DE2755689A1

DE2755689A1 - Verfahren zur bestimmung der anwesenheit einer komponente einer immunchemischen reaktion und diagnostisches immunchemisches testmaterial zur durchfuehrung des verfahrens

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Publication number: DE2755689A1
Application number: DE19772755689
Authority: DE
Inventors: Francis Xavier Cole; Deborah M Van Voorhis
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 1976-12-16
Filing date: 1977-12-14
Publication date: 1978-06-22
Also published as: IT1089403B; FR2374646A1; GB1597345A; CA1104927A; FR2374646B1

Description

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Millipore Corporation Bedford, Mass., V.St.A.

Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer Komponente einer immunchemischen Reaktion und diagnostisches immunchemisches Testmaterial zur Durchführung des Verfahrens.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Antigen oder Antikörper unter Anwendung immunchemischer Reaktionen. Proben von Körperflüssigkeit können auf die Anwesenheit eines bestimmten Antigens oder Antikörpers getestet werden, woraus diagnostische Schlüsse gezogen werden können.

Die Erfindung macht Gebrauch von den Immobilisierungstechniken, wie sie in der DT-OS 25 39 657 beschrieben werden.

Eine immunchemische Reaktion wird hier definiert als die spezifische Bindung, die zwischen einem Antigen und einem Antikörper stattfindet. Antigene und Antikörper sind Komponenten des Immunsystems, wodurch Säuger einschließlich Menschen sich selbst gegen infektiöse Mittel schützen. Ein Antigen ist jede, dem Organismus gegenüber, in den sie hineingelangt, fremde Substanz, die in der Lage ist, die schützende Immunreaktion des Organismus auszulösen. Die meisten Antigene sind ganz oder teilweise proteinhaltige Materialien mit hohen Molekulargewichten. Antikörper sind ebenfalls proteinhaltige Makromoleküle im Organismus, die als Reaktion auf die Anwesenheit eines fremden Antigens hervorgerufen worden sind. Antikörper besitzen die Eigenschaft, sich mit Antigenmolekülen in hochspezifischen Kombinationen binden zu können. Die Bindung ist gekennzeichnet durch ihre hohe Spezifität und ihre niedrige Dissoziationskonstante.

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Normalerweise besitzt ein Tier nur diejenigen Antikörper, die spezifisch gegen Antigene gerichtet sind, denen es in seiner Umgebung ausgesetzt worden ist. Jedoch kann ein Tier induziert werden, Antikörper gegen andere Antigene zu bilden, indem man sie ihnen künstlich einführt, beispielsweise durch eine Spritze. Die Medizin macht von dieser Erscheinung Gebrauch, um Menschen gegen Krankheiten zu immunisieren. Es ist außerdem möglich, ein Laboratoriumstier wie ein Kaninchen oder eine Geiß dazu zu bringen, Antikörper gegen bestimmte Substanzen zu bilden. Derartige Antikörper können vom Blut der Tiere erhalten werden und werden in hochspezifischen Bestimmungstechniken zur Bestimmung der Original-Antigenensubstanzen ausgewertet. Im Prinzip kann jedes Protein mit Hilfe einer immunchemischen Reaktion bestimmt werden.

Immunchemische Reaktionen, sind auf eine Vielzahl von Art und Weisen ausgewertet worden: für die Diagnose von Krankheiten, für die Identifizierung eines spezifischen infizierenden Organismus, als hochspezifische Enzyminhibitoren, zur Bestimmung des Sitzes spezifischer Proteine in Geweben und in Zellen und für die quantitative Messung von spezifischen Proteinen,für die kein chemischer Test verfügbar ist. Da die Reaktion eine Bindung einer Komponente (Antigen) an eine andere (Antikörper) ist, ändert sich die Anzahl an reaktiven Gruppen, wie es in einer gewöhnlichen chemischen Reaktion ist, nicht. Die Analyse einer immunchemischen Reaktion erfordert somit Techniken zum Unterscheiden zwischen gebundenen und ungebundenen Komponenten.

Eine Vielzahl von Methoden wurde bisher zum Messen von immunchemischen Reaktionen angewandt. Dazu gehört Hämagglutination, Latexteilchenagglutination, Agargeldiffusion, Komplementfixierung, Gegenelektrophorese und die Verwendung von Antikörpern, die ir.it fluoreszierenden Farbstoffen oder Radioisotopen markiert sind.

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Hämagglutination und fluoreszierende Antikörper-Techniken sind bei der Bestimmung von Antikörpern gegen Toxoplasma gondii angewendet worden. Toxoplasma ist ein protozoer Parasit des Menschen, der hauptsächlich innerhalb der Wirtszellen lebt, so daß der Organismus durch mikroskopische Maßnahmen schwer zu bestimmten ist. Die meisten Toxoplasma-Infektionen sind asymptomatisch. Jedoch kann eine asymptomatisch infizierte Mutter den Organismus an den Fötus übertragen, wobei die Toxoplasma-Infektion eine Vielzahl von Geburtsschaden verursachen kann, beispielsweise Mißbildungen, Hydrocephalus, geistige Behinderung, Augenkrankheiten, die oft zur Blindheit führen, und Kindersterblichkeit. Eine einfache billige Testmethode für schwangere Mütter würde höchst wünschenswert sein als ein Schritt zur Beseitigung der angeborenen Toxoplasmose. Obgleich die Hämagglutination und Fluoreszenz-Antikörper-Techniken für die Diagnose von Toxoplasma-Infektionen angewandt wurden, war die Standardmethode der Farbstofftest. Serumantikörper gegen Toxoplasma werden in dem Farbstofftest bestimmt, indem man von dem Vorteil Gebrauch macht, daß lebende Toxoplasmazellen in Gegenwart des Antikörpers partiell lysiert sind. Lysierte Zellen lassen sich von unlysierten Zellen durch Zugabe von Methylenblau unterscheiden, das nur intakte Organismen färbt. In der Praxis wird der Test durch das weitere Erfordernis eines Zusatzfaktors erschwert, der vom Serum eines toxoplasmafreien Spenders erhalten werden muß. Um diese Tests erfolgreich durchzuführen, müssen die Einzelheiten äußerst beachtet werden. Was besonders bedeutend ist, ist_;daß der Test gegenüber Laboratoriumsarbeitern gefährlich ist, da er die Verwendung von lebendem Toxoplasma einschließt. Eine Vielzahl von Laboratoriumsinfektionen erfolgte bei Personen, die diesen Test durchführten (vgl. Jacobs, L., "Serodiagnosis of Toxoplasmosis", in Immunology of Parasitic Infections, S. Cohen und E. Sadun, eds., Blackwell Scientific Publications, 1976). Eine verbesserte immunchemische Methode zur Bestimmung von Toxoplasma-Infektionen ist deshalb höchst wünschenswert.

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Obgleich die bisher allgemein angewandten immunchemischen Methoden hochempfindlich sein können, insbesondere radioimmunologische Bestimmungsmethoden unter Verwendung von radioisotopmarkierten Antikörpern, ist die weit verbreitete Brauchbarkeit von immunchemischen Bestimmungsmethoden durch drei Faktoren begrenzt worden:

(1) das Fehlen einer bequemen und billigen Methode zum Trennen von gebundenen immunchemisch umgesetzten Komponenten von ungebundenen Komponenten,

(2) das Fehlen einer bequemen und billigen Weise zum Messen der Menge an gebundenen immunchemischen Reaktionspartnern und

(3) das Fehlen eines schnell durchführbaren Verfahrens.

Die ersten beiden dieser Schwierigkeiten sind kürzlich durch Fortschritte in der Technik überwunden worden, während die dritte durch die vorliegende Erfindung überwunden wird.

Der erste dieser technischen Fortschritte ist die Entwicklung von Techniken zum Kuppeln eines immunchemisch reaktiven Antigens oder Antikörpers an ein unlösliches Trägermaterial. Ein auf einem unlöslichen Träger immobilisierter Antikörper kann, wenn er einer antigenhaltigen Lösung ausgesetzt wird, das Antigen binden und es seinerseits immobilisieren. Die gesamte immunchemische Reaktion erfolgt auf dem Träger und die Komponenten, die auf dem Träger gebunden sind, können von den nichtumgesetzten Komponenten getrennt werden durch übliche Techniken zum Trennen von Festphasenmaterialien von einer flüssigen Phase. Beispielsweise kann die Trennung, wenn der Träger in Form von Kügelchen oder feinteiligem Pulver vorliegt, durch Zentrifugieren oder

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Dekantieren erfolgen. Ferner kann die immobilisierte Phase die innere Oberfläche des Reaktionsgefäßes selbst sein oder kann in Form eines Schwammes oder porösen Matrix vorliegen, so daß die Trennung durch einfaches Dekantieren hzw. Entfernen des Trägers erfolgen kann.

Der zweite Fortschritt war die Einführung eines enzymmarkierten Antikörpers, das ein covalentes Konjugat aus einem Antikörper und einem Enzym ist. Jedes Behält seine charakteristischen Reaktionseigenschaften: der Antikörper bleibt immunologisch reaktionsfähig und das Enzym behält seine katalytische Aktivität. Wenn so ein Kanjugat sich an ein immobilisiertes Antigen bindet, kann seine Anwesenheit durch die Aktivität des gekuppelten Enzyms bestimmt werden, nachdem das ungebundene Konjugat durch geeignete Mittel entfernt worden ist.

