CN105974118A - 一种一步均相d-二聚体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种一步均相D‑二聚体检测试剂盒及其在检测D‑二聚体含量中的应用，所述试剂盒包括：(1)抗D‑二聚体抗体偶联的发光微球试液；(2)抗D‑二聚体抗体偶联的感光微球试液；以及能够接收和发射光的反应孔。与现有技术相比，本发明试剂盒具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点，并且特异性强。将其应用于高凝状态和血栓性疾病的监测，可以提高高凝状态和血栓性疾病的准确率。

Description

一种一步均相D-二聚体检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于检测试剂盒领域，特别涉及一种一步均相D-二聚体检测试剂盒及其应用。
背景技术
纤维蛋白溶解系统是人体最重要的抗凝系统。在纤溶过程中，凝血酶在水解纤维蛋白原后，即相继释放出纤维蛋白肽(A和B)，剩余的可溶性纤维蛋白单体，在因子Ⅻa作用下，形成稳定的交联纤维蛋白，交联纤维蛋白在纤溶酶的降解过程中，释放的碎片进一步降解为最小片段D-二聚体。在病理状态下，凝血与纤溶的动态平衡遭到破坏，凝血倾向增强，从而纤维蛋白降解产物增加，导致D-二聚体含量增加。D-二聚体水平的增高，表明体内有纤维蛋白血栓形成和纤溶发生，所以临床上可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子指标。
D-二聚体来源于纤溶酶溶解的交联纤维蛋白凝块。凝血系统激活使凝血酶作用于纤维蛋白原，将其转变成纤维蛋白单体(α、β、γ)2即D-E-D结构，并有规则连接为可溶性纤维蛋白单体聚合体(SFMC)。后者进一步在Ca2+与ⅩⅢa作用下，单体间发生α链与γ链交联(D-D交联)形成稳定的不溶性纤维蛋白聚合体。交联纤维蛋白的生成又激活纤溶酶溶解系统。纤维蛋白溶解系统由纤溶酶原、纤溶酶原激活剂、纤溶酶溶解酶、纤溶酶溶解酶抑制物4个主要部分组成。当纤维蛋白凝结块形成时，在组织型纤溶酶溶解酶原激活物存在的条件下，纤溶酶溶解酶原激活转化为纤溶酶溶解酶，纤维蛋白溶解过程开始，纤溶酶溶解酶降解纤维蛋白凝结块形成各种可溶片段(X'、Y'、D、E等碎片)。D-二聚体是通过γ链相连的2个D碎片连接起来的片段(DD、DXD、DD/E、YXD等复合物)，是交联纤维蛋白的特异性降解产物。
D-二聚体在临床检验中应用的十分广泛。有研究表明，心血管疾病由于血管壁的损伤、血小板的激活、凝血机制的亢进及血液状态的变化，使循环血液中的有形成分在心脏或血管内形成异常凝块，堵塞部分或全部血管腔导致急性心肌梗死或脑梗死，引起D-二聚体含量升高。脑梗死D-二聚体检测结果及阳性率最高。有资料显示其含量与梗死面灶的体积及病情轻重呈明显正相关。动态测定血浆D-二聚体含量可作为急性脑梗死病程判断及疗效观察的有用指标。对妊娠高血压综合征患者血浆D-二聚体的测定结果表明，妊娠高血压综合征患者血浆D-二聚体高于正常晚孕妇女，而且随病情的发展而明显升高，故认为D-二聚体升高是妊娠高血压综合征导致弥散性血管内凝血(DIC)时最早出现的阳性指标。大量临床资料证明，恶性肿瘤存在纤溶活性亢进，这与恶性肿瘤细胞具有高水平的纤维蛋白溶解酶激酶有关，并可分泌大量纤维蛋白原激活物，其主要类型是尿激酶型，能导致局部纤维蛋白溶解，使D-二聚体水平升高。D-二聚体含量与恶性肿瘤病情进展有相关性。D-二聚体作为交联纤维蛋白的特异降解产物，其水平的增高反映着继发性纤溶的增强，在临床上已被视为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一。动态观察患者体内的D-二聚体水平变化，对高凝状态和血栓性疾病的诊断及预后判断有一定实用价值。
目前用于检测D-二聚体的方法主要有放射性免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)，胶体金免疫层析法(GICA)和化学发光免疫分析法(CLIA)。RIA有很高的检测灵敏度，但由于标记物具有放射性危害，标记物稳定性差，废弃物难以处理等缺点，已逐渐退出临床检验领域；ELISA法采用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)或碱性磷酸酶标记抗体，并催化底物产生颜色变化，具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但ELISA法的检测灵敏度较低，目前主要应用于传染性疾病筛查等对检测灵敏度要求较低的项目；GICA具有操作简单，检测速度快等优点，但也存在灵敏度低，试剂不稳定，重复性较差，难以进行定量的缺点。CLIA具有操作简单，检测速度快、高通量检测等优点，但也存在非均相反应、检测时间长、实际稳定性差、批内批间变异大的缺点。
发明内容
发明目的：为解决上述问题，本发明利用D-二聚体的抗体，以氧通道化学发光技术为平台，研发出一种针对高凝状态和血栓性疾病诊断的D-二聚体快速检测试剂。使其与现有检测试剂相比，具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点；将其应用于高凝状态和血栓性疾病的监测，可以提高高凝状态和血栓性疾病的准确率。
技术方案：本发明提供了一种一步均相D-二聚体检测试剂盒，包括：
(1)抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液；
(2)抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液；
(3)分析缓冲液；
以及能够接收和发射光的反应孔。
