JPS62211558A - 歯根膜病の原因となる微生物を同定するのに有用なモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、モノクローナル抗体と抗原、及びヒトの歯根
膜病の病因に関係するある特異的微生物の存在及び濃度
の検出における上記抗体及び抗原の使用に関するもので
ある。特に、本発明は、アクチノバチルス・アクチノミ
セテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ
ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）由来の抗
原に特異的なモノクローナル抗体に関するものである。

アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（八ｃ
ｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ
ｍｃｏｍｉｔａｎｓ）は一般に、幼年性歯根膜炎に関係
している。

〔従来の技術〕

歯肉及び歯肉下の歯垢中に存在するそのような細菌に特
異的な臨床検査は、歯根膜病の診断において、歯根膜治
療の進行状況を評価する上で、及びその後の診療におけ
る患者の回復状態をチェックする上で有用で′ある。こ
のような微生物を同定する上で現在用いられている標準
的な細菌学的技術は、時間がかかり、コストが高く、高
度の熟練を必要とする。さらに、そのようなテストは、
しばしば不正確で、または、望ましいもしくは必要とさ
れる感度に満たない結果しか与えないものである。

最近、免疫診断的検定技術の利用による標準的な細菌学
的技術の改良もしくは代替法に対する種々の努力と提案
がなされている。そのような免疫検定技術は、検定すべ
き抗原物質と抗体との複合体の形成及び、その複合体の
１つ以上の構成要素が標識されていることに基づいてい
る。例えば、標識には■Ｉ！ｓのような放射性元素（放
射線免疫沈降検定法）、螢光性物質（免疫螢光検定法）
、エンザイム・リンクド・イムノソルベント検定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）又はイムノパーオキシデース検定法によるも
のが挙げられる。複合体の標識要素は、複合体を形成し
ていない抗原もし゛くは抗体と区別して、複合体を形成
した標識抗原もしくは抗体を検出及び定量することを可
能にする。

免疫検定技術を利用した典型的な競合において、被検液
体試料中の抗原性物質は、限定された抗体結合部位に対
し、既知量の標識抗原と競合する。

従って、抗体と結合した標識抗原の量は試料中の抗原量
に反比例する。対照的に、典型的な免疫検定法では、標
識抗体を使用している。この検定法では、複合体にかか
わる標識抗体の量は、液体試料中の抗原性物質の量に直
接比例する。

免疫診断技術は、従来の細菌学的検出技術の実質的な改
良法であるにもかかわらず、数多くの改良すべき点が残
存している状況にある。例えば、現在使用されている免
疫診断技術では、使用されるのが未精製の抗原及び抗体
であるために、しばしば種々の異なる結果を生じてしま
う。例えば、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミ
タンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）の三つの血清型がヒ
トの口腔内に存在することが知られているし、現在の免
疫診断技術では、１つ以上の血清型が未検出のことがし
ばしばある。同様に、ヒトの口腔内には、Ｂ、ギンギバ
リス　（Ｂ。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の少なくとも３種の血清学的変
異体が存在し、それらは毒性に差がある。それ故、免疫
的手法による、Ｂ、ギンギバリス（Ｂ、ｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ）の血清学的変異体の同定はその他の検出及び定
量法に比べかなり有利であるといえるが、現在の方法で
はそのようななされるべき区別をつけることができない
。現在、歯根膜病の確認に用いることができる免疫診断
技術は、一般に正確さ、感度及び特異性に欠ける。

〔発明が解決しようとする問題点〕

モノクローナル抗体は、既知技術で生成することができ
る単一のタンパク質と定義することができる。モノクロ
ーナル抗体を生成するための基本的技術は、ケラ−（Ｋ
ｏｈｌｅｒ）とミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）が
、骨髄−次腫瘍の悪性細胞（骨髄腫）と、肺臓リンパ細
胞をうまく融合させた後の１９７０年代中半に発展した
（Ｃ，ミルシュタイン（Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　、、
サイエンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉ、　Ａｍ、
）　　２４３巻４号、６６〜７４頁（１９８０年）〕。

