SE446229B - Sett och anordning for detektering av en analyt i ett prov som bringas att passera en yta till vilken bundits ett emne med specifik affinitet till analyten - Google Patents

Description

8400374-8 Med sättet enligt uppfinningen kan detektionsprocessen auto- matiseras och känsligheten ökas 10-100 gånger jämfört med tidigare kända metoder, såsom exempelvis “enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA) med mikroplattor eller genom radioimmunoanalys (RIA)-teknik, immunofluorescens mm. (Voller, A., Bartlett, A., och Bidwell, D.E., “Enzyme immuno assays with special reference to ELISA techniques", J. Clin. Pathol. ål, 507-520 (l978); Overby, L.R., och Mushahwar, J.K., "Radio- immune assays“, p. 39-70, in M.W. Rytel (Ed.), Rapid diagnosis in infectious disease, CRC Press, Boca, Fla. (l979); Dahle, A.B., och Laake, M., “Diversity dynamics of marine bacteria studies by immunofluorescent staining on membrane filters", Appl. Environ. Microbiol. gå, 169-l76 (1982).

Den ökade känsligheten, som erhålles med förfarandet enligt uppfinningen, beror på flödesmängden och flödestiden. Andra variabler vid sättet enligt uppfinningen är provets bakterie- koncentration och mängden till den fasta ytan inbunden sub- stans.

Flödesmängden måste därvid vid varje tillfälle utprovas och beror bl.a. på storleken hos molekylerna som skall detekteras.

Den fasta ytan kan vara vilken som helst fast yta som är immo- biliserad, men är företrädesvis hydrofob och består av poly- mert material, såsom glas, plast, metall, silikon mm.

Inbindning till denna åstadkommes .l) genom passiv adsorption till den hydrofoba ytan, eller 2) genom att den specifika molekylen, exempelvis antikropp, enzym, antigen, immobilíseras till en fast fas via adsorp- tion eller kovalent inbindning..

Vätsekprovet kan utgöras av vatten, vattenbaserade system, exempelvis buffert, kroppsvätskor, i cyklonmedier impakterade luftprover, i lämpliga buffertsystem resuspenderade fasta 8400374-8 prover innehållande det ämne, som skall detekteras.

Det har vid bakterieanalys visat sig fördelaktigt om provet innehåller minst 103 bakterier per milliliter suspenderade däri.

Vid ökande provvolym kan koncentrationen av sökt material minskas och ändå ge detekterbara resultat.

Ett icke begränsande exempel på en enligt uppfinningen använd anordning framgår av bifogade schematiska skiss över anrik- ningsförfarandet med immunologisk teknik (fig. l).

Ett prov, innehållande exempelvis antigen, pumpas med en pump in i en kyvett, till vars inre ytor antikroppar inbundits.

Vid flödet genom kyvetten avsätter sig härvid antigen på antikropparna och bildar ett komplex, som avläses med olika markörer, såsom exempelvis en färgreaktion med alkaliska fos- fataser.

För närvarande använda analysmetoder, såsom de ovan nämnda ELISA-metoderna, har begränsningar ifråga om mängderna anti- gen, som kan detekteras. Olika direkta koncentrationsökande åtgärder, såsom centrifugering och ultrafiltrering, har använts för att öka koncentrationen och känsligheten utan att ge tillfredsställande resultat.

Antikroppar erhållna från kaniner, som erhållit isolerat antigen från Francisella tularensis (som ger upphov till tularemi), testades avseende sin förmåga att känna igen hela bakterier av F. tularensis. Man fann därvid att antikropparna bands till bakterieytan och sålunda kunde användas som dia- gnostiskt verktyg. Man utvecklade ett analyssystem baserat på dessa antikroppar, varvid markörantikropparna affinitetsrena- des mot antigenet och märktes med alkalisk fosfatas.

När detta diagnostiska system testades med hela bakterier av F. tularensis genom s.k. mikroplatt-ELISA, fann man att det 84ÛåÛW3å74-8 lägsta antal bakterier, som signifikant kunde detekteras, låg vid en koncentration av 105 bakterier per milliliter (fig. 2, tabell 2).

Koncentration genom centrifugering eller ultrafiltrering gav samma resultat vid analys (dvs. ingen ökning erhölls, ej redovisat).

