CN104614533A - 心肌钙蛋白i快速检测方法及相应的检测试剂盒 - Google Patents

心肌钙蛋白i快速检测方法及相应的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种心肌钙蛋白I快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：将内部带有染料的纳米级的感光微球、包被有活性分子的发光微球以及已标记生物素的活性分子以及待测样本混合，得到混合物；步骤(2)：对所述的混合物进行温育培养，具有免疫特性的各组分反应得到结合物；步骤(3)：采用激发光对所述的结合物进行照射后，所述的结合物发光，使用光子计数器进行测定，得到检测数值。本发明还提供了一种心肌钙蛋白I快速检测试剂盒。采用本发明的心肌钙蛋白I快速检测方法及相应的检测试剂盒，检测结果稳定，准确率高、成本低，灵敏度高，精密性好，检测范围宽、适用临床推广。

Description

心肌钙蛋白I快速检测方法及相应的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及免疫测定，具体是指一种心肌钙蛋白I快速检测方法及相应的检测试剂盒。
背景技术
人心肌钙蛋白I(cTnI)是一个分子量为22.5KD的心肌蛋白，它与肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白C(TnC)一起形成一个心肌钙蛋白复合物，共同完成细胞内肌动蛋白间相互作用的钙信号传递的基本功能。心肌肌钙蛋白I(cTnI)在心肌组织中表达，在胎儿、健康人或疾病状态的成人骨骼肌中不表达，因而对心肌具有高度特异性。由于肌钙蛋白具有组织特异性强、诊断窗口期长、测定方法快速、在血中出现早等优点，使其在急性心肌梗死(AMI)诊断中的作用越来越受到人们关注，cTn被认为是目前最好的确定标志物，正逐步取代CK-MB成为AMI的诊断“金标准”。
cTnI在临床应用领域较为广泛。其在医学上的价值正得到广泛验正和承认。现将其临床意义综述如下：
1、心肌损伤的临床诊断、预后估计和危险分层
cTnI不受骨骼肌受损伤的影响，且在患者发病后出现较早，持续时间长，具有其独特的心肌特异性和诊断窗口期较长的优势，是目前诊断心肌损伤较好的确定标志物。
cTnI不仅有助于早期诊断AMI，并对其预后估计和危险分层也有一定的帮助。有研究证实，cTnI在AMI症状出现后12h，对危险分层最为适宜。
2、估计心肌梗死面积
心肌梗死的面积与心室功能的减弱和室性心率失常的发生有密切的关系，所以估计心肌梗死面积可帮助评价预后。cTnI的释放与心肌梗死面积呈线性相关，AMI后9h相关性最好，AMI后9h cTnI的浓度可估计心肌梗死的面积
3、非缺血性心衰心肌溶解的检测
有研究通过检测cTnI来评价心肌细胞溶解在非缺血性心衰中的作用。结果表明，cTnI升高与二尖瓣活动受限、左室向心性重塑以及左室壁张力的相关生化标志物(如增高的心钠素)有关，认为微小的心肌溶解可能部分与左室张力的显著增加有关，认为cTnI将是检测非缺血性心衰的心肌溶解，非常有发展前景的方法。
4、监测心脏手术造成的心肌损伤
由于cTnI对检测微小心肌损伤具有较高的敏感性和特异性，可用于心脏围手术期的监测。已有研究表明，cTnI是冠脉成形术后微小心肌损伤非常敏感的标志物，在cTnI不正常的患者中，有38％的患者在支架置入术后发生分支闭塞。Harris等对cTnI、cTnI和CK-MB在检测经皮穿刺冠状动脉成形术(PTCA)、支架术(stent)、冠脉动脉内斑块旋切术(RA)等心脏介入手术后心肌损害的敏感性进行比较，同样发现，cTnI对术后微小心肌损伤的预测价值最高。
5、原发性高血压病左室肥厚的新标志
Siciliano等对原发性高血压病伴左室肥厚组、原发性高血压病无左室肥厚组和正常对照组的cTnI进行检测发现，第一组的23例患者中，有12例cTnI大于正常高限值(0.5μg/L)，后两组的cTnI均低于0.5μg/L，认为血清cTnI浓度是原发性高血压患者左室肥厚的新标志
6、骨骼肌损伤或慢性肾衰伴有心肌损伤的鉴别
由于CK-MB、CK和Mb不仅存在于心肌组织中，也存在于非心肌组织中，在骨骼肌损伤或慢性肾衰时，可不同程度的升高；作为Tn之一的cTnI在慢性肾衰、横纹肌溶解患者中也常呈不同程度的增高，而cTnI具有唯一的心肌特异性，可鉴别骨骼肌损伤或慢性肾衰患者是否伴有心肌损伤