モノクローナル抗体は単一の特異的抗原決定因子（化学
構造）を認識する。与えられた抗原がいくつかの決定因
子をもつこともある。このように、もし、モノクローナ
ル抗体だけを使用するならば、同様の決定基が異なる抗
原もしくは分子上に存在することもあるという理由から
、−免疫診断テストは特異性を欠くし、別に、１つの抗
原が決定因子をいくつも有していることから、誤まった
測定値を示すこともありうる。慣例的に作られる典型的
抗原は、多くの決定因子を有している。本発明が生まれ
るまでのこの問題を解決するのに払われた努力は著しい
成功をおさめることはなかった。１つの複合体中の望ま
しい分子や構造を認識する能力を有するだけでなく、無
関係な、もしくは望ましくない複合体中の、同じ決定因
子は認識しない能力を兼ねそなえたモノクローナル抗体
の生成が非常に望まれている。本発明は歯根膜病に関係
する微生物に対し、特異的な抗原を供給し、それらの抗
原のみを、特に、それらの抗原をもつ特異内挿もしくは
、株を認識するモノクローナル抗体を提供する。このよ
うに、本発明は、種々の免疫診断検定法の正確さを実質
的に改良した方法を供給している。

〔問題点を解決するための手段〕

特異的な微生物が、ヒトの歯根膜病の病因と強くかかわ
っている。そして、アクチノバチルス・°アクチノミセ
テムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）は幼年性歯根
膜病と関係がある。本発明のモノクローナル抗体は、ア
クチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔ
ｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍ
ｃｏｍｉｔａｎｓ）に対し特異的なものである。

本モノクローナル抗体は、典型的には、緩衝食塩水及び
保存剤のような、好ましくは液体の不活性担体を含む試
薬として使用する。その担体の組成は、細菌が適当に分
散し、かつ、抗原及び補充物質の構造体を保持するよう
うまく選択する。適正な担体の選択は、Ｂ、ギンギバリ
ス（Ｂ。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　）のように、多量の自己分解酵
素を生産する細菌を含む混合物を検出するのにも重要で
ある。

本発明のモノクローナル抗体は、歯肉もしくは歯肉下の
血清中に含まれる抗原を臨床的試験及び選別するのに有
効である。試験及び選別方法は、病巣もしくはその他の
部分からの細菌群（ｂａｃ　ｔｅｒ　ｉａ　１ｆｌｏｒ
ａ）試料をアクチノバチルス・アクチノミセテムコミー
タンス上の単一抗原部位に特異的な既知量のモノクロー
ナル抗体と接触させること、及び引きつづいて形成した
抗原抗体複合体の数を測定する工程を含んでいる。

本発明に有効なモノクローナル抗体は、ミルシュタイン
（Ｍｉｌｓ　ｔｅｉｎ）及びコラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）に
より、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、２５６巻、４
９５〜４９７頁１９７５年に報告され、議論されている
方法により得ることができる。この方法の詳細はこの分
野ではよく知られているものである。基本的に、この方
法は、マウスもしくは他の適当な動物に免疫原を注射す
ることを含んでいる。その動物を引き続いて犠牲にし、
その肺臓から細胞を取り出し、骨髄腫細胞と融合する。

生成したハイブリッド細胞、ハイブリドーマを試験管中
で再生産する。ハイブリドーマの集団は、その各々が抗
原に特異的な単一抗体を分泌する個々のクラスを単離す
るよう選別する。この方法によって得られた個々の抗体
種は、それぞれ、免疫原物質により認識される特異的抗
原部位に応答して発生する免疫動物に由来する単一のＢ
細胞の産物である。うまく選択したモノクローナル抗体
は、少なくともモル当り１０７リツトルの、さらに好ま
しくは少なくともモル当り１０９リツトルの応答親和性
を有している。

アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃ
ｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｔｎｏｍｙｃｅｔｅ
ｍｃｏｍｉｔａｎｓ）抗原 アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（八ｃ
ｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ
ｍｃｏｍｉｔａｎｓ）は、重い口腔及び非口腔伝染病に
関係する口腔のダラム陰性通性生物である。アクチノバ
チルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏ−ｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍ
ｉｔａｎｓ）は、通常幼年性歯根膜炎の患者から、また
しばしば成人性歯根膜炎の患者がら単離されるが、まれ
には正常な幼児及び成人からも単離される。その本来の
口腔内の生態学的活動範囲は歯垢及び歯根膜ポケットで
あるようだ。

ヒトのアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス
（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）及び多くの一連の口腔内菌
株を含むその他の細菌の間での抗原の関係の研究は、三
つの抗原の種類が存在することを余している。第１に、
アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）　
−ヘモフィラス（ｌｌａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）　　“交
差反応”抗原は、アクチノバチルス・アクチノミセテム
コミタンス（Ａｃｔｉｎｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）及び、ヘモフ
ィラス・アフロフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ａ
ｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘモフィラス・パラフロフィ
ラス（ｔｌａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｐｈｒｏｐｈ
Ｈｕｓ）　、ヘモフィラス・バラインフルエンザ（ｌｌ
ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｓａｅ
）を含む口腔へモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉ　１ｕｓ
）種に共有されている。第２のセットは、ヒトの口腔起
源のアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（
＾ｃｔｉｎｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）の三種の血清型の株に共通
しているが、口腔内へモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ）株及びその他の口腔内生物を含むその他の生物に
は共有されていない“種特異的”抗原である。第３には
、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａ
ｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏ−ｍｙｃｅ
ｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）の三種の血清型の各々に独特
な“血清型特異的”抗原である。血清型ａ、ｂ、及びＣ
に対して各１つの、少なくとも三種の後者の抗原が存在
する。

活性のある“種特異的”抗原として機能するように、抗
原決定因子は、アクチノバチルス・アクチノミセテムコ
ミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎ
ｏ−ｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉ　ｔａｎｓ）を区別するよ
う選択的狭（ならなければならないが全ての血′清型を
含むよう十分広くなければならない。これまで活性のあ
る”種特異的”抗原は発見されていない。今回発見され
た抗原及びこれに対応するモノクローナル抗体はヒトの
歯根膜の病巣もしくは上記の微生物が関係する、体内の
他の部分から取り出された病巣から取られた試料中の、
いかなる血清型のアクチノバチルス・アクチノミセテム
コミタンス（八ｃｔｉｎｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）を特異的に同
定することができる。

（抗　体） Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマイスを、アクチノバチルス・アク
チノーミセテムコミタンス（八ｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）の
血清型すの形式化した全細胞で免疫化した。従来技術に
従って、肺臓を取り出し、そしてそこからの細胞をポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ　１０００）を用いて、５
ｐ−２骨髄腫細胞と融合した。その培地に、ヒボキサン
チン−アミノプテリン−チミジンを添加することにより
、望ましいハイブリッド細胞を選択した。

マイクロタイタープレートの個々のウェル中の生存した
細胞を抗体産生のテストに供し、免疫化株に対し陽性と
分ったものをクローン化し、再テストした。抗原１５Ｋ
及び１９にと反応する１つのクローン化単離物、クロー
ンＢＡＡ−２４はアクチノバチルス・アクチノミセ・テ
ムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃ’
ｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）の血清型ａ
、ｂ及びＣと特異的に反応するが歯根膜病巣もしくは他
の部位からの試料中にみられるような一連の他の試験生
物とは反応しない。それ故、１５に／１９に抗原は“種
特異的”抗原である。

もう１つのクローン、ＢＡＡ−１は抗原９７に−１２０
にと反応し、かつアクチノバチルス・アクチノミセテム
コミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉ
ｎｏ−ｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉ　ｔａｎｓ）の血清型ａ
及びｂと反応する。

