CN102608313A - 抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒，其包括供体微珠、受体微珠及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原。本发明通过纯化、浓缩甲型肝炎病毒(HAV)TZ84株抗原并使其生物素化，通过点杂交法摸索出生物素化的HAV抗原的最适量为6×10^-8ng/孔。通过优化供体微珠、受体微珠、血清等试验反应条件，建立了抗HAV IgMAlphaLISA检测方法。其优点在于特异性好，灵敏度高，血清用量少，无需洗涤步骤。用该试剂盒对93份血清样本进行检测，结果显示：灵敏度(真阳性率)＝78％；特异度(真阴性率)＝98.5％；假阳性率＝1％；假阴性率＝22％；阳性预测值＝95％；阴性预测值＝93％；准确度＝94％。

Description

抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及甲肝病毒的免疫学检测，具体地说，涉及抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒。 

背景技术

甲型肝炎病毒(HAV)是感染人类甲型肝炎的主要病原。主要是经粪口传播途径感染，即由病人的潜伏期或急性期粪便、血液中的甲肝病毒污染水源、食物、用具及生活密切接触经口进入胃肠道而传播。儿童和青少年人群多发。HAV感染的诊断依据是检出HAV的抗体。当前，抗-HAV IgM是早期诊断甲型肝炎的特异性较高的指标，且有简便，快速的优点。抗-HAV IgM在发病后1周左右即可在血清中测出。因此，可以通过检测抗-HAV IgM来建立诊断甲型肝炎的诊断方法。 

发明内容

本发明的目的是提供一种抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒。 

为了实现本发明目的，本发明的一种抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒，其包括供体微珠、受体微珠及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原，其中，所述供体微珠包被有含25mM HEPES、100mM NaCl和0.05％ Proclin-300，pH7.2的链霉亲和素溶液；所述受体微珠包被有含0.05％ Proclin-300，pH7.2的Anti-IgM的PBS溶液。 

前述的试剂盒，包括供体微珠20μg/ml、受体微珠5μg/ml以及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原6×10^-8ng/孔；使用时，以总体系10μl计，每孔添加量为：受体微珠4μl、供体微珠5μl、生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原6×10^-8ng及血清1μl。 

前述抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒的制备方法，其 是将含25mM HEPES、100mM NaCl和0.05％ Proclin-300，pH7.2的链霉亲和素溶液包被至供体微珠上；将含0.05％ Proclin-300，pH7.2的Anti-IgM的PBS溶液包被至受体微珠上；生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原的制备过程为：用甲肝病毒TZ84株感染人胚肺二倍体细胞2BS株，培养细胞至病毒增殖高峰期，14天后收获细胞悬液，经氯仿抽提、PEG沉淀、离心后，用β-丙内酯灭活，浓缩后即得甲肝病毒TZ84株抗原，最后对得到的甲肝病毒TZ84株抗原进行生物素化。 

具体地，生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原的制备方法包括以下步骤： 

(1)将甲肝病毒TZ84株接种到人胚肺二倍体细胞2BS株中，培养至病毒增殖高峰期； 

(2)14天后收获的感染细胞悬液经冻融、超声各3次释放病毒； 

(3)进行氯仿抽提，10％聚乙二醇浓缩，8000r/min，4℃离心1h； 

(4)用含2％SDS的Tris-NaCl缓冲液悬浮沉淀，经蔗糖/甘油不连续密度梯度离心，从底层收获甲肝病毒抗原；其中，蔗糖/甘油不连续密度梯度为0.5ml 80％甘油，1.8ml 30％蔗糖，1.8ml 20％蔗糖，1.8ml10％蔗糖，1％SDS；离心条件为18℃，37000r/min，6h； 

