CN114076825A - 检测SARS-Cov-2病毒的检测试剂条、试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了检测唾液中SARS‑Cov‑2病毒的检测试剂条、试剂盒和检测方法方法。具体地，所述试剂条包括：一基板，以及设置在所述基板上且从近端至远端依次排布的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；吸液棒所述硝酸纤维素膜设置有N蛋白检测线、S蛋白检测线和质控线；所述N蛋白检测线包被有第一N蛋白单克隆抗体；且所述S蛋白检测线包被有第一S蛋白单克隆抗体；所述结合垫固定有纳米碳标记的第二N蛋白单克隆抗体和纳米碳标记的第二S蛋白单克隆抗体。本发明的试剂条能够无创采样、现场检测，且操作简单快速、成本低、结果准确。

Description

检测SARS-Cov-2病毒的检测试剂条、试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，具体涉及检测唾液中SARS-Cov-2病毒的检测试剂 条、试剂盒和检测方法。
背景技术
SARS-CoV-2作为急性呼吸道传染病已纳入《中华人民共和国传染病防治法》 规定的乙类传染病，按甲类传染病管理。
目前，检测SARS-CoV-2的方法主要有以RT-PCR核酸检测方法为主，该方法 对早期诊断起到了一定的作用，由于试剂盒开发的周期比较短，因此对突发疫情的 反应比较迅速。但是，由于初期对病毒的核酸特征了解的还不是很透彻，PCR引物 的设计，反应的条件设定以及环境的控制和采样的方法等因素，导致核酸检测试剂 的假阳性和假阴性比例过高，产品质量参差不齐。
另一种基于免疫方法的诊断试剂是通过检测样本中的抗体来诊断病毒感染。 病毒抗体检测主要是检测两种抗体：IgM和IgG，其中IgM的检测主要是针对近期 感染，窗口期为3-7天。IgG大概出现在几周以后。这种免疫检测的方法有酶标， 化学发光，以及胶体金免疫层析方法。免疫检测的方法的优点是技术比较成熟，对 检测的条件要求不高，适合基层医疗单位使用，便于推广。但是，由于IgM和IgG 出现的时间滞后，不适合对于早期病毒感染的筛查。且免疫检测的样本为血样，需 要对受试者进行采血，造成创伤和疼痛。
因此，本领域急需提供一种能够无创采样、现场检测，且操作简单快速、成 本低、结果准确的SARS-Cov-2病毒检测试剂盒和检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种无创采样、现场检测，且操作简单快速、成本低、 结果准确的SARS-Cov-2病毒检测试剂盒和检测方法。
本发明第一方面，提供了一种SARS-Cov-2病毒的检测试剂条，所述试剂 条包括：
一基板，以及设置在所述基板上且从近端至远端依次排布的样品垫、结合 垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
吸液棒所述硝酸纤维素膜设置有N蛋白检测线、S蛋白检测线和质控线；
所述N蛋白检测线包被有第一N蛋白单克隆抗体；且
所述S蛋白检测线包被有第一S蛋白单克隆抗体；
所述结合垫固定有纳米碳标记的第二N蛋白单克隆抗体和纳米碳标记的第 二S蛋白单克隆抗体，
其中第一N蛋白单克隆抗体、N蛋白和纳米碳标记的第二N蛋白单克隆抗 体可形成“第一N蛋白单克隆抗体-N蛋白-纳米碳标记的第二N蛋白单克隆抗 体”三元复合物；
而第一S蛋白单克隆抗体、S蛋白和纳米碳标记的第二S蛋白单克隆抗体 可形成“第一S蛋白单克隆抗体-S蛋白-纳米碳标记的第二S蛋白单克隆抗体” 三元复合物。
在另一优选例中，当样品中含有SARS-Cov-2的N蛋白时，则所述N蛋白 与所述第二N蛋白单克隆抗体形成“N蛋白-纳米碳标记的第二N蛋白单克隆抗 体”二元复合物，然后所述的二元复合物被位于N蛋白检测线处的所述第一N 蛋白单克隆抗体所捕获，形成“第一N蛋白单克隆抗体-N蛋白-纳米碳标记的 第二N蛋白单克隆抗体”三元复合物。
在另一优选例中，当样品中含有SARS-Cov-2的S蛋白时，则所述S蛋白 与所述第二S蛋白单克隆抗体形成“S蛋白-纳米碳标记的第二S蛋白单克隆抗 体”二元复合物，然后所述的二元复合物被位于S蛋白检测线处的所述第一S 蛋白单克隆抗体所捕获，形成“第一S蛋白单克隆抗体-S蛋白-纳米碳标记的 第二S蛋白单克隆抗体”三元复合物。
