した二次抗体を使い蛍光顕微鏡で検出した。図１３では、１つのそうした実験結果；マイクロチップによる方法を使用して容易に検出したＨＩＶ及びＢ型肝炎に対する抗体を有する血清を示している。
図１５では、１００ｐｇ／ｍＬのＨＩＶｐ２４抗原を含むヒト血清においてＨＩＶｐ２４抗原を検出した別のマイクロビーズ実験の結果を示している。同じ原則が、肝酵素など、全ての免疫測定にも適用可能である。
実施例４
フィンガースティックで採血したサンプルの全血からのＨＩＶ-ＲＮＡ測定及び定量化
ＡＩＤＳの臨床的進展を抑制する抗レトロウイルス薬の効き目を示す１つの方法として、治療前後のウイルス量をモニタリングすることが挙げられる。ウイルス量測定は、医師が抗レトロウイルス治療を開始すべき時期を決定するのに、役立つことが多い。例えば、ＣＤ４数が境界線（３５０細胞／ｍｍ３）上にある場合、高ウイルス量が抗レトロウイルス治療での治療開始の根拠となり、低ウイルス量が様子見の根拠となるだろう。その他、ウイルス量測定は医師が適切な治療コースを設計するときの指針となる。
フィンガースティックで採血したサンプルの全血からのＨＩＶ-ＲＮＡ測定及び定量化
ＡＩＤＳの臨床的進展を抑制する抗レトロウイルス薬の効き目を示す１つの方法として、治療前後のウイルス量をモニタリングすることが挙げられる。ウイルス量測定は、医師が抗レトロウイルス治療を開始すべき時期を決定するのに、役立つことが多い。例えば、ＣＤ４数が境界線（３５０細胞／ｍｍ３）上にある場合、高ウイルス量が抗レトロウイルス治療での治療開始の根拠となり、低ウイルス量が様子見の根拠となるだろう。その他、ウイルス量測定は医師が適切な治療コースを設計するときの指針となる。
現在、ＨＩＶウイルス量は一般的には、サーモサイクラーを使用したウイルスの配列増幅を伴うＰＣＲをベースとする方法の後、いくつかのリアルタイム蛍光検出方法の１つを用いて検出を行い、定量される。しかし、このアッセイには安定した電力及び追加処理を行なう高度な技術を有する検査技師が必要である。こうした必要条件により、資源の乏しい環境でのその使用が大幅に制限されてしまう。そうした資源の乏しい環境では、入手可能な価格のＨＩＶ臨床検査のニーズは極めて大きい。ここに提示するアッセイは、簡素、安価で、電力に依存しないマイクロチップを含むＨＩＶ-ＲＮＡ用アッセイの成果について説明するものである。
定量パラメータ
これらのアッセイ用に、マイクロチップベースのセンサー・アッセイ；ビオチン化分子指標ＤＮＡ捕捉プローブと結合させた個別に指定可能なアガロースビーズから成る、を作成した。プローブを選択的に、シリコン・マイクロチップ・ウエハ上に局限してマイクロマシニングした空洞部に配設した。標的ＤＮＡ及びＲＮＡを含むサンプルは、これらマイクロチェンバを通過し、捕捉配列と結合して、蛍光信号を放つ。マイクロチップベースのＨＩＶ-ＲＮＡエッセイの概念を検証するために、ＨＩＶ-特定分子標識（クレードＢ型ｇａｇ、ｔｇｃａｇａａｔｇｇｇａｔａｇａｔｔｇ）をマイクロビーズに付着させ、相補的ＨＩＶ-ＲＮＡ配列を含有するサンプルを、フェムトモルからナノモルまでの濃度範囲でマイクロチップに導入した。マイクロチップに付着する捕捉配列を有するサンプルにおいてＨＩＶ−ＲＮＡをアニーリングして、分子ビーコンを広げ、その結果明るく蛍光させる。図１５Ａに示すように、基準となる信号（ＨＩＶ‐ＲＮＡ含有なし）では分子ビーコンの距離増大には繋がらず、そのため最小限の蛍光信号のみ示すことになる。対照的に、図１５Ｂに示すように、１００ｐＭのＨＩＶ‐ＲＮＡを含むサンプルを添加するとその結果明るい蛍光画像が得られる。
これらのアッセイ用に、マイクロチップベースのセンサー・アッセイ；ビオチン化分子指標ＤＮＡ捕捉プローブと結合させた個別に指定可能なアガロースビーズから成る、を作成した。プローブを選択的に、シリコン・マイクロチップ・ウエハ上に局限してマイクロマシニングした空洞部に配設した。標的ＤＮＡ及びＲＮＡを含むサンプルは、これらマイクロチェンバを通過し、捕捉配列と結合して、蛍光信号を放つ。マイクロチップベースのＨＩＶ-ＲＮＡエッセイの概念を検証するために、ＨＩＶ-特定分子標識（クレードＢ型ｇａｇ、ｔｇｃａｇａａｔｇｇｇａｔａｇａｔｔｇ）をマイクロビーズに付着させ、相補的ＨＩＶ-ＲＮＡ配列を含有するサンプルを、フェムトモルからナノモルまでの濃度範囲でマイクロチップに導入した。マイクロチップに付着する捕捉配列を有するサンプルにおいてＨＩＶ−ＲＮＡをアニーリングして、分子ビーコンを広げ、その結果明るく蛍光させる。図１５Ａに示すように、基準となる信号（ＨＩＶ‐ＲＮＡ含有なし）では分子ビーコンの距離増大には繋がらず、そのため最小限の蛍光信号のみ示すことになる。対照的に、図１５Ｂに示すように、１００ｐＭのＨＩＶ‐ＲＮＡを含むサンプルを添加するとその結果明るい蛍光画像が得られる。
