JPS61501226A - 生体分子と生物細胞の濃縮及び検出方法並びにその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 生体分子と生物細胞の′ｓＮ及び検出方法並びにその装置 発明の詳細な説明 〈産業上の利用分野〉 この発明は生物学的物質の濃縮及び検出方法並びに同方法に使用する装置に関す る。

〈従来の技術〉 いままでに知られている生物学的及び生化学的物質の検査方法は、当該検査物質 の濃縮がしばしば困難であるため不満足であった。遠心脱水法や限外濾過などの 種々な技術が分析対象の生物学的又は生化学的物質のＡａ縮物を得るために用い られている。しかし、数種類の分子はこのような方法で濃縮できそうもなく、そ のようなものの例としては、抗原、核酸、ホルモン、酵素、リガンく問題点を解 決するための手段〉 この発明は親和性を有する生物学的及び生化学物質をｍｗＡする方法に関するも のである。抗原−抗体、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ　レ クチンーリセブタ、ファージやウィルスなどの他のリセブタばかりでなく、リガ ンドの相互作用など゛の他の物質に対して親和性を有する検出対象物質の流体サ ンプルを、当該物質に親和性を有する他の物質を表面に付着させた固体のその表 面を流すことにより連成される。その結果、流体の容置との比較において数倍量 のものがその表面を通過することとなる。流体が通過する間に、検出対象物質が 親和性を有しかつ複合体を形成するところの他の′ａＪ質に付着する。形成され た複合体は酵素、放射能、レザー。

などの種々のマーカーを用いて読みとることが出来る。

この発明による検出方法は自助化可能であり、かつ感度も、既に知られているマ イクロプレートを用いるか、あるいは免疫放射能検査技術（ＲＩＡ）、免疫蛍光 検査法等を用いる酵素とＮｌ＠Ｌ、た免疫吸着剤検査法（ＥＬＩＳＡ）（Ａ・ボ ニラー、Ａ・バートレット及びり、Ｅ、バイトウェル１．ＥＬＩＳＡ技術に特に 関連した酵素免疫検査法（臨床病理学誌旦、５０７−５２０（１９７８）　（Ｖ ｏｌｌｅｒ、Ａ、、　Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ａ、、ａｎｄ　Ｂｉｄｗｅｌｌ　。

Ｄ、ε、、”Ｅｎｚｙ＊ｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　ｗｉｔｈ　５ｐｅｃｉ ａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｔｏ　ＥＬ［ＳＡ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　”　、　 Ｊ、　Ｃｈｉｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、３１　。

５０７−５２０　（１９７８）：Ｍ、ｗ、５−（チルＷＡ感染病の迅速診断中り 、Ｒ，オーババイ、Ｊ、に、マーシュアーワオー著免疫放射能検査法Ｐ、３９− ７０、フロリダ州ボカ市ＣＲＣ出社＜　１９７９　）　（（ｌｖｅｒｂｙ、　Ｌ Ｒｌ、ａｎｄＨＩＩＳｈａｈＷａｒ、Ｊ、ｋ、、Ｒａｄｉｏｉｕ＋ｕｎｅ　ａｓ ｓａｙｓ”　、Ｐ　、３９−７０、ｉｎ　Ｍ、Ｗ、Ｒｙｔｅｌ　（Ｅｄ、）　、 Ｒａｐｉｄ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　１ｎｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｄｉｓｅａｓｅ 、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ、Ｆｌａ、（１９７９）：Ａ、Ｂ、ゾール、及び Ｍ、ラーク　膜フイルタ上での免疫蛍光染色による海洋細菌研究についての多様 性の動力学、応用環境微生物字詰４３．１６９−１７６（１９８２）　（Ｄａｈ ｌｅ、Ａ、８．、ａｎｄ　Ｌａａｋｅ、Ｈ，、”Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｄｙｎａｍ ｉｃｓ　ｏｆ　ｍａｒｉｎｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｂｙｉ＋ｕ ＋ｕｎｏＮｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｎ　ｍｅｌｌｂｅｒ　ｆ ｉｌｔｅｒｓ″　。

