CN116559429B - 一种检测HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的侧向层析试剂盒 - Google Patents

一种检测HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的侧向层析试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的侧向层析试剂盒，包括处理液和试纸条；处理液含有信号物一标记的HIV p24抗体一和信号物二标记的CD4抗体，且信号物一和信号物二互不相同；试纸条包括底板和依次搭设于底板上的样品垫、细胞阻隔垫、层析膜和吸水垫，其中细胞阻隔垫的第一端搭设于样品垫的上方，第二端搭设于层析膜的上方；层析膜上设置有分子检测线、细胞检测线和质控线，分子检测线上包被有HIV p24抗体二，细胞检测线上包被有CD4抗体的二抗，细胞阻隔垫和样品垫为通过样本垫处理液处理得到。该侧向层析试剂盒能够同步检测血液中HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量。

Description

一种检测HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的侧向层析试 剂盒
技术领域
本发明属于医学检测免疫分析技术领域，具体涉及一种同步检测HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的侧向层析试剂盒。
背景技术
1981年6月，美国疾病预防与控制中心报道了艾滋病的首个病例。至今40多年间，仍没有有效的防控疫苗和根治措施，艾滋病在全球肆虐流行，已成为重大的公共卫生问题和社会问题。
目前针对艾滋病最有效的治疗方法是高效联合抗反转录病毒治疗(HighlyActive Anti-Retroviral Therapy,HAART)，但需定期检测抗病毒治疗者血中病毒载量和CD4+T细胞数量增减来评价抗病毒治疗效果和免疫功能状态。由于HIV感染人体后主要攻击CD4+T细胞，从而造成感染者免疫功能状态低下，进而引起一系列的感染性疾病和恶性肿瘤发生，感染者病死率较高。有效的HAART会使感染者血液中病毒含量下降，CD4+T细胞数量升高，可提高感染者生存质量，延长生存期。
现有的HIV病毒载量检测和CD4+T细胞检测分别基于不同检测平台，需要用到不同的检测设备，患者需多管采血，且检测方法过于复杂、对实验环境和仪器设备依赖性大，提高了检测成本和防疫难度，不利于有效的HIV感染者病情监控和对精准用药的指导。
HIV p24抗原是HIV-1的核心蛋白，在HIV入侵人体后p24的水平能够随病毒的复制而升高，在感染的早期和晚期，在血浆中p24抗原以游离形式出现。p24抗原检测可以作为HIV的早期诊断指标，相关文献指出，HIV p24抗原浓度与病毒核酸有一定的相关性，通过监测p24抗原浓度变化可以反映病毒含量变化，从而监测病情进展和治疗效果。
目前HIV p24抗原检测方法主要有酶联免疫吸附法、蛋白印迹检测法、化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析、免疫荧光分析，这些方法需使用精密的仪器设备，一般只能在专业的医学实验室开展。CD4+T细胞数量检测主要方法有流式细胞术法、微流控芯片计数及显微镜计数，对检测仪器和检测人员有较高要求，检测周期较长。同时由于采用不同检测平台需要不同的标本类型，感染者需采集多管样本，可能造成医源性失血。这些均不利于现场快速检测需求。
侧向层析分析试纸(Lateral flow assay strip，LFAS)，是以微孔层析膜为固相载体，通过各种信号物标记抗原或者抗体，基于毛细管作用进行抗原抗体反应对待测样品进行检测分析技术。自1980年代初期发明以来，已经得到了市场的广泛认可和应用。基本原理是样品中的液体在纸的毛细作用力驱动下在膜上运动，样品中的分析物与LFAS各组成部分进行混合，完成反应，形成检测信号，最后通过专门的分析仪或者肉眼对检测结果进行判读。具有反应快速、操作简便、分析简单的优点。
