JPH01131458A - 簡易迅速免疫測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は疎水性担体に抗原又は抗体を固定することによ
り、検体或は標識した反応物質の非特異的吸着反応を抑
えた簡易迅速免疫ｎノ定試薬に関するものである。

［従来の技術］ 抗原とそれに対する抗体との結合反応は生体における免
疫防御のひとつであり、その反応は特異的なものである
。このような特異性のある反応を応用して、組織化学の
分野では組織標本中の抗原を蛍光物質で標識した蛍光抗
体により検出する蛍光抗体法が古くから使用されて来て
いる。又、内分泌学の分野では生体内の微量生理活性物
質の測定には放射免疫測定法（Ｒａｄｌ。

ｔｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が応用され、内分泌学の研究
発展に大いに寄与した。しかし、これらの方法は種々の
制約があり、実験設備の完備した研究室や検査室でしか
使用することが出来ない。

１９７１年非放射免疫測定法（Ｎｏｎ−１ｓｏｔｏｐｉ
ｃｉｎｍｕｎｏａｓｓａｙ）の研究が芽生え、放射性物
質を使用しないという利点から、応用範囲が拡大した。

又、最近のバイオテクノロジーの技術の進歩、特に１９
７５年ケーラーとミルスタインによって開発されたモノ
クローナル抗体作製技術（ネイチ−？−（Ｎａｔｕｒｅ
）、　２５８．４９５（１９７５））の普及か拍車をか
けたため酵素免疫測定法が測定試薬分野で広く使用され
るようになって来た。

一方、抗生物質がペニシリウム（Ｐｅｎｌｃｌ　Ｈｉｕ
ｍ）、ストレプトマイシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
）やバチルス（Ｂａｃｉ　１１ｕｓ）属などから発見さ
れ感染症の治療薬として使用されるようなり、人類に大
いに貢献している反面、感染症に対し安易な使用が定着
し、抗生物質を乱用する傾向にあることから、菌交代症
や耐性菌の出現が問題になって来ている。

これまで起炎菌を決定するには、分離培養、鑑別、確認
検査を実施し、分離菌の生化学性状から同定を行なって
来たが、通常２〜３日間かかり、検査に多くの時間を費
やす欠点があった。

重症感染症、例えば敗血症、髄膜炎や肺炎などの診断や
治療が遅れると、患者の予後にも悪い影響を与えること
になる。

従って、従来の菌検査法の欠陥を補うべく迅速測定法が
必要となって来る。

従来、使用されている免疫反応を利用した測定試薬の一
般原理は第６図に示す通りであり、支持台ａに固定した
担体すに一次抗体Ｃを固定し、ブロッキング剤ｄにてコ
ーティングして固相試薬ｅとなし、検体中の抗原ｒを反
応させた後、酵素ｇを標識した標識抗体りを更に反応さ
せ、洗浄後基質ｉを加えて酵素活性量を定性的又は定量
的に検出、測定している。

［発明が解決しようとする問題点］ しかし、これまでに市販されている免疫反応を利用した
測定試薬には、以下のような種々の欠点が見られる。

（１）測定時のバックグラウンドが高く出現すること。

この原因には色々考えられるが、測定しようとする抗原
や抗体に夫々対応する抗体や抗原をポリスチレン性のプ
レートや親水性の強いニトロセルロース膜を固定膜とし
て利用しているので、抗原測定系の場合−次抗体を介せ
ず抗原、標識抗体が非特異的に固定膜に吸着するためと
主に考えられている。−殻内に、このような原因からく
る非特異的吸着を極力避けるため、ブロッキング剤とし
て牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等を使用しているが、検
体中にブロッキング剤に対する抗体が存在している場合
は完全に避けることは出来ない。

従ってブロッキング剤の工夫や、−次抗体及び標識抗体
にモノクローナル抗体を使用して出来る限り非特異的吸
着を低減出来るような工夫がなされているが、なかなか
軽減出来ず、時として問題が生じることがあるのが現状
である。