ＨＩＶ-ＲＮＡアッセイの特異性を設定するのに、ビーズを１つのヌクレオチドによって其々が異なる１８種類の塩基対ＤＮＡオリゴマーで被覆し、各対象プローブに関する捕捉配列を明確に識別できる蛍光色素で標識化し、溶液中で１：１：１の比率で混合して実験を行なった。その後チップをこの等モル溶液に対して検査し、蛍光顕微鏡で結合が検出された。図１６に示すように、蛍光色素で標識化された配列はそれらの相補的な対象プローブのみに結合し、1つのヌクレオチド違いにより不一致になった対象プローブには結合していない。
上記のマイクロチップベースのアッセイ用に、標的ＲＮＡの分子ビーコンへの最適結合、及び検出の閾値を設定した。他の方法とは異なり、このアッセイでは、１）ＡＩＤＳ患者からのＤＮＡの直接分離、それに続く２）サーモサイクラーを使用した配列増幅（例えば、分析用ＲＮＡ生成のためのインビトロ転写）を必要としない。
実施例５
フィンガースティックで採血したサンプルの全血からの肝酵素測定及び定量化のためのマイクロチップベースのアッセイ
２つの肝酵素である、アラニン・トランスアミン（ＡＬＴ）及びアスパルタミド・トランスアミン（ＡＳＴ）が軽度から中程度の評価であれば、肝不全に関係しており、肝不全は依然としてＡＩＤＳ感染者の最も多い死亡原因である。肝障害は現行のＨＩＶ治療効果の主な限定要因であり、それだけにＡＩＤＳ患者におけるＡＬＴ及びＡＳＴのモニタリングが重要視されている。
フィンガースティックで採血したサンプルの全血からの肝酵素測定及び定量化のためのマイクロチップベースのアッセイ
２つの肝酵素である、アラニン・トランスアミン（ＡＬＴ）及びアスパルタミド・トランスアミン（ＡＳＴ）が軽度から中程度の評価であれば、肝不全に関係しており、肝不全は依然としてＡＩＤＳ感染者の最も多い死亡原因である。肝障害は現行のＨＩＶ治療効果の主な限定要因であり、それだけにＡＩＤＳ患者におけるＡＬＴ及びＡＳＴのモニタリングが重要視されている。
ＡＬＴ及びＡＳＴのモニタリングに使用する現在の血清学的分析法は、コストが高く、安定した電力や高度に訓練された作業要員を必要とするため、資源の乏しい環境での使用に適していない。ここで示した成果により、安価で、電力に依存しない、ＡＬＴ及びＡＳＴレベルを計測するマイクロチップベースのエッセイについて記述することで、上記の制約を解決できる。
定量パラメータ
肝酵素のアッセイ用に、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）に特異的な抗体を獲得して、マイクロビーズに結合させることができる。既知の量のＡＬＴ及びＡＳＴを含有するサンプルをチップに導入し、マイクロチップ・アッセイの感度及び検出閾値を評価することができる。サンプルを導入後、チャンバを洗浄し、蛍光顕微鏡下で撮像する。蛍光検出のために、フルオロフォアで標識化した第２サンドイッチ抗体を導入する。その後、全体の蛍光強度を標準のＡＬＴ濃度及びＡＳＴ濃度と相関させ、基本的な性能特性（リニアレンジ、検出閾値、再現性、有効性）を評価することができる。
肝酵素のアッセイ用に、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）に特異的な抗体を獲得して、マイクロビーズに結合させることができる。既知の量のＡＬＴ及びＡＳＴを含有するサンプルをチップに導入し、マイクロチップ・アッセイの感度及び検出閾値を評価することができる。サンプルを導入後、チャンバを洗浄し、蛍光顕微鏡下で撮像する。蛍光検出のために、フルオロフォアで標識化した第２サンドイッチ抗体を導入する。その後、全体の蛍光強度を標準のＡＬＴ濃度及びＡＳＴ濃度と相関させ、基本的な性能特性（リニアレンジ、検出閾値、再現性、有効性）を評価することができる。