Ａｐｐｌｎ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　１４ｉｃｒｏｂｉｏｌ　４３　１６９−１７ ６（１９８２）参照）等の方法と比較して少くなくとも１０倍上げることができ る。

流蛍比及び流体を流す時間に依然しているが、検出レベルはかなり下げることが できる。ｍ菌の濃度と固定された物質の量が、その他の変数である。固定された 物質゛の（検出）限界はその特異性の増大と共に増加する。

流量はその都度検査されなければならず、とりわけ、検出対象物質の大きさに左 右される。

固体表面は、不動化されたものであればどんな固体表面でも良い、しかし、好ま しくは疎水性で、ガラス、プラスチック性物質、金属、シリコンなどの重合物質 より溝成される。上記表面への結合は １）疎水性の表面への受動的吸着によるか、又は２）特定の分子、例えば抗体、 酵素、抗原を固体相に吸着又は共有結合により固定すること によって行われる。

流体サンプルとしては水、例えば緩衝液、体液などの水を基材とした系、サイク ロン媒質中に密封した空気のサンプル、検出対象の物質を含む固体サンプルを適 当な緩衝液に再分散させたものでも良い。

細菌の検出では、サンプル１ｄ当りにすくなくとも１０３個以上の細菌が含まれ ると有利であることが判明している。しかし、１ｄ当り１０２個程型Ｏ少量でも 検出は可能である。

サンプル量が増えれば、所望の物質の濃度は下げることができ、かつ検出も可能 である。

表−１には、この発明に使用する装置の一つを、免疫学的技術を用いた濃縮方法 に用いる際の構成図として表わしているが、勿論これに限定されるわけではない 。

例えば抗原を含むサンプル（１）はポンプ（２）により内面に抗体が固定されて いる管（３）へ送られる。抗原は管内を流れることにより抗体の土に沈積し、種 々のマーカー、例えばアルカリフォスファターゼとの発色反応により読取れる複 合体を形成する。

これまでに用いられている上述のＥＬＩＳＡ方法のような分析方法は検出可能な 抗体の最低濃度（感度）に関して限界がある。遠心分離や限外濾過などの種々の 直接的な濃縮方法は、上述の如く、満足すべき結果は得られていないが濃縮及び 感度向上に用いられている。

ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）　（野兎病の病原菌）抗原を有する兎から得た抗体をエ フ、フランジセラ（Ｆ、　ｔＵＩａｒｅｎｓｉｓ）の完全菌体の認知能力につい て試験した。その結果、抗体はｍ菌の表面に固定され、診断ｇ置として使用可能 なことが判明したｇ当該抗体にもとづいて分析方法を開発した。当該方法におい ては、マーカー抗体は抗原に対して純化された親和性を有して居り、アルカリフ ォスファターゼで標識されていた。

上記の検査方法をいわゆるマイクロプレート−ＥＬＩＳＡ法を用いエフ、ツラレ ンシス菌（Ｆ。

ｔＵＩａｒｅｎｓｉｓ）の完全国体について試験したところ、図２に示す如く、 上記方法により有意に検出できる微生物の最低量は１−当り１０５個であった。

遠心分離や限外濾過による濃縮でも同一の結果が分析により得られた（従って、 全く（感度の）向上はみられず、その結果は省略した。）９ 野兎病の疫学的研究の結果エフ、フランジセラ（Ｌｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）は水 中及び空気中に存在し、これらを通して広まりうることが明らかになっている。

かくして、少量の細菌を含む水又は空気の分析方法に対する要望が高まっている 、実在するもうひとつの要望は、極めて少量最低量が１ｄ当り１０５個の範囲内 であるため不満足であることが証明されている。

く問題点を解決するための手段〉 そのため、エフ・フランジセラ（Ｆ、　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ−）　（７）特定 抗体に対する親和性を利用し、感度向上のための試験を行った。