Diese beiden Techniken wurden in Kombination verwendet, um eine sehr empfindliche Bestimmungsmethode zu entwickeln, die man als enzymgebundene Immunosorbent-Bestimmung bezeichnet. Die vorliegende Erfindung schließt diese Grundtechniken ein. Der Einfachheit halber werden zwei Arten von enzymgebundenen Immunosorbent-Bestimmungsmethoden besprochen und als EL-I und EL-2 bezeichnet (vgl. nachstehendes Diagramm):

EL-I:	C —
EL-2:	C
— Ab —
— Ag —
— Ag —
— Ab —
Ab-Enz
— AntiAb-Enz

C bedeutet einen inerten, unlöslichen Träger; Ab bedeutet eine»Antikörper:

Ag bedeutet ein Antigen;

C—Ab bedeutet einen an einen Träger gebundenen

Antikörper;

C —Ag bedeutet ein an einen Träger gebundenes Antigen; Ab-Enz bedeutet das Konjugat aus einem Antikörper und

einem Enzym;

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AntiAb-Enz bedeutet einen Antikörper gegen Immunoglobulin, das mit einem Enzym konjugiert ist.

EL-I ist eine Technik zur Bestimmung der Anwesenheit eines Antigens. Der Antikörper gegen das Antigen ist auf einem unlöslichen Träger immobilisiert. Der immobilisierte Antikörper wird dann einer antigenhaltigen Flüssigkeit ausgesetzt. Der immobilisierte Antikörper gewinnt das Antigen am, der Lösung, indem er es an Ort und Stelle bindet. Der Träger wird dann von der Lösung abgetrennt, frei von Verunreinigungen gewaschen und einer Lösung des mit einem Enzym konjugierten Antikörpers ausgesetzt. Das Prinzip dieser Arbeitsweise besteht darin, daß das Konjugat in der Lage ist, sich nur an Stellen zu binden, die durch das Antigen besetzt sind, und daß die Anzahl an so besetzten Stellen die Menge an Konjugat, das sich binden kann, bestimmt. Jede Stelle, wo Antigen gebunden ist, ist somit mit

gebundenen Enzym markiert, dessen Anwesenheit durch seine Fähigkeit, die Reaktion zu katalysieren, manifestiert wird. Die Geschwindigkeit einer solchen Reaktion ist proportional der vorhandenen Enzymmenge und wird ein direktes Maß der Menge an gebundenem Antigen.

In EL-2 ist die zu bestimmende Komponente ein Antikörper. Das Antigen wird auf dem Träger immobilisiert. Die Bindung des Antikörpers wird dann durch die anschließende Bindung eines Anti-Immunoglobulin-Enzym-Konjugats gemessen, (vgl. Wisdom, G.B., in Clinical Chemistry, Band 22, Seite 12^3 (1976)).

Antigen- oder Antikörper-Moleküle können auf einem festen Träger durch eine Vielzahl an bekannten Methoden immobilisiert werden, einschließlich covalentes Kuppeln, Direktadsorption, physikalischer Einschluß und Anlagerung an eine proteinüberzogene Oberfläche. Druckschriften, in denen diese Methoden beschrieben werden sind Silman, I.H. und Katchalski, E. in Annual Review of Biochemistry, Dd. 3'j, Seite 873 (1966); Melrose, G. J. H. in

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Review of Pure and Applied Chemistry, Band 21, S. 83 (1971); und Cuatrecasas, P. und Anfinsen, CB. in Methods in Enzymology, Band 22 (1971).

Die Methode der Anlagerung an eine proteinüberzogene Oberfläche wird in der DT-OS 2 539 657 beschrieben. Bei dieser Methode wird die innere und äußere Oberfläche einer mikroporösen Membran zuerst mit einem wasserunlöslichen Protein wie Zein, Collagen, Fibrinogen, Keratin, Glutelin, Polyisoleucin, Polytryptophan, Polyphenylalanin, Polytyrosin oder Copolymere von Leucin mit p-Aminophenylalanin überzogen. Ein solcher überzug versetzt die Membran in die Lage, eine Vielzahl von biologisch aktiven Proteinen einschließlich Enzymen, Antigenen und Antikörpern zu immobilisieren. Als mikroporöse Struktur wird eine solche bezeichnet, bei der mehr als 50? ihres Gesamtvolumens in Formjvon Poren vorliegen, die eine Größe von 25 Nanometern bis 25 U, vorzugsweise von 25 Nanometern bis I¹J u , aufweisen. Bei den meisten vorliegenden Anwendungen wird ein Porengroßenbereich von 25 Nanometern bis 5 Ά verwendet. Bei nichtüberzogenen mikroporösen Membranen liegen sogar 70 bis 75 % ihres Volumens als Porenraum vor. Die Poren gestatten den Flüssigkeitsfluß durch die Membran. Nach dem überziehen mit beispielsweise Zein ist der Porenraum um 5 bis 10 % reduziert, mit dem Ergebnis, daß die Struktur ihre wesentlichen Eigenschaften, nämlich eine hohe Proportion ihres Volumens als Porenraum vorliegen zu haben, beibehält und damit den Flüssigkeitsfluß durch die Poren gestattet, Die Struktur besitzt eine große Oberfläche in Kontakt mit jeder in den Poren enthaltenen Lösung. Eine solche überzogene Membran mit immobilisiertem Antigen oder Antikörper liefert einen kompakten, leicht zu handhabenden Träger für das immobilisierte Antigen oder den Antikörper. Ihre integrale Struktur gestattet die Entfernung der gebundenen von den ungebundenen Komponenten durch einfache mechanische Maßnahmen.

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Eine Schwierigkeit, die mit der Verwendung von mikroporösen Membranen als Träger für immobilisiertes Antigen oder Antikörper verbunden ist, besteht darin, daß diese Strukturen Proteinunspezifisch adsorbieren können. Nichtüberzogene Membranen aus gemischten Estern von Celluloseacetat und Nitrat können gewissen Proteine binden und sind außerdem in der Lage, gebundene gegen lösliche Proteine auszutauschen. Die physikochemische Basis für diese Bindung ist unklar. Gewisse Proteine scheinen sich leichter zu binden als andere. Daraus resultiert, daß Bestimmungen auf der Basis der Bindung eines spezifischen Antigens, Antikörpers oder Konjugats in Gegenwart eines Proteingemischs eine hohe Untergrundsinterferenz zur Folge haben kann, die auf eine unvorhergesehene Weise erfolgen kann.

Eine ähnliche Schwierigkeit ist vorhanden, wenn überzogene Membranen verwendet werden. Die in der DT-OS 2 539 657 beschriebenen überzogenen Membranen sind in der Lage, Proteine allgemein zu binden, jedoch ist die Bindung weser so selektiv noch so variabel wie diejenige von nichtüberzogenen Membranen. Folglich kann die Verwendung solcher Membranen zur Immobilisierung von Antikörper oder Antigen in einer EL-I oder EL-2-Bestimmung ebenfalls eine hohe Hintergrundsinterferenz zur Folge haben wegen der Bindung von unerwünschten Proteinspecies. Diese Schwierigkeiten werden mit Hilfe der vorliegenden Erfindung wirksam überwunden.

Die Erfindung betrifft eine diagnostische Bestimmungsmethode sowie die Materialien, die zur Durchführung der Methode erforderlich sind. Diese Methode ist für die Bestimmung eines Antigens oder eines Antikörpers in einer Flüssigkeitsprobe anwendbar. In einer Ausführungsform der Erfindung wird sie beispielsweise zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers in einer Serumprobe angewandt. Bei einer anderen Ausführungsform

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wird ein Antigen in einer Probe einer Körperflüssigkeit bestimmt.

Die zur Durchführung der Erfindung verwendeten Materialien umfassen ein Antigen oder einen Antikörper, immobilisiert auf der Oberfläche einer integralen Struktur mit einer großen Oberfläche, die für den Kontakt mit der Probe zur Verfügung steht und so behandelt worden ist, daß die unspezifische Proteinbindung auf ein Minimum herabgesetzt worden ist, Vorrichtungen zum Montieren der Struktur, so daß die Probe, die Waschlösungen und das Reagens durch die Struktur fließen können, ein erstes Reagens aus einem Konjugat eines Antikörpers mit einem Enzym und ein zweites Reagens aus einem Substrat für das Enzym.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Komponente der immunchemischen Reaktion entweder das Antigen oder der Antikörper auf der mit Zein überzogenen inneren und äußeren Oberfläche der mikroporösen Membran, wie vorstehend angegeben, immobilisiert, wodurch diese Oberflächen immunchemisch reaktiv gemacht werden. Die Membran ist so montiert, daß die zu testende Flüssigkeit,beispielsweise Serum, auf der einen Seite der Membran aufgebracht wird, durch die Poren der Memb^ran fließen kann und auf der anderen Seite gesammelt wird. Die gewünschte immunchemische Reaktion zwischen einer Komponente im Serum und der immobilisierten Komponente erfolgt während der Zeit, in der das Serum in Kontakt mit den reaktiven Oberflächen während seines Durchgangs durch die Membran sich befindet.

Nachdem die gewünschte immunchemische Komponente von der Testflüssigkeit aufgenommen worden ist, kann ihre Anwesenheit auf der Membranoberfläche durch die anschließende Passage eines Antikörper-Enzymkon j ugats durch die Membran bestimmt werden. Der Antikörperanteil des Konjugats ist spezifisch für die zu bestimmende Komponente, während das Enzym so ausgewählt wird, daß es

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ein solches ist, dessen Aktivität leicht durch bekannte Methoden bestimmt werden kann. Peroxidase wird bevorzugt. Die immunchemische Bindung des Konjugats an die aufgenommene Komponente erfolgt während der Passage der Konjugatlösung durch die Membran. Das Konjugat wird immunchemisch nur an solchen Stellen gebunden werden, wo die zu bestimmende Komponente gebunden ist.