本発明の詳細な実施例について以上のように説明したが、付記されたクレームによって定義された本発明は、上記説明において記載した特定の説明に限定されるものではなく、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、できる限り多くの明白な変形例が可能であるものと、理解される。
以下の詳細な説明は、一例として示すものであって、記載する特定の実施例に本発明を限定することを意図するものではなく、添付図面と併せて理解されてもよく、該図面は参照することによりここに組み込まれる。
膜ベースのフローセンサの拡大図である。
ハウジング内に配置された膜ベースのフローセンサの実施例を示す。
流入モードにおける検体検出システムの概略図である。
側方向流動モードにおける検体検出システムの概略図である。
逆流モードにおける検体検出システムの概略図である。
サンプル収集方法のフローチャートである。
郵便切手より僅かに小さい１００マイクロウェルのマイクロチップを示す。
マイクロチップ・プラットフォームの概略横断面図である。サンプルはマイクロチップの一端部で注入され反応ウェルを介して均一に広がる。該反応ウェルは３０ｎＬ容量を有する。サンプル排出により２ｍＬの洗浄緩衝液だけを使い１０，０００デッドボリューム以内まで洗浄が可能である。少なくとも２タイプのマイクロチップを使用でき、内１つにはリンパ球（すなわちＣＤ４細胞カウント用）を採取するためのマイクロウェル底部にポリカーボネート膜を含み、他方には各マイクロウェル（ＨＩＶ‐ＲＮＡ又は肝酵素測定用）に誘導体化したアガロース・マイクロビーズを含む。
フローセル及び光イメージングシステムの試験的設計を示す。サンプルはコンピュータにより制御される輸液ミニポンプによりフローセルに導入される（図９Ａ）。細胞又は検体はマイクロウェル内に保持される（図９Ｂ）、一方、保持されないサンプルはマイクロウェルを通り、排液溜めに流入する（図９Ｃ）。光源（例えば、圧力水銀ランプ）は光を、適切な波長又は波長帯域で、ダイクロイックミラーを用いてフローセルのマイクロウェルで捕捉した検体に適切な焦点面で集光する。励起光が捕捉された検体及びその蛍光発光検出コンジュゲートに当たり、ＣＣＤデジタルカメラにより捉えられると、反応による蛍光発光が起きる。その後画像を分析用に保存することができる（図９Ｄ、Ｅ）。
ＣＤ４リンパ球の用量反応を示す。精製したＣＤ４細胞をＡｌｅＸａ４８８とコンジュゲートした抗ＣＤ４抗体で標識化し、０〜２００，０００細胞の範囲の量でフローセルに導入し、撮像した（図１０Ａ）。サンプルにおけるＣＤ４細胞の濃度とこれらのメンブレンフィルタで捕捉した標識化されたリンパ球が発した光度との間に線形相関関係がある（Ｒ２＝０．９９９）（図１０Ｂ）。
ＣＤ４カウントに関する生データ画像および画像処理である。フローサイトメトリでＣＤ４絶対数が９６１細胞／μＬを有するＨＩＶ感染被験者から単一の希釈全血検体からデジタル画像を得た。ＡｌｅＸａ４８８とコンジュゲートとした抗ＣＤ４抗体でＣＤ４陽性細胞（Ｔリンパ球及び単球）を緑色に染色する（図１１Ａ）。ＡｌｅＸａ６４７とコンジュゲートした抗ＣＤ３抗体でＣＤ３陽性Ｔリンパ球を赤色に染色する（図１１Ｂ）。デジタル処理でこの２画像を合成することにより、ＣＤ３陽性ＣＤ４陽性Ｔリンパ球（すなわち”ＣＤ４細胞”）が黄色／橙色に表示され、ＣＤ４陽性ＣＤ３単球（緑色）及びＣＤ３陽性ＣＤ４陰性Ｔリンパ球（赤色）と識別される（図１１Ｄ）。リンパ球選択アルゴリズムを、合成された画像にサイズ、形状、均一性により定義されたリンパ球プロファイル及びＣＤ４陽性及びＣＤ３陽性染色に基づき、適用した。ＣＤ４陽性ＣＤ３陽性リンパ球プロファイルに適合しないオブジェクトは削除され、残りのオブジェクトが選択され、デジタル処理で強調されて計数される（図１１Ｅ）。ＣＤ８細胞数カウントと同様なプロトコルが各サブジェクトに対して利用される（図１１Ｆ）。
本発明のマイクロチップベースのシステムとフローサイトメトリとの相関研究を示す。フローサイトメトリと新たなマイクロチップ方法とは、ＨＩＶ感染におけるＣＤ４絶対数の範囲、Ｔリンパ球総数に占めるＣＤ４の割合、ＣＤ４／ＣＤ８比に渡って、極めて一致している。ＣＤ４絶対数に関しては、Ｐａｓｓｉｎｇ-Ｂａｂｌｏｋ法に従い行なった方法比較ではフローサイトメトリとの優れた相関を示し（図１２Ａ）、Ｂｌａｎｄ−Ａｌｔｍａｎプロット２４ではゼロバイアス（バイアス０）及び良好な９５％の一致限界を示した（図１２Ｂ）。ピアソン相関係数の計算結果はｒ＝０．９２である。ＣＤ３陽性Ｔリンパ球全体に占める割合として報告されたＣＤ４数（図１２Ｃ-Ｄ）とＣＤ４：ＣＤ８比（図１２Ｅ-Ｆ）両方に関して類似した結果が得られた。