シイ−・サンドストローム、エイ、テルンヴイク、エイチ・ウオルフーワツ及び ニス・Ｏイフグレン著日しＩＳＡを用いた抗体の発現のためフランジセラ・フラ ンジセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）からの抗体の調製 ；　ＦＡＯ報告書Ｃ４０１７９−Ｂ３，１９８３年６月、スエーデン国つメヤ市 （５ａｎａｓｔｒる一、Ｇ、　、Ｔａｒｎｖｉｋ、Ａ、　。

Ｗｏｌｆ−Ｗａｔｚ、Ｈ，、ａｎｄ　Ｌδｒｇｒｅｎ、ｓ、、”ＰｒＨａｒａｔ ｉｏｎ　ｏｒａｎｔｉｇｅｎ　ｆｒｏｍ　Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｔｕｌａｒ ｅｎｓｉｓ　ｆｏｒｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｒ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ 　ｂｙ　Ｔｈｅ　ＥＬＩＳＡ”　、　ＦＡＯＲｅｐｏｒｔ　Ｃ４０１７９−Ｂ３ ．　Ｊｕｎｅ　１９８３．　Ｕｍｅａ。

Ｓｗｅｄｅｎ）に記載された方法にもとづき表面抗体を調製した。

表面抗体（サンドストローム等、感染と免疫旦。

１０１−１０６　（１９８４）　（Ｓａｎｄｓｔｒｉｏ＋　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎ ｆ。

Ｉｍａ、４５，１０１−１０６　（１９８４）参照）を分離した。これは兎に免 疫化させたもので、エフ・フランジセラ（Ｆ、　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　）に対 して特異的な抗体を与えるものであった〔シイ−・サンドストローム及びエイチ ・ウオルフーワツ　水中のフランジセラ　フランジセラの迅速同定ＦＡＯ報告Ｃ −４０１８８Ｂ３．１９８３年１１月、スエーデン国つメヤ市（５ａｎｄｓｔｒ ’ａｍ、Ｇ、　、ａｎｄ　Ｗｏｌｆ−Ｗａｔｚ、Ｈ，、”Ｒａｐｉｄ　１ｄｅｎ ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　 ｉｎ　ｗａｔｅｒ　”　、ＦＡＯＲｅｐｏｒｔ　Ｃ４０１８８−８３，Ｎｏｖｅ ｍｂｅｒｌ　９８３．　Ｕｍｅ＋ａ、　Ｓｗｅｄｅｎ、）参照〕。

兎の血清 兎はエフ、フランジセラ（Ｆ、　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　）抗体を用い、シイ− ・サンドストローム及びエイチ・ウオルフーワツ　水中のフランジセラ　フラン ジセラの迅速同定ＦＡＯ報告Ｃ−４０１８８Ｂ３．１９８３年１１月、ス工−デ ン国つメヤ市（前出）に記載された方法により免疫化された。

親和性の純化及びアルカリフォスファターゼの兎抗体へのカップリング 野兎病菌の生ワクチン（Ｆ、　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　ＬＶＳ　）は米国メリー ランド州フレデリック市ホルト　ブトリック米国陸軍感染病医学研究所（Ｕ、　 Ｓ、　Ａｒｅ＋ｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ［ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏ ｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、　Ｆｏｒｔ　Ｄｅｔｒｉｃｋ。

Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｈｄ、、ＵＳＡ　）より提供された。野生株、エフ・フラ ンジセラ・バライテイ・パラニルクチイカ（ＳＢＬ　Ｒ４５株）　ＣＦ、　ｔｕ ｌａｒｅｎｓｉｓ　ｗａｒ。

ｐａｌａｅｒｃｔｉｃａ　（５ｔｒａｉｎ　ＳＢＬ　Ｒ４５）はスエーデン国ス トックホルム市国立スエーデン微生物研究所アール・メイルバイ（Ｒ，Ｈｏ１ｌ ｂｙ、Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＳｗｅｄｉｓｈＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃ ａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌ（Ｓｗｅｄｅｎ　）より提供さ れたものである。