■　測定所要時間が長くなること。

一般に検体が血液の場合、バックグラウンドが高く出現
してくるため、はとんどの場合、前処理をして血清での
測定を行なっている。

従って、測定所要時間が長くなる傾向にある。

又、上記以外の検体でも次に述べるように測定容器の性
質から派生する問題のため測定所要時間に問題がおきて
いる。

（至）　その他の欠点 一般に酵素免疫測定試薬にはウェル（Ｗｅｌ１）タイプ
のプレート（０，３ｃｊ／１ｆｅｌ１）が使用されてい
る。このプレートの場合、測定する検体量が比較的多く
必要となり、検体が少量の場合、免疫反応の最適条件か
らはずれるため反応時間を長くしないと発色が弱まると
いう問題が生じてくる。又構造上洗浄効率が悪いなどの
欠点もあり、結果的に所要時間が長くなる原因となって
いる。又、このプレートは全般的にコストが高くなる傾
向にあることも欠点の１つである。

このように、現在、免疫測定法による測定試薬が種々市
販されているが、安価、迅速且つ精度の高いものはほと
んどない。

［問題点を解決するための手段］ そこで、本発明者らは上述した問題を出来る限り解決す
る方法を鋭意努力した結果、バックグラウンドを低くす
ることや、検体の前処理をなくすことは、従来から測定
試薬に使用されている親水性膜を疎水性膜に変更するこ
とにより、解決できることを見出した。更に、抗原又は
抗体を固定した疎水性の膜又はゲルを利用し、膜等の周
辺又はカラム内を疎水性にして、それらの膜等を支える
簡易支持体及びカラムを工夫することにより本発明を完
成させることが出来た。

すなわち、本発明の第１の発明は抗原、抗イディオタイ
プ抗体又は抗体を固定した疎水性担体と標識反応物質と
からなることを特徴とするものであり、第２の発明は簡
易支持体上に設けた疎水性担体に抗原、抗イディオタイ
プ抗体又は抗体を固定し、該疎水性担体の周囲に疎水性
層を設けた固相試薬と、標識反応物質とからなることを
特徴とするものであり、及び第３の発明は抗原、抗イデ
ィオタイプ抗体又は抗体を吸着した疎水性ゲルを、疎水
性化した簡易型カラムに充填した固相試薬と、標識反応
物質とからなることを特徴とするものである。

本発明で使用される疎水性担体の素材としてはポリエー
テル系、ポリビニリデンフロライド系、テフロン系及び
サポーテッドポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）
系などが適切である。これらの疎水性の合成樹脂素材は
、それ自体で平板、ウェルプレート、膜等を形成してそ
のまま使用してもよく、第１図に示すように膜状の疎水
性担体ｌを適当な大きさ、望ましくは抗原又は抗体の固
定しである大きさ以上に切断して以下に述べる接着剤を
使用して簡易支持体２に固着して使用すると便利である
。又、前記疎水性の合成樹脂素材を簡易支持体２上に適
当な大きさに塗布、印刷等して、疎水性担体層を形成し
てもよい。この場合、あらかじめ抗原、抗イディオタイ
プ抗体又は抗体を疎水性担体と練合したものを簡易支持
体２上に塗布、印刷することもできる。

更に、高感度を要求する場合には膜状の疎水性担体１に
代えて疎水性ゲル３を疎水性担体として使用することが
できる。このような条件に適合するゲルとしては疎水性
シリカゲル、又はポリマーが適当である。これらは現在
高速液体クロマト（ＨＰＬＣ）やカラムクロマト用とし
て市販されている逆相用のもので充分満足の行く結果が
得られる。

簡易支持体２は基本的に疎水性担体１，３が固定されれ
ば、どんな材質でも使用可能である。

−殻内には、大きさは例えばスライドグラスタイプで、
材質は例えば厚紙、厚手の防水紙、プラスチック、ガラ
スなどが適切である。望ましくは、少数の検体でも個々
に測定でき、経費が節約出来るということを考慮に入れ
て、反応支持体が分割出来るもやが良いと考えられる。

膜やゲル状の疎水性担体１，３を固定台に固着させる接
着剤としては、基本的に疎水系のものが適当である。こ
れらの目的に合うものとしては酢酸ビニルエマルジョン
やアクリル樹脂エマルジョン、スチレンブタジェンゴム
系が適当である。