もう１つのクローン、ＢＡＡ−３は、抗原６３にと反応
し、かつアクチノバチルス・ア々チノミセテムコミタン
ス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅ、ｔｅｍ−ｃｏｍｉｔａｎｓ）の血清型す及びＣ
と反応する。クローンＢＡＡ−２４、ＢＡＡ−１及びＢ
ＡＡ−３は口腔内へモフィラス（Ｉｌａｅｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ）又は多くの他の一連の口腔内微生物とは反応しな
い。特異性を試験したこれらの微生物はダラム陰性及び
ダラム陽性の口腔内微生物を含んでいる。クローンＢＡ
Ａ−２４、ＢＡＡ−１及びＢ　Ａ　Ａ　−’　３を腹水
腫瘍の産生のためにプリスタン処理したネヅミに接種し
た。その腹水液を収穫し、イライザ法、免疫プロット及
びウェスタンプロット免疫電気泳動操作により再びテス
トした。その結果は、クローンＢＡＡ−２４は、分子量
１５Ｋ及び１９にのヒトのアクチノバチルス・アクチノ
ミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）の種特
異的血清型共通抗原とのみ反応する抗体を産生ずること
を示している。またこの結果は、アクチノバチルス・ア
クチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏ−ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ
）の血清型ａ及びｂに共有されている９７〜１０２にの
範囲の抗原とのみ反応する抗体を産生ずることを示して
いる。さらに、その結果は、クローンＢＡＡ−３は、ア
クチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔ
ｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍ
ｃｏｍｉｔａｎｓ）の血清型す及びＣに共有されている
６３にの抗原とのみ反応する抗体を産生ずることを示し
ている。これらの試薬を単独でか、もしくは、スライド
免疫螢　　　・光及び細胞フルオログラマ免疫螢光、イ
ライザ、抗原捕獲イライザ及び螢光イライザ、免疫沈降
、イムノプロット及びウェスタンプロット、放射線免疫
検定法を含む種々の検定法と組合せて使用することによ
り、ヒトの患者の歯根膜病巣及び他の部位から取り出さ
れた歯垢の試料からアクチノバチルス・アクチノミセテ
ムコミタンス　（＾ｃＬｉｎｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ
ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）の特異的
菌株を特異的に検出及び定量することができる。モノク
ローナル抗体、クローンＢＡＡ−２４、ＢＡＡ−１及び
ＢＡＡ−３は現在、ＭＩ、アン・アーバ−（Ａｎｎ　Ａ
ｒｂｏｒ）、ジャクソンロード（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｒｏ
ａｄ）７８８５のイン・ヴイトロ・インターナショナル
社に登録されている。

（テスト） 本発明のモノクローナル抗体を一連の免疫学的検定法で
テストし、それらが指向する微生物の検出に対する特異
性が示されてきた。例えば、クローンＢＡＡ−２４をイ
ライザ法及び免疫螢光検定法に使用し、多くの生物の中
から、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス
（Ａｃｔｉｎｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙ
ｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）を検出することができた
。細菌の培養液に対し、これらの検定法の感度及び特異
性を比較検定し、多くの生物の検出に適当であることが
判明した。例えば、幼年性歯根膜炎患者の病巣からしば
しば回収される１０６個のアクチノバチルス・アクチノ
ミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍ−ｃｏｍｉｔ−ａｎｓ）は
、免疫螢光法及びイライザ法により容易にそのレベルが
検出することができる。