上記のエフ・フランジセラ（Ｆ、　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　）の二菌株はＧＣ− 培地素材（米国ミシガン州デトロイト市ディフコ　ラボラトリーズ社１：３６ｇ ／ｉ）及びアイツバイタレックス（米国メリーランド州コツキイズヴイル市、ビ イ・ビイ・エル微生物システムズ社製、１０ＩＩｇ／ｊ）を含む、サイヤーーマ ーチン改良寒天培地で３７℃、空気中の二酸化炭素ガス濃度５％で培養した。、 細菌数は生菌計測により測定した。

流体試料 水道水を０．０１モルの塩酸を用いｐＨ５，０に調整、ツエーンｏ２０を各サン プルに０．０５％（Ｖ／Ｖ）の濃度で添加し、エフ、ツランレンシス（Ｆ、　ｔ ｕｌａｒｅｎｓｉｓ　）をそれぞれ１１Ｉｉあたり０１１０．１０２．１０３． １０４及び１０５個を分散させるか、あるいはサイクロン媒質にツエーンｏ２０ を０．０５％（Ｖ／Ｖ　）追加添加した〔（ティ・オルソン、ニス、スタイン及 びエイ・トーレ、蛍光分析を用いた細菌を含有するエアゾールの検出１、気体試 料の蛍光分析、ＦＡＯ報告０４００６１−Ｂ２　（１９７７）、スエーデン国つ ルスピツク市（０ｌｓｓｏｎ、　■１．Ｓｔｙｍｎｅ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｔｈｏｒ ｅ　、Ａ、、”０ｅｔｅｋｔｉｏｎ　ａｙｂａｋｔｅｒｉｅａｅｒｏｓｏｌｅｒ 　ｗｅｄ　Ｉｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓａｎａｌｙｓ　１　。

Ｌｕ１ｉｎｅｓｃｅｎｓａｎａｌｙｓ　ａｖ、Ｌｕｆｔｐｒｏｖｅｒ　”　、　 ＦＡＯＲｅｐｏｒｔＣ４００６１−Ｂ２　（１９７７）、　Ｕｒｓｖｉｋ、Ｓｗ ｅｄｅｎ　＞参照〕。

対照実施例 抗体−抗原 マイクロプレートＥＬＩＳＡをホーラーらの方法（臨床病理字詰３１，５０７− ５２０　（１９７８）。

Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ技術と特に関連した酵素免疫検定（Ｖｏｌ　ｌｅｒ。

ｅｔ　ａｔ、Ｅｎ２１７ｍｅ　１ｌｌＵｎｏ　ａｓｓａｌ／Ｓ　ｗｉｔｈ　５Ｏ ｅＣｉａ＋ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｔｏ　ＥＬＩＳＡ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ″、 　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、。

３１．５０７−５２０　（１９７８）））に実質的に従って実施した。エフ・ツ ラレンシス（Ｆ、　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　）　−抗体に対する兎の抗血清を１ ００＝１の割でｐＨ９，６の０．０５モル炭酸水素ナトリウム緩衝液で希釈（Ｅ ＬＩＳＡ−抗体価：１　：５，０００）した８この細１５濁液をマイクロプレー ト（スウェーデン国ストックホルム市フロー・ラボラトリーズ・スペンス力社） に添加し、３７℃で１時間インキュベートした９次いで、エフ・ツラレンシス（ Ｆ、　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　）抗原の兎抗体で親和性を純化し、かつアルカリ フォスファターゼで標識したものの溶液を３７℃で１時間適用した。反応は上記 酵素に対するＭ質の添加により行ない、４０５ｎｌの吸光度を測定した。このよ うにして得られた結果は、図２及び表−２に示す。

