WO2021117862A1 - 免疫測定方法及び免疫測定器具 - Google Patents

免疫測定方法及び免疫測定器具 Download PDF

Info

Publication number
WO2021117862A1
WO2021117862A1 PCT/JP2020/046257 JP2020046257W WO2021117862A1 WO 2021117862 A1 WO2021117862 A1 WO 2021117862A1 JP 2020046257 W JP2020046257 W JP 2020046257W WO 2021117862 A1 WO2021117862 A1 WO 2021117862A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
antigen
binding fragment
virus
protein
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/046257
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
三和 桑原
Original Assignee
デンカ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by デンカ株式会社 filed Critical デンカ株式会社
Priority to EP20900363.1A priority Critical patent/EP4075132A4/en
Priority to US17/784,417 priority patent/US20230003724A1/en
Priority to CN202080085881.5A priority patent/CN114829935A/zh
Publication of WO2021117862A1 publication Critical patent/WO2021117862A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • G01N2333/135—Respiratory syncytial virus

Definitions

  • the present invention relates to an immunoassay method and an immunoassay instrument.
  • test reagents using various antibodies are on the market.
  • the sensitivity was not sufficient (Patent Document 1).
  • an object of the present invention is to provide a highly sensitive immunoassay method and a test reagent using the same.
  • the present inventors have found that the detection sensitivity can be improved by adding disaccharides and sugar alcohols when immobilizing an antigen, an antibody or an antigen-binding fragment thereof, and completed the present invention.
  • the present invention is as follows. [1] In a method for detecting an object to be measured by an immunoassay method using a carrier on which an antigen, antibody or antigen-binding fragment thereof is immobilized, disaccharides and sugar alcohols are added to a solution containing the antigen, antibody or antigen-binding fragment thereof. An immunoassay method for detecting an object to be measured by increasing the detection sensitivity by using a carrier on which an antigen, an antibody or an antigen-binding fragment thereof is immobilized by adding an antigen, an antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • [2] Add 1 to 4% (w / v) of disaccharides and 0.5 to 4% (w / v) of sugar alcohols to a solution containing an antigen, antibody or antigen-binding fragment thereof to obtain an antigen, antibody or The method of [1] in which the antigen-binding fragment is immobilized on a carrier. [3] The method of [1] or [2], wherein the disaccharide is trehalose or maltose. [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the sugar alcohol is mannitol or sorbitol. [5] The method according to any one of [1] to [4], which is an immunochromatography method.
  • Detection reagent [8] The reagent for detection according to [7], wherein the disaccharide is trehalose or maltose.
  • An antigen, an antibody or an antigen, an antibody or a solution containing an antigen, an antibody or an antigen-binding fragment thereof is added with 1 to 4% (w / v) of disaccharides and 0.5 to 4% (w / v) of sugar alcohols.
  • the detection reagent is an immunochromatographic reagent.
  • the method for producing any of [12] to [16], wherein the antibody or an antigen-binding fragment thereof is an anti-RS virus N protein antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the method of the present invention uses a carrier in which an antigen, an antibody or an antigen-binding fragment thereof is immobilized by adding disaccharides and sugar alcohols to a solution containing an antigen, an antibody or an antigen-binding fragment thereof for immunoassay. High sensitivity.
  • the present invention also provides an immunoassay device used in the novel detection method of the present invention.
  • the present invention is an immunoassay method for detecting a measurement target.
  • An antigen, an antibody or an antigen-binding fragment thereof is immobilized on a carrier, the protein to be measured is captured by the immobilized carrier, and the captured protein to be measured is captured. To detect.
  • the measurement targets detected by the method of the present invention are viral antigens such as influenza virus antigen, adenovirus antigen, RS virus antigen, HA antigen, HBc antigen, HCV antigen, HIV antigen, EBV antigen, NLV antigen, Chlamydia trachomatis.
  • viral antigens such as influenza virus antigen, adenovirus antigen, RS virus antigen, HA antigen, HBc antigen, HCV antigen, HIV antigen, EBV antigen, NLV antigen, Chlamydia trachomatis.
  • Antibodies lytic bacterium antigens, pertussis bacterium antigens, helicobacter pylori antigens, leptspira antigens, treponema paridum antigens, toxoplasma gondii antigens, boleria antibodies, charcoal bacillus antigens, MRSA antibodies and other bacterial antigens, mycoplasma lipid antigens, human fibrous gonadotropin, etc.