（免疫螢光顕微鏡） 臨床学的研究が、アクチノバチルス・アクチノミセテム
コミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉ
ｎｏ−ｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）に対するモノ
クローナル抗体の使用を、これら微生物の細菌培養物の
と、比較することにより行なわれた。１０人の正常成人
、１０人の正常幼児、１０人の成人歯根膜炎患者及び１
１０人の幼児の局所性歯根膜炎患者（１０（ａｌ　１ｚ
ｅｄｊｕｖｅｎｉｌｅ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ　
ｐａｔｉｅｎｔｓ）を含む４０人の被検者を、アクチノ
バチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍ−ｃｏ
ｍｉｔａｎｓ）に対して試験した。表１に見られるよう
に、モノクローナル抗体クローンＢＡＡ−２４を用いた
免疫螢光顕微鏡により、選択的もしくは非選択的培地で
の細菌培養物以上に、アクチノバチルス・アクチノミセ
テムコミタンス（Δｃｔｉｎｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ
ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）を検出す
るようであり、この微生物が歯肉下の歯垢中に少数存在
するときは特に著しいようだ。このモノクローナル抗体
は、非選択的培地での培養では見ることができない、成
人の歯根膜炎患者中の多数の歯肉下試料中の微生物を検
出した。本抗体試薬は幼児の局所性歯根膜炎患者に対し
ては、選択培地のものと比して７％、非選択性培地のも
のに比して１６％多い部位の微生物を検出することがで
きた。

（ａ）　　被検部位は１６Ｍ、２１Ｄ、２６Ｍ、３６Ｍ
、４１Ｄ及び４６Ｍであった。正常成人、正常幼児にお
いては歯根膜病になっている部位はなかった。成人の歯
根膜炎患者においては、５５％部位が病気にかかってい
た。そして、幼児の局所性歯根膜炎患者においては２５
％の部位が病気にかかっていた。

（ｂ）　　いずれの方法によっても、歯根膜病部位の２
１％及び歯根膜正常部位の１３％がＡ、アクチノミセテ
ムコミタンス（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔ
ａｎｓ）に対する陽性を示した。

（Ｃ）　　いずれの方法によっても、歯根膜病部位の１
００％及び歯根膜正常部位の９％がＡ、アクチノミセテ
ムコミタンス（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔ
ａｎｓ）に対する陽性を示した。

感度及び特異性の値は、モノクローナル抗体が、非選択
性血液寒天培地でのＡ、アクチノミセテムコミタンス（
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｎ＋１ｔａｎｓ）の培
養と比較して、９０％の感度と８８％の特異性を示し、
また、選択性培地での培養と比較すると、８２％の感度
及び９２％特異性を示すことを明らかにしている。

アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃ
ｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ
ｍｃｏｍｉｔａｎｓ）に特異的なモノクローナル抗体を
用いた間接免疫螢光顕微鏡法は、ある型の歯根膜病の診
断に用いることができる。免疫螢光スライドテストにお
けるモノクローナル抗体による、Ａ、アクチノミセテム
コミタンス（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｎ＋１ｔ
ａｎｓ）の歯垢試料由来の全細菌細胞数の１２％以上の
割合での検出は、局在化幼年性歯根膜炎を有する患者と
１００％の確率で相関をもつ。すなわち、ある患者がプ
ールした歯肉下プラーク試料中に１２％以上のＡ。

アクチノミセテムコミタンス（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｍ−ｃｏｍｔ　ｔａｎｓ）を示したならば、局在化幼
年性歯根膜炎を有する患者の見込みは、１００％である
。

理論的には、単一細胞を、染色の十分な強度及び特徴的
な形態を与えるその他の多くのものの中から検出するこ
とができることから、免疫螢光検定法の感度は非常に秀
れている。しかし、スライド免疫螢光検定法は、非常に
熟練した人による、その標本の骨の折れる顕微鏡観察を
必要とする。

°ミネソタ（ＭＡ）のウェスト・ウッド（Ｗｅｓｔ−ｗ
ｏｏｄ）のオルト・インストラメンツ（Ｏｒｔｌ＋。

Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の製品であるサイトフルオロ
グラフを用いた免疫螢光法の自動化は、好んで用いられ
、より客観的に、より早く、生物の数量化を行うけれど
、スライド免疫螢光検定法でのような感度は得られてい
ない。