ぜん動ポンプシステム（米国アーズレイ市、テクニコン社製）に連結したプラス チック製管（スエーデン国、ストックホルム市、ノアクス社製タイゴンＯ）中で 検査操作は行った９管の容量は管径１α当り４０μ！であった。各検査には１０ ｏ＋＋の管を継いで用いた。抗血清の固定は至温で一晩かけて被覆することによ り行った１図３では試料は管の内部を１．９ｄ／分の流量で通過させた、数実験 では試料を管内に静置したがその他の実験では実験中管内に流れを発生せしめた ８ 洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識の抗体への静置１露を３７℃で１時間行 った９ポンプシステムから管を取りはずし、両端を切り落し５１の長さにし、ア ルカリフォスファターゼの基質を添加した。３７℃で３０分間インキュベートし た後、８管の内容物（２００μｌ）をマイクロプレート中の凹部へ移し、４０５ ｎｍで吸光度を測定した。サンプルを三叉！°制で試験し、平均値を算出した。

図３に表した如く試料を管内で静置しておいた場合には、管内をサンプルを流し た場合に得られたＥＬＩＳＡ値と比較して低い値が得られた。

この発明にもとづく方法によれば、感度は増大した、図４に示すように、流量を 限定しない試料の場合には、１ｄ当り１７−”／うＬｉンシ；１．　（Ｆ、　ｔ ｕｌａｒｅｎｓｉｓ　）　１０２個までは検出可能である。エフ・ツラレンシス （Ｆ。

ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）の管を通過前と通過後の生菌数において、明らかな細菌 量の減少は認められなかった。

１７・１ソラレンシス（Ｆ：４叶αぺｎｅｔ’ｓ　）　”ｃ　ｉも・績呆斗の容 量をさまざまに変えて、サンプルを循環させることの是非について試験した。実 際的に循環させることのできる試料の最少量は５ｄであった。図５の如く、感度 はすくなくとも１０倍向上し、試料を循環させる時間との関係では因４の如く一 般には１０〜１００倍向上した。

１０’個のエフ・ツラレンシス菌を５．１５及び５０ｍの流体試料に懸濁させ１ ８時間循環させ試験すると表−１に示す如く、流体試料の轟に応じて増大した値 が得られた。

エフ・ツラレンシス（Ｆ、　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　）に対して特異的な抗体で 被覆された管内をエフ・ツラレンシス（Ｆ。

ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）を含むサンプルの量を種々変えて流したところ、管内の 細菌の富化が得られた。管内を多量に流したとき表−３に示す如く平原状態が得 られたが、これは抗体が付着する場所は既に占領されていて、更に細菌が捕捉さ れ得ないという事★によるものと思われる。

ツエーンＯ２０を０．０５％（Ｖ／Ｖ　）追加添加したサイクロン媒賀（ティ・ オルソン、ニス・スタイン、エイ・トーレ、蛍光分析による細菌を含むエアゾー ルの検出１、気体試料の蛍光分析、Ｆ△○報告Ｃ４００６１−Ｂ２（１９７７） 、スエーデン国つルスヴイク市（前述）参照）にエフ・ツラレンシス（Ｆ、　ｔ ｕｌａｒｅｎｓｉｓ　＞を封入したときも同様の拮渠が得られている。

リガンド−リガンド相互作用 大腸Ｗ（Ｅ、ｃｏｌｉ　）ＨＢ１０１／１）ＲＨＵ８４５株はマンノース抵抗性 赤血球凝集反応を経て、Ａ型血液を凝集する。相互作用は赤Ｉｆ［１球上でＧａ ｆ−ＮＡＣβ（１→３）Ｇａｆ２　（１−＋４）Ｇａｆβ（１−４）ＧＬＣ−セ ラミドレセプタに対する細菌の特異的蛋白質の間で起る。

プラスチック製管（タイボン０）を全曲（Ａ型血液）で被覆した。大腸菌を１ｄ 当りＯから５・１０６個の濃度で検査装置中を溢れさせた。次いで、大腸菌に対 する兎の抗体を加えた。その後、アルカリフォスファターゼで標識した抗兎免疫 グＯプリンＩａＧを加え３７℃１時間インキュベートし、最後に４０５　ｎｕで の吸光度をアルカリフォスファターゼの基質を加えてモニターした。この方法で 種々濃度の大腸菌を検出することができた。