Danach wird eine Reagenslösung, die das Substrat für das gebundene Enzym enthält, durch die Membran geschickt. Qualitativ wird die Anwesenheit von immunchemisch gebundener Peroxidase durch die Verwendung eines chromagenen Substrats und anschließende Entwicklung der Farbe bestimmt. Wenn keine unspezifische Bindung vorliegt, erfolgt jede Farbentwicklung aufgrund der immunchemischen Bindung des Konjugats,das seinerseits von der Anwesenheit der zu bestimmenden Komponente abhängt und damit die Existenz der zu bestimmenden Komponente in der Testflüssigkeit demonstriert.

Quantitativ kann die Menge der sich entwickelnden Farbe, beispielsweise durch Spektrophotometrie, gemessen werden. Die Menge an entwickelter Farbe ist ein Maß für die Menge an chromagenem Substrat, das zu Produkt umgewandelt wurde, welches seinerseits ein Maß der Menge an gebundenem Enzym ist. In Abwesenheit von unspezifischer Bindung des Konjugats ist die Menge an gebundenem Konjugat ein Maß für die Menge der zu testenden Komponente, die auf die Membran aufgenomnö|iurde,und somit ein Maß für die in der Testflüssigkeit vorliegende Komponente.

In der Praxis erfolgt ein gewisses Ausmaß an unspezifischer Bindung. Es ist somit erforderlich, eine Kontrollprobe zu verwenden, von der man weiß, daß die zu bestimmende Komponente nicht vorliegt. Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist die Übernahme von Techniken, die die Menge an unspezifischer Bindung auf ein

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Mindestmaß herabsetzen und die Unterschiede, die zwischen positiven Proben und Kontrollproben beobachtet werden, auf ein Maximum heraufsetzen. In dieser Hinsicht wurden die Verwendung eines Zeinüberzugs auf der mikroporösen Membran, die Anwendung eines zweistufigen Immobilisierungsverfahrens und die Verwendung von hochreiner Peroxidase zur Bildung des Konjugats erfolgreich in der bevorzugten Aueführungsform der Erfindung kombiniert, um unspezifische Bindung zu reduzieren. Die angewendeten Methoden sind für die Durchführung der Erfindung kritisch und werden im nachstehenden einzeln diskutiert werden.

Es wurde gefunden, daß immunchemisehe Bestimmungen erfindungsgemäß durchgeführt werden können unter Anwendung extrem kurzer Inkubationszeiten. Vollständige Tests können vom Anfang bis zum Ende in 20 bis 30 Minuten durchgeführt werden im Vergleich zu mehreren Stunden bei bisherigen Methoden. Außerdem bietet die Erfindung die Vorteile einer einfachen und leichten Arbeitsweise, Anpassungsfähigkeit für Routineanwendung und erfordert keine hochgeübten Techniker oder teure Vorrichtungen. Wegen dieser Vorteile macht die Erfindung immunchemische Bestimmungen leichter verfügbar für die Anwendung in einem weiten Bereich von klinischen, industriellen und Umgebungstests. Beispiele für die Anwendbarkeit der Erfindung sind Routinebestimmungen von Hepatitis B-Antigen in Spenderblut, die Diagnose von Toxoplasmose und dae Testen von Lebensmitteln auf mikrobielle Verunreinigungen oder Toxine.

Nachstehend werden die Zeichnungen kurz erläutert:

Figur 1 ist eine perspektivische Sicht einer Vorrichtung zur Verwendung zur diagnostischen Bestimmung einer Vielzahl von Proben gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;

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Figur 2 ist ein bruchstückartiger Schnitt durch Linie 2-2 der Figur 1 in Richtung der Pfeile;

Figur 3 ist eine bruchstückartige Draufsicht darauf und

Figur 4 ist eine bruchstückartige Draufsicht auf eine Vorrichtung nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung.

Das richtige Funktionieren der Erfindung hängt zum Teil von der Wahl einer geeigneten Oberfläche ab, auf der Antigen oder Antikörper immobilisiert sind. Die Oberflächenstruktur sollte den Flüssigkeitsfluß in und durch die Struktur gestatten und sollte eine große Oberfläche relativ zum Flüssigkeitsvolumen, das innerhalb der Struktur sich befindet, zur Verfügung stellen. Derartige Forderungen werden in unterschiedlichem Ausmaß zufriedengestellt durch diverse Strukturen wie Hohlfaserbündel, poröse feuerfeste Filter, mikroporöse Membranfilter und gefüllte Säulen. Die Wahl des Trägers hängt in jedem Falle von der Art der Bestimmung und der beabsichtigten Anwendung ab. Für eine Vielzahl von Bestimmungsmethoden, wo Geschwindigkeit, Einfachheit und Wirtschaftlichkeit berücksichtigt werden müssen, wird die Verwendung einer mikroporösen Membrane bevorzugt.

Die Methode zum Immobilisieren von Antigen oder Antikörper auf der Oberfläche einer solchen Struktur kann im wesentlichen jede Methode sein, die sich für die jeweilige verwendete Oberfläche und das zu bindende Material eignet. Die in vorstehend genannter DT-OS genannte Methode eignet sich zur Immobilisierung von biologisch aktiven Materialien auf einer Vielzahl von Oberflächen. Außerdem besitzt die Verwendung eines Überzugs den unerwarteten Vorteil, unspezifische Proteinbindungen kontrollieren zu können.

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In der bevorzugten Ausführungsform werden zeinüberzogene mikroporöse Membranen verwendet. Der Ausdruck mikroporöse Membran bedeutet hier d as Vorliegen von Poren mit einer Größe von 25 Nanometer bis etwa 25 Mikrometer und vorzugsweise von 25 Nanometer bis 1Ί Mikrometer. Der überzug kann ohne wesentlichen Verlust an Durchflußvermögen aufgebracht werden und mit nur einer geringen Verringerung des Porenvolumens. Mikroporöse Membranfilter bieten den weiteren Vorteil, daß sowohl ihre äußeren als auch ihre inneren Oberflächen Überzogen werden und somit in der Lage sind, Antikörper zu immobilisieren. Bestimmte Antigene wie ganze Zellen oder Zellfragmente können ebenfalls gebunden werden, selbst wenn sie zu groß sein sollten, um in die Poren der Membran einzudringen. Antikörperpräparate, die auf zeinüberzogenen mikroporösen Membranfiltern immobilisiert worden sind, bleiben unter den richtigen Bedingungen für lange Zeit immunchemisch reaktiv. Proben können im Kühlschrank aufbewahrt oder lyophilisiert werden und in einer Umgebung mit gesteuerter Feuchtigkeit aufbewahrt werden.

Erfindungsgemäß zu verwendende Antigene und Antikörper können nach wohlbekannten Standardverfahren hergestellt werden. Antikörper können aus dem Serum von Tieren wie Kaninchen, Pferden oder Ziegen hergestellt werden, die gegen das entsprechende Antigen immunisiert worden sind. Antigene werden von dem Organismus, von dem sie stammen, nach bekannten Techniken, wie sie zur Trennung und Reinigung von biologischen Materialien angewandt werden, gereinigt.

Da die Struktur mit der immobilisierten Komponente einer Körperflüssigkeit auszusetzen ist, die ein Gemisch aus proteinhaltigen Materialien enthält, kann jede Affinität zwischen solchen Materialien und der Oberfläche dieser Struktur eine unspezifische Bindung zur Folge haben. Derartige Bindungen können die Bestimmung

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ernstlich stören. Beispielsweise könnte die Gesamtmenge an Protein, die sich an die nichtüberzogenen Oberflächen einer mikroporösen Membran binden Könnte, die Menge übersteigen, die durch eine spezifische immunchemische Reaktion gebunden ist. Ebenso kann, v/o eine überzogene mikroporöse Membran verwendet wird, die Membran die Fähigkeit beibehalten, zusätzliches Protein unspezifisch zu binden.

Es wurde nun gefunden als Teil dieser Erfindung, daß unspezifische Bindung dadurch auf ein Minimum herabgesetzt werden kann, daß man eine zweite Immobilisierungsstufe vornimmt, worin ein immunchemisch neutrales Protein an das Filter immobilisiert ist. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Immobilisierung somit in zwei Stufen: eine erste Stufe, in der die gewünschte immunchemische Komponente immobilisiert wird und eine zweite Stufe nach Beendigung der ersten, worin ein immunchemisch neutrales Protein wie fötales Kalbsserum oder Schweinegammeglobulin anschließend immobilisiert wird. Der Begriff "immunchemisch neutral" hängt von den spezifischen Komponenten der Bestimmung ab. Jedes Protein, das sich nicht immunchemisch mit einer Komponente der Bestimmung oder mit einem der Reaktionsteilnehmer verbindet, wird als immunchemisch neutral bezeichnet, obgleich ein solches Protein in einem anderen System immunchemisch reaktiv sein könnte. Die Kombination aus überziehen einer mikroporösen Membran gemäß der DT-OS 2 539 657, Immobilisieren eines immunchemischen Reaktionsteilnehmers in einer ersten Immobilisierungsstufe und anschließendes Immobilisieren eines immunchemisch neutralen Proteins in einer zweiten Immobilisierungsstufe resultiert in einer wesentlichen Reduktion von unspezifischer Bindung, wenn die die immobilisierten Komponenten tragende Membran einem Gemisch von proteinhaltigen Materialien ausgesetzt wird.

