CN103323308A - 一种处理微量全血的试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种处理微量全血的试剂及其应用，所述试剂含有以下成分：缓冲液、渗透压维持剂、保护剂、抗凝剂和防腐剂。本发明提供的试剂可以做到：以任意倍数（2-1000倍）稀释处理微量全血样本，得到血清或血浆的稀释液，而样本不被破坏、红细胞不会溶血。

Description

一种处理微量全血的试剂及其应用
技术领域
本发明涉及全血试剂，具体涉及一种处理微量全血的试剂及其应用。
背景技术
目前，临床上，血液样本的检测项目（如：25-羟基维生素D3的检测、乙肝两对半的检测等项目）绝大部分使用的是血清或血浆样本，其中血清样本获取方式是先采集静脉血，取血后离心，吸取上清进行检测；血浆样本的获取方式是先用含有抗凝剂的采血管采集静脉血，取血后离心，吸取上清进行检测。而现有的制备方法都是采集静脉血，然后将全血离心，分离血清和血浆，因此需要的血量比较多。
需要进行检测的人群中可能会有一些特殊人群，比如某些采血困难者如：特殊疾病者、吸毒人群、老年人、婴幼儿，比如不能很好配合者如：儿童，则很难得到满意的、足够量的全血标本。
因此，急需一种可采用较少的全血量，即可满足临床检测需要的试剂及方法。
在进行血样分析时，需要添加一定量的血液稀释剂，包括适当的电解质成分，而且相对于血细胞溶液必须是渗透压平衡的，为抑制微生物的生长，还要加防腐剂，而防腐剂的加入有可能导致血细胞体积的变化，为平衡或补偿防腐剂对血细胞体积变化的影响，还需要加入活化剂，因血液pH值一般在7.4左右，所以还要求所用的血液稀释剂的pH值与血细胞溶液的pH值是平衡的。
EP0049478A1公开了一种血液稀释剂，由平衡渗透剂（氯化钠、氯化钾、单和二氢硫酸钠或钾）、乙二胺四乙酸、氯化锂和苯乙醇组成，除了配方成分较复杂外，均未解决抗凝问题，实际使用的血液稀释剂在室温下储放一定时间后会出现血细胞的凝集现象，影响血细胞计数和测定的精确性。另外，氯化锂作为红细胞体积稳定剂，并引入较多的无机盐，易对测量系统的金属零部件产生腐蚀产物，无机盐结晶，造成导管和计数孔的堵塞。
CN1072020A（申请号为91109885.2）公开了一种多用途血液稀释剂，包括：氯化钠、枸橼酸钠、枸橼酸钾、庆大霉素。采用该发明检测结果偏低或者是假阴性，对病人会造成不好的影响。
CN1265196A（申请号为98807459.1）公开了一种血液稀释剂，包括：a：乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸衍生物和这两类化合物的组合；b：咪唑、咪唑衍生物（如苯并咪唑甲基咪唑、乙基咪唑和丁基咪唑）及两类化合物的组合；c：碱金属氯化物；d：第三种化合物，选自碱金属硫酸盐和碱金属有机酸盐，pH值呈中性、细胞稳定剂（如4-氨基苯甲酸酯及其衍生物）、防腐剂、预防血小板聚集的细胞稳定剂。
US4656139报道了一种用于血液分析的细胞的方法，包括使用一种稀释剂稀释血样，该稀释剂由硼酸缓冲液、乙二胺四乙酸和2-硫代-1-氧吡啶钠。
US5008202公开了一种用于血细胞分析的血液稀释剂和稀释血液的方法，该稀释剂大致由有机缓冲剂、细胞稳定剂、无机盐、溶剂和EDTA（EDTA为抗微生物剂）或EDTA和氟化钠的混合物（混合物做抗微生物剂用）组成。
CN1238455A（申请号为98102346.0）公开了一种血液分析计数仪用稀释液，含有抗凝剂、抗菌剂、缓冲溶剂、无机硫酸钠和氯化钠的水溶液，其中缓冲容剂为磷酸氢二钠、磷酸二氢钾；防腐剂为叠氮化钠；抗凝剂为EDTA。该发明所使用保护剂硫酸钠的作用是防止破碎的红细胞碎片黏连，影响其他细胞的检测。
CN101485303A（申请号为200910037434.8）公开了一种脱落细胞保存液，包括pH缓冲剂、渗透压维持剂、防腐保鲜剂、用于维持细胞形态的固定剂、抗凝剂、黏液软化剂、保湿剂及破坏红细胞的成分，其主要作用是保存细胞、溶解粘液、细胞形态完好，但是破坏了部分红细胞。
CN1683522A（申请号为200510018341.2）公开了一种全血质控物细胞生物活性保护剂及其制法，其中该保护剂中的全血细胞活性保养液包括以下成分：氯化钠、硼酸、硼酸钠、海藻糖、海藻酸钠、葡萄糖、环状糊精、牛血清白蛋白、叠氮钠。
上述发明专利均是全血细胞稀释液，其用途在于保护细胞形态、包括细胞结构，但没有保护血液中的其他蛋白和化学成分，更有的发明破坏了部分红细胞，导致在检测过程中影响检测结果，这不是本发明最终想要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种处理微量全血的试剂。
本发明提供的一种处理微量全血的试剂，所述试剂含有以下成分：缓冲液、渗透压维持剂、保护剂、抗凝剂和防腐剂。
具体的，所述100ml试剂为含有以下成分的水溶液：浓度为5-100mM，pH为6.8-7.6的缓冲液0.01-5.0g、渗透压维持剂0.5-15g、保护剂0.05-3g、抗凝剂0.005-1g和防腐剂0.03-150mg。
优选地，所述100ml试剂为含有以下成分的水溶液：浓度为5-60mM，pH为7.2-7.5的缓冲液0.02-4.0g、渗透压维持剂0.6-11.5g、保护剂0.1-1g、抗凝剂0.005-0.7g和防腐剂0.04-100mg。
本发明所述试剂还含有以下成分：植物血球凝集素或红细胞抗体。
优选地，本发明所述试剂还包含以下成分：植物血球凝集素0.1-0.5g或红细胞抗体0.02-0.2ml。