现有的LFAS是将样品垫、结合垫、层析膜(包含检测线和质控线)和吸水纸几部分按次序固定在塑料底板上，然后置于塑料外壳内组装完成。在吸水纸提供的毛细层析力的作用下，样本加入样品垫进行样本的前期处理，然后与结合垫上包被的信号探针进行反应，最后到达层析膜并在层析膜上发生特异性的识别反应形成特异性检测信号，通过信号的强弱变化显示出样本中待测物的浓度。
传统的LFAS待测靶标一般是分子靶标，如胶体金试纸条定性检测HIV抗体，而针对血液中的HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的检测，由于CD4+T细胞属于超级超级大分子，尺寸在微米级别，p24抗原属于生物大分子，尺寸在纳米级别，两种物质检测分属于两种检测原理，目前暂无法进行同步检测，针对同步检测HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞、且具有检测效果好的侧向层析试剂盒有待开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够同步检测血液中HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的侧向层析试剂盒。
实现上述目的包括如下技术方案。
本发明第一方面，提供一种检测HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的侧向层析试剂盒，其特征在于，包括处理液和试纸条；所述处理液含有信号物一标记的HIV p24抗体一和信号物二标记的CD4抗体，且信号物一和信号物二互不相同；
所述试纸条包括底板以及设置于所述底板上的样品垫、细胞阻隔垫、层析膜和吸水垫，所述样品垫、细胞阻隔垫、层析膜和吸水垫依次搭设；所述细胞阻隔垫为具有孔隙的吸水膜，且所述细胞阻隔垫的第一端搭设于所述样品垫的上方，第二端搭设于所述层析膜的上方；
所述层析膜上设置有分子检测线、细胞检测线和质控线，所述分子检测线上包被有HIV p24抗体二，所述细胞检测线上包被有CD4抗体的二抗；
所述细胞阻隔垫和所述样品垫均为通过样本垫处理液处理得到，所述样本垫处理液为缓冲液中含有1～5％(w/v)蔗糖、1～5％(w/v)PEG-4000、1～5％(v/v)Tween-20和0.001～0.005％(w/v)NaN3。
在其中一些实施例中，所述样本垫处理液为缓冲液中含有1～5％(w/v)蔗糖、1～5％(w/v)PEG-4000、1～5％(v/v)Tween-20和0.001～0.005％(w/v)NaN3。
在其中一些实施例中，所述样品垫的长度为10mm～12mm，所述细胞阻隔垫的长度为15～17mm，且所述样品垫和所述细胞阻隔垫的总长度为27mm。
在其中一些实施例中，所述样品垫的长度为10.5mm～11.5mm，所述细胞阻隔垫的长度为15.5mm～16.5mm。
在其中一些实施例中，所述细胞阻隔垫搭设于所述样品垫的长度为1mm～3mm，所述细胞阻隔垫搭设于所述层析膜的长度为1mm～3mm；优选地，所述细胞阻隔垫搭设于所述样品垫的长度为1.5mm～2.5mm，所述细胞阻隔垫搭设于所述层析膜的长度为1.5mm～2.5mm。
在其中一些实施例中，所述信号物一为时间分辨荧光微球，且所述时间分辨荧光微球的直径为280nm～300nm。
在其中一些实施例中，所述时间分辨荧光微球的直径为285nm～290nm。
在其中一些实施例中，所述信号物二为量子点荧光微球，所述量子点荧光微球的直径为90nm～110nm。
在其中一些实施例中，所述量子点荧光微球的直径为95nm～105nm。
在其中一些实施例中，所述处理液中，所述信号物一标记的HIV p24抗体一与所述信号物二标记的CD4抗体的用量比为1:2～3；优选地，所述信号物一标记的HIV p24抗体一与所述信号物二标记的CD4抗体的用量比为1:2.3～2.7。
在其中一些实施例中，所述分子检测线上包被有1.2mg/mL～1.8mg/mL HIV p24抗体二，所述细胞检测线上包被有0.6mg/mL～1.3mg/mL CD4抗体的二抗，包被量均为0.5μL/cm～1.5μL/cm。