  • Peptide hormones such as steroid hormones, physiologically active amines such as epinephrine and morphine, vitamins such as vitamin B, antibiotics such as prostaglandins and tetracyclines, toxins produced by bacteria, various tumor markers, Pesticides, anti-E.
  • coli antibody anti-salmonella antibody, anti-dextrose antibody, anti-campylobacter antibody, anti-Welsh antibody, anti-enteritis vibrio antibody, anti-velotoxin antibody, anti-human transferase antibody, anti-human albumin antibody, anti-human immunoglobulin antibody, Anti-microglobulin antibody, anti-CRP antibody, anti-troponin antibody, anti-HCG antibody, anti-Chlamydia trachomatis antibody, anti-streptidine O antibody, anti-helicobacter pyrroli antibody, anti- ⁇ -glucan antibody, anti-HBe antibody, anti-HBs antibody, Anti-adenovirus antibody, anti-HIV antibody, anti-rotavirus antibody, anti-influenza virus antibody, anti-parvovirus antibody, anti-RS virus antibody, anti-RF antibody, nucleotides complementary to nucleic acid components derived from pathogenic microorganisms, etc. Yes, but not limited to these.
  • the measurement target is an RS virus.
  • the measurement target is, for example, RS virus
  • an anti-RS virus antibody is used as the antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the anti-RS virus antibody is an antibody that specifically recognizes RS virus, and specifically, specifically recognizes and binds to a protein of RS virus as an antigen.
  • RS virus protein examples include F protein and N protein related to cell fusion.
  • N protein also called nucleoprotein, consists of 391 amino acid residues.
  • the N protein is a component of the ribonucleoprotein complex called nucleocapsid, and forms a helical structure surrounding the genomic RNA of respiratory syncytial virus.
  • an antibody against the anti-RS virus antibody N protein is used.
  • the present invention can improve the detection sensitivity of RS virus by adding disaccharides and sugar alcohols when immobilizing the anti-RS virus antibody on the carrier.
  • disaccharide examples include trehalose and maltose.
  • sugar alcohols examples include mannitol and sorbitol.
  • Disaccharides and sugar alcohols may be added to the anti-RS virus antibody solution used for immobilization.
  • the anti-RS virus antibody solution is prepared by dissolving the antibody in a buffer solution such as phosphate buffer solution or phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the antibody concentration at this time is several tens of pg / mL to several g / mL.
  • the concentration of the disaccharide is 0.5 to 10% (w / v), preferably 1 to 5% (w / v), more preferably 1 to 4% (w / v), and particularly preferably 1 to 3% (w). / v).
  • the concentration of sugar alcohol is 0.2 to 10% (w / v), preferably 0.5 to 5% (w / v), more preferably 0.5 to 4% (w / v), and particularly preferably 0.5 to 3% (w). / v).
  • These solutions may be applied to the carrier, for example, on a line and dried.
  • the detection sensitivity of RS virus antigen is 1.5 times or more, preferably 1.75 times or more, more preferably, as compared with the case where disaccharides and sugar alcohols are not added. Rise more than twice.
  • an antigen-binding fragment obtained by separating only an antigen-binding site based on an anti-RS virus antibody can also be used in the method of the present invention. That is, fragments having specific antigen-binding properties such as Fab, Fab', F (ab') 2, single-chain antibody (scFv), dsFv, diabody, and minibody produced by a known method (antigen-binding property). Fragments) are also included in the monoclonal antibody and are included in the scope of the present invention. Further, the class of the monoclonal antibody is not limited to IgG, and may be IgM or IgY.
  • the monoclonal antibody used in the method of the present invention uses a known immunological method to immunize an immunized animal with a complex or extract containing the antigen of interest, or an antigen or a partial peptide thereof, and cells of the immunized animal. It can be obtained by producing a hybridoma using.
  • the length of the peptide used for immunization is not particularly limited, but a peptide having 5 amino acids or more, more preferably 10 amino acids or more can be used as an immunogen.
  • the immunogen can be obtained from the culture medium, but it can also be obtained by incorporating a DNA encoding an arbitrary antigen into a plasmid vector and introducing the DNA into a host cell for expression.