膜又はゲル状の疎水性担体１．３に固定する抗原や抗体
には種々のものがあり、その作製については、種々の方
法が考えられる。抗原の場合、その物質によって作製方
法が異なるので従来から行なわれて来ている生化学的方
法に加えて最近行なわれている免疫学的方法或いはバイ
オテクノロジーの技術を利用することもできる。抗体の
場合は、目的とする抗原をウサギ、ヤギに免疫して高血
清（ポリクローナル抗体）を作製する方法と、当該抗原
で免疫したマウスやラットの抗体産生細胞とミエローマ
細胞とを融合させてモノクローナル抗体を作製する方法
とに分けられる（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、　２５
８．４９５゜１９７５、ジャーナル・オブ・エクスベリ
メンタル・メディシン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）、
　１５０．１００８．１９７９）。

もちろん後者の方が特異性が高いことは言うまでもない
。

疎水性担体１，３に抗原又は抗体を固定する方法として
は、水溶性物質の場合３７℃で１時間も放置すれば充分
に固定できる。固定する物質の性状は水溶性でも、水に
不溶性でもかまわないが、水に不溶性の場合、水溶性の
場合と比較すると長時間を要することがあるので注意を
要する。物質の性質によって異なるが、固定する物質す
なわち抗原又は抗体をｌＯ〜１０に／　１０７ｄの濃度
に適当な緩衝液に溶解又は懸濁し、マイクロシリンジ等
により疎水性Ｈ１又は疎水性ゲル３上に１〜１０Ｉ滴下
し、室温〜４５℃で充分風乾する。このときに使用され
企緩衝液は固定する物質によって異なるが、１０〜１０
０ｍＭリン酸緩衝液、トリス・ＥＤＴＡ・塩化ナトリウ
ム（ＴＥＮ）緩衝液などが良く使用される。

抗原又は抗体を固定化した後の疎水性膜１又は疎水性ゲ
ル３の部分をブロッキングするブロッキング剤は牛血清
アルブミン（ＢｏｖｌｎθＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ、
　ＢＳＡ）　ｓゼラチン、カゼイン、大豆タンパク、卵
白タンパクなどが考えられるが、０．１〜１．０％のＢ
ＳＡ　、ゼラチン、カゼインをＴＥＮ緩衝液やＱ、１Ｍ
リン酸緩衝液に溶かしたちのを用い、室温〜３７℃で３
０分〜５時間処理すると非常に良い結果が得られる。測
定試薬を使用に供するまで１０℃以下で保存すると約１
年間安定に使用可能である。

抗原又は抗体を固定した疎水性膜１又は疎水性ゲル３の
周辺に、疎水性層４を設けて疎水性にする工程を説明す
る。疎水性処理は、室温〜４０℃で簡易支持体２の表面
が均一になるように処理する。通常疎水化剤としては油
脂、界面活性剤、流動パラフィン、コロジオン、牛脂、
シリコーン、テフロンなどが挙げられるが、シリコーン
やテフロンが好ましい。なお、疎水性担体自体ｌが簡易
支持体２を兼ねる場合には、この疎水化処理は行なわな
くても良い。

又更に、高感度を要求する場合には、第３図に示すよう
に前記抗原又は抗体を固定した疎水性ゲル３を、前記疎
水化剤により処理した簡易型カラム５に充填して使用す
る。図中６はガラスフィルター、プレフィルタ−等のフ
ィルターを示す。

標識反応物質は、抗原に対するＩｇＧ　ＳＩｇＭなどの
抗体或は抗体と特異的に反応する物質例えばプロティン
Ａ　（Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ａ　）に、酵素、放射性同位
元素、蛍光物質等を公知の方法で標識して得られる。標
識する酵素としては、ホース・ファイッンユ・ペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）　、ウレアーゼ、アルカリ・フォス
アファターゼ（ＡＬＰ）、アミラーゼなどがある。標識
物と酵素は一概にどれが適当であるか言えないが、ケー
スバイケースとして適宜使用する方が良い。

次に、本発明の測定試薬の使用方法について説明する。

基本的には、これまで行なわれて来ている免疫測定法に
従うが、本発明の測定試薬による方法は測定しようとす
る検体の前処理を全く行なわなくてもよいため、測定操
作時間を大幅に短縮出来る。

