CN105974129A - 一步均相h-fabp检测试剂盒及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种一步均相H‑FABP氧通道化学发光检测试剂盒，主要组成包括：抗H‑FABP抗体偶联的发光微球、抗H‑FABP抗体偶联的感光微球、分析缓冲液、反应孔；本发明还公开了所述一步均相H‑FABP氧通道化学发光检测试剂盒的制备方法，该方法包括：抗H‑FABP抗体偶联发光微球的制备；抗H‑FABP抗体偶联感光微球的制备，以及分析缓冲液的制备；最后本发明公开了该试剂盒的使用方法；本发明的试剂盒具有灵敏度高、特异性好、检测范围宽、重复性好、操作简单、免清洗等特点，便于临床检测使用，其应用于心脏病的监测，可以提高心肌梗塞诊断的准确率，具有极大的市场价值。

Description

一步均相H-FABP检测试剂盒及其制备和使用方法
技术领域
本发明涉及H-FABP含量检测领域，具体涉及一种一步均相H-FABP检测试剂盒及其制备和使用方法。
背景技术
急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是世界上发病率和死亡率较高的疾病之一。据最近美国心脏病协会数据显示，2003年美国有720万AMI患者。但同时AMI又是高误诊率的疾病之一，一些确实患有AMI的患者没有得到恰当的处理，导致较高的死亡率；而另一些非AMI患者又接受了不必要的治疗，引起不必要的花费。世界卫生组织推荐：典型的胸痛、心电图改变和心肌酶异常三项指标中有两项符合，即可诊断AMI。但许多AMI患者早期没有典型的临床症状和心电图的异常改变，因此心肌损伤标志物的检测就显得尤为重要。近年来心肌标志物在临床中的应用得到了越来越广泛的重视，其发展也相当迅速，在临床中出现了很多心肌标志物。
脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein，FABP)是一族小分子质量的蛋白质，广泛存在于哺乳动物的心、脑肝和骨骼肌的多种细胞内，含量丰富，占细胞内可溶性蛋白总量的3％～8％。国外研究发现，有几种不同结构FABP存在，其中的心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)在急性心肌梗死的早期出现，在胸痛就诊的患者中测定这种蛋白质的浓度，对早期诊断和临床处理AMI有重要意义。心脏型脂肪酸结合蛋白是一种含有132个氨基酸的可溶性蛋白质，其性能类似于肌红蛋白(myoglobin)，但是分子量较低，只有15kD，存在细胞质中，在心肌损害时容易释放进入血循环，成为心肌受损的标志物。多数的研究显示在心肌梗死患者胸痛发生3～6h内测定H-FABP的敏感性要高于肌红蛋白，溶栓治疗后24小时H-FABP恢复到正常值，治疗后测定H-FABP可作为再灌注依据，也可以判断再梗死。
欧洲新近发表的一个为期3年的对664例胸痛症状入院患者前瞻性的研究报告，对这些患者进行了多项目的监测，包括心肌钙蛋白T(cTnT)和心肌脂肪酸结合蛋白的比较研究，心肌钙蛋白T(cTnT)对急性心肌梗死的确认值等于或大于0.03μg/L。患者在心肌梗死症状出现4h之内接受检查，其H-FABP对心肌梗死的敏感性要远高于cTnT(73％比55％，P＝0.043)，特异性为71％，其它标志物都没能超过cTnT。如将H-FABP和cTnT联合使用(不管哪一项先升高)，则可以明显地改善两者的敏感性(达到85％，P≤0.004)。这种联合检测的方法也可以改进阴性预测值，阴性似然比(negative likelihood ratio)和危险性比率。在症状出现4h之内用H-FABP来评估的心肌梗死要优于cTnT，故认为H-FABP是一种有用的心肌梗死标志物。
常用的H-FABP检测方法有金标定性试验、荧光免疫法、联免疫吸附试验(ELISA)、磁微粒化学发光法(CMIA)和乳胶比浊法。金标定性实验快速，但该方法灵敏度低、无法动态监测H-FABP含量的变化。荧光免疫法操作复杂，对操作环境和操作人员有较高的要求。ELISA法的检测灵敏度较低，目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目，并且反应时间较长。CMIA法是从ELISA法改进而来，与ELISA法相比具有操作简单，检测速度快等特点，但是CMIA法是非均相反应，操作过程需要清洗，降低了检测的可重复性。乳胶比浊法是利用抗原抗体反应原理测定血清中H-FABP的含量，此方法无法兼顾灵敏度和线性。
发明内容
发明目的：针对现有H-FABP免疫检测方法存在的问题，本发明提供一种可用于定量检测的一步均相H-FABP氧通道化学发光检测试剂盒；本发明还提供一种一步均相H-FABP氧通道化学发光检测试剂盒的制备方法和使用方法。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种一步均相H-FABP氧通道化学发光检测试剂盒，主要组成包括：抗H-FABP抗体偶联的发光微球、抗H-FABP抗体偶联的感光微球、分析缓冲液、反应孔。
所述发光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，发光微球带有发光化合物和镧系元素化合物的高分子，发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环己烯)或Thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen等，发光微球大小为100-300nm，该发光微球可由铂金埃尔默公司购得。
所述感光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，感光微球带有光激发产生单线态氧的染料，如酞箐染料、叶绿素等，感光微球大小为100-300nm，该感光微球可由铂金埃尔默公司购得。
进一步地，所述抗H-FABP抗体(通过常规免疫学方法制备)为针对H-FABP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
进一步地，所述反应孔为微孔板、微流控试剂盘、反应杯或反应管。