在另一优选例中，当样品上样于所述样品垫后，液体会向吸水垫方向流动， 依次流经结合垫和硝酸纤维素膜。
在另一优选例中，所述的检测试剂条还包括一吸液棒，所述吸液棒设置在 样品垫外侧并与所述样品垫接触。
在另一优选例中，所述的样品是生物样品，较佳地为体液样品或血液样品， 更佳地为唾液或尿样样本，最佳的为唾液样本。
在另一优选例中，所述N蛋白检测线和S蛋白检测线垂直于层析方向并列 设置(左右)或平行设置(前后)，较佳地，并列设置。
在另一优选例中，所述结合垫包括分隔且并排设置的第一结合垫和第二结 合垫，且所述硝酸纤维素膜包括分隔且并排设置的第一硝酸纤维素膜和第二硝 酸纤维素膜，
其中，所述第一结合垫与第一硝酸纤维素膜搭接，所述第二结合垫与第二 硝酸纤维素膜搭接，
所述第一结合垫固定有纳米碳标记的第二N蛋白单克隆抗体，所述第一硝 酸纤维素膜包被有第一N蛋白单克隆抗体；且
所述第二结合垫固定有纳米碳标记的第二S蛋白单克隆抗体，所述第二硝 酸纤维素膜包被有第一S蛋白单克隆抗体。
在另一优选例中，所述“分隔”指流体互不干扰。
在另一优选例中，所述试剂条包括一壳体，所述吸液棒一端伸出所述壳体， 样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫位于所述壳体内，且所述壳体在硝酸 纤维素膜处具有可视窗。
在另一优选例中，所述可视窗为并列的两个。
在另一优选例中，所述壳体还包括可拔插的吸液棒保护盖。
在另一优选例中，所述纳米碳的平均粒径为50-200nm，较佳地，80-150nm。
在另一优选例中，所述吸液棒伸出所述壳体的长度为5-10mm。
在另一优选例中，结合垫上预固定纳米碳标记的第二N蛋白单克隆抗体是采 用浓度为0.2-1.0mg/ml纳米碳标记的第二N蛋白单克隆抗体溶液进行固定的，更 佳地0.4-0.6mg/ml。
在另一优选例中，所述纳米碳标记的第二N蛋白单克隆抗体固定量为20-50 μl/cm2；更佳地，25-30μl/cm2。
在另一优选例中，结合垫上预固定纳米碳标记的第二S蛋白单克隆抗体是采 用浓度为0.2-1.0mg/ml纳米碳标记的第二S蛋白单克隆抗体溶液进行固定的，更 佳地0.4-0.6mg/ml。
在另一优选例中，所述纳米碳标记的第二S蛋白单克隆抗体固定量为20-50 μl/cm2；更佳地，25-30μl/cm2。
在另一优选例中，所述硝酸纤维膜上包被的第一N蛋白单克隆抗体是采用浓 度为0.5～1mg/ml的N蛋白单克隆抗体溶液进行包被的。
在另一优选例中，所述硝酸纤维膜上包被的单克隆包被量为5-20μl/cm2， 较佳地，8-12μl/cm2。
本发明第二方面，提供了一种SARS-Cov-2病毒的检测试剂盒，所述试剂 盒包括一容器，以及位于所述容器内的如本发明第一方面所述的试剂条。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书和/或取样杯。
本发明第三方面，提供了一种检测生物样本中是否存在SARS-Cov-2病毒 的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供如本发明第一方面所述的试剂条或如本发明第二方面所述的试剂 盒；和
(2)将所述试剂条与所述生物样本接触，层析并读取显色情况。
在另一优选例中，所述的生物样品是体液样品，较佳地为尿样或唾液，更佳 的为唾液样本。
在另一优选例中，所述读取为目视读取。
在另一优选例中，本发明的方法是体外、非诊断非治疗的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技 术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明的测试条的一个实施例的图片。
图2显示了本发明的测试条的结果判读图示。