検体の採取法は基本的に、従来の方法と変わりはない。

生体から採血した血液の場合、無処理のままで使用出来
るし、綿棒などで局所から採取した場合、生理食塩液そ
の他の適当な緩衝液に懸濁した液をそのまま使用出来る
。血液や懸濁した検体でも無処理のまま以下に説明する
操作をしてもバックグラウンドには何らの影響を与えな
い。その他の方法で採取した検体を例えば綿棒やそれに
類似する方法で採取し、生理食塩水、リン酸緩衝液に溶
解したり、懸濁して上記と同様の操作を行なっても良い
。

滴下する検体の容量は固定する面積によって一般的には
異なって来るが、０　、０１７１１から０　、５１１１
ぐらいが適当であると思われる。これ以上にしたい場合
は固定する疎水性担体１や疎水性ゲル３の面積を大きく
すれば何ら支障はない。

検体滴下後の反応条件は、基本的には温度と時間に左右
されるが、−殻内には室温から３７℃で４−分〜６分の
条件で反応させるのが良い。反応後、ガーゼや軟らかい
布、ペーパーで滴下した検体を除去し、洗浄操作に入る
。

洗浄液や洗浄の仕方は基本的に免疫反応を阻止しない方
法であれば、どんな方法でも良い。

通常、水道水やＲＯ水（逆浸透水）で充分である。

従来から使用されている特別な洗浄液、ＴＥＮ緩衝液、
ＥＤＴＡ又は界面活性剤（０，０１〜０．２％）を含む
洗浄液を使用する必要はない。洗浄時間は一般的には長
い程良好な結果をも光らすけれども、１０〜２０秒の短
時間で数回洗浄を繰り返す方が良い結果が得られる傾向
にある。洗浄処理温度は室温〜３７℃の間であれば問題
はないが普通は室温でやるのが作業効率の上からも推奨
される。

上記の洗浄と洗浄水の除去を２．３度繰り返した後、Ｈ
ＲＰ−結合体を１滴、滴下して室温で５分間反応させる
。

次に上記の方法で洗浄後、基質液として０．０４％４−
クロロ−１−ナフトール液を１滴加えた後、更に０．０
１％Ｈ２Ｏ２液１滴を加えて室温で３分間反応させる。

反応後、発色の程度を観察する。

また風乾後、デンシトメーターで発色の程度を定量的に
測定することも可能である。基質液の４−クロロ−１−
ナフトール液や０．０１％Ｈ２Ｏ２液の調整は常法にし
たがって作製すればよい。

［作　　　用］ 以上の反応において、疎水性担体１．３に抗原、抗イデ
ィオタイプ抗体又は抗体等を固定したので、検体中の不
純物が疎水性担体１，３に非特異的に吸着することが殆
ど完全に防止され、特異性が高められると共に洗浄操作
が簡単且つ容易となる。従って、全血を検体として使用
することが可能となり、測定時間が短縮される。又ブロ
ッキング剤によりアフターコーティングすることにより
、非特異的吸着が更に抑制される。

疎水性担体１，３の周囲に疎水性層４を形成することに
より、反応範囲が限局され、検体どうしのコンタミネー
ションも防ぐことができる。

更に該疎水性層にも検体中の不純物が非特異的に吸着す
ることも防止される。

又、疎水性層４により囲む範囲を狭くすることにより、
検体量を少なくすることができ、且つ洗浄水等の除去も
速やかに行なわれる。

洗浄後にＨＲＰ標識抗体等を反応させる場合にも、疎水
性担体１．３のため非特異的吸着が防止され、ブロッキ
ング剤により更に非特異的吸着が抑制され、更に洗浄操
作が容易になる。同様に、疎水性層４によりＨＲＰ標識
抗体等の非特異的吸着が防止されると共にＨＲＰ標識抗
体等の添加量を節減することができ、洗浄操作も容易に
なる。

以上の操作は、疎水性担体として疎水性膜Ｉ又は疎水性
ゲル３を用いた場合も同様であり、疎水性ゲル３を簡易
型カラム５に充填した場合も同様である。

［実　施　例］ 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ （１）大バルボウイルスに対するモノクローナル抗体の
作製 ■　大パルボウイルス（ＣＰＶ）の培養犬パルボウイル
ス（ＣＰＶ）の培養上清を、１８００ｃ♂培養フラスコ
中のネコ腎細胞（ＮＬＦＫ細胞）懸濁液に接種した。Ｃ
Ｏ２インキュベーター内（５％ＣＯ２，９５％空気）で
培養し、細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められた時点で細
胞の凍結融解を行ない（ドライアイス−アセトンで凍結
し、室温で融解する）、細胞懸濁液を遠心分離した（１
００００ｒｐｍ、　４５ｗ１ｎ、　４℃）。得られた培
養上清を次のウィルス精製に使用した。