以上试剂中：
所述mM为mmol/L的简写。
所述缓冲液为磷酸缓冲系统、硼酸缓冲系统、tris-Hcl缓冲系统或巴比妥缓冲系统，所述磷酸缓冲系统为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组合、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾组合；硼酸缓冲系统为硼酸和氢氧化钠组合、硼酸和硼砂组合；tris-Hcl缓冲系统为tris（tris为三羟甲基氨基甲烷的缩写）和盐酸；巴比妥缓冲系统为巴比妥钠和盐酸。
所述渗透压维持剂为氯化钠或蔗糖等；其中渗透压维持剂的用量为：氯化钠为0.6-0.9g或蔗糖为10-11.5g。
所述保护剂为BSA（牛血清白蛋白）、海藻糖或HSA(人血清白蛋白)等中的一种或几种。
所述抗凝剂为EDTA（乙二胺四乙酸）或其盐、肝素或其盐、草酸盐或枸橼酸盐等中的一种或几种；EDTA盐为EDTA二钠盐或EDTA二钾盐；肝素盐为肝素钠、肝素锂；草酸盐为草酸钾盐、草酸铵盐；枸橼酸盐为枸橼酸钠盐或枸橼酸钾盐。所述抗凝剂的用量范围即100ml血液中的使用量为：EDTA或其盐为0.15-0.25g；肝素或其盐为0.005-0.2g；草酸盐为0.4-0.7g；枸橼酸盐为0.2-0.5g。
所述防腐剂为proclin300（其主要成分是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MCI），5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMCI））或庆大霉素。
所述水为超纯水，所述超纯水是指将水中的导电介质几乎完全去除，又将水中不离解的胶体物质、气体及有机物均去除至很低程度的水。电阻率大于18MΩ*cm，或接近18.2MΩ*cm极限值（25℃）。
本发明还提供了上述试剂的制备方法，该方法包括以下步骤：按照配比称取各成分，加入80ml水，混匀，调节pH值为6.8-7.6，定容，即得。
上述制备方法中：
所述pH调节剂为氢氧化钠和盐酸。
本发明还提供了上述试剂在处理微量全血中的应用。该应用是指可根据临床检测需要的样本量，从耳垂、手指末端、足跟等处采取到的微量全血（至少20ul），然后取本发明试剂稀释2-1000倍，混匀，然后根据检测内容进行相关操作，比如离心，取上清液进行检测。
所述采血量至少为20μl，是为了满足临床检测时的最少用量。
所述临床检测是指：1、定量免疫试验，如25羟基维生素D3的检测；2、定性免疫试验，如乙肝表面抗原试验；3、生化方面的检测，如TBil（总胆红素）的检测；4、ICP-MS（电感耦合等离子体质谱）的检测。本发明可以应用在以上方面的检测，但不局限在以上的检测。
本发明提供的试剂及其应用具有以下优点：
1、本发明提供的试剂中：
缓冲液：提供合适的离子浓度和酸碱度，保护红细胞不破碎，维持血浆恒定pH值，防止易变因子失活；
渗透压维持试剂：提供合适的渗透压，保持细胞内外的水平衡和细胞的正常体积形态；
保护剂：保护血液中含有的蛋白、保持血液的稳定性；
抗凝剂：使红细胞不凝固；
防腐剂：抑制细菌生长，延长试剂的保存期，且不影响实验结果。
2、本发明提供的试剂需要的采血量可少至20μl（这个采血量为检测时所需血清或血浆的最小值），解决了幼儿、老龄及重病人采血困难的问题，是国内外首创的试剂。
3、采血后，可以根据任意倍数加入本发明的试剂稀释，得到血清或血浆的稀释液，而样本不被破坏、红细胞不会溶血，且使用方法方便，简单，快速。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明中的缓冲液的配制，以实施例1、2为例，所述磷酸二氢钠（NaH2PO4）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）是以5-100mM，pH为6.8-7.6进行配比，如10mM，pH为7.2，应该用NaH2PO4·2H200.04368g；Na2HPO4·12H200.25776g。
实施例1：一种处理微量全血的试剂
1、组成（100ml）：
Figure BDA00003379051800061
2、制备方法：取1个500ml的烧杯，加入80ml的超纯水，按照配比称取各成分，加入到烧杯中，使其溶解，并用氢氧化钠或盐酸调节pH值为7.4，定容至100ml，即得。
实施例2：一种处理微量全血的试剂
1、组成（100ml）
Figure BDA00003379051800062
2、制备方法：取500ml烧杯，加入80ml的超纯水，按照配比称取各成分，加入到烧杯中，并分别调节pH值为：7.4（对比例1和对比例2）、6.8（实施例2-1）、7.0（实施例2-2）、7.2（实施例2-3）、7.6（实施例2-4），然后用水定容至100ml。
实施例3：一种处理微量全血的试剂
1、组成（100ml）：
Figure BDA00003379051800063
2、制备方法：同实施例2，分别调节pH值为：7.2（实施例3-1）、7.3（实施例3-2）、7.4（实施例3-3）、7.5（实施例3-4）。
实施例4：一种处理微量全血的试剂
1、组成（100ml）：
2、制备方法：同实施例3。
实施例5：一种处理微量全血的试剂
1、组成（100ml）：
Figure BDA00003379051800072
2、制备方法：同实施例3。