（エンザイム・リンクド・イムノソルベント検定法） 次に、イライザ法で用いられる操作をフローシートにし
たものを示す。

（ＳＵＮＹ修正抗原捕獲イライザ操作法）ウサギの抗Ａ
、アクチノミセテムコミタンス（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ
ｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）　　４４上記と同様に洗浄 ↓ １００マイクロリツトル／ウエル 上記と同様の洗浄 ↓ １００マイクロリツトル／ウエル １１８゛時間・室温、恒温室、９９％湿度、洗浄２ＸＰ
ＢＳ、ｔｘ基質バッフア イライザ法の感度は、標準法をいくらか修正することで
増すことができ、ミリリットＪし当り１０’個の微生物
を測定できることが可能となる。その修正とは、次にあ
げるものである。

１、　　Ｉｌｌ菌を０．０５％ラウリル硫酸ナトリウム
（ＳＯ３）で溶菌肱溶解性の抗原を放出する。この？８
解性抗原をイライザ法、Ｆ−イライザ法文（よイムノプ
ロット法を使って検定した。（この処理により、生物の
検出最小レベルが、ミリリ・ノトル当り、百方個体から
千個体へと増加し、感度を１００倍増加させることが分
った。

２、細菌に特異的なポリクローナル抗体（もしくは、他
のモノクローナル抗体）をウェルに吸着させ、抗原を加
え、そしてさらに、アルカリホスファターゼと結合する
モノクローナル抗体（もしくは、もし第１ステツプでモ
ノクローナル抗体を使った場合は、第２のモノクローナ
ル抗体）を作用させる、“抗原捕獲”法を用いた、イラ
イザ法及びＦ−イライザ法を行った。検出感度はミリリ
フドル当り、１０’固体の範囲である。

３、螢光イライザ法を用いる場合、光吸着リガンド２−
ナフトイルトリフルオロアセトンを加えて、螢光イライ
ザ法における螢光性生成分の生成をモニターすることに
より、その感度をおよそもう１０倍増すことができた。

４、　アビジン又はストレブスビジンとビオチンの使用
を含む検出のための多ステップの使用。ヤキの抗ネヅミ
ＩｇＧサブクラス血清、及びアルカリホスファターゼと
結合するウサギの抗ヤキ血清を使用する“多層サンドイ
ンチ” これらの修正は、治療後もしくはだ液中のようなサンプ
リングできる細胞が少ないような場合に必要とする、検
定の感度を増加するのに有用である。たとえば治療後、
病巣から回収できる生物は１０６個である。もし、Ａ、
アクチノミセテムコミタンス（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｍｃｏｍｉ　ｔａｎｓ）が全細菌数の１％存在するな
ら、正確な測定のためには、ミリリットル当り、およそ
１０’個の細胞の感度が必要となる。

本発明の標識モノクローナル抗体は、免疫測定法で用い
るのと同じ標識を提供する。これらの中には、米国特許
３，９４０，４７５号に述べられている螢光測定法によ
る検出のための螢光標識、米国特許３．６４５，０９０
号に述べられている酵素的マーカー、もしくは、ネイチ
＋　　（Ｎａｔｕｒｅ）　　１４４巻、９４５頁（１９
６２年）にハンター（Ｈｕｎ　ｔｅｒ）及びグリーンウ
ッド（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ）によって述べられている放
射性同位元素などがある。

本発明は、液体中の結合した抗体の存在を測定するため
の種々の従来テスト操作の使用も考慮している。これら
のテストには、抗原をコートしたポリ塩化ビニン、ポリ
スチレン、ガラス表面のようなプラスチック表面の使用
を含んでいる。

本発明の抗体は、他の抗体とともに、歯根膜病原菌の測
定に有効なモノクローナル抗体試薬中で、適切でしかも
有効に使用することができる。例えば、アクチノバチル
ス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｎ＋ｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔ
ａｎｓ）は一般に、幼年性歯根膜炎と関係し、バクテロ
イデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ）は一般に、成人性歯根膜炎と関係し
ており、各患者の両方の病原菌をテストできる方法が好
ましい。