■　ｃｐｖの精製 ■で得られた培養上清（３２０１１１）を、遠心分離（
８５００ｒｐｍ、　４５ｍ１ｎ、　４℃）後、上清を更
に超遠心分離しく４５０００ｒｐｍ、　４ｈｒ、　４℃
）、その沈殿を３ｍｌのＰＢＳ　（−）に懸濁した（−
夜、４℃）。次に、遠心分離（１００００ｒｐｍ、　３
（１ｍ１ｎ。

４℃）で固形物を除いた上清を、ＣｓＣ１密度勾配グラ
ジェントで超遠心分離（２０％。

４０％、６０％Ｃｓ　Ｃ１４５００Ｏｒｐｍ、　４ｈｒ
、　４℃）し、ウィルスのバンドを得、ＰＢＳ　（−）
を外液として４℃、３８ｈｒ透析した。

■　モノクロナール抗体の作製 免疫は、■で調整した精製ウィルス液 ０．２ｚ１（タンパク質としてＬ２Ｉｔｇ）と等量のフ
ロイントの完全アジュバント（Ｐｒｅｕｎｄｃｏｍｐｌ
ｅｔｅ　ａｄｊｕｂａｎｔ）を混和した懸濁液をＢＡＬ
Ｂ／ｃマウス（雌、５週令）に腹腔内注射した、初回免
疫から２週間間隔で第２回及び第３回の追加免疫を行な
った後、マウス血清中の抗体価を測定しく岩崎辰夫ら、
単クローン抗体　講談社サイエンティフィック　１９８
３）　、１２，５００倍以上の抗体価上昇を確認した。

血清抗体価測定から１ケ月後に追加免疫を施し最終免疫
から３日後に細胞融合を行なった。細胞融合は先部らの
方法（先部則次：組織培養　旦、　４５８（１９８５）
　）に従い行なった。融合後、融合細胞はＮＹＳＦ−４
０４培地に懸濁し、９６ｗｅｌｌ培養プレートへ１００
Ｊ／ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養し
た。培養７〜１４日目にコロニー形成の認められた培養
上清中の抗体スクリーニングをエンザイム壷リンクド・
イムノφソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による抗
体判別法に従って行なった。抗体陽性のハイブリドーマ
のうち、いくつかの株について限界希釈法によるクロー
ニングを行なった。

その結果、抗ＣＰｖモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ数株が得られた。

（２）標識抗体の作製 ■で作成したウィルス懸濁液１００Ｊ／１２Ｊを２０〜
２５ｋｇのウサギ（日本内色種）２匹の５ケ所に分けて
免疫した。３週ごとに計５回免疫し、最終免疫から７日
後、心臓採血により全採血した（約１９０１ｆ）。４℃
、−晩放置後、血漿画分から常法に従って１２画分を精
製し、この画分にＨＲＰを常法に準じて結合し標識抗体
を調製した（山田剛太部、生根−穂、免疫実験操作法　
■、１８３５（１９７７））。又、ウサギ抗ｃｐｖ　Ｉ
ｇ画分のかわりにマウス抗ＣＰｖモノクローナル抗体も
使用して標識抗体を作製した。

（３）測定試薬の作製 支持体として、ポリカーボネイトの樹脂を用いる。大き
さは７６１ＩＩＩｌ×２６ｍｌ１で、厚さ１．０ｍ＋ｇ
である。左右どちらでも良いのでマーキング可能なスペ
ースを除き、全面（表裏どちらでモ良い）室温下、テフ
ロンで処理して疎水性にする。ポリテトラフロロエチレ
ン製の疎水性膜（ミリボア社製）を１１ｍ＋ａ　Ｘ　１
２ｍｍの大きさに切り上記支持体に疎水性スチレンブタ
ジェンゴム系の接着剤ではりつける（８枚はりつける）
。疎水性膜上にイヌパルボウイルスに対するモノクロー
ナル抗体を２０ｕｇ１５ｐｄマイクロシリンジで固体し
、３７℃で充分風乾する。