cTnI的测定始于20世纪80年代中期，多采用双抗体竞争放射免疫法和竞争性ELISA测定法。但由于过去cTnI的检测方法较为落后，假阳性很高，影响了它在临床上的价值，近几年来，由于检测技术的更新，测定cTnI的快速、简便和可靠的方法已迅速建立。
cTnI的检测方法市面上常见为胶体金法和化学发光法，胶体金虽成本低但一般只能半定量或者定性，存在着检测灵敏度低、精密性差等局限性，化学发光可以做定量但成本高。
所以需要提供一种新的cTnI检测方法，以解决现有技术中的存在的问题。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供一种检测结果稳定，准确率高、成本低，灵敏度高，精密性好，检测范围宽、适用临床推广的心肌钙蛋白I快速检测方法及相应的检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种心肌钙蛋白I快速检测方法，其特点在于，包括以下步骤：
步骤(1)：将内部带有染料的纳米级的感光微球、包被有活性分子的发光微球以及已标记生物素的活性分子以及待测样本混合，得到混合物；
步骤(2)：对所述的混合物进行温育培养，具有免疫特性的各组分反应得到结合物；
步骤(3)：采用激发光对所述的结合物进行照射后，所述的结合物发光，使用光子计数器进行测定，得到检测数值。
较佳地，所述的活性分子为cTnI抗体。
较佳地，所述的感光微球为填充了光敏氰基化合物的醛基感光微球。
较佳地，所述的发光微球为填充了稀土螯合物的醛基发光微球。
本发明第二方面提供了一种心肌钙蛋白I快速检测的试剂盒，包括连接了活性分子发光微球的第一试剂、主要成份为已标记生物素活性分子的第二试剂以及主要成份为感光微球的第三试剂。
采用本发明的心肌钙蛋白I快速检测方法及相应的检测试剂盒，在均相条件下，将内部带有染料的感光微球(纳米级)、标记生物素的活性分子以及包被有活性分子并且内部带有发光化合物的发光微球(纳米级)的混合物作为试剂和检测样品混合。此时纳米感光微球与标记生物素的活性分子形成连接物再和包被有活性分子的纳米发光微球可迅速有效地捕捉待测样本中的靶分子，在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后，纳米感光微球中的染料(光敏氰基化合物)被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微球俘获，从而传递能量以激活所述发光微球中的发光化合物(稀土螯合物)。数微秒后，发光微球中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子，并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度，光子数的多少即精确地反映了目标分子的浓度。而当样本不含靶分子时，无法在近距离形成免疫夹心复合物，活性氧离子也无法传递至发光微球表面。活性氧离子在液相中迅速衰减，检测时则无光能级红光产生。其采用全液相的反应模式，液态均相的模式使各测试间的一致性更好，使产品具有更好的重复性与一致性。且免冲洗，避免反应中引入不必要的干扰物及其它不确定因素，使得检测结果更为稳定。可以快速诊断领域引入独特的化学发光技术，使整体检测性能更优。
附图说明
图1为本发明心肌钙蛋白I检测方法微球结合形成二聚体的原理图。
图2为本发明心肌钙蛋白I检测方法微球微粒未结合时的原理图。
图3为本发明单线态氧随微粒距离衰减时的曲线图。
图4为本发明实施例的检测结果与进口心肌钙蛋白I试剂盒检测结果的平行比较图。
图5为本发明实施例的心肌钙蛋白I快速检测的试剂盒的结构图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，下面对本发明的具体实施方法作进一步说明。
本实施例的检测方法的原理如图1～2所示，单线态氧随微粒距离衰减时的曲线图如图3所示。
根据本实施例的检测方法，在下述实施例中使用的原料、试剂、仪器来源如下：
缓冲液
NaHCO3溶液的配方：
原料名称 标准用量(1L)
碳酸氢钠 8.410g
纯化水 定容至1000ml
CB(pH9.6)缓冲液(0.05M)
原料名称 标准用量(1L)
碳酸钠 1.540g
碳酸氢钠 2.940g
纯化水 定容至1000ml
Tris缓冲液的配方：
试剂名称 标准用量(1L)
Tris 6.000g
Proclin-300 0.500ml
Tween20 5.000g
BSA 5.000g
纯化水 定容至1000ml
MES缓冲液的配方：