Man har vid undersökningar vid epidemier av tularemi funnit att F. tularensis kan förekomma i och spridas med vatten och luft. Det har därför uppstått ett behov av att kunna genom- föra analys av vatten och luft innehållande mycket små mäng- der bakterier. Det föreligger även ett behov av att kunna analysera mycket små provmängder, såsom exempelvis kropps- vätskor.

Såsom ovan nämnts, visade sig de använda ELISA-metoderna vara otillfredsställande, då det lägsta antal bakterier, som kan detekteras med dessa metoder, ligger vid en koncentration av lo” bakterier per millilirer.

Försök gjordes därför att använda F. tularensis' affinitet till specifika antikroppar för att öka testets känslighet.

Ett ytantigen framställdes, såsom beskrives av Sandström, G., gTärnvik, A., Wolf-Watz, H., och Löfgren, S., "Preparation of antigen from Francisella tularensis for demonstration of antibodies by the ELISA“, FOA-rapport C 40179-B 3, juni l983, Umeå, Sverige.

Ett ytantigen isolerades, som immuniserat på kanin gav speci- fika antikroppar mot F. tularensis (Sandström, G., och Wolf- Watz, H., "Snabbidentifiering av Francisella tularensis i vatten", FOA-rapport C 4Öl88-B 3, november 1983, Umeå, Sverige.

Kaninsera. Kaniner immuniserades med F. tularensis-antigen såsom beskrives av Sandström, G., och Wolf-Watz, H., "Snabb- 8400374-8 identifiering av Francisella tularensis i vatten", FOA-rapport C 40188-B 3 , november 1983, Umeå, Sverige.

Affinitetsrening och alkalisk fosfatas-koppling till kanin- antikroppar.

En levande stam av F. tularensis (F. tularensis LVS) till- handahölls av US Army Medical Research Institute of Infec- tious Diseases, Fort Detrick, Frederick, Md., USA. En vild stam av F. tularensis var. palaerctica (stam SBL R45) till- handahölls av R. Möllby, Statens bakteriologiska anstalt, Stockholm, Sverige.

Bakterier av de två stammarna av F. tularensis odlades pâ modifierad Thayer-Martin-agar, innehållande Gc-mediumbas (36 g/1; Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA), hemoglo- bin (l0 g/1; Difco) och Isovitalex (10 mg/1; BBL Microbiology Systems, Cockeysville, Md., USA) vid 37°C i 5 % C02 i luft.

Bakterietätheten bestämdes genom räkning av levande bakte- rier.

Vätskegrov: Vattenledningsvatten justerades till pH 5,0 med 0,01 M saltsyra. Tween 20 sattes till samtliga vattenprov i en koncentration av 0,05 % (vikt/volym). F. tularensis- bakterierna suspenderades i dessa lösningar i mängder om vardera o, 101, 102, 103, 104 een los/mi, eller enter-native försattes cyklonmedium med 0,05 % (vikt/volym) Tween 20 (Olsson, T., Stymne, S., och Thore, A., “Detektion av bakte- rieaerosoler med luminescensanalys l. Luminescensanalys av luftprover", FOA-rapport C 40061-B 2 (1977), Ursvik, Sverige).

Referensexemgel Antigen-antikrogg Mikroplatt-ELISA genomfördes huvudsakligen enligt Voller et al., “Enzyme immuno assays with special reference to ELISA techniques", J. Clin. Pathol. 31, 507-520 (1978). Kaninanti- 8400374-8 serum mot F. tularensis-antigen utspätt l00:l (ELISA-titer l:5000) i 0,05 M natriumbikarbonatbuffert, pH 9,6, infördes i mikroplattor (Flow Laboratories, Svenska AB, Stockholm, Sverige). Bakteriesuspensioner sattes till mikroplattorna, som inkuberades i en timme vid 37°C. I nästa steg tillfördes en lösning av affinitetsrenade kanin-antikroppar mot F. tula- rensis-antigen i en timme vid 37°C. Reaktionen utvecklades genom tillsats av substratet till enzymet och absorbansen vid 405 nm uppmättes. Resultaten framgår av fig. 2 och ta- bell 2.

Exemgel Antigen-antikrogg Förfarandet genomfördes i plaströr (TygonC3; Noax AB, Stock- holm, Sverige) förbundna med ett peristaltiskt pumpsystem (Technicorn Corp., Ardesly, USA). Rörets volym var 40 pl/om rör. Vid varje analys tillkopplades l0 cm rör. Röret belades med antiserum. För tvättning bringades tvättlösning att passe- ra genom röret i 10 minuter med en flödeshastighet av 1,9 ml/ min. Testprov fick passera genom röret vid denna flödeshastig- het.