实施例6：一种处理微量全血的试剂
1、组成（100ml）：
2、制备方法：同实施例2。
实验例1：维生素D3检测
1、试剂盒来源：25羟基维生素D3，购自北京博晖创新光电技术股份有限公司。
2、样本来源：某医院自愿接受检测的患者，采取血液。
3、实验分组：
每个样本采用29种方法进行处理，具体处理方法如下：
对照1组：常规操作，按照说明书要求样本的获取方式：先采集静脉血(取血量3-5ml)，离心，吸取上清液，用样本稀释液稀释后，混匀，取混合液进行实验。静脉血要求不得溶血，要求澄清、透明。如400ul样本稀释液（试剂盒内自带，其成分是磷酸缓冲液）加入10ul的血清，震荡混匀，即可进行实验。
实验1-24组：实施例1-6合计24组，使用本发明时样本获取方式：刺破无名指，取20ul的微量全血加入到试管中，加入400ul本发明实施例提供的试剂，即将20ul的微量全血稀释20倍，震荡混匀，离心，取上清即可进行实验。
对照2组：CN1072020A（申请号为91109885.2）的优先选择的组分，即：氯化钠8.10g/l，枸橼酸钠2.98g/l，枸橼酸钾0.82g/l，庆大霉素6000u/l（u为国际单位，1u=1μg），用双蒸馏水稀释至1000ml，配制稀释液来完成检测。处理血液的方法同实验组的方法。
对照3组：CN1238455A（申请号为98102346.0）的实例1配置的稀释液，即硫酸钠10.8g、氯化钠3.6g、EDTANa21g、磷酸氢二钠1g、硫酸二氢钾0.6g、叠氮钠0.5g，用蒸馏水200g溶解，继续加蒸馏水使其体积达到1升，即得到稀释液。处理血液的方法同实验组的方法。
对照4组：按照实施例2中的对比例1提供的组分，即0.3978gNaH2PO4·2H2O，0.8771g Na2HPO4·12H2O，10g蔗糖，0.05g HSA，0.005g肝素锂，0.04mg庆大霉素，按照实施例2中对比例1的制备方法进行制备。处理血液的方法同实验组的方法。
对照5组：按照按照实施例2中的对比例2提供的组分，即0.1014gNaH2PO4·2H2O，1.5573g Na2HPO4·12H2O，11g蔗糖，1.5g HSA，0.2g肝素锂，0.1mg庆大霉素，按照实施例2中对比例2的制备方法进行制备。处理血液的方法同实验组的方法。
4、试剂盒操作：
在包被板上设置定标品（2孔*5）、质控品（3孔*2），定标品、质控品每孔均加50ul，其余孔设为样本孔，每种样本加两孔，每孔加入50ul稀释好的样本，所有孔均加50ul辣根过氧化物酶标记的25羟基维生素D3抗原，严格按照说明书进行操作。
5、检测结果：
5.1检测结果：见表1-29
表1：对照1组的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.365 19.980 17.395 15.990 34.725 15.555 17.995 9.805 10.020 18.850
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.450 13.225 22.135 29.115 13.570 7.360 9.615 12.656 25.270 30.875
表2：实验1组（即实施例1-1）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.365 19.980 17.395 15.990 34.725 15.555 17.995 9.805 10.020 18.850
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.450 13.225 22.135 29.115 13.570 7.360 9.615 12.656 25.270 30.875
表3：实验2组（即实施例1-2）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 9.91 19.39 17.63 16.84 34.89 15.71 18.48 9.88 9.66 19.50
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 17.62 13.73 22.77 30.38 13.80 8.81 9.94 12.95 20.75 31.70
表4：实验2组（即实施例1-3）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 9.98 20.57 17.28 16.09 34.03 15.17 18.52 9.02 10.86 19.35
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 17.48 13.70 22.68 30.39 13.80 8.87 10.90 12.78 20.69 31.68
表5：实验4组（即实施例1-4）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.03 20.46 17.80 16.99 31.09 15.70 18.55 10.89 10.76 19.54
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 17.52 13.63 22.78 30.50 13.79 8.74 10.90 12.86 20.73 31.66