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Das Konjugat von Antikörper mit Enzym macht von bekannten Techniken Gebrauch (vgl. Avrameas, S. und Uriel, J., in Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances de l'Academie des Sciences, Band 262, S. 25^3 (1966); Nakane, P.K. und Pierce, G.B., in Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Band 14, Seite 929 (1966); Nakane, P.K., in Methods in Enzymology, Band 37, S. 133 (1975))· In einer EL-1-Bestimmung sollte der Antikörperanteil des Kcnjugats die gleiche immunologische Spezifität wie der immobilisierte Antikörper haben. In EL-2, wo die zu bestimmende Substanz ein Antikörper ist, muß der immunchemisch reaktive Anteil des Konjugats ein Antikörper sein, der in der Lage ist, sich mit dem zu testenden Antikörper immunchemisch zu verbinden. Derartige Antikörper können erhalten

ein
werden, indem man/Tier mit dem Antikörper oder der Immunglobulinfraktion eines Serums von dem Tier, in dem der zu testende Antikörper vorkommt, immunisiert. Beispielsweise wird, wo der zu testende Antikörper ein Humanantikörper ist, ein Ziegenantikörper gegen den Humanantikörper aus dem Serum einer Ziege erhalten, die gegen Humanimmunoglobulin (Antikörper) immunisiert worden ist. Der Enzymanteil kann jedes Enzym sein, das in der Lage ist, eine Reaktion zu katalysieren, was durch jede bekannte Methode bestimmt werden kann, und das seine Aktivität beibehält nach der Konjugation mit dem Antikörper. Meerrettichperoxidase wird bevorzugt wegen ihrer Einfachheit und ihrer weiten Anwendungsmöglichkeit. Es ist bekannt, daß das Enzym die Oxidation von einer Vielzahl von organischen Verbindungen in Gegenwart von Wasserstoffperoxid katalysiert. Viele solcher organischer Substrate sind chromagen, d.h. sie unterliegen einer Farbänderung bei der Oxidation.

Es wurde gefunden, daß die Reinheit des Enzympräparates, das bei der Bildung des Konjugats verwendet wird, eine Wirkung auf

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den Grad der unspezifischen Bindung besitzt. Je größer die Reinheit des Enzympräparates, desto weniger unspezifische Bindungen sind vorhanden. Teilweise wird die Reduktion möglich gemacht, weil die Gesamtmenge an erforderlichem Konjugatprotein in dem Maße reduziert wird, indem die spezifische Aktivität des Enzyms erhöht wird. Die Möglichkeit der unspezifischen Bindung ist somit ebenfalls reduziert. In der bevorzugten Ausführungsform stellte sich heraus, daß die Verwendung eines hochgereinigten Peroxidasepräparates das Ausmaß an Farbreaktion, die in den Kontrollproben beobachtet wurde, gegenüber bekannten positiven Proben wesentlich reduziert.

Die erste Stufe in dem Bestimmungsverfahren umfaßt das Zusammenbringen der immobilisierten Komponente der immunchemischen Reaktion und der Testflüssigkeit, die die zu bestimmende Komponente enthalten kann, so daß ein reaktiver Kontakt erfolgt. In dieser Stufe wird die Wahl eines geeigneten Trägers für die immobilisierte Komponente mit einer großen Oberfläche in Relatinn zu dem innerhalb der Struktur enthaltenen Volumen wichtig. Wenn die Testflüssigkeit durch die|Struktur strömt, ist die Wahrscheinlichkeit, daß ein gelöstes Molekül während des Flüssigkeitsstroms durch die Struktur eine der Oberflächen berührt, sehr groß. Die Wahrscheinlichkeit eines immunchemisch reaktiven Kontaktes wird weiter erhöht, da die Wahrscheinlichkeit solcher Kollisionen per Oberflächeneinheit maximiert wird. Man glaubt, daß die Wahrscheinlichkeit solcher Kollisionen im allgemeinen von den Parametern der Porengröße und der Fließgeschwindigkeit abhängt, wo die Konzentration und die Reaktionstemperatur konstant gehalten werden. Somit ist die Wahrscheinlichkeit einer Kollision mit der Oberfläche desto größer je mehr der Durchgang, den die gelösten Moleküle passieren, beengt ist im Verhältnis zur ihrem freien Hauptweg. Je geringer die Fließgeschwindigkeit ist, desto

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länger ist die Verweilzeit des gelösten Stoffes innerhalb der Struktur selbst und desto größer ist die Wahrscheinlichkeit einer Kollision. Gemäß den vorstehenden Überlegungen werden erfindungsgemäß Strukturen mit hohen Verhältnissen an Oberfläche, die dem Volumen an durchströmender Flüssigkeit ausgesetzt ist, verwendet, um die Wahrscheinlichkeit des reaktiven Kontaktes mit der Oberfläche zu vergrößern und um die Zeit zu reduzieren, die zur Durchführung der Reaktionen erforderlich ist.

Die in den Zeichnungen angegebenen Bezugszahlen haben folgende Bedeutung: Die Vorrichtung 10 besteht aus geformtem Kunststoff, vorzugsweise transparent und steif, und ruht auf einer Schale Die Schale 12 hat eine Bodenplatte 13 und aufrechte Wände 14, die mit einer inneren Lippe 16 ausgestattet sind. Eine Haltevorrichtung 18 sitzt abnehmbar auf der Lippe 16. Diese Haltevorrichtung besteht aus steifem transparentem Kunststoff und ist ihrerseits mit einer Vielzahl von im allgemeinen zylindrischen becherartigen vertieften Teilen 20 ausgestattet. Die Bodenöffnung jedes Bechers 20 ist mit einer Membran 22 bedeckt, die am unteren Rand des Bechers hitzeversiegelt ist. In der In Figur k gezeigten Ausführungsform der Erfindung ist die Haltevorrichtung 18* mit einer wesentlich größeren Vielzahl an Bechern 20* ausgestattet, wodurch man eine einzige Vorrichtung für eine größere Vielzahl an Bestimmungen verwenden kann.

Beim Gebrauch wird eine Probe in einen Becher gegossen. Die Probe fließt durch die Membran in die Schale. Wie nachstehend im einzelnen beschrieben wird, wird die Membran ausgewaschen und mit Reagentien behandelt, wie es erforderlich ist, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines bestimmten Materials in der Probe zu bestimmen.

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In der bevorzugten Ausführungsform werden mikroporöse Membranen als Träger für die immobilisierte Komponente verwendet. Die Membran ist in einer zweckmäßigen Haltevorrichtung angebracht, um das Strömen der Probenflüssigkeit, der Waschlösungen und der Reagentien durch die Poren der Membran zu gestatten. Derartige Membranen sind in einer Vielzahl an Porengrößen erhältlich. Die optimale Porengröße hängt von den Erfordernissen der spezifischen Bestimmung ab einschließlich der Fließeigenschaften der zu testenden Probe und der Menge an zu behandelnder Flüssigkeit. Die Inkubationszeit wird durch die Fließgeschwindigkeit durch das Filter bestimmt und kann durch eine Vielzahl von bekannten Methoden gesteuert werden. Eine einfache und wirksame Methode besteht darin, die Flüssigkeit tropfenweise auf die obere Oberfläche der Membran so aufzubringen, daß die Fließgeschwindigkeit sich nur durch den hydrostatischen Druck regelt, der durch den Tropfen verursacht wird, wenn er oben auf der Membran ruht. Wenn der Tropfen klein genug ist, d.h. wenn er sich dem Retentionsvolumen der Membran nähert, wird die Flüssigkeit dazu neigen, in die Poren der Membran zu fließen und wird dort durch die kapillare Anziehungskraft festgehalten, bis er durch weitere Flüssigkeit verdrängt wird. Die Reaktionszeit unter diesen Umständen wird durch die Verweilzeit der Probe innerhalb der Membranporen gesteuert.

Wenn die Struktur so angebracht ist, daß Reaktionsteilnehmer und Reagentien durch die Struktur von einer Seite zur anderen strömen können, wird die gesamte Stufenfolge leicht und schnell durchgeführt. Zuerst läßt man die Testflüssigkeit durch die Struktur strömen, um jegliche darin vorliegende zu testende Komponente aufzunehmen. Zweitens läßt man eine Lösung des Konjugats bei einer gesteuerten Geschwindigkeit hindurchströmen, so daß sich das Konjugat immunchemisch an jede zu testende, in der ersten Stufe ¹^ * Komponente binden kann. Drittens läßt

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man die Substratlösung bei einer gesteuerten Geschwindigkeit durch die Struktur fließen, damit das immunchemisch gebundene Enzym das Substrat zu einem meßbaren Produkt umwandeln kann. Gegebenenfalls können zwischen den drei Reaktionsstufen Waschstufen eingeschaltet werden. Die Inkubationstemperatur kann innerhalb eines Bereiches von 15 bis ¹J5⁰C gesteuert werden, um individuellen Forderungen zu entsprechen. Bei einer qualitativen Bestimmung wird der Einfachheit halber Raumtemperatur bevorzugt. Bei der Durchführung der bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung von Toxoplasmaantigen, das auf einer mikroporösen Membran immobilisiert ist, wird die Anwesenheit von Antikörper gegen Toxoplasma in Serum leicht bestimmt unter Verwendung einer Reihe von 5minütigen Inkubationen für jede Stufe, wobei zwischen jede Stufe eine Waschstufe geschaltet wird, so daß die gesamte Reaktionsfolge in 20 bis 30 Minuten beendet ist, wie im einzelnen in Beispiel 1 beschrieben wird.