I vissa av försöken förelåg testproven stationärt i rören, medan vid andra försök ett flöde genererades genom rören.

Efter tvättning exponerades antikroppar märkta med alkalisk fosfatas stationärt vid 37°C i en timme. Rören lösgjordes från pumpsystemet och klipptes av från vardera sidan till en längd av 5 cm, och alkalisk fosfatas-buffert tillsattes.

Efter inkubation vid 37°C i 30 minuter överfördes innehållet i varje rör (200 pl) till fördjupningen i en mikroplatta och absorbansen vid 405 nm uppmättes. Proven testades tre gånger och medelvärdena beräknades.

När testproven hölls stationärt i röret, erhölls ett lägre värde än när proven fick flöda genom kyvetten (fig. 4). I 8400374-8 jämförelse med de analysvärden som erhölls vid mikroplatt- ELISA gav både ett stationärt och ett flödesprov högre ELISA-värden (fig. 4). Detta framgår av att när olika volymer innehållande 105 F. tularensis fick flöda genom kyvetten, erhölls en ändpunkt-anrikning (fig. 4).

Med användning av förfarandet enligt föreliggande uppfinning erhölls en ökad känslighet. Räkning av levande bakterier av F. tularensis före och efter passagen genom kyvetten visade ingen mätbar minskning.

Möjligheterna att återcirkulera olika volymer av testproven innehållande F. tularensis undersöktes därför. Den minsta volym, som av praktiska skäl kunde återcirkuleras, var 5 ml testprov. Känsligheten ökade l0-100 gånger i förhållande till den tid,under vilkentestprovet återcirkulerades (fig. 5).

Genonlatt låta 104 F. tularensis-bakterier, suspenderade i 5, 15, 50 och 100 ml vätskeprov, cirkulera i 18 timmar erhöll man ökande värden beroende på mängderna testat vätskeprov (tabell l).

Då olika volymer av provet innehållande F. tularensis flödade genom en kyvett belagd med antikroppar specifika mot F. tula- rensis, skedde en anrikning av bakterierna i kyvetten. När större volymer passerade genom kyvetten, uppnåddes en platå- nivå (fig. 3), troligtvis beroende på att samtliga antigen- avsättningsplatser i kyvetten redan ockuperats och sålunda inte fler bakterier kunde infångas.

Likvärdiga resultat erhölls när F. tularensis impakterades i cyklonmedium försatt med 0,05 % (vikt/volym) Tween 20 (Olsson, T., Stymne, S., och Thore, A., "Detektion av bakte- rieaerosoler med luminescensanalys l. Luminescensanalys av luftprover", FOA-rapport C 40061-B 2 (1977), Ursvik, Sverige. 8400374-8 Ligand-ligand-interaktion Coli (HBlOl/pRHU845) agglutinerar A-blod via mannos-resistent hemagglutination. Interaktion sker mellan speciell protein- struktur hos bakterien till tetraglobosid seramidreceptor på röd blodkropp.

En plastslang (Tygoncy) belades med helblod (A~blod). Qgli- bakterier i koncentrationer från 0 till 5-106 bakterier per milliliter flödades i slangsystemet. Därefter tillsattes antikroppar mot använd ggli. Enzymreaktionen efter substrat- tillsats mättes med anti-kanin IgG märkt med alkalisk fosfa- taS , 0400374-s Tabell l Resultat erhållna vid cirkulation av 104 F. tularensis i varierande mängder vätskeprov under 18 timmar A405/100 minuter Volyma 4 (ml) 0 F.tul/ml 10 F.tul/ml 5 0,57 ï 0,06 0,07 É 0,13 15 0,60 É 0,07 1,13 1 0,20 so 0,68 ï 0,05 1,27 É 0,23 100 0,56 f 0,05 1,06 É 0,17 a Återcirkulerad i 18 timmar A405/100 min. = absorbans vid 405 nm/100 min.

Resultaten utgör medelvärden av 3 mätningar.

