JPS58221166A - 免疫化学的測定用担体および該担体を使用した測定試薬 - Google Patents

免疫化学的測定用担体および該担体を使用した測定試薬

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JPS58221166A
JPS58221166A JP10478782A JP10478782A JPS58221166A JP S58221166 A JPS58221166 A JP S58221166A JP 10478782 A JP10478782 A JP 10478782A JP 10478782 A JP10478782 A JP 10478782A JP S58221166 A JPS58221166 A JP S58221166A
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antibody
antigen
resin
test tube
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Takashi Kudo
隆 工藤
Toshiyuki Sugawara
菅原 敏行
Hiroshi Sato
浩 佐藤
Suguru Mochida
持田 英
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Mochida Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は表面を合成樹脂でコーティングした免疫化学的
測定用担体および該担体を使用した免疫化学的測定試薬
に関するものである。
近年、血清、尿などの生体試料中に含まれる微量の生理
活性物質、例えばペプチドホルモン類、ステロイド類、
蛋白質類などの濃度や、生体に投与した薬剤等の濃度の
測定手段として、楕々の免疫化学的測定試薬が用いられ
ている。
なかでも、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、螢光免疫
測定法等に基づく試薬は測定感度が高く、定量性に優れ
ているので好んで用いられる。
これらの試薬においては、一般に測定すべき物質に応じ
た抗体または抗原をプラスチック等の担体に結合させた
不浴化抗体または不溶化抗原、および抗体または抗原を
#素等の標識剤で標識した標識抗体または標識抗原を一
般に構成(2) 成分として用いる。このよう表試薬による測定において
は、担体に結合させ九不溶化抗体もしく社抗原に測定物
質や標識成分を免疫反応によ多結合せしめ、こうして担
体部分(固相)に結合した標識剤と結合しなかった標識
剤の少々くとも一方の活性を調べることが必要である。
このため、担体は免疫反応に関与しない抗原、抗体その
他の成分を非特異的に吸着するものであってはならない
。したがって、担体の材料としては、従来非特異的吸着
の少ないプラスチックが使用されていた。ガラスを担体
として使用すると、激しい非特異的吸着が生じるため、
精度の高い測定ができないことが知られている。
さらに、このよう表試薬を製造するに当シ、試験管等の
容器を担体として、その内壁に抗原または抗体を結合さ
せ、この容器に標識抗原または標識抗体を収納すれに、
保存に適し、必要に応じ直ちに測定できるので便利であ
る。
しかしながら、従来そのような試薬の保存安定性は十分
でなく、数夕月保存後には測定の精度およびgt度が低
下するという問題があった。
本発明者らは、その原因解明のために広範な研究を行な
った結果、保存に伴なって試薬の品質が変化する原因は
、担体として用いるプラスチックが僅かながら通気性を
有するためであることを見出した。
通気性のない担体材料としてはガラス等があるが、前記
のとおりガラスは反応に関与しない物質も非特異的に吸
着するため、そのまま使用することはできない。本発明
者らは、この問題を解決するためさらに研究した結果、
表面を合成樹脂でコーティングしたガラスを担体として
、このコーテイング面に抗原または抗体を結合させた不
溶化抗体または不溶化抗原を使用して非特異的吸着を防
止しうろことを見出した。免疫化学的測定試薬に合成樹
脂でコーティングしたガラスを担体として使用すること
は、従来知られていない。
本発明は上記各知見に基づくものである。すなわち、本
発明は合成樹脂で表面をコーティングした免疫化学的測
定用担体および、’) 該担体に抗体を結合させた不溶