（サンプリング・キット） 歯根膜微生物の免疫学的診療におけるモノクローナル抗
体の臨床的使用にとって、キットの形のテスト法が、歯
肉下歯垢のサンプリングに簡単で容易な方法及び検出が
行なわれる参照ライブラリーへの試料の輸送の有効な手
段を提供するのに用いられる。標準試料を扱う操作を引
きおこすために、明白な説明がキットに含まれなければ
ならない。そのキットは、硬い取手のついた、１５〜２
０ｍの長さの紙片を適当に含んでいる。それら　。

を１０秒間、用意した歯肉下部位に置くという説明をつ
け、滅菌した束にして供給する。

このキットの重要な成分は輸送媒体（ＴＭ）である。我
々の研究で、Ｂ１ギンギバリス（Ｂ。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の抗原またＡ、アクチノミセテ
ムコミタンス（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏ＋ａｉ
ｔａｎｓ）の抗原はある程度、緩衝液中、室温で保存す
ることにより分解することが分った。

特に有用なＴＭは、約０．１から０．２ＭのＮａＣ１、
ｐ１１約７．２に調整した約０．０１から０．０３Ｍの
ＮａＰＯ，、及び約０．５〜３．０重量パーセント（ｖ
／ｖ）のホルマリンから成っているということが分った
。

この輸送媒体は６ケ月までの期間抗原を保存する。

また、この媒体は、紙片から細菌をうまく分散させ、そ
の結果、凝固及び凝集が最小であるスミア−として使用
できるサスペンションを免疫螢光分析もしくは、細胞螢
光測定分析のためのスライド作りに使用できる。さらに
、この媒体は、上記輸送媒体に０．０５％のＳＤＳを加
えて用いることによりイライザ法やその他の検定法での
生物の溶解につか゛うことができる。

本発明の修正は、当業者には明白であろう。それゆえ、
本発明は特許請求の範囲によってのみ制限される。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物アクチノバチルス・アクチノミセテムコミ
   タンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏ
   ｍｙｃｅｔｅｍ−ｃｏｍｉｔａｎｓ）に特異的なモノク
   ローナル抗体を少なくとも１つ含む病原体の存在を確認
   するのに有用なモノクローナル抗体試剤。
2. （２）病原体が歯根膜病原体である特許請求の範囲第１
   項記載のモノクローナル抗体。
3. （３）微生物アクチノバチルス・アクチノミセテムコミ
   タンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏ
   ｍｙｃｅｔｅｍ−ｃｏｍｉｔａｎｓ）に特異的なモノク
   ローナル抗体。
4. （４）歯肉液中に存在するアクチノバチルス・アクチノ
   ミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　
   ａｃｔｉｎｏｃｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）を確
   認する方法であって、 （ａ）上記病原体に由来する選択された抗原物質を、上
   記病原体に特異的なモノクローナル抗体と接触させて、
   上記抗原物質と上記モノクローナル抗体との複合体を形
   成させる工程、及び （ｂ）上記形成した複合体中の抗体量を測定することに
   より、上記複合体量を測定する工程を含む方法。
5. （５）生物学的液体中のアクチノバチルス・アクチノミ
   セテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ
   ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）の存在を
   確認する方法であって、 （ａ）研究されるべき生物学的液体の部分標本を供給す
   る工程、 （ｂ）上記部分標本を、アクチノバチルス・アクチノミ
   セテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ
   ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）の細胞表
   面上の個々の抗原決定因子に特異的な、既知量の抗体と
   接触させる工程、及び （ｃ）上記抗体との交差反応が起こるかどうかを決定す
   る工程を含む方法。
6. （６）抗体が標識されており、かつ、その標識抗体が与
   えられた光学的刺激に対応するあらかじめ決められた螢
   光を示す特許請求の範囲第５項記載の方法。
7. （７）交差反応量を測定し、それから、歯根膜病原体の
   存在を定量的に求める特許請求の範囲第５項記載の方法
   。