本发明所述的一步均相H-FABP氧通道化学发光检测试剂盒的制备方法，，包括如下步骤：
(1)抗H-FABP抗体偶联发光微球的制备；
(2)抗H-FABP抗体偶联感光微球的制备；
(3)分析缓冲液的制备。
进一步地，所述抗H-FABP抗体偶联发光微球的制备，包括如下步骤：
(1)将抗H-FABP抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液洗涤，备用；将发光微球，用HEPES缓冲液清洗，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到发光微球中，重悬；
(3)加入2.0-3.0μl 10％质量分数Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，震荡反应24-48小时；
(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反应体系中；震荡反应0.5-1.5小时，离心，去除上清；
(5)加入150-250μl Tris-HCl缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(6)最后一次离心后用PBS缓冲液和牛血清白蛋白混合液重悬微球，使用前稀释至所需浓度。
进一步地，所述抗H-FABP抗体偶联感光微球的制备，包括如下步骤：
(1)将抗H-FABP抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液洗涤，备用；将感光微球，用HEPES缓冲液清洗，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入感光微球中，重悬；
(3)加入2.0-3.0μl 10％质量分数Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，震荡反应24-48小时；
(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反应体系中；震荡反应0.5-1.5小时，离心，去除上清；
(5)加入150-250μl Tris-HCl缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(6)最后一次离心后用PBS缓冲液和牛血清白蛋白混合液重悬微球，使用前稀释至所需浓度。
进一步地，所述分析缓冲液的制备，包括如下步骤：将HEPES 0.1-2g、BSA0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-1ml加入蒸馏水溶解后，制成分析缓冲液。
进一步地，步骤(1)中所述抗H-FABP抗体与发光微球与的质量比为1：(1-100)。
进一步地，步骤(1)所述抗H-FABP抗体与感光微球的质量比为1：(1-100)。
进一步地，使用分析缓冲液稀释抗H-FABP抗体偶联的发光微球浓度为10-200μg/ml；稀释抗H-FABP抗体偶联的感光微球浓度为10-200μg/ml。
本发明所述的一步均相H-FABP氧通道化学发光检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗H-FABP抗体偶联的发光微球和抗H-FABP抗体偶联的感光微球，混合反应5-60分钟；
(2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值；
(3)绘制H-FABP浓度与光信号值的标准曲线，利用步骤(2)测得的光信号值，通过标准曲线计算H-FABP含量。
有益效果：由现有技术相比，本发明的一步均相H-FABP氧通道化学发光检测试剂盒具有如下优点：本发明所得试剂盒能利用H-FABP的抗体，以氧通道化学发光技术为平台，针对心肌梗塞诊断的H-FABP快速检测，本发明的试剂盒检测快速准确、范围宽、灵敏度高、特异性好、重复性好、免清洗；同时本发明的试剂盒的制备方法简单，无污染，并且试剂盒使用方法操作简单，将其应用于心脏病的监测，可以提高心肌梗塞诊断的准确率，便于临床检测使用，具有极大的市场价值。
附图说明
图1是本发明实施例3提供的H-FABP氧通道化学发光检测试剂盒原理示意图；
图2是本发明实施例3提供的H-FABP氧通道化学发光检测试剂盒检测线性范围图；
图3是本发明实施例3试剂盒与朗道H-FABP乳胶比浊试剂盒的检测结果相关性比较图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
抗H-FABP抗体偶联发光微球的制备：
(1)将0.1mg抗H-FABP单克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将0.1mg发光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到发光微球中，重悬；
(3)加入2.0μl 10％Tween 20，8μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应24小时；
(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加8μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应0.5小时，离心，去除上清；
(5)加入150μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
抗H-FABP抗体偶联感光微球的制备：
(1)将0.1mg抗H-FABP单克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将0.1mg感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到感光微球中，重悬；
(3)加入2.0μl 10％Tween 20，8μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应24小时；
