CN106093411A - 一种一步均相ck‑mb检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种一步均相ck‑mb检测试剂盒及其应用 Download PDF

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黄宝福
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Abstract

本发明提供了一种一步均相CK‑MB检测试剂盒及其在检测CK‑MB含量中的应用，所述试剂盒包括：(1)抗CK‑MB抗体偶联的发光微球试液；(2)抗CK‑MB抗体偶联的感光微球试液；以及能够接收和发射光的反应孔。与现有技术相比，本发明试剂盒具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点，并且特异性强。将其应用于心肌损伤的监测，可以提高急性心肌梗塞诊断的准确率。

Description

一种一步均相CK-MB检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于检测试剂盒领域，特别涉及一种一步均相CK-MB检测试剂盒及其应用。
背景技术
急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是世界上发病率和死亡率较高的疾病之一。据最近美国心脏病协会数据显示，2003年美国有720万AMI患者。但同时AMI又是高误诊率的疾病之一，一些确实患有AMI的患者没有得到恰当的处理，导致较高的死亡率；而另一些非AMI患者又接受了不必要的治疗，引起不必要的花费。世界卫生组织推荐：典型的胸痛、心电图改变和心肌酶异常三项指标中有两项符合，即可诊断AMI。但许多AMI患者早期没有典型的临床症状和心电图的异常改变，因此心肌损伤标志物的检测就显得尤为重要。近年来心肌标志物在临床中的应用得到了越来越广泛的重视，其发展也相当迅速，在临床中出现了很多心肌标志物。
肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)主要存在于脊椎动物中，通常存在于动物的心脏，骨骼肌以及脑等组织的细胞质和线粒体中。CK催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之间磷酸转移的可逆反应。CK活性在人体中存在较广泛，在血中半衰期约为6-8小时。CK是一个二聚体，有3种同工酶的形式存在：2个B单体(CK-BB)，2个M单体(CK-MM)，MB的单体混合体(CK-MB)。这3种同工酶分子量相同，催化相同的化学反应，但其分子结构和来源不同：CK-BB来源于横纹肌，CK-MM来源于大脑和消化道，而CK-MB来源于心肌。心肌中CK-MB占CK总量的15％～25％。所以在心肌损伤，特别是急性心肌梗死(AMI)时，测定CK-MB对AMI的诊断有极大的临床意义。
有关实验表明，在AMI症状发生后12～48d时采样分析，CK-MB质量的临床灵敏度和临床特异性分别为96.8％和89.6％，这就使它在众多心肌标志物中脱颖而出，成为对AMI临床诊断起重要作用的一个指标。同时，结合cTnI、Myo等心肌特异标志物可提高临床诊断的准确性。在缺血性心脏疾病中，当被阻塞的冠脉再通时，心肌中的CK-MB被血流冲刷出来，引起血液中CK-MB质量升高，峰值时间提前。因此我们可通过CK-MB定量检测结果来判断溶栓治疗在短时间内再通与否，确定心肌再灌注以及观察治疗效果等。除此之外，CK-MB质量还可以用于较早期诊断AMI，也可以用于估计梗死范围大小或再梗死。
常用的CK-MB检测方法有金标定性试验、荧光免疫法、联免疫吸附试验(ELISA)、磁微粒化学发光法(CMIA)和生化仪检测。金标定性实验快速，但该方法灵敏度低、无法动态监测CK-MB含量的变化。荧光免疫法操作复杂，对操作环境和操作人员有较高的要求。ELISA法的检测灵敏度较低，目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目，并且反应时间较长。CMIA法是从ELISA法改进而来，与ELISA法相比具有操作简单，检测速度快等特点，但是CMIA法是非均相反应，操作过程需要清洗，降低了检测的可重复性。自动生化分析仪检测，其检测成本低、速度快，因而应用最普遍。但由于目前该项目测定方法本身的局限，偶尔会产生测定结果的假性升高，甚至出现CK-MB酶活性高于总CK酶活性的怪异现象。
发明内容
发明目的：为解决上述问题，本发明利用CK-MB的抗体，以氧通道化学发光技术为平台，研发出一种针对急性心肌梗塞诊断的CK-MB快速检测试剂盒。使其与现有检测试剂盒相比，具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点；将其应用于心肌损伤的监测，可以提高急性心肌梗塞诊断的准确率。
技术方案：本发明提供了一种一步均相CK-MB检测试剂盒，包括：
(1)抗CK-MB抗体偶联的发光微球试液；
(2)抗CK-MB抗体偶联的感光微球试液；
(3)分析缓冲液；
以及能够接收和发射光的反应孔。
作为优选，所述抗CK-MB抗体为针对CK-MB不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体，其可以通过常规免疫学方法获得。