化抗体または前記担体に抗原を結合させた不溶化抗原お
よびb)標識抗体または標識抗原、からなる免疫化学的
測定試薬を提供する本のである。
ガラス製担体をコーティングするには、通常次のように
行なう。すなわち、ガラス製のビーズ、試験管等、担体
にしようとする物を合成樹脂浴液または懸濁液に浸して
担体表面に該樹脂を付着させ、余分の樹脂を除去した抜
熱処理を行なう。熱処理によってコーティングされなか
った樹脂部分は洗浄によって除去する。このように処理
した担体に抗体または抗原を結合させ、不溶化抗体また
は不溶化抗原を得る。
コーティング剤としては、各種のプラスチックが用いら
れる。プラスチックを化学構造と加工上の性質から大別
すると、熱可塑性樹脂と熱硬化性樹脂に分類される。前
者は、線状高分子で、加熱すると軟化流動性となり、冷
却すると固体となり、これを繰υ返し得るプラスチック
(5) である。後者は、初期縮合体は線状構造をなしているが
高分子でなく、加熱すると軟化流動性となるが、分子間
で架橋反応が行なわれ、三次元構造の不浴不融物となる
プラスチックである。
本発明においては、このいずれをも使用することができ
る。
熱可塑性樹脂としては、塩化ビニル樹脂、ポリスチレン
樹脂、ポリプロピレン樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂
などが使用でき、熱硬化性樹脂としては、シリコン樹脂
、フェノール樹脂、エポキシ樹脂々どが使用できる。こ
のなかで、特に好ましいものとして、シリコン樹脂、ポ
リスチレン樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂があげられ
る。
シリコン樹脂としては、線状構造をしたシリコン油、最
終的には部分的に架橋構造を有するシリコンゴム、加工
時に完全に架橋硬化したケイ素樹脂があげられる。この
なかでシ1,1コン油が特に好ましい。
ポリスチレン樹脂としては、スチレンを単独Ir、1 で塊状重合した一般用スチレン樹脂、スチレンを単独重
合する時、一般用スチレン樹脂よシ重合度の高い線状高
分子にしたル、耐熱性を与えるような単量体と共重合さ
せたシ、α−メチルスチレンなどを重合させた耐熱用ス
チレン樹脂、スチレンとブタジェンをグラフト的に’l
K合させた耐衝撃性スチレン樹脂があげられる。このな
かで、一般用スチレン樹脂が特に好しい。
アクリル樹脂としては、アクリル酸エステルの重合体と
メタクリル酸エステルの重合体があげられるが、アクリ
ル酸エステルの重合体が特に好ましい。
フッ素樹脂としては、ポリテトラフルオロエチレンとポ
リクロルトリフルオロエチレントカあげられるが、ポリ
テトラフルオロエチレンが特に好ましい。
これらの合成樹脂は、ヘキサン、アセトン、メチルクロ
リド、クロロホルム、ジクロルエタン、トリクロルエチ
レンなどの有機溶剤に溶解したシ、微粉末として、さら
にま九石油系ナフサに分散したペーストあるいは懸濁液
として用いられる。例えは、シリコン樹脂をコーティン
グする場合、1〜30%の濃度、好ましくは5〜10チ
の傭度に俗解し、この溶液に担体の表面を接触させた後
、余分な溶液を除去し、180℃、1時間加熱する。放
冷後、コーティングされなかった樹脂をトリクロルエチ
レンで洗浄して除去し、乾燥してコーティングした担体
を得る。
担体の形状拡ビーズ、試験管、太鼓状ビーズ、タイター
プレート、アンプル、注射筒など各種形状のものが使用
できる。
合成樹脂でコーティングした担体に抗体又は抗原を結合
させるには、rclinica ChimicaAct
aJ 、 48s15(1973)、rJournal
 ofImmunologyJ 、 116:1554
(1976)、rseienceJ、158:1570
(1967)  に記述された方法と同様に行なう。例
えば、抗α−フェトプロティン抗体を1η/−の濃度に
グリシン緩衝液pH8,2に溶解し、この抗体溶液をシ
リコン樹脂コーティングしたガラスピーズ中ガラス試験
管と接触させて、37℃、3時間反応させる。これを生
理食塩水で洗浄した後、1チ正常家兎血清を含むリン酸
緩衝液pH7,0を加え、4℃で1夜放置して抗体結合
担体を製造する。
免疫化学的測定に用いられる標識剤としては、酵素(例
えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ)、放
射性同位元素(例えは、  ■、H)、螢光物*<例え
ば、フルオレラセンインチオシアネート、テトラメチル