在其中一些实施例中，所述分子检测线上包被有1.4mg/mL～1.6mg/mLHIV p24抗体二，所述细胞检测线上包被有0.9mg/mL～1.1mg/mL CD4抗体的二抗，包被量均为0.9μL/cm～1.1μL/cm。
本发明第二方面，提供一种如上所述的检测HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的侧向层析试剂盒在同步检测血液中HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的应用。
本发明中，通过对侧向层析试纸条的研究及重新设计，在试纸条的样品垫和层析膜之间增加细胞阻隔垫并通过设计特定的搭设方式，以及优化相关反应条件，在信号物标记的CD4抗体作为信号探针和CD4+T细胞的识别反应完成后，通过细胞阻隔垫可以将CD4+T细胞靶标滞留于此，而多余的游离CD4抗体信号探针能够进入层析膜并与细胞检测线上的羊抗鼠IgG结合输出检测信号，细胞检测线的信号强度与CD4+T细胞的含量呈负相关；信号物标记的HIV p24抗体一作为信号探针与HIV p24抗原靶标结合反应后不会被细胞阻隔垫阻隔，能够进入层析膜并与分子检测线上的HIV p24抗体二结合形成双抗体夹心复合物而输出检测信号，分子检测线的信号强度与HIV p24抗原含量呈正相关，整个过程一步加样，并能够实现分子靶标与细胞靶标同步定量检测，可实现快速、简便、检测效果好且无需复杂设备和特定实验室的HIV感染者病毒含量和免疫功能同步检测。
进一步地，研究发现，CD4抗体的标记物直径，样品垫和细胞阻隔垫长度范围，均对HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的检测效果有较大的影响，通过优化D4抗体的标记物直径，以及优化样品垫和细胞阻隔垫长度范围，能够提高信号采集的灵敏性，检测效果更优。
附图说明
图1是本发明实施例1的侧向层析检测卡的结构示意图。
图2是本发明实施例1的侧向层析检测盒的结构示意图。
图3(a)至图3(c)是对样品处理管中的PBMC样本中CD4+T细胞的共聚焦成像，其中，图3(a)是样品处理管内的细胞核染色结果图，图3(b)样品处理管内的细胞膜染色结果图，图3(c)是图3(a)和图3(b)的合成图。
图4(a)至图4(c)是对细胞阻隔垫的SEM分析的扫描电镜图，其中图4(a)是未用的细胞阻隔垫的扫描电镜图；图4(b)是检测完成后的细胞阻隔垫的扫描电镜图；图4(c)是图4(b)的局部放大图。
图5(a)至图5(b)是对层析膜的SEM分析的扫描电镜图，其中图5(a)是未用的层析膜的扫描电镜图；图5(b)是检测完成后的层析膜的扫描电镜图。
图6(a)是侧向层析检测盒用于0～100ng/mL HIV p24抗原溶液检测的标准曲线图,图6(b)是侧向层析检测盒用于0-700个/μL CD4+T细胞检测的标准曲线图。
图7是实施例2的试纸条中样品垫与细胞阻隔垫的不同长度组合对全血的层析效果图。
图8(a)是手机记录的样品垫与细胞阻隔垫不同长度组合及检测HIV P24抗原时结果优化的图片；图8(b)是样本垫和细胞阻隔垫在不同长度比的条件下进行HIV P24抗原检测的结果图,图8(c)是样本垫和细胞阻隔垫在不同长度比的条件下进行CD4+T细胞检测的结果图。
图9是不同直径的时间分辨荧光微球(EuNPs)与HIV p24抗体一进行标记得到的信号探针液采用HIV p24阴性检测液和HIV p24阳性检测液进行检测得到的荧光强度结果图。
附图标记说明：
1、样品垫；2、细胞阻隔垫；3、层析膜；4、分子检测线；5、细胞检测线；6、质控线；7、吸水垫；8、底板；9、外壳；10、样本处理管。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1检测HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的侧向层析试剂盒的制备
1、主要试剂材料，如表1.1所示
表1.1试剂材料
2、主要使用仪器，如表1.2所示：
表1.2使用仪器
3、主要溶液的配制：
(1)2M NaOH溶液：