(5)用β-丙内酯灭活甲肝病毒抗原后，进行超速离心浓缩； 

(6)对步骤(5)中得到的甲肝病毒抗原进行生物素化，具体为： 

(i)加入100μlWS缓冲液和60μl约123μg的浓缩甲肝病毒抗原到超滤管中； 

(ii)离心1000g，10min； 

(iii)将10μl二甲基亚砜加入到装有NH₂-reactive biotin的管中，用移液器吹打混匀； 

(iv)加入100μl反应缓冲液和8μl NH₂-reactive biotin到超滤管中，用移液器吹打混匀，37℃孵育30min； 

(v)加100μl WS缓冲液到超滤管中，离心10000g，10min，弃 滤液； 

(vi)加200μl WS缓冲液到超滤管中，离心10000g，10min，重复此步骤一次； 

(vii)加入200μl WS缓冲液，用枪头吹打10至15次，重悬此结合物； 

(viii)分装于200μl PCR中，加等量甘油，-20℃保存。 

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果： 

利用本发明的试剂盒进行甲型肝炎病毒的检测，特异性好，灵敏度高，血清用量少，无需洗涤步骤。用试剂盒对93份血清样本进行检测，结果显示：灵敏度(真阳性率)＝78％；特异度(真阴性率)＝98.5％；假阳性率＝1％；假阴性率＝22％；阳性预测值＝95％；阴性预测值＝93％；准确度＝94％。 

附图说明

图1为点杂交(dot-blot)法摸索生物素化甲肝病毒抗原最适浓度的结果。其中，上排为生物素化甲肝病毒抗原，质量分别180、90、45、22.5、11.25、5.625ng；下排为未生物素化的甲肝病毒抗原作为对照，质量分别180、90、45、22.5、11.25、5.625ng。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。 

以下实施例中使用的甲型肝炎病毒(Hapatitis A)TZ84株已在尹等人，病毒学报，1986，2(3)：209中公开，该毒株可购自北京科兴生物制品有限公司。 

实施例 

一、甲型肝炎病毒释放、浓缩和纯化： 

1、将甲肝病毒TZ84株在人胚肺二倍体细胞2BS株中，培养至病 毒增殖高峰期； 

2、14天后收获的感染细胞悬液经冻融、超声各3次释放病毒； 

3、进行氯仿抽提，10％聚乙二醇浓缩，8000r/min，4℃离心1h； 

4、沉淀物用适量的Tris-NaCl(NT)缓冲液(含质量分数为2％SDS，SDS：十二烷基磺酸钠)悬浮，蔗糖/甘油不连续密度梯度(0.5ml 80％甘油，1.8ml 30％蔗糖，1.8ml 20％蔗糖，1.8ml 10％蔗糖(含质量份数为1％SDS)37000r/min，18℃离心6h，从底层收获甲肝病毒TZ84株抗原； 

5、β-丙内酯灭活。 

二、抗原浓缩 

1、二喹啉甲酸(BCA)法测定甲肝病毒抗原浓度为9.2μg/ml，而后分两步进行浓缩： 

第一步：15ml，3千道尔顿(KD)超滤浓缩 

试验材料：甲肝病毒TZ84株抗原，200μl移液器，15ml 3KD超滤管。 

试验仪器：固定转头离心机。 

试验步骤： 

(1)在超滤管内加入10ml的甲肝病毒TZ84株抗原； 

(2)配平，4℃固定转头离心机5000g离心55分钟(min)； 

(3)收集滤过液； 

(4)用1ml移液器和200μl移液器沿滤膜底部将1.3ml浓缩液吸入到1.5mlEP管中。 

BCA法测定浓缩液和滤过液的浓度分别为43.2μg/ml和3.2μg/ml。 

第二步：0.5ml，3KD超滤管浓缩 

试验材料：甲肝病毒TZ84株抗原、1ml移液器、0.5ml 3KD超滤管。 

试验仪器：小型离心机。 

试验步骤： 

(1)在超滤管内加入500μl第一步浓缩的甲肝病毒TZ84 株抗原滤过液； 

(2)配平，14000g，离心30min，收集滤过液； 

(3)将浓缩管口反向置于外离心管内，2000g，离心30min，收集浓缩液。 

结果： 

10ml原液可浓缩至160μl。BCA法测定浓缩液浓度为205.2μg/ml。 

三、甲肝病毒抗原的生物素化 

试验原理：生物素与抗原结合，一个抗原分子可连接多个生物素分子，抗原的活性不受影响。 

试验材料：生物素化试剂盒购自Dojindo Molecular Technologies公司(商品编号LK03-10)、10μl移液器、甲肝病毒抗原、200μl PCR管。 

