CN104849224A - 一种补体c3检测试剂盒及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种补体C3检测试剂盒，所述试剂盒为液体双试剂，包括试剂R1与R2，所述试剂R1含PH6.0磷酸盐缓冲液，吐温-20(Tween 20)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，氯化钠，聚乙二醇(PEG6000)，叠氮钠；试剂R2为含有补体C3胶乳颗粒的溶液，其特点在于应用化学方法交联，通过水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使羊抗人补体C3抗血清与羧化聚苯乙烯胶乳共价交联，形成补体C3胶乳试剂。本试剂灵敏度高，特异性强，试剂配制简单，值得进一步推广使用。

Description

一种补体C3检测试剂盒及其制备

技术领域：

本发明属于生物技术领域，提供一种补体C3检测试剂盒及其制备，具有灵敏度高，特异性强，试剂配制简单的特点，值得进一步推广使用。

背景技术：

C3是血清中含量最高的补体成分，由巨噬细胞、单核细胞、淋巴组织、骨髓、腹膜和肝脏等合成的一种β球蛋白，在C3转化酶的作用下，裂解成C3a和C3b两个片段，在补体经典激活途径和旁路激活途径中均发挥重要作用。

C3是补体各成分中含量最高的一种，且是补体激活途径中最重要的环节，故其含量的测定非常重要。C3增多与减少与总补体活性基本相符，但更为敏感。约70％-80％的急性肾小球肾炎、狼疮性肾炎患者血清C3含量减少，病情缓解后可恢复正常，故C3的测定不仅有助于诊断，还可以观察疗效和监测预后。C3降低还可见于自身免疫性疾病、新生儿呼吸窘迫综合征、菌血症、组织损害和慢性肝炎。

补体C3的检测方法有单向免疫扩散法、ELISA法、免疫透射比浊法等。单向免疫扩散法费时，变异大，结果不易观察，测量直径不精确；ELISA法重复性不好，易出现假阳性，受温度和时间影响最大；免疫透射比浊法相对优于之前两种方法，但存在所需抗血清量大的缺点。本发明采用胶乳增强免疫比浊法，不仅灵敏度高，准确性好，不费时的优点，而且所需的样本量极少，更加经济节约。

发明内容：

本发明的目的在于，大量制备补体C3胶乳试剂，使用所获得的补体C3胶乳试剂制备补体C3检测试剂盒。 

本发明的技术方案：应用化学方法交联，通过水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使羊抗人补体C3抗血清与羧化聚苯乙烯胶乳共价交联，形成补体C3胶乳试剂，使用所获得的补体C3胶乳试剂制备补体C3检测试剂盒。

本发明中，包括补体C3胶乳试剂的制备及补体C3检测试剂盒的制备。

补体C3胶乳试剂的制备：

取粒径为100nm浓度为5％胶乳微球1ml，加入100mmol/L，PH6.0的磷酸盐缓冲液9ml，混合均匀后分别加入5mg水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌20min，2-8℃离心30min(转速12000)，用100mmol/L，PH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤三次，除去上清液，取沉淀用100mmol/L，PH6.0的磷酸盐缓冲液1ml重悬，并加入200μl羊抗人补体C3抗血清，室温搅拌5h，2-8℃离心30min(转速12000)，沉淀用含0.05％吐温-20(Tween 20)，100mmol/L，PH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤三次，除去上清液，所得沉淀用100mmol/L，PH6.0的磷酸盐缓冲液进行稀释，2-8℃密封保存。

补体C3检测试剂盒的制备：

本检测试剂盒包括试剂R1与R2，具体成分如下：

补体C3检测试剂盒的使用：

1)检测仪器：具有340nm波长、37℃恒温装置的生化分析仪。

2)待测样本：新鲜不溶血血清，2-8℃可稳定七天。-20℃可稳定一个月。

3)具体检测程序：

4)计算结果：补体C3浓度(g/L)＝ΔAT/ΔAS×Cs

ΔAT：样品管吸光度

ΔAS：校准管吸光度

Cs：校准品浓度值

5)参考值范围：0.9～1.5g/L

6)精密度：批内CV≤4％；批间相对极差≤6％。

7)准确度：相对偏差控制在±10％内。

8)线性范围：在0.1～3g/L范围内，相关系数r≥0.990。

附图说明：

图1：采用奥林巴斯400全自动生化分析仪，对5个梯度浓度的试剂进行测定，并对测定值进行相关分析。其中X轴表示的是稀释浓度，Y轴表示的是测定值均值。相关系数：r²＝0.9963，线性方程为：y＝1.0272x-0.0007。

