CN103604931A - 一种人s100蛋白检测试剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人S100蛋白检测试剂及制备方法，特别是采用乳胶增强免疫比浊法检测人S100蛋白的试剂及制备方法，包括试剂R1、试剂R2以及校准品，其特征在于：所述试剂R1为pH值为7.0-8.0的改性缓冲液；所述试剂R2为抗人S100蛋白抗体胶乳试剂；所述校准品为含有定量的S100蛋白的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然S100蛋白标准液。本发明与现有技术相比，具有如下特点：①准确性高（与化学发光免疫分析法的相关性R2为0.9956-0.9995）。②检测快速（从测定开始到得出结果只需要10分钟）。能够在常规生化仪上进行大批量样本测定，大大提高了检测工作效率。该试剂的制备方法操作简便，原料易得，成本不高，适合各类医学研究单位以及常规实验室应用。

Description

一种人S100蛋白检测试剂及制备方法
技术领域
本发明涉及一种人S100蛋白检测试剂及制备方法，特别是采用乳胶增强免疫比浊法检测人S100蛋白的试剂及制备方法，可应用在检验医学领域。
背景技术
人中枢神经蛋白（S-100蛋白）主要集中在中枢神经系统的星形胶质细胞及相应的肿瘤细胞内，S-100分子由α和β亚基组成，其分子量为21000，生物半衰期22小时。脑脊液中的S-100蛋白与年龄有关，随着年龄的增加而增高，但血浆中的S-100蛋白浓度与年龄、性别无确切关系。当中枢神经系统细胞损伤时S100蛋白从胞液中渗出进入脑脊液，再经受损的脑血屏障进入血液。因此脑脊液和血液中S100蛋白增高是中枢神经系统损伤特异和敏感的生化标志。
目前，临床已经使用S-100蛋白单克隆抗体对临床标本进行检测，从检测角度上来说，目前临床上用于测定S-100的方法主要有放免法、ELISA法、化学发光法等。
过去以放免为代表的人S100蛋白(S-100)测定试剂受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。
酶联免疫法（ELISA）自动化程度不高，且受人为因素影响较大，重复性差，整个反应测定时间也很长（至少需要40分钟）。
化学发光法(CLIA)是利用化学发光物质经催化剂催化和氧化剂氧化，形成一个激发态的中间体，这种激发态的中间体回到稳定基态时，发出光子，利用发光信号测量仪测量光子数，从而间接测定浓度。该方法又分为两种，一种是直接标记法，属于瞬间发光型，很难保证测试结果的稳定性和重复性，而且需要特殊的检测仪器。不便于常规实验室开展。第二中生物素-亲和素标记电化学发光免疫试剂法，需要配套昂贵的全自动电化学发光检测仪，常规实验室无法开展，而且给患者带来不必要的费用，增加患者负担。
发明内容
本发明的目的在于克服上述问题，提供一种人S100蛋白检测试剂；所提供的试剂具有准确度高、测定时间短（最多只需要15分钟、甚至更短）、重复性好，操作简单、适用于各种类型的生化分析仪的特点；所提供的试剂制备方法具有制作方便以及成本不高的特点。
人S100蛋白检测试剂及制备方法，作为两项发明创造，具有共同的特定技术特征：通过胶乳微粒和抗人S100抗体的偶联，利用胶乳增强免疫比浊法检测人血清S100含量，属于一个相同的发明构思，符合单一性要求。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种人S100蛋白检测试剂，包括试剂R1、试剂R2以及校准品，其特征在于：所述试剂R1为PH值为7.0-8.0的改性缓冲液；所述试剂R2为抗人S100蛋白抗体胶乳试剂；所述校准品为含有定量的S100蛋白的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然S100蛋白。
前述的一种人S100蛋白检测试剂，所述的试剂用于人外周血血清样本的测定。
前述的一种人S100蛋白检测试剂，所述的试剂R1组成如下：
Figure BDA0000414529740000031
所述缓冲液是磷酸盐缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸（TAPS）缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)、3-吗啉丙磺酸（MOPS）缓冲液、硼酸缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合液；缓冲液浓度20-200mmol/L，pH值7.0-8.0；
所述电解质是阴离子电解质或阳离子电解质，优选阳离子中的氯化钠（NaCl），浓度为50-200mmol/L；
所述促进剂（即反应加速剂）为聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或两种以上任意比例的混合，浓度优选为0.05-30g/L；
所述表面活性剂为吐温20，浓度为0.2-1.0g/L；
所述防腐剂为叠氮钠，浓度为2-4mmol/L；
所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠,浓度为3-5mmol/L。