8g的NaOH用100mL的超纯水溶解，待完全溶解后放置4℃冰箱保存。
(2)0.1M，PH＝6.0MES缓冲液：
2.13gMES用95mL的超纯水溶解，待完全溶解后，用2M NaOH溶液将pH调至6.0，超纯水定容至100mL，放置4℃冰箱保存。
(3)0.015M pH＝7.4磷酸盐缓冲液(1×PBS)
根据实际所需物料按照下表1.3进行配制：
表1.3磷酸盐缓冲液配制
试剂名称 数量 单位
KH2PO4 135 mg
Na2HPO4 570 mg
KCl 100 mg
NaCl 4.00 g
超纯水 500 mL
(4)10％ ProClinTM300防腐剂
取100μL ProClinTM300防腐剂，加入1000μL超纯水充分混匀，放置4℃冰箱保存。
(5)10㎎/ml EDC溶液：
EDC从-20℃冰箱取出后置于室温平衡10min，根据实际所需物料进行配制。电子天平称取1㎎EDC溶解于100μL 0.015M pH＝7.4的PBS中，溶解后尽快使用(现配现用)；
(6)50㎎/ml NHS溶液：
NHS从-20℃冰箱取出后置于室温平衡10min，根据实际所需物料进行配制。电子天平称取1㎎NHS溶解于20μL 0.015M pH＝7.4的PBS中，溶解后尽快使用(现配现用)；
(7)10％(w/v)BSA溶液：
电子天平称取1000㎎BSA溶解于10mL 0.015M pH＝7.4的PBS缓冲液中；
(8)0.1M pH＝8.5的Gly-NaOH缓冲液
称取7.5g甘氨酸，加入950mL超纯水，完全溶解后，用2M NaOH溶液调pH至8.5，定容至1L，放置4℃冰箱保存。
(9)包被抗体缓冲液(2％蔗糖PBS)
称量2mg蔗糖，加入100μL 0.015M pH＝7.4的PBS中，完全溶解后放置4℃冰箱保存。
(10)复溶液按照下表1.4进行配制：
表1.4复溶液配制
(11)样本垫处理液按照下表1.5进行配制：
表1.5样本垫处理液配制
组分 浓度 数量 单位
蔗糖 2％ 1 g
PEG 4000 1.5％ 0.75 g
Tween-20 1％ 500 μL
10％NaN3 0.04％ 20 μL
1×PBS - 50 mL
4、检测HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的侧向层析试剂盒的制备
1)样品垫的处理：
配制样本垫处理液，将玻璃纤维素膜浸泡于样本垫处理液，然后将浸润的玻璃纤维膜置于37℃干燥箱中干燥5h，将干燥后的玻璃纤维素膜裁剪成11mm长条，即为处理后的样品垫。
2)信号探针制备：
本方案选择Thermo Fisher公司的时间分辨荧光微球(EuNPs，粒径288nm，固含量10mg/mL，激发波长365nm，发射波长615nm)作为HIV p24抗原检测信号物一，量子点荧光微球(QDNPs，粒径100nm，固含量10mg/mL，激发波长365nm，发射波长570nm)作为CD4+T细胞检测信号物二；将EuNPs活化后的1mL(0.2mg/mL)的溶液中加入20μgHIV p24抗体一，所述HIVp24抗体一是兔源p24多克隆抗体(Anti-HIV p24 PcAb)，将EuNPs活化后的1mL(0.2mg/mL)的溶液中加入20μg羊抗鸡IgY抗体，将QDNPs活化后的1mL(0.2mg/mL)的溶液中加入20μgCD4抗体，所述CD4抗体是鼠源CD4单克隆抗体(Anti-CD4 mAb)，将QDNPs活化后的1mL(0.2mg/mL)的溶液中加入20μg羊抗鸡IgY抗体，室温旋转反应3h，然后各加入10μL 10％(w/v)牛血清白蛋白，室温旋转反应30min，最后4℃，15 000RCF离心30min弃上清，然后各加入500μL复溶液复溶，分别获得EuNPs-Anti-HIV p24 PcAb信号探针液(HIV p24抗体一的浓度为0.04μg/μL)、EuNPs-羊抗鸡IgY信号探针液、QDNPs-Anti-CD4 mAb信号探针液(CD4抗体的浓度为0.04μg/μL)和QDNPs-羊抗鸡IgY信号探针液。
3)处理液的制备：