作为优选，所述抗D-二聚体抗体为针对D-二聚体不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体，其可通过常规免疫学方法获得。
所述发光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，发光微球带有发光化合物和镧系元素化合物的高分子。发光化合物可以是Dioxene(二氧杂环己烯)或Thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen等，发光微球大小为100-300nm，该微球可由市场购得，如铂金埃尔默公司。
所述感光微球表面活性基团为醛基、羧基、氨基等，感光微球带有光激发产生单线态氧的染料，如酞箐染料、叶绿素等，感光微球大小为100-300nm，该微球可由市场购得，如铂金埃尔默公司。
所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球，其中发光微球与抗D-二聚体抗体的质量比为(1-100):1；所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液的浓度为10-200μg/ml。
所述抗D-二聚体抗体偶联的感光微球，其中感光微球与抗D-二聚体抗体的质量比为(1-100):1；所述抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液的浓度为10-200μg/ml。
所述反应孔为微孔板、微流控试剂盘、反应杯或反应管等。
所述分析缓冲液的制备，包括如下步骤：将HEPES 0.1-2g、BSA0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-1ml加入蒸馏水溶解后，制成分析缓冲液。
所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液或抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液主要由以下步骤制成：
(1)将抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤，抗体稀释到1mg/ml备用；取发光微球或者感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到发光微球或感光微球中，重悬；
(3)加入10％Tween20；
(4)加入400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足；
(5)37℃震荡反应24-48小时；
(6)封闭：用800mMNaOH配制65mg/ml CMO溶液，加到反应体系中；
(7)37℃震荡反应；
(8)离心，去除上清；
(9)加入Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(10)最后一次离心后用PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
本发明还提供了所述一步均相D-二聚体检测试剂盒在检测D-二聚体含量中的应用。
其中，检测方法包括以下步骤：
(1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液和抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液，混合反应5-60分钟；
(2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值；
(3)绘制D-二聚体浓度与光信号值的标准曲线，利用步骤(2)测得的光信号值，通过标准曲线计算D-二聚体含量。
技术效果：与现有技术相比，本发明试剂盒具有操作方便、检测快速、灵敏度高、准确性好等优点，并且特异性强。将其应用于高凝状态和血栓性疾病的监测，可以提高高凝状态和血栓性疾病的准确率。
附图说明
图1是本发明D-二聚体氧通道化学发光检测试剂盒原理示意图；
图2是本发明D-二聚体氧通道化学发光检测试剂盒检测线性范围图；
图3是本发明试剂盒与罗氏D-二聚体试剂盒的检测结果相关性比较。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1试剂盒
实验中原料来源及试剂配方：
一、抗D-二聚体抗体偶联发光微球，以醛基发光微球为例：
1)将0.1mg抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。取1mg发光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清。
2)将抗体溶液加入到发光微球(购自铂金埃尔默公司)中，重悬。
3)加入1.25μl 10％Tween20。
4)加入10μl 400mMNaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl。
5)37℃震荡反应24-48小时。
6)封闭：用800mMNaOH配制65mg/ml CMO溶液。加10μl CMO溶液到反应体系中。
7)37℃震荡反应1小时。
8)离心，去除上清。
9)加入200μlTris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清。重复一次。
10)最后一次离心后用200μl PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度0.5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
二、抗D-二聚体抗体偶联感光微球，以醛基感光微球为例：