表6：实验5组（即实施例2-1）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.94 19.52 17.69 15.92 30.89 15.69 18.53 10.99 9.76 18.42
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 17.48 13.68 22.69 29.79 13.79 8.75 10.90 11.86 19.69 31.72
表7：实验6组（即实施例2-2）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.11 19.50 16.90 14.98 34.62 15.74 18.47 10.85 9.82 18.53
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.56 13.72 22.69 29.50 13.63 8.82 10.81 11.88 19.74 31.72
表8：实验7组（即实施例2-3）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.41 19.57 16.08 14.89 34.04 16.77 18.51 9.86 9.74 18.47
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 17.49 13.72 21.69 29.50 13.79 8.97 10.91 11.89 19.74 31.74
表9：实验8组（即实施例2-4）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.98 19.53 16.68 14.91 34.28 15.86 18.49 10.44 9.77 18.55
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.55 13.64 22.83 29.45 13.81 9.87 10.88 11.86 23.61 31.70
表10：实验9组（即实施例3-1）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.99 19.57 16.69 15.99 33.72 14.78 18.96 10.35 10.67 18.38
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.49 12.96 21.66 28.85 13.85 8.86 10.87 11.87 24.71 27.64
表11：实验10组（即实施例3-2）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.02 19.47 16.71 15.91 33.02 17.74 18.05 10.93 10.81 18.44
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.51 12.65 21.84 28.49 13.83 8.81 10.90 11.88 24.66 26.56
表12：实验11组（即实施例3-3）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 9.88 19.39 16.80 15.94 33.93 17.81 18.46 10.86 10.71 18.50
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.53 12.60 21.76 28.51 13.85 8.82 10.88 11.35 21.69 26.68
表13：实验12组（即实施例3-4）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 9.98 19.48 16.71 15.93 33.91 17.72 18.52 10.91 10.74 18.42
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.50 12.65 21.81 28.53 13.80 8.84 10.58 11.87 21.60 26.66
表14：实验13组（即实施例4-1）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.01 19.55 16.69 15.91 33.94 15.72 17.49 9.92 9.75 18.42
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 17.54 12.70 22.75 28.53 13.78 7.80 10.87 11.84 25.68 30.41
表15：实验14组（即实施例4-2）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 9.99 19.53 16.73 15.87 33.94 15.73 17.49 9.91 9.72 18.42