マイクロビーズ実験の結果を示す。抗ＨＢｓＡｇ及び抗ｇｐ４１／１２０抗体（1：２００で）を有するヒト血清を、抗原をコーティングしたマイクロビーズで培養し、蛍光用ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（１：２００で）を使い検出した。
ＨＩＶｐ２４抗原マイクロビーズ・アッセイの結果を示す。ＨＩＶｐ２４に対する抗体を被覆したビーズをシリコンマイクロチップの４マイクロウェルに入れ、ＨＩＶｐ２４抗原１００ｐｇ／ｍＬを含むヒト血清と反応させた。その後Ｃｙ２標識した抗ｐ２４二次抗体を加え、蛍光顕微鏡で検出した。
ＨＩＶ‐ＲＮＡアッセイを示す。ＨＩＶ特異的な分子ビーコン（クレードＢ gag）をマイクロビーズに付着させ、相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）配列を含むサンプルをマイクロチップに導入した。マイクロチップに付着する捕捉配列を有するサンプルにおいてＨＩＶ‐ＲＮＡ配列のアニーリングを行い、分子ビーコンを広げ、その結果明るく蛍光する。図１５Ａは基準となる蛍光信号を示す。図１５Ｂは１００ｐＭの相補的なＨＩＶ‐ＲＮＡ配列を含むサンプル添加後の蛍光信号を示す。
ＤＮＡ塩基対識別実験の結果を示す。ビーズを１つのヌクレオチドで其々が異なる１８種類の塩基対ＤＮＡオリゴマーで被覆する。各対象プローブに関する捕捉配列を明確に識別できる蛍光色素で標識化し、溶液中で１：１：１の比率で混合する。その後チップをこの等モル溶液に対して試験し、蛍光顕微鏡で結合検出する。蛍光色素で標識化された配列はそれらの捕捉対象プローブのみに結合し、１つのヌクレオチドの違いによって不一致になった対象プローブには結合しない。
１１０ 膜
１２０ ガスケット
１３０ 部材支持体
１４０ 上部部材
１５０ 下部部材
１５２ 窪部
１５４ 第２窪部
１６０ 流体入口部
１６２ 経路
１６４、１７４ 管
１７０ 流体出口部
１７２、１８２ 経路
１８０ 洗浄流体出口
２００ ハウジング
２１０ キャップ
２５０ 検出器
ｖ１、ｖ２、ｖ３ バルブ
１２０ ガスケット
１３０ 部材支持体
１４０ 上部部材
１５０ 下部部材
１５２ 窪部
１５４ 第２窪部
１６０ 流体入口部
１６２ 経路
１６４、１７４ 管
１７０ 流体出口部
１７２、１８２ 経路
１８０ 洗浄流体出口
２００ ハウジング
２１０ キャップ
２５０ 検出器
ｖ１、ｖ２、ｖ３ バルブ
Claims (38)
- 血液サンプル中のＨＩＶ関連検体を検出する方法であって、
ａ）蛍光発光コンジュゲートと結合したＨＩＶ関連検体を、１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに通すことであって、前記１つ又は複数の空洞部にはフィルタを備え、それにより前記検体を前記フィルタ上で固定化して前記血液から前記検体を分離し、
ｂ）前記コンジュゲートの励起に適した波長で前記検体に光を当てること、
ｃ）蛍光信号を発したコンジュゲートを、検出器を使いデジタル処理で撮像すること、
を備えたことを特徴とする方法。 - 前記フィルタはポリカーボネート多孔性膜であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記検出器はＣＣＤデジタルカメラであること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記検出器はＣＭＯＳ検出器であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記検体はリンパ球であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記リンパ球はＣＤ４陽性Ｔ細胞であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記リンパ球はＣＤ８陽性Ｔ細胞であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記リンパ球はＣＤ３陽性Ｔ細胞であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記検体は肝酵素であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記肝酵素はアラニンアミノトランスフェラーゼであること、を特徴とする請求項９に記載の方法。