图3显示了本发明的测试条的上样方法。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，本发明人首次意外地发现，在受呼吸道 传染的SARS-CoV-2病毒感染的对象，居然可以在非常早期就在唾液样本存在原本 存在于SARS-CoV-2病毒内部的N蛋白和S蛋白，因此通过基于特异性的抗SARS-CoV-2的N蛋白和/或S蛋白的抗体所制备的检测试剂条，可快速检测唾液 中N蛋白和/或S蛋白，从而为防治新冠病毒相关疾病提供依据。此外，本发 明的检测试剂条(片)通过设置双检测区，能够更方便、准确、快速实现唾液样 本的SARS-Cov-2的无创、现场检测。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发 明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和 封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“基板”、“背衬”、“底板”可互换使用，指检测试 剂条(或检测试剂片)的支撑性的固相载体(或支撑板)。
如本文所用，术语“室温”是指温度为4-40℃，较佳地，25±5℃。
如本文所用，术语“S蛋白”和“纤突蛋白(Spike protein,S)”可互换 使用，指SARS-CoV-2纤突蛋白。
如本文所用，术语“N蛋白”和“核衣壳蛋白N蛋白(Nucleocapsid protein, N)”可互换使用，指SARS-CoV-2核衣壳蛋白。
如本文所用，术语“SARS-CoV-2检测试剂条”、“本发明的试剂条”、 “ars-Cov-2抗原检测试剂条”“唾液Sars-Cov-2抗原检测试剂条”可互换使 用。
SARS-CoV-2
SARS-CoV-2，又称2019-nCoV，属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆 形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。体外分离培养时，2019-nCoV 96个小 时左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现，而在Vero E6和Huh-7细胞系中分离培 养需约6天。新型冠状病毒SARS-Cov-2基因5'端有甲基化帽子状结构，前2/3的 区域编码病毒RNA聚合酶复合蛋白，后1/3的区域编码结构蛋白和非结构蛋白，按 基因组上的排列顺序依次为纤突蛋白(Spikeprotein,S)、小膜蛋白(Envelop protein,E)、膜蛋白(Membrane protein,M)和核衣壳蛋白N蛋白(Nucleocapsid protein,N)。
SARS-CoV-2检测试剂条
本发明的检测试剂条(或检测试剂片)采用双抗体夹心法检测SARS-CoV-2，具 体地，通过检测SARS-CoV-2的N和/或S蛋白抗原是否存在来判断SARS-CoV-2是 否存在。以纳米碳作为示踪标志物标记N/S蛋白抗体(标记抗体)，固定在玻璃纤维 的结合物释放垫上，其一端与硝酸纤维素膜(NC膜)相连，另一端与样品垫相连， 样品垫一端与吸液棒相连，NC膜的另一端连有吸水垫。在NC膜上的检测线(T线) 和质控线(C线)分别包被与纳米碳标记抗体配对的N/S蛋白抗体和羊抗鼠IgG抗 体。
优选地，本发明的试剂条具有并排设置N蛋白检测区和S蛋白检测区。可通过 设置并排且分隔的结合垫以及硝酸纤维素膜来实现。
检测时，通过吸液棒吸取样本，样本通过毛细作用，经样品垫均匀的供应到含 标记物的结合垫，使标记物重新水化，并与纳米碳抗体复合物反应，然后一起向前 泳动。
若样本中含有N和/或S蛋白，会与纳米碳微球标记相应的N/S蛋白抗体形成 微球标记抗体-蛋白复合物。随后在通过固相化有N/S蛋白抗体的检测区T线时， 形成微球标记抗N/S蛋白抗体-蛋白-抗体复合物，在NC膜上的检测线上形成至少 一条黑色条带，判断为阳性，反之，当N蛋白和S蛋白T线都不显色时，结果为阴 性。由于纳米碳标记抗体的过量存在，所以无论样本中是否含有N/S蛋白，纳米碳 标记抗体会层析至C线形成微球纳米碳标记抗体-羊抗鼠IgG复合物，在NC膜上的 质控线形成黑色条带，该条色带是判定层析过程是否正常和试剂条是否变质的标准 (如图2)。
特别地，本发明的试剂条设计为棒状采样，前端由吸水能力很强的吸液棒，连 接检测的样品垫，所述吸液棒能够吸取唾液样本，最终样本通过层析经过NC膜， 完成检测。采样方式为两种，一种是将唾液采集到样品杯中，检测的吸液棒浸入； 或者直接将吸液棒置入口腔吸取唾液进行检测(如图3)。
本发明的试剂条特别适用于唾液样本中的N/S蛋白的定性定量检测。另外，也 可用于其他生物样本的检测，包括但不限于：痰液、尿液等。