前述的一种人S100蛋白检测试剂，试剂R2采用的是抗人的S100蛋白抗体与胶乳颗粒相偶联。经过离心(过滤)的方法去掉未反应的偶联剂以及未反应的抗体，在含有稳定剂和防腐剂的缓冲液中分散而成。主要包含抗人单(多)克隆抗体胶乳微球、缓冲液、稳定剂和防腐剂。其中乳胶微球直径为20-500nm。
所述试剂R2所选用的抗体为兔抗人S100蛋白单克隆抗体、鼠抗人S100蛋白单克隆抗体、羊抗人S100蛋白单克隆抗体一种或者几种混合。也可以选兔抗人S100蛋白多克隆抗体、鼠抗人S100蛋白多克隆抗体，羊抗人S100蛋白多克隆抗体其中一种。
所述试剂R2中的稳定剂选自小牛白蛋白，甘氨酸，明胶，吐温20，曲拉通一种或者几种。
前述的一种人S100蛋白检测试剂，所述的胶乳微球的基本材质是聚苯乙烯或共聚苯乙烯，表面用羧基基团COOH修饰或不作任何修饰；羧基胶乳微球直径为80-300nm。
前述的一种人S100蛋白检测试剂，所述的校准品包括5份形成S100蛋白系列浓度的参考校准品；5份参考校准品中的S100蛋白含量由低到高分别为20pg/ml、60pg/ml、180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml；或者所述S100蛋白校准品是单点高浓度的S100蛋白参考校准品；其中校准品的组成如下：
Figure BDA0000414529740000051
余量为水；适量是指满足前述的S100蛋白浓度要求的用量。
前述的一种人S100蛋白检测试剂，所述的试剂能检测S100蛋白浓度在0.02ng/ml-1.6ng/ml样本(通过最低检出限和定标曲线的最高值确定)；当样本浓度超过该范围，先对样本进行稀释处理。
一种人S100蛋白检测试剂的制备方法，其特征在于：按照以下步骤进行：
①R1试剂制备：
按配方量将缓冲液、促进剂、防腐剂、稳定剂、电解质以及纯化水混合均匀，调pH值至7.0-8.0；
②所述R2试剂抗人S100蛋白抗体的胶乳试剂的制备包括以下步骤：
步骤1：将胶乳在PH6.0的溶液中活化；
取羧基胶乳微球用缓冲液稀释成浓度为0.01mg/ml的悬浮液，按1ml的羧基胶乳微球悬浮液加20mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDAC羧基活化剂）和40mg的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（NHS）的比例，即加入EDAC和NHS，混匀后在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
步骤2：用缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，去掉溶液中未反应的碳化二亚胺，并将胶乳微球在纯化水中悬浮得羧基胶乳微球悬浮液，使其浓度控制为0.01mg/ml；
步骤3：将抗S100蛋白抗体溶于缓冲溶液中，使抗人S100蛋白抗体的蛋白质浓度为5ng/ml；
步骤4：取步骤2中的羧基胶乳微球悬浮液1ml立即加入步骤3中的抗人S100蛋白抗体1ml；使该混合液中羧基胶乳微球、抗人S100蛋白抗体和缓冲溶液的浓度分别为0.005mg/ml、2.5mg/ml、25mmol/L；
步骤5：将混合物在37℃反应:4小时，不断搅拌；
步骤6：按1ml反应混合物加2.5μl的乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应10-30分钟，不断搅拌；
步骤7：离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用缓冲液稀释，使抗人S100蛋白抗体胶乳颗粒浓度为0.002-0.01mg/ml，然后加入稳定剂、防腐剂溶解混匀后即得试剂R2；
③所述校准品：
先按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合并分成5份混合液，然后按照需要的S100蛋白参考校准品浓度，将相应量的10ng/ml的S100蛋白纯品分别加入上述混合液中，获得形成系列浓度的5份参考校准品；5份参考校准品中的S100蛋白含量由低到高分别为20pg/ml、60pg/ml、180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml；
或者按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合后得混合液，然后在混合液中加入一定量的10ng/ml的S100蛋白纯品，获得单点高浓度S100蛋白参考校准品；使用时再用生理盐水稀释成多个不同浓度的参考校准品；制得的S100蛋白参考校准品能与样品比较，并能测定样品中S100蛋白的含量。
前述的一种人S100蛋白检测试剂的制备方法，在步骤2中，去掉溶液中所含的未反应的物质时，采用高速离心机或者单层微孔滤膜进行过滤；离心机转速为15000转/分，单层微孔滤膜的孔径为0.22um。
前述的一种人S100蛋白检测试剂的制备方法，在步骤7中，所述的稳定剂是小牛白蛋白、甘氨酸、明胶、吐温20、曲拉通的一种或者几种。