Eine Vielzahl an chromagenen Substanzen ist für die Bestimmung der Peroxidaseaktivität verfügbar. Für qualitative Tests ist es wünschenswert, entweder ein Chromagen zu verwenden, das auf der Membran ausfällt, wenn es durch Peroxidase aktiviert wird, oder eines,worin das Peroxidase-Reaktionsprodukt sich vorzugsweise an die Membran bindet. Ein Beispiel für das erstere ist 3-Aminoethylcarbazol. Ein Beispiel für das letztere ist 4-Aminoantipyrin. Quantitative Messungen können unter Verwendung eines löslichen Chromagenproduktes und Messen der Farbentwicklung durch geeignete Methoden wie Spektrophotometrie durchgeführt werden.

Die Geschwindigkeit und die einfache Arbeitsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens machen es eminent geeignet für Routineanalysen. Alle Komponenten können in einer stabilen Form, getrocknet oder lyophilisiert, geliefert werden, so daß der Praktiker nur das abgewogene Gemisch an Puffersalzen oder Reagen-

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tien in einer vorbestimmten Menge Wasser vor der Verwendung lösen muß. Ein Testsatz, der diese Vorteile einschließt, ist vorgesehen. Beispielsweise enthält ein Testsatz für die Bestimmung von Toxoplasmaantikörper in Serum folgende Bestandteile: Mikroporöse Membranen mit darauf immobilisierten Toxoplasmaantigen, die in einer geeigneten Haltevorrichtung angebracht sind, um Reaktionskomponenten auf die obere Oberfläche der Membran aufzubringen, und Materialien, die durchgeflossen sind, von der unteren Oberfläche zu gewinnen, lyophilisiertes Antikörper-Enzymkonjugat, vorgewogene getrocknete Puffersalze und vorgewogenes trockenes Substrat. Wo der Enzymanteil des Konjugats Peroxidase ist, ist ein Substratgemisch aus ^-Aminoantipyrin, 4-Hydroxybenzoat, lyophilisierter Glucoseoxidase, Glucose und Puffersalzen vorteilhaft. Die Wirkung von Glucoseoxidase und Glucose erzeugt das in der Peroxidase-Reaktion verwendete Wasserstoffperoxidsubstrat, wodurch die Notwendigkeit der Zugabe von Wasserstoffperoxid, welches für längere Lagerungszeiten schwierig zu stabilisieren ist, ausgeschaltet wird. Wenn Ί-Aminoantipyrin durch Peroxid in Gegenwart von Peroxidase oxidiert wird, bildet es eine farbige Substanz, die vorzugsweise von der mikroporösen Membran adsorbiert wird. Auf diese Weise können alle Testkomponenten in stabiler, trockener, wasserlöslicher Form geliefert werden.

Die vorliegende Erfindung weist bedeutende Vorteile gegenüber bisherigen Verfahren auf, und zwar im Hinblick auf Geschwindigkeit, Einfachheit der Durchführung, Bequemlichkeit und Kosten.

Nachstehende Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

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Beispiel 1 Tox oplasmaantikörpe r-Bea t immung

A. Ein mikroporöses Membranfilter mit einer nominalen Porengröße von 3 U (Typ SS, hergestellt won Millipore Filter Corp.) wurde mit Zein gemäß nachstehender Verfahrensweise überzogen. 79 g Zein wurden in einem Lösungsmittelgemisch aus 180 ml Ethanol, 3^0 ml n-Butanol, 80 ml Wasser und 30 ml Cellusolve gelöst, indem man in einer Kugelmühle bis zum vollständigen Auflösen mischte. Die Filter wurden in die Zeinlösung eingetaucht, worauf man sie sich 16 Stunden lang vollsaugen ließ, und wurden dann entfernt und luftgetrocknet.

B. Toxoplasraaantigen wurde auf Überzogenen Membranfiltern immobilisiert, indem man die überzogenen Filter Über Nacht bei k°C in 1,5 ml eines Antigenpräparates, das 6 bis 12 mg

Geaamtprotein enthielt, eintauchte. Die Filter wurden dann

TM bei Raumtemperatur luftgetrocknet, mit MiIIiRO (Warenzeichen der Millipore Corporation)-Wasser gewaschen und wieder bei Raumtemperatur luftgetrocknet.

Das Toxoplasmaantigen-Präparat war ein Lysat aus frischen Toxoplasmazellen, die nach bekannten Verfahren aus peritonealen Exudaten von infizierten Mäusen erhalten worden waren.

C. Die zweite Immobilisierungsstufe wurde durchgeführt, nachdem die Immobilisierung mit Töxoplasmaantigen beendet war und die Filter getrocknet worden waren. Die Filter wurden in einen

Becher getan, der eine Lösung aus Schweinegammaglobulin-

TM Fraktion II in einer Konzentration von 20 mg/ml in MiIIiRO - Wasser enthielt, worauf man sie sich etwa 16 Stunden lang vollsaugen ließ. Die Filter wurden dann bei Raumtemperatur luftgetrocknet, einmal mit MiIIiRO -Wasser gewaschen und wieder bei Raumtemperatur luftgetrocknet.

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D. Das zu testende Serum wurde aus Blutproben von Patienten gewonnen, die man gerinnen ließ, um rote Blutzellen und gerinnende Proteine zu entfernen. Die Serumproben wurden mit einem gleichen Volumen eines Tris-salzpuffers verdünnt (der Tris-salzpuffer enthielt 0,1 Mol 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol und 0,15 Mol Natriumchlorid und besaß einen pH-Wert von 8,0).

E. Ein überzogenes Membranfilter mit immobilisiertem Toxoplasmaantigen wurde in einer geeigneten Haltevorrichtung angebracht, damit zugesetzte Flüssigkeit auf der einen Seite der Membran eintreten konnte, durch die Membranporen fließen konnte und aus der anderen Seite der Membran austreten konnte. Serum (100 ul,verdünnt 1:1 in Tris-salzpuffer) wurde infclie Membranenporen gefüllt,und man ließ es 5 Minuten bei Raumtemperatur dort verweilen. Das Serum wurde dann durch Zugabe von 1 ml Tris-öalzpuffer aus dem Filter ausgewaachen.

F. Das Filter wurde dann durch Zugabe von 100 ul Antikörper-Enzymkonjugat behandelt. Das Konjugat war zusammengesetzt aus Meerrettichperoxidase (Worthington, HPOFF), das an einen Ziegen-Antihuman-IgG-Antikörper (Meloy Laboratories Inc., Springfield, Va., lot Nr. G51624, 3^,2 ml/ml) gekuppelt war. Das Kuppeln erfolgte durch die Metaperiodataktivierungsmethode, wie sie von Nakane, P.K. und Kawaoi, A., in Histochem. Cytochem., Band 22, Seite 1084 (197Ό beschrieben wird. Die dem Filter zugesetzte Konjugatlösung besaß 6,6 ^ig/ml Gesamtkonjugatprotein und wurde von einer Vorratslösung um das 500fache verdünnt unter Verwendung von lOJtigera Fötal-Kalbsserum als Verdünnungsmittel. Das Konjugat wurde mit dem Filter 5 Minuten lang inkubiert und dann mit 1 ml Tris-salzpuffer gewaschen.

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G. Die qualitative Färbung erfolgte unter Verwendung von 3-Aminoethylcarbazol als Chromagen. Das Chromagen (10 mg) wurde in 6 ml Dimethylsulfoxid verdünnt, wonach außerdem 50 ml 0,02M Natriumacetat mit einem pH-Wert von 5,0 zugesetzt wurden. Unmittelbar vor der Verwendung wurden 0,5 ml 3?iges (V/V) Wasserstoffperoxid zugesetzt. Man ließ die Lösung 5 Minuten lang mit den auf dem Membranfilter immobilisierten Komponenten während des Durchströmens durch das Filter reagieren. Die Anwesenheit von Antikörper gegenüber Toxoplasma im Testserum wurde angezeigt durch eine auf dem Testfilter entwickelte rote Farbe. Ein Filter, das mit einer Probe von normalem Serum behandelt worden war, blieb weiß oder schwach gefärbt.

Beispiel 2

In diesem Versuch wurde die Wirkung von unterschiedlichen Inkubationszeiten für die Seruminkubationsstufe (wie in Beispiel l/E beschrieben) und für die Konjugatinkubationsstufe (Beispiel 1/F) getestet. Man verfuhr nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß die zweite Immobilisierungsstufe (Stufe 1/C) weggelassen wurde. Mit Hilfe des Fluoreszenz-Antikörpertestes stelte man fest, welche Proben des Serums negativ (ohne Toxoplasmaantikörper) oder positiv (enthaltend Toxoplasmaantikörper) waren (Kelen, A.E., Ayllon-Leindl, L. und Labzoffsky, M.A., Canad. J. Microbiol., Band 8, Seiten 545-55¹» (1962)).

A. Die Seruminkubationszeit wurde verändert, während die Konjugat-Inkubationszeit und Substratinkubationszeit konstant gehalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben, wo ein Minuszeichen (-) das Fehlen einer Farbentwicklung anzeigt und Pluszeichen (+) die Farbtöne auf einer Skala von hellrosa (+) bis dunkelrosa (+++) anzeigen.

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- rf -

	Tabelle	1	Seruminkubations
Röhrchen Nr.	Serumgehalt	zeit (Minuten)
		15
1	negativ	15
2	negativ	5
3	positiv	5
4	positiv	10
5	positiv	10
6	positiv	15
7	positiv	15
8	positiv

Ergebnis

Die 5-Minuten-Proben entwickelten genauso viel Farbe wie die 15-Minuten-Proben, wodurch angezeigt wird, daß eine 5minütige Inkubationszeit ausreicht.