風乾後、ＴＥＮ緩衝液に溶解した０、１％ゼラチン液に
３７℃、１時間浸潤しブロッキング処理を行なったのち
、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０添加ＴＥＮ緩衝液で軽
く洗浄して以下の種々の試験に共する。長時間使用しな
い場合、４℃に保存して置くと安定である。完成した試
薬を第１図及び第２図に示す。

（４）　　イヌパルボウイルスの検出 （３）で作製したイヌパルボウイルス検出試薬を用いて
イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）人工感染大糞便中のＣＰ
ｖを測定した。すなわち、４力月齢の抗体陰性犬に、イ
ヌパルボウイルス強毒株を経口投与し、感染前日及び感
染１０日までの糞便を採取し、採取した人工感染大糞便
を２ｘｌの生理食塩水に懸濁し、その１滴を検出試薬の
各ウェルに滴下する。室温にて５〜１０分放置する。次
に、ガーゼなどの柔らかい布又は紙で拭き取り水道水又
はあらかじめ容器に入れである洗浄水などで洗浄する。

ガーゼ又は濾紙で軽く拭いた後、ＨＲＰを標識したマウ
ス抗ＣＰ■モノクローナル抗体を１滴滴下して室温で５
〜１０分反応させる。その後、水道水などで軽く洗浄し
、基質液（４−クロロ−１−ナフトール液）１滴と０．
０１％Ｈ２Ｏ２液１滴滴下して室温にて５分反応させて
水道水で洗浄後、発色の程度をデンシトメータ）フィル
ター４５０ｎａ＋　）でピーク高を測定した。その結果
を第４図に示す。

実施例２ （１）抗体価検出用試薬の作製 イヌパルボウイルスワクチン接種時には母方からの移行
抗体の血中レベルが重要である。

そこで、その抗体を測定する為に試薬を作製した。ガラ
ス製の支持体（７６ｍｍ　Ｘ２６ｍｇ＋　　厚さ１．０
ｍｆｆ１）を前もってシリコンで疎水化して置く。

この上にポリビニリデンフロライド製の疎水性膜を直径
５ＩＩＩＩＩｌの円形状に切り抜いたものを疎水性接着
剤で接着する。次に支持体上に接着された膜上にイヌバ
ルボウイルスを固定して実施例１と同様の操作でキット
を作製する。

ウィルスは密度勾配遠心法により充分に精製したものを
使用した。使用濃度は蛋白質ととして１０ｑ１５ＩＪＪ
に調製した。

標識反応物質（プロティンＡ−ＨＲＰ）の作製方法は以
下の方法に従った。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａはシグマ（Ｓｉｇｍａ）社製（婁Ｐ
−８１４３゜Ｌｏｔｌ１３Ｆ−８８２１）のものを用い
、常法ニヨリ１（ＲＰ（シグマ社製）と反応させて結合
体を作製した（ポットジータ−等（Ｌ、　Ｎ、　Ｄ、　
Ｐｏｔｇｉｅｔｅｒｅｔ　ａ１）、アメリカン・ジャー
ナル・オブ・ベテリナリイー・リサーチ（Ａｍ、　Ｊ、
　Ｙｅｔ、　Ｒｅｓ、）＋４１、９７８−９８０（１９
８０）　）。

（２）新生ピーグル大の抗体価の検出 実施例２の（１）で作製した試薬を用いて、大全血中の
移行抗体を定性的に検出し、旧価も測定して相関を検討
した。

実施例２の（１）の試薬を用意し、新生ピーグル大２匹
から血液３猷を表１に示す時期に採取し、測定に供した
。それぞれの検体を２滴ずつ滴下して洗浄した後、ＨＲ
Ｐで標識したプロティンＡを２滴、滴下して、室温で５
〜１０分反応させる。次に水道水で洗浄し、基質液（４
−クロロ−１−ナフトール液）２滴と０．０１％Ｈ２０
２液２滴滴下して室温にて５分反応させて水道水で洗浄
後、発色の程度を目で観察した。その結果を表１に示し
た。なお、旧価の測定はマイクロタイター法（ウィルス
実験学、２［９頁、丸善）により測定した。