所述发光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，发光微球带有发光化合物和镧系元素化合物的高分子。发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环己烯)或Thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen等，发光微球大小为100-300nm，该微球可由市场购得，如铂金埃尔默公司。
所述感光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，感光微球带有光激发产生单线态氧的染料，如酞箐染料、叶绿素等，感光微球大小为100-300nm，该微球可由市场购得，如铂金埃尔默公司。
所述抗CK-MB抗体偶联的发光微球，其中发光微球与抗CK-MB抗体的质量比为(1-100):1；所述抗CK-MB抗体偶联的发光微球试液的浓度为10-200μg/ml。
所述抗CK-MB抗体偶联的感光微球，其中感光微球与抗CK-MB抗体的质量比为(1-100):1；所述抗CK-MB抗体偶联的感光微球试液的浓度为10-200μg/ml。
所述反应孔为微孔板、微流控试剂盘、反应杯或反应管等。
所述分析缓冲液的制备，包括如下步骤：将HEPES 0.1-2g、BSA 0.1-5g、Casein0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-1ml加入蒸馏水溶解后，制成分析缓冲液。
所述抗CK-MB抗体偶联的发光微球试液或抗CK-MB抗体偶联的感光微球试液主要由以下步骤制成：
(1)将抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤，抗体稀释到1mg/ml备用；取发光微球或者感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到发光微球或感光微球中，重悬；
(3)加入10％Tween20；
(4)加入400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足；
(5)37℃震荡反应24-48小时；
(6)封闭：用800mMNaOH配制65mg/ml CMO溶液，加到反应体系中；
(7)37℃震荡反应；
(8)离心，去除上清；
(9)加入Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(10)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
本发明还提供了所述一步均相CK-MB检测试剂盒在检测CK-MB含量中的应用。
其中，检测方法包括以下步骤：
(1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗CK-MB抗体偶联的发光微球试液和抗CK-MB抗体偶联的感光微球试液，混合反应5-60分钟；
(2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值；
(3)绘制CK-MB浓度与光信号值的标准曲线，利用步骤(2)测得的光信号值，通过标准曲线计算CK-MB含量。
技术效果：与现有技术相比，本发明试剂盒具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点，并且特异性强。将其应用于膀胱癌的监测，可以提高膀胱癌诊断的准确率。
附图说明
图1是本发明CK-MB氧通道化学发光检测试剂盒原理示意图；
图2是本发明CK-MB氧通道化学发光检测试剂盒检测线性范围图；
图3是本发明试剂盒与罗氏CK-MB试剂盒的检测结果相关性比较。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1试剂盒
实验中原料及试剂：
原料及试剂
BSA
Casein
Tris
NaCNBH3
CMO
Tween20
Triton X-100
抗CK-MB抗体
感光微球
发光微球
重组CK-MB抗原
HEPES
PBS(pH7-8)
一、抗CK-MB抗体偶联发光微球，以醛基发光微球为例：
1)将0.1mg抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。取1mg发光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清。
2)将抗体溶液加入到发光微球(购自铂金埃尔默公司)中，重悬。
3)加入2.5μl 10％Tween20。
4)加入10μl 400mMNaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl。
5)37℃震荡反应24-48小时。
6)封闭：用800mMNaOH配制65mg/ml CMO溶液。加10μl CMO溶液到反应体系中。
7)37℃震荡反应1小时。
8)离心，去除上清。
9)加入200μlTris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清。重复一次。
10)最后一次离心后用200μl PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