试剂条及其材料
本发明的试剂条可采用本领域常用的试剂条材料，采用常规的试剂条制备方 法制成。
本发明检测N/S蛋白的免疫试剂条，包括测试条和支撑测试条的背衬(或底 板)，如可采用PVC聚脂胶板等；所述的测试条由吸液棒、样品垫、结合垫、硝酸 纤维素膜和吸水垫依次搭接组成，搭接部位可以采用常规的方法，如胶带等固定连 接。
其中：结合垫预固定纳米碳标记的N/S蛋白单克隆抗体或多克隆抗体，优选 被纳米碳标记的N/S蛋白单克隆抗体，硝酸纤维素膜上包被检测线和质控线；
所述的检测线为N/S蛋白单克隆抗体，检测线所在的区域为检测区；
所述的质控线为固定化IgG，如羊抗鼠多克隆抗体，质控线所在的区域为质 控区。
所述吸液棒可以使用任何适合吸取生物液体尤其是唾液的材料和形状。如圆 柱、长方体、梯形等。所述吸液棒的材质可以为PP、PE、PVA等无毒吸水材料。
所述试剂条还包括可拔插的盖子，用于保护所述吸液棒。
在一个优选的方案中：结合垫上预固定纳米碳标记的N/S蛋白单克隆抗体是 采用浓度为0.2-1.0mg/ml纳米碳标记的N/S蛋白单克隆抗体溶液进行固定的，固 定量为20-50μl/cm2；优选的浓度为0.4-0.6mg/ml，25μl/cm2；
硝酸纤维膜上包被的N/S蛋白特异性抗体是采用浓度为0.5～1mg/ml的N/S 蛋白单克隆抗体溶液进行包被的，包被量为10μl/cm2；优选的浓度为0.5或 1mg/ml，10μl/cm2；试剂条的最低检测量在5ng/ml之内。
单克隆抗体的制备
本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即，组 成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单 克隆的”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。
抗SARS-CoV-2病毒的N蛋白和S蛋白的抗体，可以通过本领域内技术人 员已知的各种技术进行制备。例如，本发明完全抗原，可被施用于动物以诱导 单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等 人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976； Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA 法(美国专利号4,816,567)制备。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞 系，例如鼠类的骨髓瘤细胞系，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤 细胞系(可购自Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福 尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也 已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur 等，单克隆抗体的生产技术和应用(Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(MarcelDekker，Inc.，纽约，1987)]。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆 抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫 分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通 过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗 体(MonoclonalAntibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如， DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