表１　若齢犬におけるイヌパルボウィルスに対する移行
抗体価と旧価の相関 ＊発色二十明瞭な青紫色を呈するもの ±不明瞭な青紫色を呈するもの −青紫色を呈しないもの 廿　　　（）は採取時期を示す （３）　　ウサギ抗血清中のパルボウィルスの抗体価の
測定 実施例２の（１）で作製した測定試薬を用いてウサギ抗
血清中のバルボウィルスの抗体を定量的にｎノ定した。

方法は、２倍段階希釈したウサギ抗体ｃＰｖ抗血清を、
２７ｉ！ずつ滴下して洗浄した後、ＨＲＰで標識したプ
ロティンＡを２滴ずつ滴下して室温で５〜ＩＯ分反応さ
せた。次に水道水で洗浄し、基質液（４−クロロ−１−
ナフトール液）を２滴と、０．０１％Ｈ２Ｏ２液２滴滴
下して室温にて５分反応させ、水道水で洗浄後、発色の
程度をデシンシトメーターでピーク高を測定した。その
結果を第５図に示す。

実施例３ （１ン　　疎水性ゲルを用いたｎ１定試薬の作製疎水性
ゲルを利用した場合の測定試薬の基本原理は実施例１の
疎水性膜を用いた場合と同様であるが、第３図に示すよ
うな外径７■、内径５ａｕｎのディスポタイプのカラム
を作製した（カラムの内部はシリコンなどであらかじめ
疎水性にしておく。）。疎水性シリカゲル１００ｍｇを
充分量の生理食塩水で洗浄した後、約１ａ＋ｇのパルボ
ウイルスに対するモノクローナル抗体（５００Ｊ）を添
加し、３７℃で充分風乾する。次にＴＥＮ緩衝液ｐＨ７
、２に溶解した０、１％ゼラチン液に３７℃１時間浸潤
してブロッキグ処理した。０，０５％ツイーン２０添加
ＴＥＮ緩衝液で軽く洗浄して以下の試験例に共した。

（２）イヌパルボウイルス検出 実施例３の（１）で作製したディスポカラムタイプの測
定試薬で、試験１と同様に人工感染大糞便中のＣＰｖを
検討した。方法についてはすべて実施例１の（４ンの方
法に従った。結果は以下の表２に示す。

表２　簡易型カラムによるイヌパルボウィルスの検出 ＊発色度；　−発色なし ±　不明瞭 十　緑色 替　明らかに緑色を呈する 惜　濃緑色を呈する ［発明の効果］ 以上述べたように本発明の簡易迅速免疫測定試薬の第１
の発明によれば、 （Ｄ　抗原、抗イディオタイプ抗体又は抗体を固定する
担体を疎水性としたので、検体中の不鈍物の非特異的吸
着及び標識反応物質の非特異的吸着を著しく低減させる
ことができる。

（ＩＤ　　（Ｄにより検体として全血を使用することが
可能となり、従来の血球成分の分離のための手間と時間
が不要となる。従って、測定時間が大幅に短縮される。

（Ｉｎ）　　（Ｄによりバックグラウンドを大幅に低下
することができ、検出感度が向上する。

■　検体中の不純物や標識反応物質の非特異的吸着を著
しく抑制できるので、洗浄液を特に選ばなくて良く、し
かも洗浄回数、洗浄液量等も減少でき、洗浄操作が著し
く簡単になる。

又、本発明の第２の発明によれば、上記効果（Ｄ　＜Ｉ
Ｄ　（［［Ｄ■に加えて、 ■　疎水性担体を簡易支持体上に形成したので、簡易支
持体の材質、形状等は種々のものが使用可能となり、安
価なものを選択することができる。

■　疎水性担体を簡易支持体上に形成する手段は種々の
方法が可能であり、多様な測定形態に対応することがで
きる。

０　疎水性担体の周囲に疎水性層を設けたので、反応の
範囲を限局することができ、検体のコンタミネーション
を防止することができる。

■　疎水性担体の周囲に疎水性層を設けたので、反応範
囲を任意に選定することができ、反応の範囲を小さくす
ることにより少量の検体で測定を行うことが可能となる
。従って、検体及び標識反応物質の量が少なくて済み、
且つ洗浄の操作も容易になる。