本发明检测的原理是：利用抗原抗体反应，先加入试剂R1使血清中的S100蛋白的位点暴露，当加入抗人的S100蛋白胶乳颗粒溶液，使溶液中的抗原抗体反应形成不溶于溶液的抗原抗体复合物，从而产生一定的浊度，在人血清中S100蛋白的含量在一定的范围内S100蛋白的含量与浊度成正比。再通过标准曲线进行计算，从而得到S100蛋白的含量。
本发明与现有技术相比，具有如下特点：
①准确性高（与化学发光免疫分析法的相关性R2为0.9956-0.9995）。
②检测快速（从测定开始到得出结果只需要10分钟）。能够在常规生化仪上进行大批量样本测定，大大提高了检测工作效率。该试剂的制备方法操作简便，原料易得（全部选用外购原料），成本不高，适合各类医学研究单位以及常规实验室应用。
附图说明
图1为实施例1中通过本发明方法所得S100检测试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的S100测得值的相互关系；
图2为实施例2中通过本发明方法所得S100检测试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的S100测得值的相互关系；
图3为实施例3中通过本发明方法所得S100检测试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的S100测得值的相互关系；
图4为实施例4中通过本发明方法所得S100检测试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的S100测得值的相互关系。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明检测试剂及校准品所需主要原料：
1、抗人S100蛋白抗体：有许多商品化的抗人S100抗体可供选择，如美国R&D公司、Abnova公司、Santa公司、Abcam公司等；该抗体仅与人S100反应，与其它抗原无免疫交叉反应，可以是多克隆抗体或单克隆抗体，只要能与胶乳微球偶联即可。其抗人S100抗体可以是兔抗（即羊抗人S100；以下同）、也可以是羊抗或鼠抗。只要采用已知的免疫电泳法测定，该抗体只与人S100之间呈现单一的沉淀，抗人S100抗体的滴度≥1.0mg/ml。
2、胶乳微球，有许多商品化的纳米微球可供选择，如德国Merck公司、日本UNF公司和美国Thermo公司；其基本材质是聚苯乙烯或共聚苯乙烯，表面用羧基基团（COOH）修饰，也可不用作任何修饰，可以根据选择抗体和微球的结合方法不同而选择不同的微球（如化学交联法、物理吸附法）。本法优选羧基基团修饰的胶乳微球（羧基胶乳微球的粒径进一步优选为80nm-300nm）。
3、S100蛋白：购自美国Santa公司，用于制备本试剂所需参考校准品。
下面将结合实施例详细说明本发明试剂，但这些实施例不应认为是限制本发明的定义。
实施例一：
1.所述R1试剂：HEPES缓冲液
Figure BDA0000414529740000091
用纯化水800ml将上述原料溶解后，再补加纯化水定容至1L，然后用盐酸或氢氧化钠调PH至8.0。
2.所述R2试剂：
步骤1：取300nm的羧基胶乳微球用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液稀释成0.01mg/ml的悬浮液；按1ml的羧基胶乳微球悬浮液加20mg EDAC和40mg的NHS的比例，加入EDAC和NHS并立即混匀后在室温将混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
步骤2：用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的NHS和EDAC，并将胶乳微球在纯化水中悬浮，得浓度为0.01mg/ml的羧基胶乳微球悬浮液；
步骤3：将鼠抗人S100抗体溶于50mmol/L、PH8.5的TAP盐缓冲溶液中，使鼠抗人S100抗体的蛋白质浓度为5ng/ml；
步骤4：取步骤2中的羧基胶乳微球悬浮液1ml立即加入步骤3中的鼠抗人S100蛋白抗体1ml；使该混合液中羧基胶乳微球、抗人S100蛋白抗体和缓冲溶液的浓度分别为0.005mg/ml、2.5ng/ml、25mmol/L；
步骤5：将混合物在37℃反应:4小时，不断搅拌；
步骤6：按1ml反应混合物加2.5μl的乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应15分钟，不断搅拌；
步骤7：离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用50mmol/L、PH7.2的Tris缓冲液稀释，使鼠抗人S100蛋白抗体胶乳颗粒浓度为0.002ml/ml，然后加入牛血清白蛋白（稳定剂）4mmol/L、叠氮钠（防腐剂）4mmol/L溶解混匀后即得S100蛋白试剂。离心转速15000转/分
3.所述标准品
Figure BDA0000414529740000101
其余为纯化水
按照需要的S100校准品浓度将相应的S100纯品10ng/ml加入上述缓冲液中，制备得形成系列浓度的5个参考校准品；5个参考校准品中S100含量由低到高分别为20pg/ml、60pg/ml、180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml。