- 前記肝酵素はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであること、を特徴とする請求項９に記載の方法。
- 前記蛍光発光コンジュゲートが抗ＣＤ４抗体を有すること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ４抗体がＡｌｅｘａ４８８とコンジュゲートした抗ＣＤ４抗体であること、を特徴とする請求項１２に記載の方法。
- 前記蛍光発光コンジュゲートは抗ＣＤ８抗体を有すること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記蛍光発光コンジュゲートは抗ＣＤ３抗体を有すること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記蛍光発光コンジュゲートはＡｌｅｘａ６４７とコンジュゲートとした抗ＣＤ３抗体であること、を特徴とする請求項１５に記載の方法。
- 前記血液はフィンガースティックで採血した血液サンプルから採取されること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
- 血液サンプル中のＣＤ４陽性Ｔ細胞対ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を決定する方法であって、
ａ）其々が異なる蛍光発光コンジュゲートと結合したＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔリンパ球を、１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに、通すことであって、１つ又は複数の前記空洞部にはフィルタを備え、それにより前記ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔリンパ球を前記フィルタ上で固定化し、
ｂ）各コンジュゲートの励起に適した波長で前記リンパ球に光を当てること、
ｃ）検出器を使い蛍光信号を発した各コンジュゲートをデジタル処理で撮像すること、及び
ｄ）ＣＤ４陽性細胞対ＣＤ８陽性細胞の前記割合を判定すること、
を備えたことを特徴とする方法。 - 血液サンプル中でＨＩＶ‐ＲＮＡを検出する方法であって、
ａ）ＨＩＶ-ＲＮＡを含む血液サンプルを、１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに通すことであって、前記１つ又は複数の空洞部には蛍光発光化合物と結合した相補的なヌクレオチド配列を有するフィルタを含み、
ｂ）前記フィルタ上の前記ＨＩＶ-ＲＮＡと前記相補的なヌクレオチド配列間で結合複合体を形成することであって、前記結合複合体の形成により蛍光発光化合物より発せられる信号を強化し、
ｃ）前記蛍光発光化合物の励起に適した波長で前記複合体に光を当てること、及び
ｄ）検出器を使い前記複合体が発する蛍光信号をデジタル処理で撮像すること、
を備えたことを特徴とする方法。 - 血液サンプル中のＨＩＶ関連検体を検出する方法であって、
ａ）蛍光発光コンジュゲートと結合したＨＩＶ関連検体を、１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに通すことであって、前記１つ又は複数の空洞部には前記検体に対して結合親和力を有する適切な生物因子を備えるアガロースビーズを含み、それにより前記検体を該ビーズ上で固定化して、前記検体を前記血液から分離し、
ｂ）前記コンジュゲートの励起に適する波長で前記検体に光を当てること、
ｃ）検出器を使い蛍光信号を発したコンジュゲートをデジタル処理で撮像すること、