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 17.53 12.55 22.75 28.48 13.88 7.77 10.88 11.87 25.65 30.43
表16：实验15组（即实施例4-3）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.01 19.55 16.71 14.79 33.94 15.77 17.53 10.89 9.68 18.51
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 17.46 12.58 22.78 28.50 13.90 7.95 10.83 11.66 26.65 29.87
表17：实验16组（即实施例4-4）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.58 19.50 16.77 14.89 33.94 15.76 17.66 10.55 9.54 18.54
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 17.65 12.66 22.69 28.46 13.75 7.87 10.90 11.88 26.73 29.69
表18：实验17组（即实施例5-1）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 9.68 19.56 16.76 16.62 33.93 15.73 17.51 10.92 9.34 18.45
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 17.53 12.66 22.87 29.54 11.86 7.75 10.85 11.88 26.65 29.68
表19：实验18组（即实施例5-2）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.28 19.50 16.73 16.89 33.92 15.66 17.50 10.93 9.71 18.45
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 17.53 12.56 22.75 28.47 12.87 7.77 10.81 11.85 25.71 29.89
表20：实验19组（即实施例5-3）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 9.95 19.42 16.81 16.90 33.92 15.77 17.45 10.36 9.76 18.52
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.82 12.55 22.76 28.53 12.82 8.17 10.85 11.88 25.64 30.68
表21：实验20组（即实施例5-4）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.02 19.45 17.77 16.93 34.84 15.75 17.52 10.18 9.73 18.45
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.54 12.67 22.72 28.48 12.79 7.79 10.85 11.86 24.66 30.03
表22：实验21组（即实施例6-1）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 9.99 20.55 17.18 16.94 33.94 15.76 17.56 9.87 9.69 18.49
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.45 12.96 22.97 28.51 12.84 7.56 10.85 12.34 24.64 30.76
表23：实验22组（即实施例6-2）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.83 19.43 17.71 16.89 33.93 15.73 17.49 9.02 9.74 18.44
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.52 12.54 22.77 28.50 12.83 7.86 10.83 12.95 24.57 30.93
表24：实验23组（即实施例6-3）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 9.99 19.47 17.69 16.99 33.92 15.73 17.45 9.88 9.73 18.41
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.54 12.62 22.75 28.52 12.83 7.86 10.87 12.89 24.69 30.70
表25：实验24组（即实施例6-4）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.49 17.51 17.75 16.92 33.96 17.69 17.53 9.49 9.69 18.38