本发明还提供了抗N/S蛋白的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中，单 克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸 铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗 体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，2-4周内可见腹部明显 胀大。抽取腹水，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱 (Protein G-Sephrose)纯化。
本发明在采用N/S蛋白抗原免疫的小鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞按 常规方法制备杂交瘤时，分别筛选到(i)两种针对N蛋白有高特异性和高活力的单 克隆抗体杂交瘤细胞株，通过这两种N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株分别制备的两 种单克隆抗体与N蛋白发生免疫反应的位点不相同；
以及(ii)两种针对S蛋白有高特异性和高活力的单克隆抗体杂交瘤细胞株，通 过这两种S蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株分别制备的两种单克隆抗体与S蛋白发生 免疫反应的位点不相同。
免疫试剂条的性能
本发明的唾液检测N/S蛋白免疫试剂条具有如下性能：
灵敏度高：调节纳米碳标记的N/S蛋白抗体量、结合垫上固定的纳米碳标记 的单抗溶液、硝酸纤维素上包被的N/S蛋白抗体量，测试样品中含有的N/S蛋白， 进行灵敏度测试。结果表明，本发明的试剂条N/S蛋白的最低检测量可达到1 ng/ml。
稳定性好：将本发明的唾液检测N/S蛋白免疫试剂条置于4℃真空干燥14小 时以上，结果表明，所述试剂条能长期保存。
特异性佳：用本发明的唾液检测N/S蛋白免疫试剂条检测共20种常见病原 体或其产生的抗原物质，结果仅N蛋白和S蛋白呈阳性，其他为阴性。用于检 测的物质包括N蛋白、S蛋白、乙型流感、副流感病毒抗原、地方性人类冠状 病毒HKU1、地方性人类冠状病毒OC43、地方性人类冠状病毒NL63、地方性人 类冠状病毒229E、新型甲型H1N1流感病毒、EB病毒抗原、鼻病毒抗原、呼吸 道合胞病毒抗原、柯萨奇病毒抗原、腮腺炎病毒、麻疹病毒、水痘-带状疱疹 病毒、人巨细胞病毒、肺炎支原体、肠道病毒、轮状病毒共20种。
综上所述，本发明的唾液检测N/S蛋白免疫试剂条与RT-PCR核酸检测相比， 本发明的试剂条简单、轻便，易于携带，可以现场检测，而且不需要昂贵的设备。 而与其他免疫检测如酶标法、化学发光，以及胶体金免疫层析等相比，本发明的试 剂条适用于唾液样本，可以无创采样，且相对于检测SARS-CoV-2的IgM和IgG等 抗体，本发明试剂条的检测对象N/S蛋白可在感染第三天起即可检测，可在感染更 早期用于检测。使用本发明的试剂条检测N/S蛋白，整个测试可在15-20min钟内 完成，且与18种常见病原体或其产生的抗原物质、没有交叉反应。
检测方法与结果判定
用吸液棒在取样杯中吸取唾液或将吸液棒接触受试者的舌下试样约 300-400ul，15min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果，示意图见 图2。
阳性：质控区、任一检测区均出现明显的色带，示为阳性；
阴性：只在质控区出现明显色带，而在检测区无色带，示为阴性；
无效：质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色 带，表明检测方法错误或试剂条变质或失效，应重新换取试剂条检测。
试剂盒
本发明还提供了一种指含有本发明的SARS-CoV-2检测试剂条的试剂盒，在本 发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括取样杯、使用说明书等。
本发明的主要优点包括：
1.本发明的试剂盒用于可检测唾液样本，无创采样，检测过程中被测人 员无不适感；
2、本发明的试剂盒检测过程操作非常简单，可由被测人员自行操作，无 需其他设备、试剂及耗材，无需专业技术人员参与，适合家庭使用(home-use)；