  • any antigen or partial peptide thereof as an immunogen can be expressed as a fusion protein with a protein as exemplified below, and can be used as an immunogen after purification or as it is unpurified.
  • Glutathione S-transferase GST
  • MBP maltose-binding protein
  • TRX thioredoxin
  • Nus tag, S tag, HSV which are commonly used by those skilled in the art as "protein expression / purification tags" for the preparation of fusion proteins.
  • Tags, FRAG tags, polyhistidine tags, etc. can be used. It is preferable that the fusion protein with these is used as an immunogen after cleaving an arbitrary antigen or a partial peptide portion thereof and a tag portion other than the tag portion using a digestive enzyme, separating and purifying the protein.
  • a known immunoglobulin purification method can be used to purify the monoclonal antibody from ascites or culture supernatant.
  • a fractionation method by salting out using ammonium sulfate or sodium sulfate, a PEG fractionation method, an ethanol fractionation method, a DEAE ion exchange chromatography method, a gel filtration method and the like can be mentioned.
  • It can also be purified by an affinity chromatography method using a carrier to which any of protein A, protein G, and protein L is bound, depending on the immune animal species and the class of the monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof prepared as described above hereinafter, "antibody” unless it is clear from the context in the description prior to Examples. Means “antibody or antigen-binding fragment thereof" and is measured by immunoassay using an antigen-antibody reaction with an antigen in a sample.
  • immunoassay method any method well known to those skilled in the art can be used, such as a competitive method, an agglutination method, a Western blotting method, an immunostaining method, and a sandwich method.
  • “measurement” includes any of quantitative, semi-quantitative, and detection.
  • the sandwich method is preferable for immunoassay.
  • a complex is formed by sandwiching an antigen between two antibodies, and the complex is detected.
  • the sandwich method itself is well known in the field of immunoassay and can be performed, for example, by immunochromatography or ELISA. All of these sandwich methods themselves are well known, and the method of the present invention can be carried out by a well-known sandwich method except that a monoclonal antibody that recognizes the above-mentioned N protein as an antigen is used.
  • one type or two or more types of antibodies that recognize antigens are used.
  • antibodies immobilized on a solid phase and labeled antibodies are used.
  • at least one of these two types of antibodies is a monoclonal antibody that recognizes the above-mentioned N protein as an antigen.
  • the same two antibodies may sandwich the antigen to form a complex.
  • any solid phase in which the antibody can be immobilized by a known technique can be used as the solid phase on which the antibody is immobilized.
  • a porous thin film (membrane) having a capillary action. Particulate matter, test tube, resin flat plate and other known substances can be arbitrarily selected.
  • an enzyme, a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, colored particles, colloidal particles and the like can be used.
  • the immunochromatography method which is a lateral flow type immunoassay method using a membrane, is particularly preferable from the viewpoint of simplicity and speed of clinical examination.
  • the present inventors perform immunoassay in a lateral flow manner capable of improving the detection sensitivity of RS virus by adding disaccharides and sugar alcohols when immobilizing the anti-RS virus antibody. It also provides an immunoassay capable of.
  • the immunoassay device provided by the present invention includes a carrier having a detection region in which an antibody (antibody 1) that captures an object to be measured (antigen) is immobilized, a labeled region having a movable labeled antibody (antibody 2), and the like.
  • the sample pad for dropping a sample, an absorption band for absorbing the developed sample solution, and a backing sheet for bonding these members together, and at least one of antibody 1 and antibody 2 antigens the N protein of the present invention.
  • It is an immunoassay device that is a monoclonal antibody recognized as.
  • the immunoassay device is also called an immunochromatographic test piece.
  • the carrier is a material having the ability to immobilize an antibody for capturing a substance to be detected (antigen), and has the ability not to prevent the liquid from passing in the horizontal direction.
  • it is a porous thin film having a capillary action, and is a material capable of transporting a liquid and components dispersed therein by absorption.
  • the material forming the carrier is not particularly limited, and examples thereof include cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, polyvinylidene fluoride (PVDF), glass fiber, nylon, and polyketone. Of these, those made into a thin film using nitrocellulose are more preferable.
  • the membrane on which the antibody is immobilized is called an antibody-immobilized membrane.
  • the labeled body region is made of a porous base material containing a labeled antibody, and the material of the base material can be glass fiber, non-woven fabric, or the like which are generally used.