ローダミンイソチオシアネート)などが用いられるが、
測定の感度、精度、簡便性を考慮すると酵素を用いるの
が最も有利である。抗体または抗原をこれらの標識剤で
標識する方法は一般に知られており、#索による標識は
例えば中機、相生(rJ、 Histochem、 C
ytochenn、 J 、 22:1084(197
4))  らの方法で行なうことができる。
前記のように得られた不浴化抗体又は不溶化rQ ) 抗原と標識抗体又は標識抗原よりなる測定試薬を用いて
、各種の生理活性物質を測定することができる。例えば
、適当な濃度に希釈した被検液を抗体を結合させた試験
管に入れ、抗原抗体反応を行なわせる。反応終了後、試
験管を洗浄し、標識抗体を加え反応させる。次いで、こ
の試験管を洗浄後、試験管に結合した標識抗体の量を適
当な手段で測定する。得られた測定値から濃度既知の標
準物質について同様に操作して得た標準曲線により、被
検液中の測定物質の童を算出する。
測定を実施するにあたって、検体の量、使用する標識抗
体の濃度及び量、反応温度及び時間などの条件は、測定
する物質の8M#I、使用する抗体の力価、標識剤の種
類などによって異なるので、各測定系において最も適当
な条件を実験的に定める。
本発明の免疫化学的測定試薬は、前記のとおり &) 
不溶化抗体または下情化抗原およびb)標識抗体または
標識抗原、から栴成されるが、(10) さらに必要に応じ、緩衝液、測定物質の標準溶液、およ
び標識剤として酵素を用いる場合には、酵素基質、酵素
基質溶解液および反応停止液等も組合せると測定に便利
である。
緩衝液は検体を適当な濃度に希釈するとともに、抗原抗
体反応の場を適当−& pH、イオン強度に維持するた
めに用いられる。この緩衝液としては、従来から免疫化
学の分野で一般的に使用されている緩衝液、例えば、グ
リシン緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水、ホウ酸緩衝食塩
水などを使用することができる。また、反応の再現性を
高めるために適当量の蛋白質例えば0.01〜5%、好
ましくは0.5〜2チの牛血清アルブミン(以下、BS
Aと略す)、を含有させてもよい。
標識抗体又は41!識抗原は、酵素、放射性同位元素、
螢光物質で抗体又は抗原を標識したもので、抗原抗体反
応によシ固相に結合した測定物質に結合または結合しな
かった標識物質を測定することにより、被検液中の生理
活性物質が測定される。
なお、本発明の測定試薬はその一部又は全部を凍結乾燥
した試薬で構成してもよく、更に、この構成に当該試薬
を使用する際に、凍結乾燥した試薬を溶解させるための
適当な溶解液を添付してもよい。更に、本発明の試薬に
は、その使用を便ならしめるために、試験管、ピペット
等の付属品を添付して測定キットとしてもよい。
本発明の測定試薬によって測定しうる物質としては、ヒ
ト胎盤性ゴナドトロピン、インスリン、ヒト成長ホルモ
ン等の蛋白性ホルモン、α−7xF、;’ofイ′(以
下・AFPと略す)、B型肝炎ウィルス(FIBg)、
免疫グロブリン、抗原抗体複合物、セルロプラスミン、
トランスフェリン等の蛋白性の物質、サイロキシン、エ
ストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、フ
ェニトイン、フエノバルビタール等のハゲテン類をあけ
ることができる。
本発明の測定試薬は、担体による非特異的吸着がないた
め、測定精度が高いだけでなく1年間以上も安定に保存
しうる優れたものである。
以下、本発明を実験例および実施例によって具体的に説
明する。
実験例I  AFP測定試薬の安定性 ポリスチレン樹脂製の試験管を担体として用いた従来の
AFP測定試薬とシリコン樹脂コーティングガラス試験
管を用いた本発明によるAFP桐11定試薬を後記実施
例6に準じて製造し、その保?)性を比較した。保存は
4℃で行ない、1ヶ月彼、3ケ月後および1年後にA 
F P Onf/−とAFP80nf/dの吸光度差を
求め、保存期間0日の吸光度差を1oosとして第1表
に示した。
第1表に示すように、従来の試薬では、保存後1年でそ
の反応性(吸光度差)が60優に低下してしまうが、本
発明による試薬では1年間の保存彼でも、まったく反応
性の低下は認められない。反応性の低下は当然のことな
がら、測定精度および測定感度の低下となって現れる。
(13) 第  1  表 実施例1 シリコン樹脂コーティング試験管の製造 ガラス試験管(10X75mm)中に、シリコン樹脂を