B. In diesem Versuch wurde die Seruminkubationszeit und die SubstratInkubationszeit auf 5 Minuten konstant gehalten, während die Konjugatinkubationszeit von 5 Minuten bis 15 Minuten verändert wurde. Die Ergebnisse v/erden in Tabelle 2 gezeigt.

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	^—	*y? -*	Konjugatinku- bationszeit (Minuten)	2755689
	39		15
	Tabelle 2	15	Ergebnis
Röhrchen Nr.	Serumgehalt	5	+
1	negativ	5	+
2	negativ	10	+++
3	positiv	10	++
i»	positiv	15	+++
5	positiv	15	+++
6	positiv		+++
7	positiv	+++
8	positiv

Man kann daraus schließen, daß 5minütige Reaktionszeiten sowohl für die Seruminkubation als auch für die Konjugatinkubation ausreichen.

Beispiel 3

Dieser repräsentative Versuch diente dem Test der Wirksamkeit einer zweistufigen Immobilisierung, wie sie in Beispiel 1/C beschrieben wird, auf die Reduzierung der Hintergrundsfarbe von negativen Kontrollproben. Die verwendeten Seruraproben waren als negativ (ohne Toxoplasmaantikörper) oder positiv (mit Toxoplasmaantikörper) bekannt, was wie vorstehend durch den Fluoreszenz-Antikörpertest oder die Hämagglutinationsprobe bestimmt worden war (Jacobs,L. und Lunde, M.N., J. Parasitöl, Band 1*3, Seiten 303-314 (1957)). Die Tests wurden wie in Beispiel 1 durchgeführt mit dem Unterschied, daß für Einstufen-Immobilisierungsproben Stufe 1/C weggelassen und für Zweistufen-Immobilisierungsproben lOOjiges (Q/V) fötales Kalbsserum anstelle von Schweinegammaglobulin in Stufe 1/C verwendet wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. Die dort verwendeten

Symbole haben die gleiche Bedeutung wie im Beispiel 2.

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- UO -

	Probe	Tabelle 3
Röhrchen Nr.	negativ	Immobilisier
1	negativ	1 Stufe
2	negativ	c. Stufen
3	negativ	2 Stufen
	negativ	2 Stufen
5	negativ	2 Stufen
6	positiv	2 Stufen
7	positiv	2 Stufen
θ	2 Stufen

Ergebnis

+♦+

Man kann daraus schließen, daß die 2-Stufen-Immobilisierung die Hintergrundsfarbe in den negativen Proben bedeutend herabr setzt und den Farbunterschied zwischen negativen und positiven Proben verbessert.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die vorliegende Erfindung die Bestimmung von Antigenen und Antikörpern in Körperflüssigkeiten für diagnostische Zwecke unter Ausnutzung von immunchemischen Reaktionen betrifft. Durch eine Kombination von Faktoren und Prinzipien wird die zur Durchführung der Stufenfolge erforderliche Zeit reduziert und die Einfachheit der Verfahrensweise und die Wirtschaftlichkeit des gesamten Verfahrens verbessert.

In der bevorzugten Ausführungsform bietet die Verwendung von zein- oder collagenüberzogenen mikroporösen Membranen bedeutende Vorteile_:bei der Durchführung der Erfindung. Erstens wird die Immobilisierung von spezifischen Antigenen oder Antikörpern leicht bewirkt und zweitens machen die Bindungseigenschaften von überzogenen mikroporösen Membranen dieselben so regelbar, daß unspezifische Bindungen auf ein annehmbares Maß unterdrückt werden können.

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- Ml -

Die Testmethode ist auf jede Testflüssigkeit anwendbar, die in der Lage ist, durch die beschriebene Art von Struktur zu strömen,oder jede Flüssigkeit, die sich strömbar machen läßt, durch Verdünnung oder Vorfiltrieren. Die Methode eignet sich sowohl für die EL-I als auch für die EL-2-Bestimmung, d.h. es kann entweder ein Antigen oder ein Antikörper in der Testflüssigkeit bestimmt werden. Die Anpassung der Erfindung für die Bestimmung eines bestimmten Antigens oder Antikörpers ist hauptsächlich eine Sache der Wahl einer geeigneten, auf der Struktur immobilisierten Komponente und der Wahl der mit einem Enzym zu konjugierenden richtigen immunchemischen Komponente.

Für: Millipore Corporation Bedford, ÄassyL V.St.A.

Dr .Tl.J.''Wolff Rechtsanwalt

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Claims

BEIF., V'OPFF & BEIL
Rn?: JT-W ■":,.—-:

FRANKFURT AM MAIN 80
Patentansprüche:

1.1 Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer Komponente ^-^ einer iimnunchemischen Reaktion zwischen einem Antikörper oder Antigen als erste Komponente und einer zweiten Komponente, die sich immunchemisch mit der ersten Komponente verbindet, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Komponente auf der inneren und äußeren Oberfläche einer mikroporösen Membran immobilisiert, die ein miteinander in Verbindung stehendes Netzwerk von Poren aufweist, das sich durch deren Dicke erstreckt und das Hindurchströmen von Flüssigkeit gestattet, wodurch innere und äußere Oberflächen geschaffen werden, die jeglichem Flüssigkeitsstrom in die Membran ausgesetzt werden, wobei die gesamte innere Oberfläche um ein Vielfaches größer ist als die äußere Oberfläche, eine Lösung der zweiten Komponente durch die Membran führt, auf der die erste Komponente immobilisiert ist, wodurch die zweite Komponente in reaktiven Kontakt mit der ersten Komponente gebracht wird, um die immunchemische Bindung der zweiten Komponente an die immobilisierte erste Komponente zu gestatten und

die Anwesenheit der zweiten Komponente auf der Membran bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Komponente auf einem über die innere und äußere Oberfläche der mikroporösen Membran angebrachten überzug immobilisiert, wobei der Überzug ein dünner wasserunlöslicher Film aus einem Protein, nämlich Zein oder Collagen, ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Membran verwendet, deren Porengröße etwa 25 Nancir.eter bis etwa 25 Mikrometer beträgt.

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4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Membran verwendet, deren Porengröße etwa 25 Nanometer bis etwa 14 Mikrometer beträgt und worin mindestens 50 Vol.-? der Membran porös sind.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine überzogene Membran verwendet, die zifynindestens 50 Vol.-ϊ porös bleibt, wobei die Porengröße der nichtüberzogenen Membran vorwiegend im Bereich von etwa 25 Nanometer bis etwa 5 Mikrometer liegt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Bestimmungsstufe durch die Membran, auf der die zweite Komponente immobilisiert ist, eine Lösung eines Konjugats aus einem Enzym und einem Antikörper gegen die zweite Komponente zur Immobilisierung des Konjugats hindurchführt und dann die Anwesenheit des Enzyms auf der Membran bestimmt.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Membran verwendet, deren Porengröße in nichtüberzogenem Zustand vorwiegend unter 5 Mikrometer beträgt und wobei die überzogene Membran eine Porosität von mindestens 50 % aufweist.

8. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer ersten Komponente einer immunchemischen Zweikomponenten-Reaktion in einer Testflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Komponente aus-der Testflüssigkeit aufnimmt, indem man die Testflüssigkoit durch eine Struktur führt mit einer inneren und äußeren Oberfläche, die der Flüssigkeit ausgesetzt sind, wobei die innere überfläche groß ist ir. Verhältnis zum Volumen der in der Struktur enthaltenen Testflüssigkeit,

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-Jf-

worin die zweite Komponente der immunchemischen Reaktion auf der inneren und äußeren Oberfläche immobilisiert worden ist und wobei die Struktur in der Lage ist, den Flüssigkeitsstrom über die gesamte innere Oberfläche fließen zu lassen, um die Testflüssigkeit in reaktive Nachbarschaft mit der immobilisierten zweiten Komponente zu bringen, um jegliche erste Komponente , von der zweiten Komponente durch eine immun chemische Reaktion aufzunehmen, die Struktur mit der immobilisierten zweiten Komponente und jeglicher aus der Testflüssigkeit aufgenommenen ersten Komponente abtrennt,

die aiJgenanmeneKomponente in reaktive Nachbarschaft mit einem Konjugat aus einem Enzym und einem Antikörper gegen die erste Komponente bringt, um das Antikörper-Enzym-Konjugat durch eine immunchemische Reaktion an Stellen zu binden, wo die erste Komponente gebunden ist, das immunchemisch gebundene Antikörper-Enzym-Konjugat in Anwesenheit eines Substrats des Enzyms inkubiert, wodurch eine Reaktion katalysiert wird und

das Ausmaß dieser enzymkatalysierten Reaktion mißt, um zu bestimmen, ob irgendwelches Antikörper-Enzym-Konjugat an die erste Komponente gebunden ist, um zu bestimmen, ob diese erste Komponente von der inunobilisierten zweiten Komponente aufgenommen wurde, wodurch die Anwesenheit dieser ersten Komponente in der Testflüssigkeit bestimmt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ausmaß der Enzymreaktion quantitativ mißt, um die Menge an Konjugat zu bestimmen, die an die erste Komponente gebunden ist, um die Menge an aufgenommener erster Komponente zu bestimmen und dadurch die Menge an dieser ersten Komponente in der Testflüssigkeit zu messen.