试剂名称 标准用量(1L)
MES 10.660g
NaCl 2.922g
纯化水 定容至1000ml
发光微粒缓冲液配方：
试剂名称 标准用量(1L)
碳酸钠 1.540g
碳酸氢钠 2.940g
NaCl 17.532g
BSA 2.000g
Dextran 1.000g
TritronX-405 1.000g
Proclin 0.5ml
纯化水 定容至1000ml
生物素化抗体缓冲液配方：
原料名称 标准用量(1L)
EDTA-NA-2H2O 1.860g
Tris 12.110g
BSA 5.000g
Proclin 0.5ml
NaCl 17.532g
纯化水 定容至1000ml
感光微粒缓冲液配方：
试剂名称 标准用量(1L)
HEPES 11.915g
NaCl 17.532g
EDTA-Na-2H2O 9.306g
Dextran 1.000g
TritronX-405 1.000g
Proclin 0.5ml
纯化水 定容至1000ml
步骤(1)：生物素化抗体的制备
生物素标记抗心肌钙蛋白I的制备程序
使用NaHCO3缓冲液将待标记抗体配制至1mg/ml待用。
使用DMSO将生物素配制至16.17mg/ml待用。
将以上配制好的抗体和生物素处理液按照1：30的体积比进行混合，2～8℃反应12～16小时。得到反应液。
使用PH8.0的TRIS缓冲液对以上反应液进行透析，透析完成后使用生物素化抗体缓冲液调整至终浓度0.5mg/ml。
步骤(2)：发光试剂的制备与配制
使用0.05M CB缓冲液将待包被抗体配制至1mg/ml待用。
按制备量量取醛基发光微粒(内部填充稀土螯合物)于离心管中，12000rpm离心30min，弃上清，按照每10mg微粒添加0.2mg的比例向沉淀中加入待包被抗体，37℃置于旋转混合仪混匀过夜
按每10mg微粒需要0.02ml 8mg/ml的NaBH4溶液，量取NaBH4溶液，迅速加入反应液中，垂直旋转混合器40rpm，2～8℃,反应2小时。。
按每10mg微粒需要0.16ml 75mg/ml的Gly溶液，量取Gly溶液，迅速加入反应液中，垂直旋转混合器40rpm，2～8℃,反应1小时。
用0.05M CB缓冲液离心清洗三次，再用发光微粒缓冲液洗一次，使用发光微粒缓冲液将已包被cTnI抗体的发光微粒调整至终浓度10mg/ml。
步骤(3)亲和素标记感光微粒的制备
按制备量量取醛基感光微粒(内部填充光敏氰基化合物)于离心管中，12000rpm离心30min，弃上清，按照每10mg微粒添加20mg的比例向沉淀中加入SA，再补加一定体积的0.05M MES pH6.0，使微粒终浓度为25mg/ml。
步骤(4)杯式超声迅速混匀。
向离心管按照每10mg微粒加入16ul的比例加入NaBH3CN(25mg/ml，0.05M MES pH6.0配制)混匀，37℃置于旋转混合仪反应36～48h。
封闭：按照每10mg微粒加入16ul的比例加入80ul Gly(75mg/ml,0.05M MES pH6.0配制)以及40ul NaBH3CN(25mg/ml，0.05M MES pH6.0配制)37℃置于旋转混合仪反应2h。
按照每10mg微粒加入16ul的比例加入0.25ml的BSA(200mg/ml，0.05M MES pH6.0配制)，37℃置于旋转混合仪反应12～16h。
用0.05M MES缓冲液清洗三次，再用GG-Buffer洗一次，使用感光微粒缓冲液将已标记亲和素的感光微粒调整至终浓度10mg/ml。
步骤(5)：试剂盒的配制与组装
图5为本发明实施例的心肌钙蛋白I快速检测的试剂盒的结构图。如图5所示：
使用发光微粒缓冲液作为第一缓冲单元6，作为将已包被心肌钙蛋白I抗体的发光微粒作为第一试剂单元3，按照50ug/ml的终浓度进行稀释。
使用生物素化抗体缓冲液作为第二缓冲液单元7，将已标记生物素的心肌钙蛋白I抗体作为第二试剂单元4，按照1ug/ml的终浓度进行稀释。
使用感光微粒缓冲液将作为第三缓冲液单元8，已包被亲和素的感光微粒作为第三试剂单元5，按照40ug/ml的终浓度进行稀释。
第一试剂单元3、第二试剂单元4、第三试剂单元5、第一缓冲液单元6、第二缓冲液单元7、第三缓冲液8均置于盒体2中。盒盖1和盒体2连接。
步骤(6)：样本的检测
将待检测样本与以上得到的试剂置于本试剂配套的快速化学发光全自动分析仪中进行检测，由仪器自动添加样品、各种试剂，后反应5分钟得到检测结果。
性能分析
检测范围