3、本发明的试剂盒检测过程快速，15-20min可完成检测，结果肉眼可判 定，无需专业仪器设备，可现场检测；
4.目前认为，对于SARS-Cov-2早N:\2020年\2020-1603-八通\Other期 检测，应采集鼻咽拭子进行核酸检测(如《新冠肺炎诊疗方案》)。本发明人意 外发现，虽然唾液样本不适合进行核酸检测，但是在唾液样本中居然在非常早 期(感染第3天即可检测)就存在一定量的SARS-Cov-2抗原(N蛋白和S蛋白)， 因此可通过高特异性的抗体进行SARS-Cov-2病毒的免疫检测，从而实现 SARS-Cov-2病毒的早期筛查(感染第3天即可检测)，远远早于和优于新型冠状 病毒特异性IgM抗体、IgG抗体的检测(通常在发病1周后才可检测到)。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如J.E.科利根等人《精编免疫学实验指南》中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按 重量计算。
实施例1重组新冠病毒N/S蛋白的表达
1.1、表达质粒的构建
PCR：设计引物，利用阳性血清为样本，PCR扩增获得N/S蛋白的基因序列 片段。
连接：将目的片段:载体片段＝3:1的方式连接，载体是PET-28a(+)，加 入连接酶和缓冲液。16℃或23℃(根据说明书)连接1h后转染合适的目的菌 株(DH5α)
转菌：转菌涂平板，通过菌落PCR鉴定片段的存在
菌种保存：挑取阳性菌落在合适的抗性LB培养基中37℃，200rpm过夜 培养抽取0.5mL的过夜培养物和等体积的50％灭菌甘油混匀，保存于-80℃并做 好标记。
1.2、重组蛋白的表达和纯化
挑取含有N/S蛋白表达质粒pET-28a的BL21菌株，接种入含有50μg/mL 卡那霉素的LB培养基100mL中，震荡培养过夜。
取出2mL空白LB培养基作为背景，在600nm波长下作为空白调零设置分 光光度计。将过夜培养物倒入四瓶500mL的LB培养基100mL中，每一瓶加入 50mg/mL卡那霉素，将两瓶500mL加入卡那霉素和过夜培养物的培养基合并为 一瓶，倒入时摇晃混匀后分装回两瓶500mL的状态，确保两瓶间的均一性。对 另外两瓶同样操作。
震荡培养2-3h，测定OD值(600nm)，按照每500mL加入12.5mL过滤除菌 的IPTG，每两瓶合并到一瓶后，倒入过滤除菌的100mM的IPTG混匀后，分装 回两瓶500mL的状态，确保两瓶间的均一性。对另外两瓶同样操作。
N蛋白诱导表达后，离心收集菌体。取菌体加200ml破碎缓冲液(pH7.4的 50mM磷酸缓冲液)在冰上混合，冰浴超声破碎2h。离心，收集上清。
过镍柱，用咪唑洗脱纯化蛋白，收集洗脱液。
1.3、重组蛋白的鉴定
洗脱液采用SDS-PAGE的方法鉴定纯度＞95％。
实施例2 Balb/C小鼠免疫操作
2.1、乳化每次免疫前用PBS将N/S(即N或S)蛋白重组抗原配制成 1mg/ml的溶液，然后将N/S蛋白重组抗原溶液与弗氏佐剂(弗氏完全佐剂或弗 氏不完全佐剂)等体积混合，用高速震荡器震荡形成均匀乳浊液，将此乳浊液 用于动物的免疫。
2.2、免疫取4-6周龄的健康Balb/C小鼠10只，在第0天，每只皮下 多点注射完全弗氏佐剂乳化抗原100μL。第14天，再对每只小鼠皮下多点注 射不完全弗氏佐剂乳化抗原100μL。第21天，以摘小鼠眼球法采血，用ELISA 方法检测血清中抗体效价(滴度)。第28天，再次皮下多点注射不完全弗氏佐 剂乳化抗原100μl。在细胞融合反应前3天，用100μg/100μl抗原生理盐水 腹腔注射加强免疫。
实施例3 N/S蛋白重组抗原免疫小鼠抗血清效价(滴度)测定
取实施例1中经过3次免疫的小鼠，用N/S蛋白重组抗原包被的酶联板测 定抗血清的滴度。将包被抗原以10μg/ml稀释于pH 9.6的0.05M碳酸盐缓冲 液中，100μl/孔加入到96孔酶标板于4℃过夜。弃去包被液后用1％明胶/PBS 在37℃下封闭2小时，然后用PBS-Tween-20洗液洗板3遍，再加入稀释后的 氯胺酮抗血清，置于37℃孵育1小时。用PBS-Tween-20洗液洗板3遍，加入 1:2000的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多抗，37℃孵育1小时后用 PBS-Tween-20洗液洗板3遍，加TMB/H2O2底物进行显色10min，并用终止液 (0.1N硫酸)终止显色。