试验仪器：小型离心机。 

试验步骤： 

(1)加入100μlWS缓冲液和60μl约123μg的浓缩甲肝病毒抗原到超滤管中，离心1000g，10min； 

(2)另外将10μl二甲基亚砜(DMSO)加入到装有NH₂-reactive biotin的管中，用移液器吹打混匀； 

(3)加入100μl反应缓冲液和8μl NH₂-reactive biotin到超滤管中，用移液器吹打混匀，37℃孵育30min； 

(4)加100μl WS缓冲液到超滤管中，离心10000g，10min，弃滤液； 

(5)加200μl WS缓冲液到超滤管中，离心10000g，10min，重复此步骤一次； 

(6)加入200μl WS缓冲液，用枪头吹打10至15次，重悬此结合物； 

(7)分装于200μl PCR中，加等量甘油，-20℃保存。 

结果： 

BCA法测定生物素化后甲肝病毒TZ84株抗原浓度为125.5μg/ml。 加入等量甘油保存，浓度约60μg/ml。 

四、Dot-blot法摸索生物素化甲肝病毒TZ84株抗原的最适浓度 

1、试验原理：生物素能与带HRP标记的SA特异性结合。 

2、试验材料：硝酸纤维素(NC)膜、杂交袋、带HRP标记的SA、生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原，PCR管、显色液。 

3、试验器材：凝胶成像仪。 

4、试验步骤： 

(1)在一张适当大小的NC膜上用铅笔画二排圆圈，每排6个，第一排为生物素化甲肝病毒抗原，第二排为未生物素化甲肝病毒抗原； 

(2)在二排的PCR管中分别加入3μl PBS，然后在每排第一个PCR管中加入6μl约180ng的生物素化甲肝病毒抗原和未生物素化的甲肝病毒抗原，然后每排第一管中取3μl加入到第二管中，依次倍比稀释； 

(3)从每个PCR管中分别取3μl体积的样本到相对应的NC膜圆圈上； 

(4)待膜上的样本吸收完全，约30min； 

(5)将膜装入杂交袋内，加入6ml 5％脱脂奶封闭，以1∶500加入带HRP的SA，4℃过夜； 

(6)PBST洗膜3次，每次10min； 

(7)取出置于杂交袋内，加上等体积的A、B显色液； 

(8)暗室压片10min，显影约3min，洗片，定影，洗片。 

5、试验结果(见表1及图1)： 

表1点杂交法得到的试验结果 

ng	200	100	50	25	12.5	6.25
							Bio-Ag	++	++	++	++	++	+
Ag	-	-	-	-	-	-

从图1中可以看出第一排有明显蛋白印迹，而第二排没有，说明 经鉴定甲肝病毒TZ84株抗原已经生物素化，开始采取12ng及6ng的生物素化抗原进行下一步AlphaLISA试验条件的摸索。 

五、抗-HAV IgM AlphaLISA检测条件的摸索 

1、试验原理：AlphaLISA技术主要依赖于供体微珠和受体微珠的相互作用，当生物反应使供体微珠和受体微珠相互接近时，激光激发级联反应，从而产生极大的放大信号。具体来说，在680nm的激光照射下，供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体微珠，产生一系列的化学发光反应，最后将能量转移到铕，发射波长为615nm。在生物分子不存在特异的相互作用时，单体氧无法扩散至受体微珠，则不会有信号的产生。 

2、预试验结果：4个阳性样本中有3个高于空白对照的二倍以上，为试验有效性，同时可观察到采取的生物素化甲肝病毒抗原12ng及6ng试验结果无明显差异，故后续试验采取6ng的生物素化甲肝病毒抗原进行下一步试验。另外，不加血清的对照孔数值较高，考虑加入胎牛血清可以降低背景，故后续试验在体系中加入0.1％的BSA，并且进一步采取小体系继续进行试验条件的摸索，即总体系10μl，其中血清1μl，受体及供体微珠量各降低一半。 

3、生物素化TZ84株抗原的最适浓度的摸索： 

将总体系定为10μl，其中血清1μl，受体及供体微珠量各降低一半后结果显示：生物素化甲肝病毒TZ84株抗原稀释至6×10^-8ng，检测值与对照值之比仍然大于2.1，提示此浓度可以进行后续的试验。 