实施例二：
1.所述R1试剂：Tris缓冲液
Figure BDA0000414529740000102
用纯化水800ml将上述原料溶解后，再补加纯化水定容至1L，然后用盐酸或氢氧化钠调PH至7.4。
2.所述R2试剂：
步骤1：取100nm的羧基胶乳微球用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液稀释成0.01mg/ml的悬浮液；按1ml的羧基胶乳微球悬浮液加20mg EDAC和40mg的NHS的比例，加入EDAC和NHS并立即混匀后在室温将混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
步骤2：用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的NHS和EDAC，并将胶乳微球在纯化水中悬浮，得浓度为0.01mg/ml的羧基胶乳微球悬浮液；
步骤3：将鼠抗人S100抗体溶于50mmol/L、PH8.5的TAP盐缓冲溶液中，使鼠抗人S100抗体的蛋白质浓度为5ng/ml；
步骤4：取步骤2中的羧基胶乳微球悬浮液1ml立即加入步骤3中的鼠抗人S100蛋白抗体1ml；使该混合液中羧基胶乳微球、抗人S100蛋白抗体和缓冲溶液的浓度分别为0.005mg/ml、2.5ng/ml、25mmol/L；
步骤5：将混合物在37℃反应:4小时，不断搅拌；
步骤6：按1ml反应混合物加2.5μl的乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应15分钟，不断搅拌；
步骤7：离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用50mmol/L、PH7.6的HEPES缓冲液稀释，使鼠抗人S100蛋白抗体胶乳颗粒浓度为0.004ml/ml，然后加入牛血清白蛋白（稳定剂）5mmol/L、叠氮钠（防腐剂）5mmol/L溶解混匀后即得S100蛋白试剂。离心转速15000转/分
3.所述标准品
Figure BDA0000414529740000112
Figure BDA0000414529740000121
其余为纯化水
按照需要的S100校准品浓度将相应的S100纯品10ng/ml加入上述缓冲液中，制备得形成系列浓度的5个参考校准品；5个参考校准品中S100含量由低到高分别为20pg/ml、60pg/ml、180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml。
实施例三：
1.所述R1试剂：甘氨酸缓冲液
Figure BDA0000414529740000122
用纯化水800ml将上述原料溶解后，再补加纯化水定容至1L，然后用盐酸或氢氧化钠调PH至8.0。其中Thesit为聚氧乙烯月桂醚类，与吐温-20属于同类。
2.所述R2试剂：
步骤1：取200nm的羧基胶乳微球用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液稀释成0.01mg/ml的悬浮液；按1ml的羧基胶乳微球悬浮液加20mg EDAC和40mg的NHS的比例，加入EDAC和NHS并立即混匀后在室温将混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
步骤2：用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的NHS和EDAC，并将胶乳微球在纯化水中悬浮，得浓度为0.01mg/ml的羧基胶乳微球悬浮液；
步骤3：将鼠抗人S100抗体溶于50mmol/L、PH8.5的TAP盐缓冲溶液中，使鼠抗人S100抗体的蛋白质浓度为5ng/ml；
步骤4：取步骤2中的羧基胶乳微球悬浮液1ml立即加入步骤3中的鼠抗人S100蛋白抗体1ml；使该混合液中羧基胶乳微球、抗人S100蛋白抗体和缓冲溶液的浓度分别为0.005mg/ml、2.5ng/ml、25mmol/L；
步骤5：将混合物在37℃反应:4小时，不断搅拌；
步骤6：按1ml反应混合物加2.5μl的乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应15分钟，不断搅拌；
步骤7：离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用50mmol/L、PH7.2的硼酸盐缓冲液稀释，使鼠抗人S100蛋白抗体胶乳颗粒浓度为0.006ml/ml，然后加入牛血清白蛋白（稳定剂）4mmol/L、叠氮钠（防腐剂）4mmol/L溶解混匀后即得S100蛋白试剂。离心转速15000转/分
3.所述标准品
Figure BDA0000414529740000131
其余为纯化水
按照需要的S100校准品浓度将相应的S100纯品10ng/ml加入上述缓冲液中，制备得形成系列浓度的5个参考校准品；5个参考校准品中S100含量由低到高分别为20pg/ml、60pg/ml、180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml。