在450nm光波长下测定吸收值(OD)，与空白对照孔的OD均值比较，采用 计量资料的t检验，取P＜0.05的最低稀释度作为此抗体的效价。经比色测定， 所得N蛋白抗血清的效价为1:6400,S蛋白抗血清的效价为1:12800。
实施例4细胞融合及克隆化
按《精编免疫学实验指南》描述的方法进行细胞融合和克隆化操作。
在12天间，就可以观察到杂交细胞的克隆。当克隆直径长到约1mm时， 用N蛋白重组抗原包被的酶联板来筛选出抗N蛋白的杂交瘤细胞。筛选到的阳 性克隆用有限稀释法进行克隆化，以N蛋白重组抗原包被的ELISA法酶标板来 筛选抗N/S蛋白的特异性杂交瘤细胞。经五次克隆后，得到多株能分泌专一性 抗体的抗N/S蛋白单克隆细胞。
实施例5 N/S蛋白单抗的大规模制备
5.1、腹水制备第0天取24周龄的健康Balb/C小鼠10只，腹腔注射石 蜡油0.3mL/只；培养实施例2制备的单克隆细胞株，第7天取106-107个杂交 瘤细胞接种到小鼠腹腔内。第17天见腹部明显胀大，抽取腹水离心，加入0.02wt％的叠氮钠，于4℃冰箱内保存。
5.2、抗体的纯化(辛酸-硫铵法)
5.2.1取腹水10ml，离心取上清，向上清中加入三倍体积的pH5.0的0.06 M的醋酸钠缓冲液，而后用1M的HCl调pH4.2-4.8。
5.2.2以每ml腹水加入33μL正辛酸，滴加完后继续搅拌30min，4℃静置 1.5h。
5.2.3 4℃离心(10000r/min，30min)，收集上清夜，弃去沉淀。
5.2.4向上清中加入1/10体积的0.1M的PBS，用1M的NaOH调pH至7.4， 在4℃下缓慢加入(NH4)2SO4至终浓度0.277g/ml(边加边搅拌，30min内加完)； 4℃静置过夜；
5.2.5 4℃离心弃上清液。收集沉淀，沉淀用0.01M的PBS溶解；每6h更 换透析液，4℃透析3天。
5.2.6用紫外吸收法测定280nm下的蛋白浓度。制得S1/S2、N1/N2抗体 各约20mg。
实施例6
唾液Sars-Cov-2抗原检测试剂条的制备
6.1纳米碳标记物的制备
纳米碳分散：取100μL 100nm的纳米碳微球(Special Black4(SB4)购自 DegussaAG公司)，加到900μL 5mM Borax(pH8.5)中，超声3次打碎。
标记抗体：加入100ug抗体，摇床混匀1h。
封闭：加入100μL 10％的BSA，混匀1h。
洗涤：14000rmp离心5min，0.1M Borax(pH8.5)洗4次。
收集标记好的纳米碳：250μL0.1M Borax(pH8.5，含1％BSA，0.02％NaN3) 重悬沉淀，4℃保存备用。
6.2结合垫的制备
将标记好的纳米碳超声5次，混匀，取37.5μL加入到600μL微球稀释 液中。冰浴，200W超声9min。超声后，将混合物加入到900μL微球稀释液 中混匀。
取一块洁净的玻璃板，将裁好的玻纤KB50(3CM*20CM)放置在玻璃板 上，将超声稀释后的纳米碳标记物均匀的涂在KB50上。分别形成纳米碳标记 的N蛋白抗体结合垫，纳米碳标记的S蛋白抗体结合垫。
37℃烘干过夜，保存在铝箔袋中。
6.3硝酸纤维素膜的包被
将分别针对N、S抗原的特异性抗体划在不同的硝酸纤维素膜上作为T线， 同时将羊抗鼠多克隆抗体作为C线划在硝酸纤维素膜上，利用点膜仪进行硝酸 纤维素膜的包被，37℃干燥过夜。
6.4样品垫的制备
本实验选择8964玻璃纤维作为样品垫，将样品垫浸没在样品垫缓冲液中， 37℃干燥过夜，待用。
6.5免疫试纸条的组装
首先将包被有N蛋白抗体和S蛋白抗体的硝酸纤维素膜分别黏连在背衬光 片材上，硝酸纤维素膜一端黏连相应的结合垫和样品垫，一端黏连吸水垫。相 邻各个组分之间覆盖重叠1mm左右，然后用切条机将试纸条切下，将切好的N 蛋白试剂条和S蛋白试剂条，以及吸液棒装入塑料外壳中，插上盖子装入铝箔 袋密封保存。
本实施例所得试剂条如图1所示，判读方法如图2，当N蛋白和S蛋白的 检测窗C线显色且任一T线显色时，结果判定为阳性；当C线显色而T线都不 显色时，结果判定为阴性；当C线不显色时，说明所述试剂条无效或失效。
实施例7特异性分析
使用本发明的试剂条检测下列物质的样本。