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 16.57 12.69 22.74 28.50 12.80 7.80 10.96 12.89 24.66 30.97
表26：对照2组的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 8.67 16.48 15.59 12.37 30.49 10.67 15.37 7.64 7.13 13.88
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 15.67 10.96 20.10 23.64 10.30 5.62 8.27 9.94 19.72 25.17
表27：对照3组的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 10.44 19.87 16.94 15.09 34.65 16.96 15.45 9.19 9.23 18.18
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 15.57 14.83 20.84 28.83 11.60 7.13 10.94 11.69 24.67 30.57
表28：对照4组(即实施例2的对比例1）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 12.34 21.68 19.55 17.49 37.21 17.83 17.64 12.57 11.87 20.79
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 17.49 15.59 23.37 30.13 15.07 10.67 12.66 14.83 29.47 33.52
表29：对照5组（即实施例2的对比例2）的检测结果（单位：ng/ml）
编号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
均值 8.54 17.19 15.47 14.28 32.17 15.33 15.49 8.46 9.36 17.21
编号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
均值 15.27 11.86 20.95 28.55 13.08 7.11 8.46 11.03 24.39 28.59
表1-29结果显示：对照1组为现有方法，其结果为标准结果；与对照1组相比，实验1-24组的检测结果差异很小，对照2组、对照5组的检测结果较低，对照3组的检测结果差异很小。对照4组的检测结果较高。
对于人群来说，检测值在19-57.6ng/ml之间是正常的，如果采用对照2、4、5组的结果，会使检测结果偏低和偏高，造成检测结果不准确，以致于误诊。
5.2对上述结果进行配对T检验，即每组与对照1组进行比较，其计算结果见表30：
表30：实验组与对照组配对T检验结果
实验1组 实验2组 实验3组 实验4组
结果 0.897 0.617 0.502 0.577
实验5组 实验6组 实验7组 实验8组
结果 0.295 0.369 0.472 0.672
实验9组 实验10组 实验11组 实验12组
结果 0.679 0.621 0.886 0.865
实验13组 实验14组 实验15组 实验16组
结果 0.613 0.672 0.384 0.264
实验17组 实验18组 实验19组 实验20组
结果 0.298 0.358 0.483 0.708
实验21组 实验22组 实验23组 实验24组
结果 0.431 0.523 0.541 0.228
对照2组 对照3组 对照4组 对照5组
结果 9.311 1.819 9.442 8.225
表28结果显示：查配对T检验界值表，T0.05(19)=2.093，与对照1组相比，实验1-24组的结果均小于2.093，说明采用现有技术的方法和本发明的方法最终处理结果非常接近，没有统计学差异；对照3组的检测结果与对照1组接近，而如果采用对照2、4、5组的方法进行试验，其结果与对照1组实验方法检测结果有差异（>2.093）。
结果表明：采用25羟基维生素D3的试剂盒进行检测，本发明提供的试剂对微量全血进行处理，与现有的标准检测方法采取较大量全血，检测结果相同，方法优于现有技术的其他方法。
实验例2：乙肝表面抗原的检测
1、试剂盒来源：乙肝表面抗原胶体金检测卡，购自上海科华生物工程股份有限公司。
2、样本来源：某医院自愿接受检测的患者，采取血液。
3、实验分组：
每个样本采用29种方法进行处理，具体处理方法如下：
对照1组：常规操作，按照说明书要求样本的获取方式：先采集静脉血(取血量3-5ml)，离心，吸取上清液50ul进行试验。
实验1-24组：实施例1-6合计24组，使用本发明时样本获取方式：刺破无名指，取60ul的微量全血加入到试管中，加入60ul本发明实施例提供的试剂，即将60ul的微量全血稀释2倍，震荡混匀，离心，取上清100ul即可进行实验。
对照2组：CN1072020A（申请号为91109885.2）的优先选择的组分，即：氯化钠8.10g/l，枸橼酸钠2.98g/l，枸橼酸钾0.82g/l，庆大霉素6000u/l（u为国际单位，1u=1μg），用双蒸馏水稀释至1000ml，配制稀释液来完成检测。具体操作同实施例1-6的方法。