Tabell 2 Resultat erhållnavidtest med användning av mikroplatt- ELISA, analys med vätskan i stationärt tillstånd i kyvett och analys med flöde Vätskan stationär Vätskan Antal i kyvetten i flödeï) bakterier Mikroplatt- (Tygon B) (Tygon R per ml ELISA plaströr) plaströr) 105 0,12sa 0,335 0,504 104 0,020 0,006 0,162 103 0,000 0,027 0,064 a Absorbans vid 405 nm/100 min. Värdena minskade med värdena för vattenledningsvatten utan F. tularensis. 8400374-8 10 Nivån detekterbar F. tularensis LVS ökades med användning av vätskan i flöde. Genom ett Tygon(R)-plaströr belagt med antikroppar mot F. tularensis bringades en suspension inne- hållande 103, 104 øch 105 att passera. Testsuspensíonens flödeshastighet var ungefär F. tularensis-celler per milliliter 100 ml per 3 timmar. Enligt detta förfarande kunde mängden F. tularensis LVS anrikas och den detekterbara nivån blev lägre än den detekterbara nivå, som erhölls med mikroplatt- ELISA.

Inflytandet av Tygon(:)-plaströret undersöktes. ELISA-analysen genomfördes utan något flöde i Tygon -plaströr. Fördelarna med vätskan i flöde visas även i detta försök. En lägre detek- terbar nivå erhölls jämfört med ELISA med mikroplattor. 8400374-3 ll Figurförklaringar: Fig. l: Fig. 2: Fig. 3: Fig. 4: Anrikning av kyvettväggarna med användning av ett flödessystem. Flödeshastigheten var l,9 ml/min. och volymen var 40 pl/cm i kyvetten. Testprovet flöda- des antingen rakt igenom kyvetten eller återcirkule- rades. Analysen skedde på samma sätt som vid mikro- platt-ELISA med avseende på antigen och antikroppar.

Kyvettens längd var 10 cm under förfarandet, med undantag av det sista steget, då enzymsubstrat till- sattes. Före tillsatsen av enzymsubstratet klipptes kyvetten av från båda sidor till en längd av 5 cm.

ELISA genomfördes i míkroplattor. Mikroplattorna för- .belades med immunserum mot F. tularensis-antigen vid 4°C över natten. Efter tvättning tillsattes test- proven och fick reagera vid 37°C i en timme. Affini- tetsrenat-F. tularensis-antikroppar märkta med alkalisk fosfatas tillsattes därefter och mikroplat- torna inkuberades i en time vid 37°C. Slutligen tillsattes enzymsubstratet och reaktionen monitore- rades efter 30 minuter med användning av en automa- tisk spektrofotometer. Angivna värden är medelvärden i standardavvikelser av 16 prov.

Anrikning av F. tularensis vid kyvettväggen med användning av olika volymmängder vatten innehållande 105 bakterier per milliiiter. Försökstiaen var 3 tim- mar. Medelvärde É standardavvikelse för 3 prov anges.

Detektionsnivâer av F. tularensis vid Bakterier/ml Kurvmarkering 0 . - . 103 +-+ 104 I~l 105 A-A 8400374-8 Fig. 5: Fig. 6: Fig. 7: 12 Mätningen skedde efter 3, 6, 18 och 24 timmar.

Medelvärde É standardavvikelse för 10-15 prov anges.

Absorbans vid 405 nm/100 min. för testprov innehål- lande o, 101, 102, 103 och 104 rier per milliliter vid körning under 3, 6 och 18 tim- F. tularensis-bakte- mar. Angivna värden är medelvärden av 10 prov.

Absorbans vid 405 nm/100 min. vid test med 105 F. tularensis-bakterier per milliliter vid olika flö- deshastigheter mellan 10 och 1000 ml/3 timmar. Angivna värden är medelvärden É standardavvikelser av 10 prov.

Absorbansen för ett test med mikroplatt-ELISA är markerad med "X" och ligger vid ca. 0,2 (jfr. även tabell 2).

Absorbans vid 405 nm/100 min. vid test med Coli i koncentrationer mellan 0 och 5-106 per milliliter.

Provet âüercirkulerades 3 timmar. Volym = 5 milliliter.

Angivna värden är medelvärden av 3 prov. s4oo374-e 13 Identifiering av Shigella dysenteriae och Salmonella typhi- murium i vatten med användning av metoden enligt uppfin- ningen (Duct-ELISA).

MATERIAL OCH METODER Bakterier och bakteriologisk metodik Shigella dysenteriae (ATCC nr. 27345), Salmonella typhimu- rium (LT2), Escherichia coli 031 och Pseudomonas aeruginosa (kliniskt isolat) odlades i nutrient broth (Oxoid, Limited Basingstoke, Hampshire, England) över natten och viable counts (antalet levande bakterier) bestämdes på nutrient agar(Oxoid) plattor.