(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加8μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应0.5小时，离心，去除上清；
(5)加入150μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
分析缓冲液的制备：将HEPES 0.1g、BSA 0.1g、Casein 0.1g、NaCl 0.5g、Triton X-100 0.01ml加入90ml蒸馏水溶解后调节pH到7.4，水补足到100ml，制成分析缓冲液。
使用分析缓冲液稀释抗H-FABP抗体偶联的发光微球浓度为10-200μg/ml；稀释抗H-FABP抗体偶联的感光微球浓度为10-200μg/ml。
上述抗H-FABP抗体偶联发光微球、抗H-FABP抗体偶联感光微球、分析缓冲液再加入微孔板组成本发明所述的试剂盒。
实施例2
抗H-FABP抗体偶联发光微球的制备：
(1)将0.1mg抗H-FABP多克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将10mg发光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到发光微球中，重悬；
(3)加入3μl 10％Tween 20，12μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应48小时；
(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加12μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应1.5小时，离心，去除上清；
(5)加入250μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
抗H-FABP抗体偶联感光微球的制备：
(1)将0.1mg抗H-FABP多克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将10mg感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到感光微球中，重悬；
(3)加入3μl 10％Tween 20，12μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应48小时；
(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加12μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应1.5小时，离心，去除上清；
(5)加入250μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
分析缓冲液的制备：将HEPES 2g、BSA 5g、Casein 5g、NaCl 3g、TritonX-100 1ml加入90ml蒸馏水溶解后调节pH到7.4，水补足到100ml，制成分析缓冲液。
使用分析缓冲液稀释抗H-FABP抗体偶联的发光微球浓度为10-200μg/ml；稀释抗H-FABP抗体偶联的感光微球浓度为10-200μg/ml。
上述抗H-FABP抗体偶联发光微球、抗H-FABP抗体偶联感光微球、分析缓冲液再加入微流控试剂盘组成本发明所述的试剂盒。
实施例3
(1)将0.1mg抗H-FABP单克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将1mg发光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到发光微球中，重悬；
(3)加入2.5μl 10％Tween 20，10μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应36小时；
(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加10μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应1小时，离心，去除上清；
(5)加入200μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
抗H-FABP抗体偶联感光微球的制备：
(1)将0.1mg抗H-FABP单克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将1mg感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到感光微球中，重悬；
(3)加入2.5μl 10％Tween 20，10μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应36小时；
(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加10μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应1小时，离心，去除上清；
(5)加入200μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
分析缓冲液的制备：将HEPES 1.0g、BSA 2.5g、Casein 2.5g、NaCl 1.75g、Triton X-100 0.5ml加入90ml蒸馏水溶解后调节pH到7.4，水补足到100ml，制成分析缓冲液。
使用分析缓冲液稀释抗H-FABP抗体偶联的发光微球浓度为10-200μg/ml；稀释抗H-FABP抗体偶联的感光微球浓度为10-200μg/ml。
上述抗H-FABP抗体偶联发光微球、抗H-FABP抗体偶联感光微球、分析缓冲液再加入反应杯组成本发明所述的试剂盒。
实施例4