对照3组：CN1238455A（申请号为98102346.0）的实例1配置的稀释液，即硫酸钠10.8g、氯化钠3.6g、EDTANa21g、磷酸氢二钠1g、硫酸二氢钾0.6g、叠氮钠0.5g，用蒸馏水200g溶解，继续加蒸馏水使其体积达到1升，即得到稀释液。处理血液的方法同实验组的方法。
对照4组：按照实施例2中的对比例1提供的组分，即0.3978gNaH2PO4·2H2O，0.8771g Na2HPO4·12H2O，10g蔗糖，0.05g HSA，0.005g肝素锂，0.04mg庆大霉素，按照实施例2中对比例1的制备方法进行制备。处理血液的方法同实验组的方法。
对照5组：按照实施例2中的对比例2提供的组分，即0.1014gNaH2PO4·2H2O，1.5573g Na2HPO4·12H2O，11g蔗糖，1.5g HSA，0.2g肝素锂，0.1mg庆大霉素，按照实施例2中对比例2的制备方法进行制备。处理血液的方法同实验组的方法。
4、试剂盒操作：
将上述方法取得的样本加入到加样孔中，等待10-15min后读取结果，两条红线即为阳性，只有后面一条红线为阴性，如果后面没有红线时判断试剂卡无效。
5、实验结果：
5.1具体检测结果：见表31-32
表31：对照1组的检测结果
样本号 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6 样本7 样本8 样本9 样本10
血清检测结果 - - - - - - + - - -
样本号 样本11 样本12 样本13 样本14 样本15 样本16 样本17 样本18 样本19 样本20
血清检测结果 - - - + - + - - - -
备注：-为阴性，+为阳性。
表32：微量全血处理试剂及对照组的检测结果
Figure BDA00003379051800151
Figure BDA00003379051800161
Figure BDA00003379051800171
备注：-为阴性，+为阳性。
表31-32结果显示：对照1组是目前标准的方法，其结果为标准结果；与对照1组相比，本发明提供的实验例1-6共24组的检测结果完全一致；对照2组的检测结果中，样本14、样本16的检测结果不同；对照3组的检测结果与对照1组的检测结果相同。对照4组的检测结果中，样本13、样本18检测结果不同；对照5组的检测结果中，样本14、16样本的检测结果不同。
对于人群来说，检测结果是“-”才是正常的，否则是病毒感染者，如果采用对照2组、对照4、5组的检测结果，其检测结果出现差异，造成检测结果不准确，使病人达不到早发现、早诊断的目的，造成误诊。
结果表面：与现有标准方法相比，采用本发明稀释微量全血进行检测，其结果与标准方法相同，没有统计学差异，效果优于现有技术。
实验例3：TBil(总胆红素)的检测
1、试剂盒来源：总胆红素检测试剂盒，购自上海荣盛生物技术有限公司。
2、样本来源：某医院自愿接受检测的患者，采取血液。
3、实验分组：
每个样本采用29种方法进行处理，具体处理方法如下：
对照1组：常规操作，按照说明书要求样本的获取方式：先采集静脉血(取血量3-5ml)，离心，吸取上清液100ul进行试验。
实验1-24组：实施例1-6合计24组，使用本发明时样本获取方式：刺破无名指，取100ul的微量全血加入到试管中，加入100ul本发明实施例提供的试剂，即将100ul的微量全血稀释2倍，震荡混匀，离心，取上清100ul即可进行实验，将所得实验结果乘以稀释倍数，即为原血液样本的含量。
对照2组：CN1072020A（申请号为91109885.2）的优先选择的组分，即：氯化钠8.10g/l，枸橼酸钠2.98g/l，枸橼酸钾0.82g/l，庆大霉素6000u/l（u为国际单位，1u=1μg），用双蒸馏水稀释至1000ml，配制稀释液来完成检测。处理血液的方法同实验组的方法。
对照3组：CN1238455A（申请号为98102346.0）的实例1配置的稀释液，即硫酸钠10.8g、氯化钠3.6g、EDTANa21g、磷酸氢二钠1g、硫酸二氢钾0.6g、叠氮钠0.5g，用蒸馏水200g溶解，继续加蒸馏水使其体积达到1升，即得到稀释液。处理血液的方法同实验组的方法。
对照4组：按照实施例2中的对比例1提供的组分，即0.3978gNaH2PO4·2H2O，0.8771g Na2HPO4·12H2O，10g蔗糖，0.05g HSA，0.005g肝素锂，0.04mg庆大霉素，按照实施例2中对比例1的制备方法进行制备。处理血液的方法同实验组的方法。
对照5组：按照实施例2中的对比例1提供的组分，即0.1014gNaH2PO4·2H2O，1.5573g Na2HPO4·12H2O，11g蔗糖，1.5g HSA，0.2g肝素锂，0.1mg庆大霉素，按照实施例2中对比例2的制备方法进行制备。处理血液的方法同实验组的方法。
4、试剂盒操作
4.1实验原理
样本中的总胆红素在表面活性剂及强酸存在的条件下，与重氮盐反应，形成偶氮胆红素。在分光光度计570nm波长下测定，其值与样本中的TBil的含量成正比。
4.2实验操作
4.2.1根据下表移液至贴有标签的试管中
Figure BDA00003379051800191
4.2.2用570nm波长将试剂空白调“零”点，分别读取样本管和校准管的吸光度
Figure BDA00003379051800192
5、检测结果：见表33
表33：各实验组和对照组的检测结果