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10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die zweite Komponente auf der überzogenen Oberfläche einer mikroporösen Membran mit einer inneren und einer äußeren dieser Testflüssigkeit ausgesetzten Oberfläche immobilisiert, wobei die innere Oberfläche größer ist im Verhältnis zum Volumen der in der Membran enthaltenen Testflüssigkeit, wobei die Membran in der Lage ist, einen Flüssigkeitsstrom über die innere Oberfläche zu gestatten /wobei der Überzug ein Protein ist, nämlich Zein, Collagen, Fibrinogen, Keratin, Glutelin, Polyisoleucin, Polytryptophan, Polyphenylalanin, Polytyrosin oder Copolymere von Leucin mit p-Aminophenylalanin.

11. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer ersten Komponente einer immunchemischen Zweikomponenten-Reaktion in einer Testflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man

die erste Komponente aufnimmt, indem man sie in die reaktive Nachbarschaft der zweiten Komponente bringt, die auf den überzogenen Oberflächen einer mikroporösen Membran immobilisiert ist, wobei die Membran innere Oberflächen und ein Paar gegenüberliegender äußerer Oberflächen aufweist, die der Testflüssigkeit ausgesetzt sind beim Strom der Flüssigkeit durch die Membran, wobei die innere Oberfläche groß ist im Verhältnis zum Volumen des innerhalb der Membran enthaltenen Flüssigkeit, wobei der Überzug ein Protein ist, nämlich Zein oder Collagen, und wobei die Testflüssigkeit durch die Membran poren strömt, indem sie an einer der gegenüberliegenden Ober flächen eintritt und aus der anderen austritt, wodurch die erste Komponente in reaktive Nachbarschaft zur zweiten Komponente während des Ströir.ens durch die Membran gebracht wird, wobei die Nachbars chaftsaeit abhängig ist von der Fließgeschwindigkeit durch die Kerr.bran, um die erste Komponente durch immunchemische Bindung von der zweiten Komponente aufzunehmen,

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•r-

die Testflüssigkeit von der aufgenommenen ersten Komponente abtrennt, dann

die Membran, die die immobilisierte zweite Komponente trägt und jegliche erste Komponente in reaktive Nachbarschaft zur Lösung eines Konjugats aus einem Enzym und einem Antikörper gegen die erste Komponente bringt, indem man die Konjugatlösung durch die Membran fließen läßt, um das Konjugat durch immunchemische Reaktion an der Stelle zu binden, wo die erste Komponente gebunden ist, dann

die Membran, die die gebundenen Komponenten trägt, in reaktive Nachbarschaft mit einer Lösung eines Substrats des Enzyms bringt, indem man die Substratlösung durch die Membran fließen läßt, um eine durch das Enzym katalysierte Reaktion stattfinden zu lassen und

das Ausmaß der enzymkatalysierten Reaktion mißt, um zu bestimmen, ob irgendwelches Antikörper-Enzym-Konjugat an die erste Komponente gebunden ist, um zu bestimmen, ob die erste Komponente von der immobilisierten zweiten Komponente auf genomiuar wurde und dadurch die Anwesenheit der ersten Komponente in der TestflUssigkeit zu bestimmen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß

man als erste Komponente ein Antigen und als zweite Komponente einen Antikörper verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als erste Komponente einen Antikörper und als zweite Komponente ein Antigen verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als erste Komponente einen Antikörper von Toxoplasma genau, als Testflüssigkeit Serum und als zweite Komponente ein Antiger von Toxoplasma gondii verwendet.

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15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als erste Komponente ein Antigen des Hepatitis B-Virus, als Testflüssigkeit Serum und als zweite Komponente einen Antikörper gegen den Hepatitis B-Virus verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ausmaß der Enzymreaktion quantitativ mißt,um die Menge an Konjugat zu messen, die an die erste Komponente gebunden ist, um die Menge an e rs te rpLUfgenomirerer Komponente zu messen und dadurch die Menge an erster Komponente in der Testflüssigkeit zu messen.

17. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit einer ersten Komponente einer immunchemischen Zweikomponenten-Reaktion in einer Testflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man die zweite Komponente auf den überzogenen Oberflächen einer mikroporösen Membran immobilisiert, wobei die Membran innere Überflächen und ein Paar gegenüberliegender äußerer Oberflächen aufweist, die der Testflüssigkeit beim Durchströmen durch die Membran ausgesetzt sind, wobei die innere Oberfläche groß ist im Verhältnis zum Volumen der innerhalb der Membran enthaltenen Flüssigkeit, und wobei der Überzug ein Protein, nämlich Zein oder Collagen enthält, dann

auf diesen überzogenen Oberflächen, die die immobilisierte zweite Komponente tragen, immunchemisch neutrale Proteine immobilisiert, um die Störung zu reduzieren, die durch die nicht immunchemischen Bindungen an diese überzogenen Oberflächen verursacht v/ird,

die erste Komponente,'aui'nimmt, indem man sie in reaktive Nachbarschaft zur zweiten Komponente bringt, indem man die Tejtflüssigkeit durch die Membranporen und über die inneren Membranoberflächen strömen läßt, wobei die Flüssigkeit auf einer dieser gegenüberliegenden äußeren Oberflächen eintritt und aus der anderen austritt, wodurch die erste Komponente in reaktive Nachbarschaft mit der zweiten Komponente während

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des Fließens durch die Membran gebracht wird, wobei die Nachbarschafts zeit von der Fließgeschwindigkeit durch die Membran abhängt, damit die erste Komponente durch immunchemische Bindung von der zweiten Komponente aufgenommen wird,

die Testflüssigkeit von der aufgenommenen ersten Komponente abtrennt, dann

die Membran, die die immobilisierte zweite Komponente und jegliche immunchemisch gebundene erste Komponente trägt, in reaktiven Kontakt mit einer Lösung eines Konjugats aus Peroxidase mit einem Antikörper gegen die erste Komponente bringt, indem man die Konjugatflüssigkeit strömen läßt, um das Konjugat immunchemisch an die Stellen zu binden, wo irgendwelche erste Komponente gebunden ist, dann

die Membran, die die gebundenen Komponenten trägt, in reaktive Nachbarschaft zu einer Lösung bringt, die ein chromagenes Substrat von Peroxidase und Wasserstoffperoxid enthält, indem man die Substratlösung durch die Membran fließen läßt, um Oxidation des durch Peroxidase katalysierten Chromagens zu gestatten, um eine Farbe zu produzieren und das Ausmaß der Farbproduktion mißt, um zu bestimmen, ob das Antikörper-Peroxidase-Konjugat an die erste Komponente gebunden ist, um zu bestimmen, ob die erste Komponente ursprünglich in der Testflüssigkeit vorhanden war.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als erste Komponente einen Antikörper gegen Toxoplasma gondii, als Testflüssigkeit Serum und als zweite Komponente ein Antigen von Toxoplasma gondii verwendet.

19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als erste Komponente ein Antigen von Hepatitis B-Virus, als Testflüssigkeit Serum und als zweite Komponente einen Antikörper gegen Hepatitis B-Virus verwendet.

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20. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ausmaß der Enzymreaktion quantitativ mißt, um die Kenge an Konjugat zu bestimmen, dao an die erste Komponente gebunden

. . ,. ., , aufgenoirjnener, . , . .

list, um die Menge an erster / tiomponente zu bestimmen, wodurch die Menge der ersten Komponente in der Testflüssipkeit gemessen wird.

21. Verfahren zum Immobilisieren von zwei Proteinen auf der inneren und der äußeren ODerflache einer mikroporösen Membran, daduren gekennzeichnet, daß man die innere und äußere Oberfläche der Membran mit einem Protein wie Zein oder Collagen überzieht,

die überzogne Membran in eine Lösung eines biologisch aktiven ersten Proteins eintaucht, um das erste Protein zu immobilisieren ,

dann aie überzogene Kenn ran mit dem darauf immobilisierten biologisch aktiven ersten Protein in eine Lösung des zweiten Proteins eintaucht, um das zweite Protein zu immobilisieren, während das erste Protein immobilisiert bleibt und seine biologische Aktivität beibehält.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als erstes immobilisiertes Protein ein Enzym verwendet.

23- Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als erstes immobilisiertes Protein ein Antigen verwendet.

2k. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als erstes immobilisiertes Protein einen Antikörper verwendet.

25· Immunchemische Bestimmungsmethode, bestehend aus einer spezifischen Bindungsreaktion zwischen einer ersten Komponente in einer Testflüssigkeit und einer zweiten auf den überzogenen

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Überflächen einer mikroporösen Membran immobilisierten Komponente, worin unspezifische Bindung als NebenreaktLon erfolgt und worin der überzug im wesentlichen aus Zein oder Colluf-en besteht,und einer Methode zur Unterdrückung der unspezifischen Bindung, dadurch gekennzeichnet, daß man die überzogene Membran mit der darauf immobilisierten zweiten Komponente einer zweiten Immobilisierungsstufe unterwirft, worin man ein immunchemisch neutrales Protein auf der überzogenen Meir.brar immobilisiert, wordurch, wenn die erste Komponente in reaktive Nachbarschaft zur immobilisierten zweiten Komponente gebracht wird, eine spezifische Reaktion erfolgt und die unspezifische Bindung unterdrückt wird.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man als erste Komponente einen Antikörper und als zweite Komponente ein Antigen verwendet.

27. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man als erste Komponente ein Antigen und als zweite Komponente einen Antikörper verwendet.

28. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man als erste Komponente ein Antigen von Toxoplasma gondii und als zweite Komponente einen Antikörper gegen Toxoplasma gondii verwendet.

29. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch., gekennzeichnet, daß man als immunchemisch neutrales Protein fötales Kalbsserum oder Schweinegammaglobulin verwendet.