抗H-FABP抗体偶联发光微球的制备：
(1)将0.1mg抗H-FABP单克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将5mg发光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到发光微球中，重悬；
(3)加入2.5μl 10％Tween 20，10μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应36小时；
(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加10μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应1小时，离心，去除上清；
(5)加入200μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
抗H-FABP抗体偶联感光微球的制备：
(1)将0.1mg抗H-FABP单克隆抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。将5mg感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到感光微球中，重悬；
(3)加入2.5μl 10％Tween 20，10μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，37℃震荡反应36小时；
(4)用800mM NaOH配制65mg/ml CMO，加10μl溶液到反应体系中；37℃震荡反应1小时，离心，去除上清；
(5)加入200μl Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(6)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
分析缓冲液的制备：将HEPES 1.0g、BSA 2.5g、Casein 2.5g、NaCl 1.75g、Triton X-100 0.5ml加入90ml蒸馏水溶解后调节pH到7.4，水补足到100ml，制成分析缓冲液。
使用分析缓冲液稀释抗H-FABP抗体偶联的发光微球浓度为10-200μg/ml；稀释抗H-FABP抗体偶联的感光微球浓度为10-200μg/ml。
上述抗H-FABP抗体偶联发光微球、抗H-FABP抗体偶联感光微球、分析缓冲液再加入反应管组成本发明所述的试剂盒。
实施例5
试剂盒的使用方法：
(1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗H-FABP抗体偶联的发光微球和抗H-FABP抗体偶联的感光微球，混合反应5-60分钟；
(2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值；
(3)绘制H-FABP浓度与光信号值的标准曲线，利用步骤(2)测得的光信号值，通过标准曲线计算H-FABP含量。
试验例6
发明试剂盒方法学评价：
1、线性
配制浓度为0ng/ml，2ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，的H-FABP标准品溶液。在反应孔中分别加入5μl标准品、加入20μl偶联H-FABP抗体的发光微球(终浓度10μg/ml)，加入20μl偶联H-FABP抗体的感光微球(终浓度10μg/ml)，室温暗处温育15分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。
如上用本发明实施3所制备的H-FABP检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线(见附图2)。从附图2可以看出本发明所制备的检测试剂盒能保持良好的线性，H-FABP浓度为200ng/ml时方法无Hook效应。
2、准确度
准确性测量是指用已知量H-FABP标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算H-FABP的回收率。检测结果如下：
3、精密度
选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果，计算平均偏差C.V.％值。
4、分析灵敏度
分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为0.1ng/ml。
5、特异性
检测本发明的氧通道化学发光免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液(5mg/ml)分别取适量加入到1ml的H-FABP阳性血清标本中，使血清中血红蛋白的含量分别为1mg/ml、0.5mg/ml。将甘油三酯溶液(5mg/ml)分别取适量加入到1ml的H-FABP阳性血清标本中，使血清中甘油三酯的含量分别为1mg/mL、0.5mg/ml。将胆红素溶液(5mg/ml)分别取适量加入到1ml的H-FABP阳性血清标本中，使血清中胆红素的含量分别为50μg/ml、25μg/ml。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的H-FABP阳性标本进行测定，在反应孔中每孔分别加入5μl含加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的H-FABP阳性标本，加入20μl偶联抗H-FABP抗体的发光微球(终浓度10μg/ml)，加入20μl偶联H-FABP抗体的感光微球(终浓度10μg/ml)，室温暗处温育15分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在95.62％-105.36％之间。表明H-FABP氧通道化学发光试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。
6、相关性
如图3所示，与朗道H-FABP乳胶比浊试剂盒的相关性为：