实施例四：
1.所述R1试剂：磷酸盐缓冲液
用纯化水800ml将上述原料溶解后，再补加纯化水定容至1L，然后用盐酸或氢氧化钠调PH至7.2。
2.所述R2试剂：
步骤1：取80nm的羧基胶乳微球用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液稀释成0.01mg/ml的悬浮液；按1ml的羧基胶乳微球悬浮液加20mgEDAC和40mg的NHS的比例，加入EDAC和NHS并立即混匀后在室温将混合物反应15-30分钟，不断搅拌；
步骤2：用50mmol/L、PH6.0的MES缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，除去未反应的NHS和EDAC，并将胶乳微球在纯化水中悬浮，得浓度为0.01mg/ml的羧基胶乳微球悬浮液；
步骤3：将羊抗人S100单克隆抗体溶于50mmol/L、PH8.5的TAP盐缓冲溶液中，使羊抗人S100单克隆抗体的蛋白质浓度为5ng/ml；
步骤4：取步骤2中的羧基胶乳微球悬浮液1ml立即加入步骤3中的羊抗人S100蛋白单克隆抗体1ml；使该混合液中羧基胶乳微球、抗人S100蛋白抗体和缓冲溶液的浓度分别为0.005mg/ml、2.5ng/ml、25mmol/L；
步骤5：将混合物在37℃反应:4小时，不断搅拌；
步骤6：按1ml反应混合物加2.5μl的乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应15分钟，不断搅拌；
步骤7：离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用50mmol/L、PH7.2的MOPS缓冲液稀释，使抗人S100蛋白抗体胶乳颗粒浓度为0.01ml/ml，然后加入牛血清白蛋白（稳定剂）3mmol/L、叠氮钠（防腐剂）3mmol/L溶解混匀后即得S100蛋白试剂。离心转速15000转/分。
3.所述标准品
Figure BDA0000414529740000141
其余为纯化水
按照需要的S100校准品浓度将相应的S100纯品10ng/ml加入上述缓冲液中，制备得形成系列浓度的5个参考校准品；5个参考校准品中S100含量由低到高分别为20pg/ml、60pg/ml、180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml。
所述S100检测试剂临床试验：
1、检测数据
本专利检测标本采自1100例正常体检、供血者。样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病，半年内无输血和大手术史，无妊娠期和哺乳期妇女。将测值进行统计学分析，得出正常外周血血清S100蛋白浓度参考范围：＜0.12ng/ml。本数据仅供参考，不同地区、不同个体以及采用不同方法进行检测，所测得的S100水平也会有所不同，建议各实验室建立自己的正常值范围。不可仅凭本方法得出的S100值作出诊断，仅作为中间数据参考作用，应结合临床其他资料分析结果，包括病人的具体情况和治疗状况。通过其他方法得到的样品中的S-100浓度值与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。超出试剂盒测定范围的样本，系统将无法给出确切的数值。如欲测定其确切的结果，建议稀释后再进行测定。本品可用于外周血血清样本的测定，用于其他体液样本中S-100浓度测定的可靠性未得到充分确认。
2.本发明试剂性能指标
①本试剂与化学发光法试剂相关线性评估
测定方法：日立7060全自动生化分析仪
校准品浓度：20pg/ml、60pg/ml、180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml。
测定波长：主波长：340nm副波长：800nm
试剂比例：R1：R2：S＝200ul：50ul：10ul
读点方式：在试剂R1与样品加入，反应5分钟，读点A1，然后加入R2后，反应5分钟，再读点A2，计算吸光度的变化。
②灵敏度测定
用本发明所述的试剂盒对空白样本(含有5％牛血清的生理盐水)重复测定20次，最低检测限度为空白的均值浓度加上二个标准差，得到最低检测限度。
③精密性检测
同时评价批内和批间不精密度：每天做2个批次的测试，每批测试时，对同一样品作双份测量，共做20天。评估结束时共有40对，即80个测试结果。从40批次测量中双份结果的差值求出批内精密度。从所有80个数据计算出批间精密度。
实施例性能指标检测结果
实施例一：
表1与图1显示实施例1中通过本发明方法所得S100试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的S100测得值的相互关系。经回归分析：
y=-0.0001X2+1.0454-1.7244；R2=0.9978,显示出本实施例1与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。
本实施例1灵敏度测定，显示最低检测限度为25pg/ml。
本实施例1精密度检测显示，批内精密度CV为8.9%；批间精密度为10.8%.