n−へキサンで10%に希釈した溶液を、各々1mt分
注した。室温で10分静置した後、シリコン樹脂のn−
へキサン溶液を吸引除去した。次いで、180℃1時間
加熱した後、放冷した。トリクロルエチレン2−を加え
、洗浄をTiない、転舵してシリコン樹脂コーティング
試験管を製造した。
実施例2. シリコン樹脂コーティングガラスピーズの
製造 ガラスピーズ(直径8mm)100個を10饅シリコン
樹脂のn−ヘキサン溶液に浸した。
(1AI 室温で10分間靜置後、ビーズをピンセットでガラスシ
ャーレに取り出し、次いで、180℃1時間加熱し、放
冷した。トリクロルエチレン50−で5回洗浄を行ない
乾燥し、シリコン樹脂コーティングガラスピーズを製造
した。
実施例3、 ポリスチレン樹脂コーティング試験管の製
造 ガラス試験管(10X75mm)に180℃に加熱して
溶解したポリスチレン樹脂1−を分注し、すばやく吸引
除去し、放冷し、ポリスチレン樹脂コーティング試験管
を製造した。
実施例4. アクリル樹脂コーティング試験管の製造 ガラス試験管(10X75mm)に200℃に加熱して
溶解したアクリル樹脂1−を分注し、すばやく吸引除去
し、放冷し、アクリル樹脂コーティング試験管を製造し
た。
実施例5. フッ素樹脂コーティング試験管の製造 ガラス試験管(10°X75mm)の内壁にフッ素樹脂
の懸濁液を吹きつけ、400℃に加熱した後、放冷し、
フッ素樹脂コーティング試験管を製造した。
実施例6.AFP測定試薬の製造 ’a)抗AFP抗体の製造 西ら(rcancer Rep、J 、30:2707
(1970))の方法により肝癌患者腹水から抽出、精
製したAFPを、2キ/−の濃度に生理食塩水に溶解し
、その0.5−をフロイントの完全アジュバントと混合
し、家兎に5回以上免疫して抗AFP血清を得た。この
抗血清を、硫酸ナトリウムで2回塩析を行ない、グロブ
リン分画を得、抗AFP抗体を製造した。
b)抗AFP抗体結合試験管の製造 実施例1,3,4.及び5で製造したコーティング試験
管に抗AFP抗体1■を含むリン酸緩衝食塩水(以下、
PBSと略す)0.5−を各々加え、37℃3時間反応
を行なった後、PBSで洗浄して抗体結合試験管を製造
した。
C)抗AFP抗体・酵素結合物の製造 中根拳相生(rJ、 Histochem、 Cyto
 −chem、J、22:1084(1974))  
らの方法により、酵素標識抗体を製造した。519の西
洋わさびペルオキシダーゼ(以下HRPOと略す)を1
−の0.3 M炭酸水素ナトリウム浴液に溶解し、1−
の1%2.4−ジニトロフルオロベンゼンを加えて室温
で1時間攪拌した。この溶液に0.08M過ヨウ素酸ナ
トリウム済液を加え、30分間室温で混合した後、1−
の0.16Mエチレングリコール溶液を加え、室温で1
時間混合した。0.OIM炭酸緩衝液p H9,5に対
して1夜透析後、前記(1k)で製造した抗AFP抗体
を0.OIM炭酸緩衝液p H9,5に5キ/−に溶解
し、その1−を加え、室温で3時間反応させた後、51
1Fの水素化ホウ素ナトリウムを加え、4℃で更に3時
間反応させた。反応終了後、PBSに対して1夜透析し
、セファデックスG200で分画、精製して抗AFP抗
体・f(RPO結合物を製r1)) 造した。
d)AFP橡準俗液の調製 西らの方法によシ、肝癌患者腹水よ多抽出、鞘装したA
FPを、1%BSAおよびTween20を含むPBS
で、160,80,40,20および1onr/−のs
tiに溶解した。
e)抗AFP測定試栗の製造 前記(b)および(C)で製造した抗AFP結合試験管
並びに抗A P’ P抗体・)LRPO結合物全合物し
て、下記の組合せよ多なるAFP測定試薬を製造した。
1)抗AFP結合試験管 2)抗AFP抗体・HrLPO結自物 3)AFP標準浴液 4)酵素基質(0−フェニレンジアミン)5)酵素基質
溶解液(6mM/Lの過酸化水素を含むPBS) 6)反応停止液(1規定塩酸) 7)緩衝液(1チBSAを含むPBS )大地fit 
7.  A F Pの測定(18) 前記実施例6で製造したAFP測定試薬の各濃度のAF
P標準俗液0.1m/を、合成樹脂コーティングした本
発明の試験管および比較のため合成樹脂でコーティング
を行なっていガい本発明外の試験管に取シ、1%BSA
を含むPBSを0.4−加え攪拌後、2時間静置し反応
させた。
反応終了後、試験管を蒸留水で洗浄して前記実施例6 
c)  で製造した抗AFP −HRPO結合物全合物