y＝0.9963x+0.1633，R2＝0.996
本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。
本发明的原理(见附图1)是通过在均相条件下将偶联了抗H-FABP抗体的带有酞菁染料的感光微球1，包被有二甲基噻吩、蒽等活性分子且带有铕螯合物、偶联了抗H-FABP抗体的发光微球2混合。此时偶联了抗H-FABP抗体感光微球1和偶联了抗H-FABP抗体的发光微球2迅速有效地识别检测样本3的目标分子而形成免疫夹心复合物。在激光(波长为680nm)的照射下，感光微球上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单线态氧。单线态氧扩散至发光微球，与其上的化学发光剂反应，进一步激活了同样在发光微球上的荧光基团，使之发出荧光，波长为615nm。单线态氧的半衰期为4μs，在溶液中的扩散距离为200nm左右。如果生物分子不存在相互作用，单线态氧无法扩散到发光微球，则不会有荧光信号产生。
以上实施例仅用以说明本材料的技术实施方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种一步均相H-FABP氧通道化学发光检测试剂盒，其特征在于，主要组成包括：抗H-FABP抗体偶联的发光微球、抗H-FABP抗体偶联的感光微球、分析缓冲液、反应孔。
2.根据权利要求1所述的一步均相H-FABP氧通道化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述抗H-FABP抗体为针对H-FABP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一步均相H-FABP氧通道化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述反应孔为微孔板、微流控试剂盘、反应杯或反应管。
4.权利要求1-3任一所述的一步均相H-FABP氧通道化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)抗H-FABP抗体偶联发光微球的制备；
(2)抗H-FABP抗体偶联感光微球的制备；
(3)分析缓冲液的制备。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述抗H-FABP抗体偶联发光微球的制备，包括如下步骤：
(1)将抗H-FABP抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液洗涤，备用；将发光微球，用HEPES缓冲液清洗，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到发光微球中，重悬；
(3)加入2.0-3.0μl 10％质量分数Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，震荡反应24-48小时；
(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反应体系中；震荡反应0.5-1.5小时，离心，去除上清；
(5)加入150-250μl Tris-HCl缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(6)最后一次离心后用PBS缓冲液和牛血清白蛋白混合液重悬微球，使用前稀释至所需浓度。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述抗H-FABP抗体偶联感光微球的制备，包括如下步骤：
(1)将抗H-FABP抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液洗涤，备用；将感光微球，用HEPES缓冲液清洗，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到感光微球中，重悬；
(3)加入2.0-3.0μl 10％质量分数Tween 20，8-12μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl，震荡反应24-48小时；
(4)加8-12μl 65mg/ml CMO溶液到反应体系中；震荡反应0.5-1.5小时，离心，去除上清；
(5)加入150-250μl Tris-HCl缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(6)最后一次离心后用PBS缓冲液和牛血清白蛋白混合液重悬微球，使用前稀释至所需浓度。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述分析缓冲液的制备，包括如下步骤：将HEPES 0.1-2g、BSA 0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-1ml加入蒸馏水溶解后，制成分析缓冲液。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述抗H-FABP抗体与发光微球与的质量比为1：(1-100)。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述抗H-FABP抗体与感光微球的质量比为1：(1-100)。
10.权利要求1-3任一所述的一步均相H-FABP氧通道化学发光检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗H-FABP抗体偶联的发光微球和抗H-FABP抗体偶联的感光微球，混合反应5-60分钟；
(2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值；
(3)绘制H-FABP浓度与光信号值的标准曲线，利用步骤(2)测得的光信号值，通过标准曲线计算H-FABP含量。
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