Hyperímmunisering av kaniner Före första immuniseringen tappades blod och serum preparera- des som kontrollserum. Koncentrationen av antigen (avdödade bakterier) var 109/ml genom hela immuniseringsschemat. Dag l injicerades 0,5 ml intrakutant med Freunds kompletta adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, Mn., USA). Dag 3, 5 och 7 gavs subkutant 2 x 0,5 ml med Freunds kompletta adjuvant. Dag 14 och 15 injicerades intramuskulärt 0,5 ml samt dag 18 2 x 0,5 ml intramuskulärt. Slutligen gavs 0,5 ml intramuskulärt varje vecka under 6 veckor. Därefter tappades blod, serum (immun- serum) preparerades och förvarades i -70°C.

Rening och konjugering av kaninserum Immunserum precipiterades (20 ml) med lika delar mättat ammoniumsulfat. Precipitatet löstes i l ml PBS (fosfatbuff- rat koksalt) och dialyserades över natten med PBS. Den dia- lyserade antikroppslösningen blandades (l0:l) med bakterier i PBS. Blandningen inkuberades vid 37°C i en timme och centrifugerades därefter, 2000 rpm i 10 minuter. Pelleten löstes i lM glycin-HCl, pH 2,8. Efter 3 timmars inkubering vid rumstemperatur centriguerades lösningen, 2000 rpm i 10 minu- ter. Supernatanten (innehållande de specifika antikropparna) dialyserades mot PBS under 12 timmar. 8460374-s 14 Specifika antikroppar renade från immunserum (2 mg) i PBS blandades med cirka 5 mg alkaliskt fosfatas (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA) vid rumstemperatur. Blandningen dia- lyserades i 18 timmar mot PBS vid 4°C. Därefter tillsattes glutaraldehyd (25 % v/v) till slutkoncentrationen 0,2 % (v/v) följt av 1-2 timmars inkubering vid rumstemperatur. Dialys mot PBS över natten vid 4°C vidtogs, varefter dialysvätskan byttes till 0,05M Tris-HCl, pH 8,0 med lmM MgCl2 och dialysen fort- satte l dygn ytterligare vid 4°C. Slutligen tillsattes l % (v/v) bovint serumalbumin (Sigma). Konjugerade antikroppar förvarades i mörk flaska vid 4°C.

DuCt~ELISA Gä _ . 5 .

Tygon -slang (lnnerdiameter 2,2 mm) fylldes med immunserum spätt l0_2 i 0,05M natriumkarbonatbuffert (3,47 g/l NaHC03, 1,18 g/l Na2CO3), pH 9,6 och fick beläggas över natten vid rumstemperatur. Slangen klipptes i bitar om 10 cm och kopp- lades till en pump (Ismatec SA, Mp 25 GJ4, Laboratoriums- technik, Apparateban+Elektronik, Zürich, Schweiz) där de tvättades i 154 mM NaCl-lösning innehållande 0,05 % Tween 20 (v/v) och 0,5 % bovint serumalbumin (Sigma). Prov pumpades genom de olika slangarna vid rumstemperatur under 3 timmar efterföljt av ytterligare en tvättning. Slangarna kopplades loss från pumpen och fylldes med en lösning av konjugerade antikroppar. Inkubering en timme vid 37°C företogs varefter slangarna tvättades och klipptes till en längd av 5 cm. De iordningsställda slangarna fylldes med p-nitrofenylfosfat- lösning (Sigma). Efter inkubering vid 37°C i 30 minuter överfördes slangarnas innehåll till mikrotiterplattor och avläsningen gjordes med hjälp av en automatisk spektrofoto- meter (Titertech Multiscan, Flow Laboratories).

Mikrotiterplatt-ELISA ELISA utfördes i stort sett enligt tidigare beskriven metod av Voller m.fl. (4). ls s4oos74-s Behandling av vattenprover Kranvatten supplementerades med salter och detergent för att likna ingående buffertar i konventionell ELISA (1,4).

RESULTAT OCH DISKUSSION Identifiering av Shigella dysenteriae Med mikrotiterplatt-ELISA var det möjligt att identifiera l06/ml och mera S. dysenteriae (Fig. 8), när bakterierna i vattenprovet inkuberades vid rumstemperatur i 3 timmar. Denna nivå är något högre än infektionsdosen som är 104 till 109/ml.