表1：
Figure BDA0000414529740000161
实施例二：
表2与图2显示实施例2中通过本发明方法所得S100试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的S100测得值的相互关系。经回归分析：y=0.9859x+2.1516；R2=0.9956显示出本实施例2与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。
本实施例2灵敏度测定，显示最低检测限度为22pg/ml。
本实施例2精密度检测显示，批内精密度CV为9.4%；批间精密度为11.5%。
表2：
Figure BDA0000414529740000171
实施例3：
表3与图3显示实施例3中通过本发明方法所得S100试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的S100测得值的相互关系。经回归分析：
y=1.0054x-0.1891；R2=0.9994显示出本实施例3与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。
本实施例3灵敏度测定，显示最低检测限度为15pg/ml。
本实施例3精密度检测显示，批内精密度CV为8.4%；批间精密度为10.2%。
表3：
实施例4：
表4与图4显示实施例4中通过本发明方法所得S100试剂的测定值与化学发光免疫分析法所得的S100测得值的相互关系。经回归分析：y=1.0152x-0.2805；R2=0.9995,显示出本实施例4与化学发光免疫分析法具有良好的相关性。
本实施例4灵敏度测定，显示最低检测限度为10pg/ml。
本实施例4精密度检测显示，批内精密度CV为9.4%；批间精密度为10.3%。
表4：
Figure BDA0000414529740000191
上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种人S100蛋白检测试剂，包括试剂R1、试剂R2以及校准品，其特征在于：所述试剂R1为PH值为7.0-8.0的改性缓冲液；所述试剂R2为抗人S100蛋白抗体胶乳试剂；所述校准品为含有定量的S100蛋白的重组蛋白或者是从人血清中提取出来的天然S100蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种人S100蛋白检测试剂，其特征在于：
所述的试剂用于人外周血血清样本的测定。
3.根据权利要求2所述的一种人S100蛋白检测试剂，其特征在于，
所述的试剂R1组成如下：
Figure FDA0000414529730000011
所述缓冲液是磷酸盐缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-1乙烷磺酸(HEPES)缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸（TAPS）缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)、3-吗啉丙磺酸（MOPS）缓冲液、硼酸缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合液；缓冲液浓度20-200mmol/L，pH值7.0-8.0；
所述电解质是阴离子电解质或阳离子电解质，浓度为50-200mmol/L；
所述促进剂为聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或两种以上任意比例的混合，浓度为0.05-30g/L；
所述表面活性剂为吐温20，浓度为0.2-1.0g/L；
所述防腐剂为叠氮钠，浓度为2-4mmol/L；
所述稳定剂是乙二胺四乙酸二钠,浓度为3-5mmol/L。
4.根据权利要求3所述的一种人S100蛋白检测试剂，其特征在于：试剂R2由抗人单克隆或多克隆抗体胶乳微球、缓冲液、稳定剂和防腐剂组成；
抗体为兔抗人S100蛋白单克隆抗体、鼠抗人S100蛋白单克隆抗体、羊抗人S100蛋白单克隆抗体一种或者几种混合；或者为兔抗人S100蛋白多克隆抗体、鼠抗人S100蛋白多克隆抗体、羊抗人S100蛋白多克隆抗体的其中一种。
所述稳定剂选自小牛白蛋白、甘氨酸、明胶、吐温20、曲拉通的一种或者几种。