30. Hilfsmittel zur Verwendung bei einer immunchemischen Bestimmung in einer Testflüssigkeit, enthaltend:

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eine einheitliche Struktur· mit einem Paar gegenüberliegender äußerer Oberflächen und ein miteinander in Verbindung stehende! Netzwerk von innoren Höh Lräumen, die eine innere Oberfläcne bilden, wobei die Struktur in tier Lage ist, da3 Hindurchsti'üinen von Flüssigkeit zu gestatten, wobei der Strom über die inneren Oberflächen geführt wird, wobei die innere Überfläche groß ist iia Verhältnis zum Volumen der in der Struktur enthaltenen 'Jes ^f lussigkeit , v.'obei auf der inneren und der äußeren überfläche eine biologisch aktive Substanz, nämlich ein Antigen oder ein Antikörper·, immob i lisiert sind und einen Träger auf eiern diese Struktur befestigt ist, wodurch eine Testflüssigkeit, die auf eine der· äußeren Oberflächen gerichtet ist, durch die Struktur fließt, um Kontakt mit der inneren Uberflache :ui erzielen und aus der anderen äußeren Oberfläche hinausfließt.

31. Hilfsmittel zur Verwendung in einem diagnostischen Test einer immunchemisch reaktiven Substanz in einer Testflüssigkeit, enthaltend:

eine überzogene mikroporöse Membran mit einer inneren und einer äußeren überzogenen Oberfläche, wobei die Membran ein miteinander in Verbindung stehendes Netzwerk von Hohlräumen aufweist, die tue inneren Oberflächen bilden, und das Strömen von Flüssigkeit durch s if.· hindurch gestattet, wobei die innere Oberfläche groß ist im Verhältnis zu dem Volumen ut:v innerhalb der· Membran enthaltenen Flüssigkeit, wobei auf den überzogenen Oberflächen eine immunchemisch reaktive Substanz, nämlich ein Antigen oder· ein Antikörper·, immobilisiert sind und wobei die Membran in einer· st runnings leitenden Vorrichtung angebracht ist, wodurch der Strom der Test flüssigkeit durch die Membran geführt wird, um die Testflüssigkeit in reaktiven Kontakt mit der immobilisierten Substanz auf der inneren und der äußeren Ujerfläche zu bringen.

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32. Hilfsmittel zur Verwendung in einem diagnostischen Test auf der Basis einer immunchemischen Bindungsreaktion mit anschließender spezifischer Bindung einer Reagenssubstanz in einem Flüssigkeitsgeinischt, das die zu testende Komponente in Anwesenheit einer Komponente, die sich unspezifisch bindet, enthalten kann, enthaltend:

eine überzogene mikroporöse Membran mit einer inneren und einer äußeren überzogenen Oberfläche, wobei die Membran ein miteinander in Verbindung stehendes Netzwerk von Hohlräumen aufweist, die diese innere Oberfläche bilden und die den Flüssigkeitsstrom hindurch gestatten, wobei die innere Oberfläche mindestens lOOmal größer ist als die äußere Oberfläche, der überzug aus einem Protein, nämlich Zein oder Collagen, besteht, auf den überzogenen Oberflächen eine erste Substanz, nämlich ein Antigen oder ein Antikörper, immobilisiert ist, die in der Lage ist, die zu testende Komponente immunchemisch zu binden,und eine zweite getrennt immobilisierte Substanz aus einem Protein, die nicht in der Lage ist, die zu bestimmende Komponente zu binden und die nicht in der Lage ist, jegliche reagierende Substanzen zu binden, und wobei die Membran in einer Haltevorrichtung angebracht ist, die so gestaltet ist, daß sie das Strömen der Testflüssigkeit durch die Membran gestattet, worauf die Testflüssigkeit in Kontakt mit den auf der inneren und äußeren Oberfläche immobilisierten Substanzen gebracht wird, um eine spezifische immunchemische Bindung der zu bestimmenden Komponente an die erste immobilisierte Substanz zu gestatten und jegliche unspezifische Bindung zu unterdrücken.

33. Hilfsmittel nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die erete immobilisierte Substanz ein Antigen von Toxoplasma gondii ist.

3H. Hilfsmittel nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die erste immobilisierte Substanz ein Antikörper gegen Hepatitis-B-Virus ist. 809825/0840

35· Hilfsmittel nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite immobilisierte Komponente fötales Kalbsserum ist.

36. Hilfsmittel nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite immobilisierte Komponente Schweinegammaglobulin ist.

37· Testsatz für die diagnostische Bestimmung einer immunchemisch reaktiven Substanz in einer Testflüssigkeit, enthaltend:

eine Platte, die mit einer Vielzahl von vertieften Teilen ausgestattet ist, die sich im Abstand voneinander befinden, wobei jeder vertiefte Teil durch eine Seitenwand begrenzt und mit einer nach unten gerichteten Öffnung ausgestattet ist,

eine mikroporöse Membran, die sich quer über jede Öffnung als Verschluß erstreckt, wobei jede Membran eine innere und eine äußere Oberfläche mit einem miteinander in Verbindung stehendem Netzwerk von Poren aufweist, das sich durch deren Dicke erstreckt und das Hindurchströmen von Flüssigkeit gestattet, wodurch innere und äußere Oberflächen geschaffen werden, die jeglichem Flüssigkeitsstrom durch die Membran ausgesetzt werden, wobei die gesamte innere Oberfläche um ein Vielfaches größer ist als die äußere Oberfläche, wobei der Überzug ein Protein, nämlich Zein oder Collagen, enthält, wobei jede Membran auf ihren überzogenen Oberflächen ein Antigen oder einen Antikörper immobilisiert hat und in der Lage ist, immunchemisch mit der zu bestimmenden Substanz zu reagieren, wodurch Testflüssigkeit, die sich innerhalb der Kammer befindet, durch die Membran strömt, um einen reaktiven Kontakt zwischen einer Komponente dieser Testflüssigkeit und der auf den Membranoberflächen immobilisierten Substanz zustande zu bringen,
ein Reagensgemisch, enthaltenflldas Konjugat eines Antikörpers

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und eines Enzyms, wobei der Antikörperanteil in der Lage ist, mit der zi^bestiminenden Substanz immunchemisch zu reagieren und der Enzymanteil in der Lage ist, eine meßbare Reaktion zu katalysieren und

Vorrichtungen zur Bestimmung der Anwesenheit des Enzyms.

38. Testsatz nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierte Komponente ein Antikörper ist.

39· Testsatz nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierte Komponente ein Antigen ist.

¹10. Testsatz nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß der Enzymanteil des Konjugats Peroxidase ist.

¹11. Testsatz nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Bestimmung des Enzyms Wasserstoffperoxid und ein chromagenes Substrat von Peroxidase enthalten.

M2. Testsatz für die diagnostische Bestimmung eines Antikörpers von Toxoplasma gondii in Serum, enthaltend: ein Trägerteil mit einer Vielzahl von Kammern, wobei jede eine obere öffnung, eine nichtporöse Seitenwand und einen Boden aufweist,

eine Vielzahl von überzogenen mikroporösen Membranen, wobei jede Membran in einer getrennten Kammer des Trägers angebracht ist und den Boden davon bildet, wobei jede Membran ein miteinander in Verbindung stehendes Netzwerk von Poren hat, das sich durch deren Dicke erstreckt und das Hindurchströmen von Flüssigkeit gestattet, wodurch innere und äußere Oberflächen geschaffen werden, die jeglichem Flüssigkeitsstrom durch die Membran ausgesetzt werden, wobei die gesamte innere

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Oberfläche um ein Vielfaches größer ist als die äußere Oberfläche, der Überzug ein Protein, nämlich Zein oder Collagen, enthält, jede Membran auf ihren überzogenen Oberflächen eine erste Substanz immobilisiert enthält, die ein Antigen von Toxoplasma gondii ist,und eine zweite getrennt immobilisierte Substanz, die ein in dem diagnostischen Test immunchemisch neutrales Protein ist, wodurch innerhalb der Kammer sich befindliches Serum durch die Membran fließt, um reaktiven Kontakt zwischen jeglichem Antikörper von Toxoplasma gondii in Serum und dem immobilisierten Antigen von Toxoplasma gondii zustande zu bringen, und jede unspezifische Bindung zu unterdrücken,

ein Reagens aus dem Konjugat eines Antikörpers und Peroxida&e, lyophilisiert in Gegenwart von lO^igem (G/V) fötalem Kalbsserum, wobei der Antikörperanteil in der Lage ist, mit einem Antikörper von Toxoplasma gondii immunchemisch zu reagieren,

ein trockenes Puffergernisch aus abgewogenen Komponenten eines Puffers, der sich als Verdünnungsmittel und als Reagenslösungsmittel eignet,

ein Peroxidasesubstratgemisch in abgewogener trockener Pulverform, enthaltend 4-Aminoantipyrin, 'J-Hydroxybenzoat, lyophilisierte Glucoseoxidase, Glucose und Puffersalze, alle in geeigneten Proportionen, wodurch die Zugabe eines vorgeschriebenen Volumens V/asser ausreicht, um das Gemisch zu löen und das Gemisch fertig zum Gebrauch zu machen,

eine positive Kontrollprobe, enthaltend eine lyophilisierte Serumprobe, enthaltend Antikörper gegenüber Toxoplasma gondii,

eine negative Kontrollprobe, enthaltend eine lyophilisierte Serumprobe, die keinen Antikörper gegen Toxoplasma gondii enthält.

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