För att förbättra känsligheten och eventuellt uppnå den nedre gränsen (104/ml) användes Duct-ELISA.

Lägre halter av S. dysenteriae var möjligt att identifiera med Duct-ELISA (Fig. 9) jämfört med mikrotiterplatt-ELISA (Fig. 8) eftersom Duct-ELISA är en anriknings- och selektionsmetod (2).

Det framgår också av Fig. 9 att denna teknik hade större variation mellan ingående värden än mikrotiterplatt-ELISA (Fig. 8). Detta är förmodligen beroende av att de antikroppar som ingår i testet inte är av högsta specificitet. För att uppnå största möjliga specificitet måste bakterieprodukter renas och användas som immunogen. Rening av bakterieprodukter från Francisella tularensis (3) som använts som immunogen (3) har tidigare utnyttjats med framgång i Duct-ELISA (2). Med sådana förbättringar är det sannolikt möjligt att identi- fiera bakterierna i nivån som ligger i paritet med lägsta infektionsdos.

Identifiering av Shigella dysenteriae i kontaminerat vatten- B52! Vid provtagning i vatten av olika kvaliteter kan också problem med kontaminanter uppstå. Det har tidigare visats att Duct- ELISA kan utnyttjas för att överbrygga dessa problem (2). När vattenprover kontaminerats med P.-aeruginosa, E. coli och â¿ typhimurium och identifiering av S. dysenteriae företogs med mikrotiterplatt~ELISA och Duct-ELISA visade det sig fördel- aktigt att använda Duct-ELISA (Fig. 10). Även i detta fall noterades en selektiv anrikning av bakterier i Duct-ELISA- s4oßs74-s 16 systemet.

Identifiering av Salmonella typhimurium För att visa på möjligheten att med Duct-ELISA anrika andra vattenburna bakterier testades S. typhimurium. Det var möjligt att anrika och identifiera omkring tio gånger lägre halter med Duct-ELISA, jämfört med mikrotiterplatt-ELISA (Fig. ll). l.

REFERENSER Engvall, E., and Perlman, P.: Enzyme-linked immunosorbent assay. III. Quantitation of specific antibodies by enzyme- labeled anti-immunoglobulin in antigen coated tubes.

J. Immunol. l09:l29-135 (1972).

Sandström, G. och Wolf-Watz, H.: Duct-ELISA. Ett sätt att identifiera låga halter Francisella tularensis. FOA rapport C 40202*B3 (1984).

Sandström, G., Tärnvik, A., Wolf~Watz, H. and Löfgren, S.: Antigen from Francisella tularensis: Nonidentity between determinants participating in cell-mediated and humoral reactions. Infect. Immun. 7:lOl-106 (1984).

Voller, A., Bartlett, A., and Bidwell, D.E.: Enzyme immuno- assays with special reference to ELISA techniques. J. Clin.

Pathol. 3l:507-520 (1978).

Claims (7)

1. U 8400374-s PATENTKRAV l. Sätt att detektera biologiska material med affinitets- egenskaper, k ä n n e t e c k n a t av att ett vätskeprov innehållande ämnet, som skall detekteras och som har affini- tet till ett annat ämne, i flöde får passera en företrädesvis hydrofob fast, dvs. ogenomsläpplig yta vid vilken det andra ämnet, vartill ämnet som skall detekteras visar affinitet, är fästat, så att en anrikning av substansen som skall detekteras sker och att en i förhållande till den provvolym som står i kontakt med den aktiva ytan flerfaldigt större provvolym får passera.

2. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t av att det ämne som skall detekteras och det ämne, till vilket detta visar affinitet, utgöres av antigen-antikropp, DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA, lektin-receptor och övriga ligand-receptor- kombinationer.

3. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t av att flödet genereras av en pump.

4. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t av att flödet utan att återcirkuleras passerar den fasta ytan.

5. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t av att flödet återcirkuleras.

6. Sätt enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e - t e c k n a t av att flödeshastigheten utprovas med hänsyn till storleken hos molekylen, som skall detekteras.

7. Anordning för att detektera biologiska material med affini- tetsegenskaper, k ä n n e t e c k n a d av att nämnda anordning innefattar en hydrofob fast, dvs. ogenomsläpplig, yta på vilken ett ämne med affinitet till det biologiska mate- - s400z74-s m ríal som skall detekteras är fästat, ett medel, företrädesvis en pump för generering av ett flöde av provet över nämnda fasta yta och en detektor.