5.根据权利要求4所述的一种人S100蛋白检测试剂，其特征在于：所述的胶乳微球的基本材质是聚苯乙烯或共聚苯乙烯，表面用羧基基团COOH修饰或不作任何修饰；羧基胶乳微球直径为80-300nm。
6.根据权利要求5所述的一种人S100蛋白检测试剂，其特征在于：
所述的校准品包括5份形成S100蛋白系列浓度的参考校准品；5份参考校准品中的S100蛋白含量由低到高分别为20pg/ml、60pg/ml、180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml；或者所述S100蛋白校准品是单点高浓度的S100蛋白参考校准品；其中校准品的组成如下：
Figure FDA0000414529730000031
余量为水；适量是指满足前述的S100蛋白浓度要求的用量。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种人S100蛋白检测试剂，其特征在于：所述的试剂能检测S100蛋白浓度在0.02ng/ml-1.6ng/ml的样本，通过最低检出限和定标曲线的最高值确定；当样本浓度超过该范围，先对样本进行稀释处理。
8.一种人S100蛋白检测试剂的制备方法，其特征在于：按照以下步骤进行：
①R1试剂制备：
按配方量将缓冲液、促进剂、防腐剂、稳定剂、电解质以及纯化水混合均匀，调pH值至7.0-8.0；
②所述R2试剂抗人S100蛋白抗体的胶乳试剂的制备包括以下步骤：
步骤1：将胶乳在PH6.0的溶液中活化；
取羧基胶乳微球用缓冲液稀释成浓度为0.01mg/ml的悬浮液，按1ml的羧基胶乳微球悬浮液加20mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDAC羧基活化剂）和40mg的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（NHS）的比例，即加入EDAC和NHS，混匀后在室温将此混合物反应15-30分钟并不断搅拌；
步骤2：用缓冲液或纯化水洗涤羧基胶乳微球，去掉溶液中未反应的碳化二亚胺，并将胶乳微球在纯化水中悬浮得羧基胶乳微球悬浮液，使其浓度控制为0.01mg/ml；
步骤3：将抗S100蛋白抗体溶于缓冲溶液中，使抗人S100蛋白抗体的蛋白质浓度为5ng/ml；
步骤4：取步骤2中的羧基胶乳微球悬浮液1ml立即加入步骤3中的抗人S100蛋白抗体1ml；使该混合液中羧基胶乳微球、抗人S100蛋白抗体和缓冲溶液的浓度分别为0.005mg/ml、2.5mg/ml、25mmol/L；
步骤5：将混合物在37℃反应:4小时，不断搅拌；
步骤6：按1ml反应混合物加2.5μl的乙醇胺的比例加入乙醇胺，反应10-30分钟，不断搅拌；
步骤7：离心除去未结合的蛋白质和乙醇胺，用缓冲液稀释，使抗人S100蛋白抗体胶乳颗粒浓度为0.002-0.01mg/ml，然后加入稳定剂、防腐剂溶解混匀后即得试剂R2；
③所述校准品：
先按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合并分成5份混合液，然后按照需要的S100蛋白参考校准品浓度，将相应量的10ng/ml的S100蛋白纯品分别加入上述混合液中，获得形成系列浓度的5份参考校准品；5份参考校准品中的S100蛋白含量由低到高分别为20pg/ml、60pg/ml、180pg/ml、540pg/ml、1620pg/ml；
或者按配方量将防腐剂、稳定剂及缓冲液混合后得混合液，然后在混合液中加入一定量的10ng/ml的S100蛋白纯品，获得单点高浓度S100蛋白参考校准品；使用时再用生理盐水稀释成多个不同浓度的参考校准品；制得的S100蛋白参考校准品能与样品比较，并能测定样品中S100蛋白的含量。
9.根据权利要求8所述的一种人S100蛋白检测试剂的制备方法，其特征在于：在步骤2中，去掉溶液中所含的未反应的物质时，采用高速离心机或者单层微孔滤膜进行过滤；离心机转速为15000转/分，单层微孔滤膜的孔径为0.22um。
10.根据权利要求8所述的一种人S100蛋白检测试剂的制备方法，其特征在于：在步骤7中，所述的稳定剂是小牛白蛋白、甘氨酸、明胶、吐温20、曲拉通的一种或者几种。
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