BSAを含むPBSで2000倍に希釈し、その0.5
 g7!を加え室温で2時間反応させた。
反応終了後、試験管を蒸留水で洗浄し、ペルオキシダー
ゼ活性を測定するため、0.5−の基質tl(i液(6
mM/!の過酸化水素、20 mM/lの0−フェニレ
ンジアミンを含有スるPBS )を試験管に入れ、室温
で遮光しながら30分間反応させた。1規定の塩酸2 
mlを添加混合し、492nmの波長で発色強度を測定
した。標準画−の結果を第1図に示した。本発明外の試
験管を使用した場合は、AFPOnf/−の場合にも強
い発色が生じ標準曲線の勾配も小さいのでガラス試験管
による非特異的吸着が生じていることがわかる。これに
対して、本発明の試験管を使用した場合は、AFPが存
在しないときは発色は殆んど誌められないうえ、標準曲
線の勾配が大きいので正確な測定を行なうことができる
実施例8.AFPの測定 (&)  ”’I−AFPの製造 自らの方法により、肝癌患者腹水よυ抽出、精製したA
FP20pfと1m(:’iのNa  Iとクロラミン
T250μりとを0.05Mリン酸緩衝液(pH7,2
) 0.225−中で60秒間反応させた後、600μ
Vのピロ亜硫酸ナトリウムを加え60秒間反応させた。
反応液に511fのKIを加えた後、3ephadex
  Q−50にてts ゲル濾過を行ない、第1分画を分取し、μ′標識AFP
′fr製造した。
(b)AFPの測定 実施例6(d)で製造したAFP標準溶液の0.1−及
び実施例8(a)で製造した I−AFPを20,00
0倍VC1%BSAを含むPBSで希釈し、その0.1
−を実施例6(b)で製造した本発明の試験管及び合成
樹脂のコーティングを行なっていない本発明外のガラス
試験管に加えた。次に1チBSAを含むPBSo、3m
gを加え攪拌し、4℃で18時間反応させた。反応終了
後、試験管を蒸留水で洗浄稜、試験管の放射活性を測定
した。標準曲線の結果を第2図に示した。
【図面の簡単な説明】
第1図は実施例7における標準曲線を示すグラフ、第2
図は実施例8における標準曲線を示すグラフである。 特許出願人 持田製薬株式会社 代理人 弁理士  萼  優 美 (ほか1名) (21)

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)合成樹脂で表面をコーティングした免疫化学的測
    定用担体。
  2. (2)内壁表面を合成樹脂でコーティングした容器であ
    る特許請求の範囲第1項記載の担体。
  3. (3)  a)  合成樹脂で表面をコーティングした
    担体に抗体を結合させた不溶化抗体又は前記担体に抗原
    を結合させた不溶化抗原および、b)  i[織抗体ま
    たは標識抗原、 からなる免疫化学的測定試薬。
  4. (4)担体が内壁表面を合成樹脂でコーティングした容
    器である特許請求の範8第3項記載の試薬。
  5. (5)容器が試験管である特許請求の範囲第4¥[記載
    の試薬。
  6. (6)  合成樹脂がシリコン樹脂、ポリスチレン樹(
    11 脂、アクリル樹脂またはフッ素樹脂である特許請求の範
    囲第3項ないし第5項のいずれか一項記載の試薬。
JP10478782A 1982-06-18 1982-06-18 免疫化学的測定用担体および該担体を使用した測定試薬 Pending JPS58221166A (ja)

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JP10478782A JPS58221166A (ja) 1982-06-18 1982-06-18 免疫化学的測定用担体および該担体を使用した測定試薬
GB08315228A GB2125963A (en) 1982-06-18 1983-06-03 Carriers for immunochemical measurement and measuring reagents utilizing said carriers
DE19833321629 DE3321629A1 (de) 1982-06-18 1983-06-15 Traeger zur immunochemischen bestimmung und messreagentien unter verwendung derselben
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