Figure BDA00003379051800201
Figure BDA00003379051800211
Figure BDA00003379051800221
表33结果显示：对照1组的检测方法是现有技术中的标准方法，与对照1组的结果相比较，实验1-24组各组的检测结果很接近，差异很小；对照2组的检测结果较低（平均小6），而对照3组的检测结果更低（平均小18）；对照3组和对照2组比，检测结果更低（平均小12），对照4组和对照5组的结果与对照1组接近。
对于人群来说，谷丙转氨酶的检测值在3.42-20umol/l之间是正常的，如果采用对照2和3组的结果，会使检测结果偏低，造成检测结果不准确，使处于边缘的病人达不到早发现的目的，以致于误诊。
6、统计方法：各组分别与对照1组进行配对T检验，其统计结果见表34。
表34：各实验组和对照组配对T检验结果
实验1组 实验2组 实验3组 实验4组
结果 0.761 0.868 0.495 0.818
实验5组 实验6组 实验7组 实验8组
结果 0.372 0.373 0.376 0.404
实验9组 实验10组 实验11组 实验12组
结果 0.612 0.591 0.533 0.282
实验13组 实验14组 实验15组 实验16组
结果 0.407 0.927 0.552 0.518
实验17组 实验18组 实验19组 实验20组
结果 0.334 0.675 0.467 0.676
实验21组 实验22组 实验23组 实验24组
结果 0.722 0.416 0.622 0.496
对照2组 对照3组 对照4组 对照5组
结果 10.510 10.073 1.634 1.351
7、统计结果分析：查配对T检验界值表，T0.05(19)=2.093，上表实验组的结果均小于2.093，说明采用现有技术的方法和本发明的方法最终处理结果非常接近，没有统计学差异；而采用对照2组和对照3组的方法进行试验，其结果与对照实验方法检测结果有差异（>2.093)，说明对照2组的发明不同于本发明；对于对照4和5组来说，均与对照1组接近。
结果表明：采微量全血后，用本发明提供的试剂处理，可以与现有技术方法采取较大量血液检测的结果相同，效果优于其他现有技术。对照2组与本发明相比，最大的区别在于没有缓冲系统，使整个系统没有缓冲作用，从而不稳定；对照3组与本发明最大的区别在于使用了叠氮钠作为防腐剂，叠氮钠对于某些生化反应是有很大影响的；对照4和5组与本发明最大的区别在于使用了超出本发明的保护剂的范围，这样会使本底过高或抑制过度，从而影响其检测限或检测值。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种处理微量全血的试剂，所述试剂含有以下成分：缓冲液、渗透压维持剂、保护剂、抗凝剂和防腐剂。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述100ml试剂为含有以下成分的水溶液：浓度为5-100mM，pH为6.8-7.6的缓冲液0.01-5.0g、渗透压维持剂0.5-15g、保护剂0.05-3g、抗凝剂0.005-1g和防腐剂0.03-150mg。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述100ml试剂为含有以下成分的水溶液：浓度为5-60mM，pH为7.2-7.5的缓冲液0.02-4.0g、渗透压维持剂0.6-11.5g、保护剂0.1-1g、抗凝剂0.005-0.7g和防腐剂0.04-100mg。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂，其特征在于，所述试剂还含有以下成分：植物血球凝集素0.1-0.5g或红细胞抗体0.02-0.2ml。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂，其特征在于，所述缓冲液为磷酸缓冲系统、硼酸缓冲系统、tris-Hcl缓冲系统或巴比妥缓冲系统；优选地，所述磷酸缓冲系统为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的组合、磷酸二氢钠和磷酸氢二钾的组合；硼酸缓冲系统为硼酸和氢氧化钠的组合、硼酸和硼砂组合；tris-Hcl缓冲系统为tris和盐酸；巴比妥缓冲系统为巴比妥钠和盐酸。
6.根据权利要求1-4任一项所述的试剂，其特征在于，所述渗透压维持剂为氯化钠或蔗糖。
7.根据权利要求1-4任一项所述的试剂，其特征在于，所述保护剂为BSA、海藻糖或HSA中的一种或几种。
8.根据权利要求1-4任一项所述的试剂，其特征在于，所述抗凝剂为EDTA或其盐、肝素或其盐、草酸盐或枸橼酸盐中的一种或几种；所述防腐剂为proclin300或庆大霉素中的一种或两种。
9.一种制备权利要求1-8任一项所述试剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：按照配比称取各成分，加入80ml水，混匀，然后调节pH值为6.8-7.6，定容，即得。
10.权利要求1-8任一项所述试剂在处理微量全血中的应用；优选地，所述应用包括以下步骤：根据临床检测需要的样本量，从耳垂、手指末端、足跟等处采取到的微量全血，然后直接用试剂稀释2-1000倍，混匀。
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