取1.5mL的Ep离心管，加入1μL EuNPs-Anti-HIV p24 PcAb信号探针液、0.5μLEuNPs-羊抗鸡IgY信号探针液、2.5μL QDNPs-Anti-CD4 mAb信号探针液、1.5μL QDNPs-羊抗鸡IgY信号探针液，即为处理液。
4)细胞阻隔垫的制备：
将细胞阻隔垫(具有孔隙的吸水膜)浸泡于样本垫处理液，然后将浸润的细胞阻隔垫置于37℃干燥箱中干燥5h，将干燥后的细胞阻隔垫裁剪成16mm长条，即为细胞阻隔垫。
5)层析膜的制备：
将25mm宽硝酸纤维素膜(Nitrocellulose filter membrane:NC膜)，粘贴在底板上对应位置，对应于细胞阻隔垫端按从前向后的顺序分别设置为分子检测线区域(T1检测线)、细胞检测线区域(T2检测线)和质控线区域(C线)，T1检测线上包被1.5mg/mL的HIV p24抗体二，所述HIV p24抗体二是鼠源p24单克隆抗体(Anti-HIV p24 mAb3)，T2检测线上包被1.0mg/mL的CD4抗体的二抗，该CD4抗体的二抗是羊抗鼠IgG，质控线上包被1.0mg/mL鸡IgY，包被量均为1μL/cm，包被好抗体的NC膜置于37℃干燥箱中干燥24小时，然后置于恒温恒湿柜保存得到上述的层析膜。
6)检测HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的侧向层析试剂盒组装：
如图1所示，侧向免疫层析检测卡包括样品垫1、细胞阻隔垫2、层析膜3、分子检测线4、细胞检测线5、质控线6、吸水垫7、底板8、外壳9。
底板8上依次粘贴样品垫1、细胞阻隔垫2、层析膜3、和吸水垫7，且样品垫1、细胞阻隔垫2、层析膜3和吸水垫7依次搭设，细胞阻隔垫2搭设于所述样品垫1的长度为2mm，所述细胞阻隔垫2搭设于所述层析膜3的长度为2mm，吸水垫7前端与层析膜3后端2mm重合得到试纸条。
将组合好的试纸条置于外壳9内，组成完整的侧向层析检测卡。
如图2所示，侧向层析试剂盒包括上述的侧向层析检测卡和样本处理管10。具体地，在样本处理管中加入有处理液，与上述的侧向层析检测卡配合即可组成完整的侧向层析检测试剂盒。
5、样品管处理液分析
定量检测侧向层析检测试剂盒操作：将待测PBMC样本100μL加入到样本处理管的处理液中反应15min，对样品处理管中的PBMC样本中CD4+T细胞进行共聚焦成像检测，结果如下图3(a)至图3(c)所示，待测PBMC样本中的CD4+T细胞可与信号探针结合反应。
取样本处理管中混合反应液100μL加入检测卡加样孔中，15min后对细胞阻隔垫和层析膜进行SEM分析，细胞阻隔垫的SEM分析结果如下图4(a)至图4(c)所示，细胞阻隔垫能够阻隔CD4+T细胞靶标滞留于此；层析膜的SEM分析结果如下图5(a)至图5(b)所示，层析膜可实现信号的输出。
6、样本分析：
定量检测侧向层析检测试剂盒操作：将待测样本100μL加入到样本处理管的处理液中反应15min，取样本处理管中混合反应液100μL加入检测卡加样孔中，15min后使用荧光读取仪记录检测线和质控线荧光信号；
结果分析：
HIV p24抗原阳性结果为T1检测线和质控线出现荧光，荧光信号强度与样本中HIVp24抗原浓度呈正相关；CD4+T细胞阳性结果为T2检测线出现较弱荧光或无荧光，质控线出现荧光，荧光信号强度与样本中CD4+T细胞数量呈负相关；若质控线没有荧光，则该试纸条无效。如图6(a)所示，以T1线荧光强度与C线荧光强度之比为Y轴，HIV p24抗原浓度为X轴绘制曲线，得到了定量检测侧向层析检测试剂盒的检测标准曲线。在HIV p24抗原的检测中定量检测侧向层析检测试剂盒的线性检测范围是0-100ng/mL。以T2线荧光强度与C线荧光强度之比为Y轴，CD4+T细胞浓度为X轴绘制曲线，得到了定量检测侧向层析检测试剂盒的检测标准曲线(图6(b))。在CD4+T细胞的检测中定量检测侧向层析检测试剂盒的线性检测范围是0-700cells/μL。从图中数据分析可以看出定量检测侧向层析检测试剂盒的线性范围较宽，并相比传统的检测方法的操作更简便、快速，且可定量检测待测物，可用于疾病进展过程中的动态观察与评估。