本试剂盒线性检测范围为0.1-50ng/mL，对其用双对数模型拟合，剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值不低于0.9900。如要准确的测定样品中心肌钙蛋白I浓度值，样品中心肌钙蛋白I浓度值应不超出0.1-50ng/mL的浓度范围，超出此范围的测定结果是通过校准品曲线外延得出的计算结果。
分析灵敏度的检测
检测10孔浓度为0的空白样本，计算其RLU均值(AVE)和二个标准偏差(SD)，以AVE+2SD反代入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度，其分析灵敏度为0.04ng/mL
精密性的检测
分别采用不同浓度水平的质控品QC L、QC H进行1次检测，复测10次，得到如下结果：
由上述结果可知，精密性小于15％。
线性的检测
对除0值外其他5点校准品用双对数或其他数学模型拟合，剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值应不低于0.9900。经检测两个批号的试剂盒，其线性r值分别为0.9923、0.9931。
Hook实验
由上述结果可知，两个批号的试剂盒其HOOK效应在500ng/L均未见。
与国外同类产品的比较，收集进口心肌钙蛋白I试剂盒检测过的临床标本250份，再以本发明心肌钙蛋白I快速检测试剂盒(化学发光法)测定每份标本，作平行比较，结果如图4所示。
由以上结果可知，本试剂盒检测结果与国外同类产品结果相关性r＝0.9579，且该试剂盒成本底、灵敏度高、精密性好、检测范围宽、操作简便、省时，且与国外同类产品对临床样本的符合率良好，适合于向临床推广。
采用本发明的心肌钙蛋白I快速检测方法及相应的检测试剂盒，在均相条件下，将内部带有染料的感光微球(纳米级)、标记生物素的活性分子以及包被有活性分子并且内部带有发光化合物的发光微球(纳米级)的混合物作为试剂和检测样品混合。此时纳米感光微球与标记生物素的活性分子形成连接物再和包被有活性分子的纳米发光微球可迅速有效地捕捉待测样本中的靶分子，在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后，纳米感光微球中的染料(光敏氰基化合物)被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微球俘获，从而传递能量以激活所述发光微球中的发光化合物(稀土螯合物)。数微秒后，发光微球中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子，并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度，光子数的多少即精确地反映了目标分子的浓度。而当样本不含靶分子时，无法在近距离形成免疫夹心复合物，活性氧离子也无法传递至发光微球表面。活性氧离子在液相中迅速衰减，检测时则无光能级红光产生。其采用全液相的反应模式，液态均相的模式使各测试间的一致性更好，使产品具有更好的重复性与一致性。且免冲洗，避免反应中引入不必要的干扰物及其它不确定因素，使得检测结果更为稳定。可以快速诊断领域引入独特的化学发光技术，使整体检测性能更优。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (5)

1.一种心肌钙蛋白I快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：将内部带有染料的纳米级的感光微球、包被有活性分子的发光微球以及已标记生物素的活性分子以及待测样本混合，得到混合物；
步骤(2)：对所述的混合物进行温育培养，具有免疫特性的各组分反应得到结合物；
步骤(3)：采用激发光对所述的结合物进行照射后，所述的结合物发光，使用光子计数器进行测定，得到检测数值。
2.根据权利1所述的心肌钙蛋白I快速检测方法，其特征在于，所述的活性分子为cTnI抗体。
3.根据权利1所述的心肌钙蛋白I快速检测方法，其特征在于，所述的感光微球为填充了光敏氰基化合物的醛基感光微球。
4.根据权利1所述的心肌钙蛋白I快速检测方法，其特征在于，所述的发光微球为填充了稀土螯合物的醛基发光微球。
5.一种心肌钙蛋白I快速检测的试剂盒，其特征在于，包括连接了活性分子发光微球的第一试剂、主要成份为已标记生物素活性分子的第二试剂以及主要成份为感光微球的第三试剂。
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