二、抗CK-MB抗体偶联感光微球，以醛基感光微球为例：
1)将0.1mg抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。取1mg感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清。
2)将抗体溶液加入到感光微球(购自铂金埃尔默公司)中，重悬。
3)加入2.5μl 10％Tween20。
4)加入10μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl。
5)37℃震荡反应24-48小时。
6)封闭：用800mMNaOH配制65mg/ml CMO溶液。加10μl CMO溶液到反应体系中。
7)37℃震荡反应1小时。
8)离心，去除上清。
9)加入200μlTris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清。重复一次。
10)最后一次离心后用200μl PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
三、试剂盒的制备
按所述用量量取各个组分：
HEPES 0.1-2g
BSA 0.1-5g
Casein 0.1-5g
NaCl 0.5-3g
Triton X-100 0.01-1ml
加入90ml蒸馏水溶解后调节pH到7.4，水补足到100ml，制成分析缓冲液。
1)使用分析缓冲液稀释偶联CK-MB抗体的发光微球浓度为10-200μg/ml；
2)使用分析缓冲液稀释偶联CK-MB抗体的感光微球浓度为10-200μg/ml。
实施例2试剂盒应用
试剂盒使用方法，包括如下步骤：
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗CK-MB抗体偶联的发光微球和抗CK-MB抗体偶联的感光微球，混合反应5-60分钟；
2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。
本发明试剂盒方法学评价：
1.线性
配制浓度为0ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，250ng/ml，500ng/ml，的CK-MB标准品溶液。在反应孔中分别加入5μl标准品、加入20μl偶联CK-MB抗体的发光微球(终浓度10μg/ml)，加入20μl偶联CK-MB抗体的感光微球(终浓度10μg/ml)，室温暗处温育15分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。
如上用本发明所制备的CK-MB含量检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线(见附图2)。从附图2可以看出本发明所制备的检测试剂盒能保持良好的线性，CK-MB浓度为500ng/ml时方法无Hook效应。
2.准确度
准确性测量是指用已知量CK-MB标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算CK-MB的回收率。检测结果如下：
3.精密度
选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果，计算平均偏差C.V.％值。
4.分析灵敏度
分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为0.5ng/ml。
5.特异性
检测本发明的氧通道化学发光免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液(5mg/ml)分别取适量加入到1ml的CK-MB阳性血清标本中，使血清中血红蛋白的含量分别为1mg/ml、0.5mg/ml。将甘油三酯溶液(5mg/ml)分别取适量加入到1ml的CK-MB阳性血清标本中，使血清中甘油三酯的含量分别为1mg/mL、0.5mg/ml。将胆红素溶液(5mg/ml)分别取适量加入到1ml的CK-MB阳性血清标本中，使血清中胆红素的含量分别为50μg/ml、25μg/ml。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的CK-MB阳性标本进行测定，在反应孔中每孔分别加入5μl含加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的CK-MB阳性标本，加入20μl偶联抗CK-MB抗体的发光微球(终浓度10μg/ml)，加入20μl偶联CK-MB抗体的感光微球(终浓度10μg/ml)，室温暗处温育15分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在95.69％-104.16％之间。表明CK-MB氧通道化学发光试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。
6.相关性
如图3所示，与罗氏CK-MB化学发光试剂盒的相关性为：y＝0.9871x+0.7294，R2＝0.9931
本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。