艮：」− 試料容量を変えて１８時間エフ・７５９２９２１０４個を含む流体を循環させた 壜台に得られた　果（註）ａ　：１８時間循環させた。

測定値は３回計測したものの平均値 検出可能なエフ・ツラレンシス生ワクチンＬＶＳ（Ｆ。

ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　ＬＶＳ）は流体を流すことにより増加した。エフ・ツラ レンシス（Ｆ、　ｔｕｌａｒｅｎｓ：ｓ　）を１−中に１０．１０　及び１０５ 個含む懸濁液を同国に対する抗体で被覆したタイボン［Ｆ］プラスチック製管内 を通過させた。試料懸濁液の流量は３時間当り１００ｄに調整した。この方法に より、エフ・ツラレンシスＬＶＳ（Ｆ。

ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　ＬＶＳ）　（生ワクチン）の旦は富化され、マイクロプ レート・ＥＬＩＳＡ法で検出可能なレベルと比較し、より低い検出レベルが得ら れた。、タイボン［Ｆ］プラスチック製管の影響も検査した。

ＥＬＩＳＡ検出方法をタイボン［Ｆ］プラスチック製管内で流体を静置したま） 実施した。流体を流すことの有利性がこの試験においても実証された。マイクロ プレート・ＥＬＩＳＡ法と比較してより低い検出レベルが得られた。

図面の簡単な説明 図１はサンプルを分析￥ｉ置の管壁を通過させることによる富化操作を示す。流 速は毎分１．９ｄで、管の内容量は管長１αあたり４０μｌであった。試料は管 内を一回通過させるか又は循環させた。抗原と抗体に関してはマイクロプレート ・ＥＬＩＳＡ分析方法と同様の方法で分析を行った。分析操作中の管長はｌ０Ｃ Ｉであるが酵素基質を添加する最終工程は異なる。上記の添ｔＩｌｌ前に、管は 両端から切断し５αの長さとした。

図２はＥＬＩＳＡをマイクロプレート中で行った時の結果を示す。すなわち、マ イクロプレートをエフ・ツラレンシス（Ｆ、　ｔｕ＋ａｒｅｎｓ＋ｓ　）に対す る免疫血清で室温で一晩かけて予しめ被覆した。次いで、試料を洗浄後添加し、 ３７℃で１時間反応させた。アルカリフォスファターゼで標識した親和性を純化 したエフ・ツラレンシス（Ｆ、　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　）抗体を次いで加え、 マイクロプレートを１時間３７℃でインキュベートした。酵素基質は最後に加え 、３０分後反応を自動分光光度計を用いてモニターした。表中の値は１６サンプ ルの平均値と標準偏差を増減した値を示す。

図３は１ｄ当り細菌１０５個を含む水の容量を種々に変えたときの、管壁でのエ フ・ツラレンシス（Ｌｔｔｌ　１ａｒｅｎｓ　ｉ　３　）の富化の結果を示す。

試験時間は３時間。

図中の値は３サンプルの平均値とそれに標準偏差値を増減した値を示す。

図４は試料の容量に応じた種々の濃度のエフ・ツラレンシス（Ｆ、　ｔＬＩｌａ ｒｅｎｓｉｓ　）を、予じめ被覆した［Ｆ］ タイボン　管を通過させときの検出水準を示す、、３時間が検出できた。１１ｄ 当り細菌数が１０２個という少くない場合には有意な検出水準を得るには、約４ ．５１のサンプル（全部で４．５Ｘ１０”個の細菌数）をタイボン［Ｆ］管を通 過させることとなった。

上記の試験は特異的な抗体でタイボン［Ｆ］管を被覆すると管の内壁で抗原は富 化されることを示している。検査対象サンプル中の細菌数に試験期間、すなわち 富化時間は依存することが明らかとなっている。