1)将0.1mg抗体加入到超滤管中，离心10分钟，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。取1mg感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清。
2)将抗体溶液加入到感光微球(购自铂金埃尔默公司)中，重悬。
3)加入2.5μl 10％Tween20。
4)加入10μl 400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足到200μl。
5)37℃震荡反应24-48小时。
6)封闭：用800mMNaOH配制65mg/ml CMO溶液。加10μl CMO溶液到反应体系中。
7)37℃震荡反应1小时。
8)离心，去除上清。
9)加入200μlTris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清。重复一次。
10)最后一次离心后用200μl PBS缓冲液(pH7-8)和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度0.5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
三、试剂盒的制备：
按所述用量量取各个组分：
HEPES 0.1-2g
BSA 0.1-5g
Casein 0.1-5g
NaCl 0.5-3g
Triton X-100 0.01-1ml
加入90ml蒸馏水溶解后调节pH到7.4，水补足到100ml，制成分析缓冲液。
1)使用分析缓冲液稀释偶联D-二聚体抗体的发光微球浓度为10-200μg/ml；
2)使用分析缓冲液稀释偶联D-二聚体抗体的感光微球浓度为10-200μg/ml。
实施例2试剂盒的应用
试剂盒使用方法，包括如下步骤：
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗D-二聚体抗体偶联的发光微球和抗D-二聚体抗体偶联的感光微球，混合反应5-60分钟；
2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
本发明试剂盒方法学评价：
1.线性
配制浓度为0ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，2500ng/ml，10000ng/ml，50000ng/ml，100000ng/ml的D-二聚体标准品溶液。在反应孔中分别加入5μl标准品、加入20μl偶联抗D-二聚体抗体的发光微球(终浓度10μg/ml)，加入20μl偶联抗D-二聚体抗体的感光微球(终浓度10μg/ml)，室温暗处温育15分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。
如上用本发明所制备的D-二聚体含量检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线(见附图2)。从附图2可以看出本发明所制备的检测试剂盒能保持良好的线性，D-二聚体浓度为100000ng/mL时方法无Hook效应。
2.准确度
准确性测量是指用已知量D-二聚体标准品加入到正常人的血清标本中，测量加入后浓度值与加入的理论值进行比较，计算D-二聚体的回收率。检测结果如下：
3.精密度
选取3份不同浓度的标本，分别按照本发明所述的方法重复测量20次。根据20次的测量结果，计算平均偏差C.V.％值。
4.分析灵敏度
分析灵敏度的定义为：是指在统计学意义上能与零剂量区别的量。重复20次测量零剂量点，计算其平均值(X)和标准差(SD)，以X+2SD的计算的浓度值即为该试剂盒的分析灵敏度。本发明试剂盒的分析灵敏度为10ng/ml。
5.特异性
检测本发明的氧通道化学发光免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液(5mg/ml)分别取适量加入到1ml的D-二聚体阳性血清标本中，使血清中血红蛋白的含量分别为1mg/ml、0.5mg/ml。将甘油三酯溶液(5mg/ml)分别取适量加入到1ml的D-二聚体阳性血清标本中，使血清中甘油三酯的含量分别为1mg/mL、0.5mg/ml。将胆红素溶液(5mg/ml)分别取适量加入到1ml的D-二聚体阳性血清标本中，使血清中胆红素的含量分别为50ng/ml、25ng/ml。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的D-二聚体阳性标本进行测定，在反应孔中每孔分别加入5μl含加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的D-二聚体阳性标本，加入20μl偶联抗D-二聚体抗体的发光微球(终浓度10μg/ml)，加入20μl偶联抗D-二聚体抗体的感光微球(终浓度10μg/ml)，室温暗处温育15分钟。温育后，激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在97.05％-105.23％之间。表明D-二聚体氧通道化学发光试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。
6.相关性
如图3所示，与Roche(罗氏)D-二聚体化学发光试剂盒的相关性为：y＝0.9994x+151.5，R2＝0.9986
本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。