本发明的原理(见附图1)是通过在均相条件下将偶联了抗CK-MB抗体的带有酞菁染料的感光微球1，包被有二甲基噻吩、蒽等活性分子且带有铕螯合物、偶联了抗CK-MB抗体的发光微球2混合。此时偶联了抗CK-MB抗体感光微球1和偶联了抗CK-MB抗体的发光微球2迅速有效地识别检测样本3的目标分子而形成免疫夹心复合物。在激光(波长为680nm)的照射下，感光微球上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单线态氧。单线态氧扩散至发光微球，与其上的化学发光剂反应，进一步激活了同样在发光微球上的荧光基团，使之发出荧光，波长为615nm。单线态氧的半衰期为4μs，在溶液中的扩散距离为200nm左右。如果生物分子不存在相互作用，单线态氧无法扩散到发光微球，则不会有荧光信号产生。
实施例3
与实施例1基本相同，不同之处仅在于所用发光微球为羧基发光微球，所用感光微球为羧基感光微球；
经过实施例2方法学进行验证，其线性、准确度、精密度、分析灵敏度、特异性和相关性与实施例1结果基本相同。
实施例4
与实施例1基本相同，不同之处仅在于所用发光微球为氨基发光微球，所用感光微球为氨基感光微球；
经过实施例2方法学进行验证，其线性、准确度、精密度、分析灵敏度、特异性和相关性与实施例1结果基本相同。

Claims (10)

1.一种一步均相CK-MB检测试剂盒，其特征在于，包括：
(1)抗CK-MB抗体偶联的发光微球试液；
(2)抗CK-MB抗体偶联的感光微球试液；
(3)分析缓冲液；
以及能够接收和发射光的反应孔。
2.根据权利要求1所述的一步均相CK-MB检测试剂盒，其特征在于，所述抗CK-MB抗体为针对CK-MB不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一步均相CK-MB检测试剂盒，其特征在于，所述发光微球表面活性基团为醛基、羧基或氨基，发光微球带有发光化合物和镧系元素化合物的高分子，发光微球大小为100-300nm；所述感光微球表面活性基团为醛基、羧基或氨基，感光微球带有光激发产生单线态氧的染料，感光微球大小为100-300nm。
4.根据权利要求3所述的一步均相CK-MB检测试剂盒，其特征在于，所述发光化合物为二氧杂环己烯或二甲基噻吩的衍生物，镧系元素化合物为Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen；所述染料为酞箐染料或叶绿素。
5.根据权利要求1所述的一步均相CK-MB检测试剂盒，其特征在于，所述抗CK-MB抗体偶联的发光微球，其中发光微球与抗CK-MB抗体的质量比为(1-100):1；所述抗CK-MB抗体偶联的发光微球试液的浓度为10-200μg/ml。
6.根据权利要求1所述的一步均相CK-MB检测试剂盒，其特征在于，所述抗CK-MB抗体偶联的感光微球，其中感光微球与抗CK-MB抗体的质量比为(1-100):1；所述抗CK-MB抗体偶联的感光微球试液的浓度为10-200μg/ml。
7.根据权利要求1所述的一步均相CK-MB检测试剂盒，其特征在于，所述反应孔为微孔板、微流控试剂盘、反应杯或反应管；所述分析缓冲液的制备，包括如下步骤：将HEPES 0.1-2g、BSA 0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-1ml加入蒸馏水溶解后，制成分析缓冲液。
8.根据权利要求1所述的一步均相CK-MB检测试剂盒，其特征在于，所述抗CK-MB抗体偶联的发光微球试液或抗CK-MB抗体偶联的感光微球试液主要由以下步骤制成：
(1)将抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤，抗体稀释到1mg/ml备用；取发光微球或者感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到发光微球或感光微球中，重悬；
(3)加入10％Tween20；
(4)加入400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足；
(5)37℃震荡反应24-48小时；
(6)封闭：用800mMNaOH配制65mg/ml CMO溶液，加到反应体系中；
(7)37℃震荡反应；
(8)离心，去除上清；
(9)加入Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(10)最后一次离心后用PBS缓冲液和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
9.权利要求1-8任一项所述一步均相CK-MB检测试剂盒在检测CK-MB含量中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，检测方法包括以下步骤：
(1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗CK-MB抗体偶联的发光微球试液和抗CK-MB抗体偶联的感光微球试液，混合反应5-60分钟；
(2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值；
(3)绘制CK-MB浓度与光信号值的标准曲线，利用步骤(2)测得的光信号值，通过标准曲线计算CK-MB含量。
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