細菌数／ｄ　グラフのプロット 図中の値は９−１２サンプルの平均値と標準偏差を増減させた値を示す。

バックグラウンド値（エフ・ツラレンシス（Ｆ。

ｔＬＩｌａｒｅｎｓｉｓ）を含まない水道水）は減じである。

図５は試料を循環させたときのエフ・ツラレンシス（Ｆ、　ｔｕｌａｒｅｎｓｉ ｓ　）の検出レベルヲ示す。

測定は３．６．１８及び２４時間に行った。図中の値は１０−１５サンプルの平 均値と標準偏差を増減した値図６は大腸菌を用い細菌数を１ｄ当りＯから５×１ ０６個の間の濃度としたときの４０５ｎｌｌ／１００分の吸光度を示す。サンプ ルは３時間循環させた。

図中の値は３サンプルの平均値である。

Ｆｉｇ、７　”（Ｆ’３＠Ｃ！ｊＪ！７！Ｌ）浄書（内容に変更なし） 浄書（内容警こ変更なし） ＯＸ７’　１０’　／ζ？　ｔｏ’　ｔｏ５　ｔｏＥ　ノ０７細菌状 立４？−ｌ出六Ｉ−亦１丁す戸マ） 浄書（内容４こ変更なし） 浄書（内容に変更なし） 麹菌　数 手続補正書（方式） ％式％ １゜事件の表示 ＰＣＴ／８ε９ケ／ρクク２乙 ２、発明の名称　主イネ分手乙打勿声８８妃農脇ｎび゛撞ム伯ム立び１５ろめ歿 ｉ ３、補正をする者 １！件との関係　特許出願人 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 ８、補正の内容　別紙のとおり 口面の４１７文の淳ご　（内容にス更なし）国際調査報告 巷表ｎ邦１−５０１２２６（８）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）他の物質に対し親和性を示す検査対象物質に親和性を示す物質を付着させ た固体の表面上を当該検査対象物質を含む液状検査サンプルを流れとして通過さ せ、その結果当該検査対象物質の富化が達成されること及び上記活性表面と接触 する液量の関連において何倍もの多量の液量がその表面を通過することを特徴と する生物学的物質の検出方法。
2. （２）被検物質及び被検物質が親和性を有する物質とが抗体−抗原、ＤＮＡ−Ｄ ＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−レクチンレセプタ、リガンド相互作用及びファ ージ又はウイルスなどの他のレセプタからなることを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の生物学的物資の検出方法。
3. （３）流れがポンプによつて発生させられることを特徴とする請求の範囲第１項 記載の生物学的物質の検出方法。
4. （４）流れが循環されることなく上記固体表面を通過することを特徴とする請求 の範囲第１項記載の生物学的物質の検出方法。
5. （５）流れが循環されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の生物学的物質 の検出方法。
6. （６）流速を被検物質の大きさとの関係を決定することを特徴とする請求の範囲 第１項ないし第５項記載の生物学的物質の検出方法。
7. （７）表面に他の物質に親和性を示す検査対象物質に対して親和性を有する物質 を付着させ、その表面を検査対象物質が流体となつて通過し、それによつて検査 対象物質が富化されるようになつていることを特徴とする親和性を有する生物学 的物質の検査用装置。
8. （８）上記固体表面が疎水性である請求の範囲第７項記載の生物学的物質の検査 用装置。
9. （９）流体を発生せしめるようポンプを設けてある請求の範囲第７項記載の生物 学的物質の検査用装置。
10. （１０）上記固体が重合物質、すなわちグラス、プラスチツクス、金属又はシリ コンよりなる請求の範囲第７項及び第８項記載の生物学的物質の検査用装置。
11. （１１）上記固体表面が柔軟性のあるプラスチツクス製の管である請求の範囲第 ７項、第８項及び第１０項記載の生物学的物質の検査装置。