由上可知，通过对侧向层析试纸条的研究及重新设计，其中通过细胞阻隔垫的第一端搭设于所述样品垫的上方，第二端搭设于所述层析膜的上方的特定搭设方式能够将可以将CD4+T细胞靶标滞留于此，而不会阻碍多余的游离CD4抗体信号探针，以及信号物标记的HIV p24抗体一与HIV p24抗原靶标的结合物进入层析膜输出检测信号，从而实现在单个试纸条上完成CD4+T细胞和HIV p24抗原的双重测定，减少非特异性信号的产生，为后续层析膜上的反应提高特异性和降低背景干扰。此外，处理液的成分和浓度的变化对免疫反应的灵敏性和特异性会产生较大影响，能够在保证反应最佳条件下尽量减少其他成分的干扰，保证试剂的稳定，处理过程方便。由此，通过在试纸条的样品垫和层析膜之间增加细胞阻隔垫并通过设计特定的搭设方式，以及优化相关反应条件，可以在一步加样的过程中，能够实现分子靶标与细胞靶标同步定量检测，可实现快速、简便、检测效果好且无需复杂设备和特定实验室的HIV感染者病毒含量和免疫功能同步检测。
实施例2样品垫与细胞阻隔垫的长度设计优化
在相同的样品量及反应时间时，由于不同的样品垫与细胞阻隔垫的长度组合对层析效果有关键作用，故选用不同的样品垫与细胞阻隔垫的长度组合进行优化。如图7所示，其中图7中(1)的试纸条为样品垫12mm和细胞阻隔垫15mm的组合，(2)的试纸条为样品垫17mm和细胞阻隔垫10mm的组合，(3)的试纸条为样品垫22mm和细胞阻隔垫5mm的组合。当加入同样体积的全血反应15min后，样品垫为17mm和细胞阻隔垫10mm的组合(2)以及样品垫为22mm和细胞阻隔垫5mm的组合(3)的试纸条NC膜上有较多血液残留，样品垫为12mm和细胞阻隔垫15mm的组合(1)试纸条NC膜上背景相对干净。
进一步地，将样品垫与细胞阻隔垫按总长度一定的前提下选择不同长度进行组合后进行P24抗原和CD4+T细胞检测，其中，组合A：样品垫13mm，细胞阻隔垫14mm；组合B：样品垫11mm，细胞阻隔垫16mm；组合C：样品垫9mm，细胞阻隔垫18mm；组合D：样品垫7mm，细胞阻隔垫20mm。
检测结果如图8(a)-(c)所示，其中图8(a)为手机记录的样品垫与细胞阻隔垫不同组合(A-D)及检测HIV p24抗原时结果优化的图片实验。图8(b)是检测HIV p24抗原阴性和阳性样本的结果图，可知，当样品垫为组合A时，HIV p24阴性检测液的FIT1/FIC最高，样本信躁比最低，说明存在较高的非特异性信号；而随着细胞阻隔垫长度增加，由于一定的存在阻隔效应，C线、T1线的显色强度在下降，且T1线下降程度大于C线，因此HIV p24为阴性时，FIT1/FIC明显下降，非特异性信号有所减弱，此时阳性样本结果的信躁比随之降低，当样品垫为组合B时，T1检测线阴性结果最小，阳性结果信躁比最高。
用样品垫与细胞阻隔垫不同组合长度(A-D)进行CD4+T细胞测定时，结果如图8(c)，细胞阻隔垫长度增加时，C、T2线的显色强度下降，且C线下降程度远大于T2线，因此CD4+T阴性样本的FIT2/FIC呈现上升趋势，检测阳性CD4+T细胞样本时，当细胞阻隔垫长度最短时，测试的抑制率最高，随着细胞阻隔垫长度增加，阳性样本抑制率有所下降，使用组合B、C、D时，阳性样本抑制率变化不大。由于HIV感染者体内病毒含量变化比CD4+T细胞数量变化更灵敏，综合考虑二者检测结果，结合临床应用的意义，后续选用组合B(样品垫为11mm和细胞阻隔垫16mm为最优组合长度。
由上可知，不同的样品垫与细胞阻隔垫的长度组合对层析效果有关键作用，由于细胞阻隔垫孔径较小，过短会造成后续NC膜上残留全血红色背景，影响观察效果。而随着其长度增加可降低反应灵敏性及非特异性反应，提高反应的特异性，但长度过长时其反应的特异性反而下降，因此在总长度之内选择合适的长度组合，其中样品垫的长度设置为12～10mm，细胞阻隔垫的长度设置为15～17mm的组合时，能够达到最佳的检测效果。
实施例3用于HIV p24抗体一标记的时间分辨荧光微球的直径的优化
选择3种不同直径199nm、288nm和322nm的时间分辨荧光微球(EuNPs)分别与相同的HIV p24抗体一进行标记，得到3种信号探针液，用HIV p24阴性检测液和阳性检测液分别检测，以T1检测线的荧光强度作为Y轴，荧光微球直径作为X轴，结果如图9所示，当EuNPs直径为288nm时，阴性和阳性检测液T1检测线的荧光强度差值最大，检测效果较优。