を備えたことを特徴とする方法。 - 前記検出器はＣＣＤデジタルカメラであること、を特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 前記検出器はＣＭＯＳ検出器であること、を特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 前記検体はリンパ球であること、を特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 前記リンパ球はＣＤ４陽性Ｔ細胞であること、を特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 前記リンパ球はＣＤ８陽性Ｔ細胞であること、を特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 前記リンパ球はＣＤ３陽性Ｔ細胞であること、を特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 前記検体は肝酵素であること、を特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 前記肝酵素はアラニンアミノトランスフェラーゼであること、を特徴とする請求項２７に記載の方法。
- 前記肝酵素はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであること、を特徴とする請求項２７に記載の方法。
- 前記蛍光発光コンジュゲートは抗ＣＤ４抗体を有すること、を特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 前記抗ＣＤ４抗体がＡｌｅｘａ４８８とコンジュゲートした抗ＣＤ４抗体であること、を特徴とする請求項３０に記載の方法。
- 前記蛍光発光コンジュゲートは抗ＣＤ８抗体を有すること、を特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 前記蛍光発光コンジュゲートは抗ＣＤ３抗体を有すること、を特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 前記蛍光発光コンジュゲートはＡｌｅｘａ６４７とコンジュテーとした抗ＣＤ３抗体であること、を特徴とする請求項３３に記載の方法。
- 前記血液はフィンガースティックで採血した血液サンプルから採取されること、を特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 血液サンプル中のＣＤ４陽性Ｔ細胞対ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を判定する方法であって、
ａ）其々異なる蛍光発光コンジュゲートと結合したＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔリンパ球を、１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに通すことであって、１つ又は複数の前記空洞部にはＣＤ４陽性又はＣＤ８陽性Tリンパ球のいずれかに対して結合親和力を有する生物因子を備えるアガロースビーズを含み、それにより前記ビーズ上で前記リンパ球を固定して、前記血液から検体を分離し、
ｂ）各コンジュゲートの励起に適した波長で前記リンパ球に光を当てること、
ｃ）検出器を使い蛍光信号を発する各コンジュゲートをデジタル処理で撮像すること、及び
ｄ）ＣＤ４陽性細胞対ＣＤ８陽性細胞の前記割合を判定すること、
を備えたことを特徴とする方法。 - 前記生物因子は抗体であること、を特徴とする請求項３６に記載の方法。
- 血液サンプル中でＨＩＶ‐ＲＮＡを検出する方法であって、
ａ）ＨＩＶ-ＲＮＡを含む血液サンプルを、１つ又は複数の空洞部を備えるフローセルに通すことであって、前記１つ又は複数の空洞部には蛍光発光化合物と結合した相補的なヌクレオチド配列を有するアガロースビーズを含み、
ｂ）前記ビーズ上で前記ＨＩＶ-ＲＮＡと前記相補的なヌクレオチド配列間の結合複合体を形成することであって、前記ＨＩＶ-ＲＮＡに前記相補的なヌクレオチド配列が結合することにより、前記蛍光発光化合物から発せられる前記信号が強化され、
ｃ）前記蛍光発光化合物の励起に適した波長で前記複合体に光を当てること、及び
ｄ）検出器を使い前記複合体が発した蛍光信号をデジタル処理で撮像すること、
を備えたことを特徴とする方法。
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