六、抗-HAV IgM AlphaLISA对样本的检测 

1、Mix的准备：AlphaLISA Anti-IgM受体微珠+6×10^-8ng/孔的甲肝病毒TZ84株抗原； 

采取总体系10μl，其中1μl血清。 

2、试验步骤： 

(1)在对应的孔内加入4μl准备好的Mix； 

(2)加入1μl阳性血清、健康人血清； 

(3)23℃孵育60min； 

(4)对应的孔内加入5μl供体微珠(避光)； 

(5)避光23℃孵育45-60min。 

3、试验结果： 

对23份ELISA检测甲肝阳性样本以及2份ELISA检测阴性样本进行检测，AlphaLISA结果显示ELISA检测甲肝阳性样本中有5个为阴性。 

对70份ELISA检测阴性的血清样本，1份ELISA检测甲肝阳性样本及1份阴性样本和空白对照进行检测，AlphaLISA结果显示70份ELISA检测阴性样本中有1份为阳性。 

4、结果评价(见表2)： 

表2评价结果 

灵敏度(真阳性率)＝78.3％；特异度(真阴性率)＝98.6％；假阳性率＝1.4％；假阴性率＝21.7％；阳性预测值＝94.7％；阴性预测值＝93.2％；准确度＝93.5％；批间差(CV)＜15％。 

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 

Claims (4)

1.抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于，包括供体微珠、受体微珠及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原；

其中，所述供体微珠包被有含25mM HEPES、100mM NaCl和0.05％Proclin-300，pH7.2的链霉亲和素溶液；所述受体微珠包被有含0.05％Proclin-300，pH7.2的Anti-IgM的PBS溶液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括供体微珠20μg/ml、受体微珠5μg/ml以及生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原6×10^-8ng/孔；

使用时，以总体系10μl计，每孔添加量为：受体微珠4μl、供体微珠5μl、生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原6×10^-8ng及血清1μl。

3.权利要求1或2所述抗甲型肝炎病毒IgM AlphaLISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，将含25mM HEPES、100mM NaCl和0.05％Proclin-300，pH7.2的链霉亲和素溶液包被至供体微珠上；将含0.05％Proclin-300，pH7.2的Anti-IgM的PBS溶液包被至受体微珠上；生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原的制备过程为：用甲肝病毒TZ84株感染人胚肺二倍体细胞2BS株，培养细胞至病毒增殖高峰期，14天后收获细胞悬液，经氯仿抽提、PEG沉淀、离心后，用β-丙内酯灭活，浓缩后即得甲肝病毒TZ84株抗原，最后对得到的甲肝病毒TZ84株抗原进行生物素化。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，生物素化的甲肝病毒TZ84株抗原的制备包括以下步骤：

(1)将甲肝病毒TZ84株接种到人胚肺二倍体细胞2BS株中，培养至病毒增殖高峰期；

(2)14天后收获感染的细胞悬液经冻融、超声各3次释放病毒；

(3)进行氯仿抽提，10％聚乙二醇浓缩，8000r/min，4℃离心1h；

(4)用含2％SDS的Tris-NaCl缓冲液悬浮沉淀，经蔗糖/甘油不连续密度梯度离心，从底层收获甲肝病毒抗原；其中，蔗糖/甘油不连续密度梯度为0.5ml 80％甘油，1.8ml 30％蔗糖，1.8ml 20％蔗糖，1.8ml10％蔗糖，1％SDS；离心条件为18℃，37000r/min，6h；

(5)用β-丙内酯灭活甲肝病毒抗原后，进行超速离心浓缩；

(6)对步骤(5)中得到的甲肝病毒抗原进行生物素化，具体为：

(i)加入100μlWS缓冲液和60μl约123μg的浓缩甲肝病毒抗原到超滤管中；

(ii)离心1000g，10min；

(iii)将10μl二甲基亚砜加入到装有NH₂-reactive biotin的管中，用移液器吹打混匀；

(iv)加入100μl反应缓冲液和8μl NH₂-reactive biotin到超滤管中，用移液器吹打混匀，37℃孵育30min；

(v)加100μl WS缓冲液到超滤管中，离心10000g，10min，弃滤液；

(vi)加200μl WS缓冲液到超滤管中，离心10000g，10min，重复此步骤一次；

(vii)加入200μl WS缓冲液，用枪头吹打10至15次，重悬此结合物；

(viii)分装于200μl PCR中，加等量甘油，-20℃保存。

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