由上可知，时间分辨荧光微球(EuNPs)的直径大小对检测效果有较大的影响，时间分辨荧光微球(EuNPs)的直径过大或者过小均降低荧光强度差值。其原因可能是时间分辨荧光微球(EuNPs)的直径过大时，检测阳性样本时，标记抗体结合的待测物较多，可被阻隔于细胞阻隔垫而使检测信号降低；而时间分辨荧光微球(EuNPs)直径过小时，一方面可能标记的抗体较少，使结合的待测物相对较少，检测信号降低；另一方面，直径过小易形成空间位阻效应，使反应灵敏度降低。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一种检测HIV p24抗原浓度与CD4+T细胞数量的侧向层析试剂盒，其特征在于，包括处理液和试纸条；所述处理液含有信号物一标记的HIV p24抗体一和信号物二标记的CD4抗体，且信号物一和信号物二互不相同；
所述试纸条包括底板以及设置于所述底板上的样品垫、细胞阻隔垫、层析膜和吸水垫，所述样品垫、细胞阻隔垫、层析膜和吸水垫依次搭设；所述细胞阻隔垫为具有孔隙的吸水膜，且所述细胞阻隔垫的第一端搭设于所述样品垫的上方，第二端搭设于所述层析膜的上方；
所述层析膜上设置有分子检测线、细胞检测线和质控线，所述分子检测线上包被有HIVp24抗体二，所述细胞检测线上包被有CD4抗体的二抗；
所述细胞阻隔垫和所述样品垫均为通过样本垫处理液处理得到，所述样本垫处理液为缓冲液中含有1~5%w/v蔗糖、1~5%w/v PEG-4000 、1~5%v/v Tween-20和0.001~0.005%w/vNaN3；
所述样品垫的长度为10mm~12mm，所述细胞阻隔垫的长度为15~17mm，且所述样品垫和所述细胞阻隔垫的总长度为27mm；所述细胞阻隔垫搭设于所述样品垫的长度为1mm~3mm，所述细胞阻隔垫搭设于所述层析膜的长度为1mm~3mm；
所述信号物一为时间分辨荧光微球，且所述时间分辨荧光微球的直径为280nm~300nm。
2.如权利要求1所述的侧向层析试剂盒，其特征在于，所述样本垫处理液为缓冲液中含有1.5~2.5%w/v蔗糖、1~2%w/v PEG-4000 、1~1.5%v/v Tween-20和0.0035~0.0045%w/vNaN3。
3.如权利要求1所述的侧向层析试剂盒，其特征在于，所述样品垫的长度为10.5mm~11.5mm，所述细胞阻隔垫的长度为15.5mm~16.5mm。
4.如权利要求1所述的侧向层析试剂盒，其特征在于，所述细胞阻隔垫搭设于所述样品垫的长度为1.5mm~2.5mm，所述细胞阻隔垫搭设于所述层析膜的长度为1.5mm~2.5mm。
5.如权利要求1所述的侧向层析试剂盒，其特征在于，所述时间分辨荧光微球的直径为285nm~290nm。
6.如权利要求1所述的侧向层析试剂盒，其特征在于，所述信号物二为量子点荧光微球，所述量子点荧光微球的直径为90nm~110nm。
7.如权利要求6所述的侧向层析试剂盒，其特征在于，所述量子点荧光微球的直径为95nm~105nm。
8.如权利要求1至7任一项所述的侧向层析试剂盒，其特征在于，所述处理液中，所述信号物一标记的HIV p24抗体一与所述信号物二标记的CD4抗体的用量比为1:2~3。
9.如权利要求8所述的侧向层析试剂盒，其特征在于，所述信号物一标记的HIV p24抗体一与所述信号物二标记的CD4抗体的用量比为1:2.3~2.7。
10.如权利要求1至7任一项所述的侧向层析试剂盒，其特征在于，所述分子检测线上包被有1.2mg/mL~1.8 mg/mL HIV p24抗体二，所述细胞检测线上包被有0.6mg/mL~1.3mg/mLCD4抗体的二抗，包被量均为0.5μL/cm~1.5μL/cm。
11.如权利要求10所述的侧向层析试剂盒，其特征在于，所述分子检测线上包被有1.4mg/mL~1.6 mg/mLHIV p24抗体二，所述细胞检测线上包被有0.9mg/mL~1.1mg/mL CD4抗体的二抗，包被量均为0.9μL/cm~1.1μL/cm。
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