更に、本発明の第３の発明によれば、上記効果（Ｄ　＜
ＩＤ　（［Ｄ■に加えて、 ［Ｆ］　抗原、抗イディオタイプ抗体又は抗体を吸着し
た疎水性ゲルを、簡易型カラムに充填したので、表面積
を大きくすることができ、検出、測定感度が更に高くな
る。

■　簡易型カラムを疎水性化したので、検体及び標識反
応物質のカラムへの非特異的吸着を著しく減少させるこ
とができ、バックグラウンドを大幅に低下させることが
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の第２の発明の一実施例の説明図、第２
図は第１図の■−■方向矢視図、第３図は本発明の第３
の発明の一実施例の説明図、第４図は本発明の測定試薬
による人工感染大中のイヌバルボウイルスの検出結果を
示す図、第５図は本発明の他の測定試薬によるバルボウ
イルス抗体価の測定結果を示す図、第６図は従来の酵素
免疫測定法の一例を示す図である。 ■は疎水性担体、２は簡易支持体、３は疎水性ゲル、４
は疎水性層、５は簡易型カラムを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）抗原、抗イディオタイプ抗体又は抗体を固定した疎
   水性担体と標識反応物質とからなることを特徴とする簡
   易迅速免疫測定試薬。 ２）簡易支持体上に設けた疎水性担体に抗原、抗イディ
   オタイプ抗体又は抗体を固定し、該疎水性担体の周囲に
   疎水性層を設けた固相試薬と、標識反応物質とからなる
   ことを特徴とする簡易迅速免疫測定試薬。 ３）簡易支持体が厚紙、厚手の防水紙、合成樹脂板、ス
   ライドガラスのいずれかである特許請求の範囲第２）項
   記載の簡易迅速免疫測定試薬。 ４）簡易支持体上に設けた疎水性担体が、膜状の疎水性
   担体、疎水性合成樹脂を塗布して形成した疎水性担体、
   疎水性ゲルのいずれかである特許請求の範囲第２）項又
   は第３）項記載の簡易迅速免疫測定試薬。 ５）疎水性担体がポリテトラエチレン膜、ポリビニリデ
   ンフロライド膜、ポリビニルクロライド膜のいずれかで
   ある特許請求の範囲第２）項、第３）項又は第４）項記
   載の簡易迅速免疫測定試薬。 ６）疎水性担体が疎水性シリカ、疎水性ポリマーのずれ
   かである特許請求の範囲第２）項、第３）項又は第４）
   項記載の簡易迅速免疫測定試薬。 ７）疎水性層がシリコーン、テフロンの疎水性層である
   特許請求の範囲第２）項、第３）項、第４）項、第５）
   項又は第６）項記載の簡易迅速免疫測定試薬。 ８）標識反応物質が標識抗体、標識プロテインＡのいず
   れかである特許請求の範囲第２）項記載の簡易迅速免疫
   測定試薬。 ９）標識物が酵素、放射性同位元素、蛍光物質のいずれ
   かである特許請求の範囲第２）項又は第８）項記載の簡
   易迅速免疫測定試薬。 １０）抗原、抗イディオタイプ抗体又は抗体を吸着した
   疎水性ゲルを、疎水性化した簡易型カラムに充填した固
   相試薬と、標識反応物質とからなることを特徴とする簡
   易迅速免疫測定試薬。 １１）疎水性ゲルが疎水性シリカ、疎水性ポリマーのい
   ずれかである特許請求の範囲第１０）項記載の簡易迅速
   免疫測定試薬。 １２）シリコーン、テフロンのいずれかにより疎水性化
   した簡易型カラムである特許請求の範囲第１０）項又は
   第１１）項記載の簡易迅速免疫測定試薬。 １３）標識反応物質が標識抗体、標識プロテインＡのい
   ずれかである特許請求の範囲第１０）項、第１１）項又
   は第１２）項記載の簡易迅速免疫測定試薬。 １４）標識物が酵素、放射性同位元素、蛍光物質のいず
   れかである特許請求の範囲第１０）項、第１１）項、第
   １２）項又は第１３）項記載の簡易迅速免疫測定試薬。