图2：分别采用本发明试剂与市售试剂A，采用奥林巴斯400全自动生化分析仪，对50份样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，并对测定值进行相关分析。其中X轴表示的是本发明试剂的测定值，Y轴表示的是市售试剂A的测定值。相关系数：r²＝0.9948，线性方程为：y＝1.041x-0.054。

具体实施方式：

实施例1

1)精密度测定：同一样品中连续抽取20次进行测定，计算测定值的均数、标准差和变异系数，  $\mathrm{CV}=\frac{\mathrm{SD}}{\stackrel{\‾}{X}}\×100\%$

表1精密度检测结果

变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的。表1中CV值小于3％，表明本发明方法具有优良的精密度。

2)准确度测定：用同一质控品，重复测定3次，取平均值，与质控品靶值相对偏差应在±10％范围内。

表2准确度检测结果

表2中相对偏差CB＝-2.00％，处于±10％范围内，表明本发明方法具有优良的准确度。

3)线性测定：使用去离子水将试剂稀释成5个梯度浓度，每个梯度浓度检测3次，取平均值，对测定值与预期值作回归分析，计算r值和相对偏差(结果见图1，单位g/L)。

表3线性相关检测结果

通过表3得到相关系数：r²＝0.9963，线性方程为：y＝1.0272x-0.0007，结果表明本试剂相关性良好。

4)稳定性测定：将本发明检测试剂盒分别放置在室温和4℃冰箱，以新鲜配制的3.0g/L人补体C3标准品替代样品，每隔1个月测定1次，记录出现凝集所需时间，结果见表4。结果表明，试剂盒在4℃冰箱放置至少6个月以上不会有明显活性丧失，但不宜在室温存放。

表4稳定性检测结果

室温下	出现凝集的时间(min)	4℃下	出现凝集的时间(min)
				新配制	1	新配制	1
存放1个月	2	存放1个月	1
				存放2个月	不凝集	存放2个月	1
存放3个月	不凝集	存放3个月	1
				存放4个月	不凝集	存放4个月	1
存放5个月	不凝集	存放5个月	1
				存放6个月	不凝集	存放6个月	1

实施例2本发明试剂与市售试剂A的线性相关测定：

分别采用本发明试剂与市售试剂A，采用奥林巴斯400全自动生化分析仪，对50份样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，并对测定值进行相关分析(结果见图2，X轴表示的是本发明试的测定值，Y轴表示的是市售试剂A的测定值)。相关系数：r²＝0.9948，线性方程为：y＝1.041x-0.054，结果表明本试剂与市售试剂相关性良好。

表4线性相关检测结果

Claims (4)

1.本发明提供一种补体C3检测试剂盒，所述试剂盒为液体双试剂，包括试剂R1与R2，所述试剂R1含PH6.0磷酸盐缓冲液，吐温-20(Tween 20)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，氯化钠，聚乙二醇(PEG6000)，叠氮钠；试剂R2为含有补体C3胶乳颗粒的溶液，其特点在于应用化学方法交联，通过水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使羊抗人补体C3抗血清与羧化聚苯乙烯胶乳共价交联，形成补体C3胶乳试剂。

2.根据权利要求1所述化学交联方法制备补体C3胶乳试剂，其特征在于所用的羧化聚苯乙烯胶乳粒径为100nm。

3.根据权利要求1所述化学交联方法制备补体C3胶乳试剂，其特征在于羧化聚苯乙烯胶乳与羊抗人C3抗血清共价交联过程中分别添加水溶性碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

4.一种补体C3检测试剂盒其特征在于所述的液体双试剂，包括试剂R1与R2，两者的成分如下：

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