Figure BDA0002642762890000141
Figure BDA0002642762890000151
结果显示不发生交叉反应，说明本发明的试剂条具有非常高的特异性。
实施例8唾液Sars-Cov-2抗原检测实施例
在本实施例中，采用本发明的唾液快速检测试剂条对88例鼻咽拭子PCR 阳性病例的舌下唾液样本进行检测。
检测过程如下：
1、取出本发明的检测试剂条，拔下盖子，将试剂条海绵头放入被测人员 舌下；
2、至检测窗口出现液体时取出检测条，平放于桌面上；
3、15min后观察结果，结果判定如下：
表1本发明的检测条与PCR检测结果：
Figure BDA0002642762890000152
检测结果如表1，符合率92.5％，说明本发明的试剂条检出率高。
综上可知，Sars-Cov-2为呼吸道传染疾病，通常采样为血液样本或鼻咽拭 子，但本发明人令人惊讶地发现，在非常早期，唾液样本中就存在一定量N蛋 白和S蛋白，因此非常适合用于Sars-Cov-2的早期免疫检测。在此基础上开 发的本发明的试剂条具有检测灵敏度高，准确性好，操作简单，成本低廉，可 目视读卡等优点，非常适合家庭使用，现场检测。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种SARS-Cov-2病毒的检测试剂条，其特征在于，所述试剂条包括：
一基板，以及设置在所述基板上且从近端至远端依次排布的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
吸液棒所述硝酸纤维素膜设置有N蛋白检测线、S蛋白检测线和质控线；
所述N蛋白检测线包被有第一N蛋白单克隆抗体；且
所述S蛋白检测线包被有第一S蛋白单克隆抗体；
所述结合垫固定有纳米碳标记的第二N蛋白单克隆抗体和纳米碳标记的第二S蛋白单克隆抗体，
其中第一N蛋白单克隆抗体、N蛋白和纳米碳标记的第二N蛋白单克隆抗体可形成“第一N蛋白单克隆抗体-N蛋白-纳米碳标记的第二N蛋白单克隆抗体”三元复合物；
而第一S蛋白单克隆抗体、S蛋白和纳米碳标记的第二S蛋白单克隆抗体可形成“第一S蛋白单克隆抗体-S蛋白-纳米碳标记的第二S蛋白单克隆抗体”三元复合物。
2.如权利要求1所述的试剂条，其特征在于，所述的检测试剂条还包括一吸液棒，所述吸液棒设置在样品垫外侧并与所述样品垫接触。
3.如权利要求1所述的试剂条，其特征在于，较佳地为体液样品或血液样品，更佳地为唾液或尿样样本，最佳的为唾液样本。
4.如权利要求1所述的试剂条，其特征在于，所述N蛋白检测线和S蛋白检测线垂直于层析方向并列设置或平行设置，较佳地，并列设置。
5.如权利要求1所述的试剂条，其特征在于，所述结合垫包括分隔且并排设置的第一结合垫和第二结合垫，且所述硝酸纤维素膜包括分隔且并排设置的第一硝酸纤维素膜和第二硝酸纤维素膜，
其中，所述第一结合垫与第一硝酸纤维素膜搭接，所述第二结合垫与第二硝酸纤维素膜搭接，
所述第一结合垫固定有纳米碳标记的第二N蛋白单克隆抗体，所述第一硝酸纤维素膜包被有第一N蛋白单克隆抗体；且
所述第二结合垫固定有纳米碳标记的第二S蛋白单克隆抗体，所述第二硝酸纤维素膜包被有第一S蛋白单克隆抗体。
6.如权利要求1所述的试剂条，其特征在于，所述试剂条包括一壳体，所述吸液棒一端伸出所述壳体，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫位于所述壳体内，且所述壳体在硝酸纤维素膜处具有可视窗。
7.如权利要求6所述的试剂条，其特征在于，所述壳体还包括可拔插的吸液棒保护盖。
8.如权利要求1所述的试剂条，其特征在于，所述纳米碳的平均粒径为50-200nm，较佳地，80-150nm。
9.一种SARS-Cov-2病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一容器，以及位于所述容器内的如权利要求1所述的试剂条。
10.一种检测生物样本中是否存在SARS-Cov-2病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供如权利要求1所述的试剂条或如权利要求9所述的试剂盒；和
(2)将所述试剂条与所述生物样本接触，层析并读取显色情况。
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