本发明的原理(见附图1)是通过在均相条件下将偶联了抗D-二聚体抗体的带有酞菁染料的感光微球1，包被有二甲基噻吩、蒽等活性分子且带有铕螯合物、偶联了抗D-二聚体抗体的发光微球2混合。此时偶联了抗D-二聚体抗体感光微球1和偶联了抗D-二聚体抗体的发光微球2迅速有效地识别检测样本3的目标分子而形成免疫夹心复合物。在激光(波长为680nm)的照射下，感光微球上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单线态氧。单线态氧扩散至发光微球，与其上的化学发光剂反应，进一步激活了同样在发光微球上的荧光基团，使之发出荧光，波长为615nm。单线态氧的半衰期为4μs，在溶液中的扩散距离为200nm左右。如果生物分子不存在相互作用，单线态氧无法扩散到发光微球，则不会有荧光信号产生。
实施例3
与实施例1基本相同，不同之处仅在于所用发光微球为羧基发光微球，所用感光微球为羧基感光微球；
经过实施例2方法学进行验证，其线性、准确度、精密度、分析灵敏度、特异性和相关性与实施例1结果基本相同。
实施例4
与实施例1基本相同，不同之处仅在于所用发光微球为氨基发光微球，所用感光微球为氨基感光微球；
经过实施例2方法学进行验证，其线性、准确度、精密度、分析灵敏度、特异性和相关性与实施例1结果基本相同。

Claims (10)

1.一种一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，包括：
(1)抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液；
(2)抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液；
(3)分析缓冲液；
以及能够接收和发射光的反应孔。
2.根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述抗D-二聚体抗体为针对D-二聚体不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述发光微球表面活性基团为醛基、羧基或氨基，发光微球带有发光化合物和镧系元素化合物的高分子，发光微球大小为100-300nm；所述感光微球表面活性基团为醛基、羧基或氨基，感光微球带有光激发产生单线态氧的染料，感光微球大小为100-300nm。
4.根据权利要求3所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述发光化合物为二氧杂环己烯或二甲基噻吩的衍生物，镧系元素化合物为Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen；所述染料为酞箐染料或叶绿素。
5.根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球，其中发光微球与抗D-二聚体抗体的质量比为(1-100):1；所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液的浓度为10-200μg/ml。
6.根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述抗D-二聚体抗体偶联的感光微球，其中感光微球与抗D-二聚体抗体的质量比为(1-100):1；所述抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液的浓度为10-200μg/ml。
7.根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述反应孔为微孔板、微流控试剂盘、反应杯或反应管；所述分析缓冲液的制备，包括如下步骤：将HEPES 0.1-2g、BSA 0.1-5g、Casein 0.1-5g、NaCl 0.5-3g、Triton X-100 0.01-1ml加入蒸馏水溶解后，制成分析缓冲液。
8.根据权利要求1所述的一步均相D-二聚体检测试剂盒，其特征在于，所述抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液或抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液主要由以下步骤制成：
(1)将抗体加入到超滤管中，离心，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复洗涤，抗体稀释到1mg/ml备用；取发光微球或者感光微球，用HEPES缓冲液(pH7.4)重复清洗两次，离心，去除上清；
(2)将抗体溶液加入到发光微球或感光微球中，重悬；
(3)加入10％Tween20；
(4)加入400mM NaCNBH3，加入HEPES缓冲液将体积补足；
(5)37℃震荡反应24-48小时；
(6)封闭：用800mMNaOH配制65mg/ml CMO溶液，加到反应体系中；
(7)37℃震荡反应；
(8)离心，去除上清；
(9)加入Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬，离心，去除上清，重复一次；
(10)最后一次离心后用PBS缓冲液和牛血清白蛋白混合液重悬微球，终浓度5mg/ml，使用前稀释至所需浓度。
9.权利要求1-8任一项所述一步均相D-二聚体检测试剂盒在检测D-二聚体含量中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，检测方法包括以下步骤：
(1)在试剂盒的反应孔中加入样品、抗D-二聚体抗体偶联的发光微球试液和抗D-二聚体抗体偶联的感光微球试液，混合反应5-60分钟；
(2)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值；
(3)绘制D-二聚体浓度与光信号值的标准曲线，利用步骤(2)测得的光信号值，通过标准曲线计算D-二聚体含量。
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