  • the base material is preferably in the form of a pad having a thickness of about 0.3 mm to 0.6 mm in order to impregnate a large amount of labeled antibody.
  • a porous substrate impregnated with a labeled antibody and dried is also called a drying pad.
  • Enzymes such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase, metal colloids such as colloidal gold, silica particles, cellulose particles, colored polystyrene particles, colored latex particles, etc. are often used for labeling of labeled antibodies.
  • metal colloids such as colloidal gold, silica particles, cellulose particles, colored polystyrene particles, colored latex particles, etc.
  • coloring occurs due to the aggregation of these labeling reagents, and this coloring is measured.
  • Particles on which an antibody is immobilized are called antibody-immobilized particles.
  • the amount of the antibody immobilized is not particularly limited, but it may be several ng to several tens of ⁇ g in the labeled region.
  • the detection region refers to a part of the carrier on which the antibody that captures the substance to be detected (antigen) is immobilized.
  • the detection region is provided with at least one region in which an antibody for capturing an antigen is immobilized.
  • the detection region may be contained in the carrier, and the antibody may be immobilized on the carrier.
  • disaccharides and sugar alcohols are added to the anti-RS virus antibody solution.
  • the amount of antibody immobilized is not particularly limited, but may be immobilized in the detection region from several ng to several tens of ⁇ g.
  • the detection region of the present invention contains disaccharides and sugar alcohols in a detectable manner.
  • the sample pad is a part for dropping a sample and is a porous material.
  • the sample pad is the most upstream part of the immunoassay.
  • filter paper, glass fiber, non-woven fabric and the like can be used as the material.
  • it is preferably in the form of a pad having a thickness of about 0.3 mm to 1 mm.
  • the sample also includes a sample prepared by using the sample, such as a sample obtained by suspending the sample in another solution.
  • the absorption band is a member for absorbing components supplied to the carrier and not involved in the reaction in the detection region.
  • a filter paper having high water retention, a sponge or the like made of a general natural polymer compound, a synthetic polymer compound or the like can be used, but a material having high water absorption is preferable in order to promote the development of the sample. ..
  • the backing sheet is a member for attaching and fixing all the above-mentioned materials, that is, the carrier, the sample pad, the labeling body region, the absorption band, etc. with partial overlap.
  • the backing sheet is not always necessary as long as these materials are arranged and fixed at the optimum intervals, but it is generally preferable to use the backing sheet from the viewpoint of convenience in manufacturing or use.
  • the immunoassay device of the present invention may further have a control display region (member).
  • the control display area is the site that indicates that the test was performed accurately.
  • the control display region exists downstream of the detection region, and when the sample sample passes through the detection region and reaches the control display region, a signal is emitted by coloring or the like.
  • a substance that binds to the antibody to which the labeled carrier is bound may be immobilized, or a reagent such as a pH indicator that changes color when the sample arrives may be immobilized. May be good.
  • the antibody to which the labeled carrier is bound is a mouse monoclonal antibody, an anti-mouse IgG antibody may be used.
  • the size of the immunoassay device is not limited, but for example, it is about several cm to a dozen cm in length and several mm to several cm in width.
  • the immunoassay device of the present invention may be housed in a containment vessel, which can prevent deterioration due to, for example, ultraviolet rays or moisture in the air.
  • the containment vessel can prevent the tester performing the assay from being contaminated or infected.
  • a resin case of an appropriate size may be used as a containment vessel, and the device of the present invention may be stored in the case.
  • the containment vessel and the immunoassay device contained therein may be collectively referred to as an immunoassay device.
  • the RS virus detection reagent containing the anti-RS virus N protein monoclonal antibody of the present invention includes the immunoassay instrument.
  • the RS virus detection kit containing the anti-RS virus N protein monoclonal antibody of the present invention includes the immunoassay device.
  • the kit may also include a blower, a sample collection device, and the like.
  • antibody 2 that can bind to a substance to be detected (labeling reagent) labeled with an appropriate labeling substance such as colored polystyrene particles or colloidal gold by utilizing the capillary phenomenon on a solid phase carrier on which antibody 1 is immobilized.
  • an appropriate labeling substance such as colored polystyrene particles or colloidal gold
  • the complex of the substance to be detected is expanded and moved.
  • a complex of the immobilized substance-substance to be detected-labeling reagent is formed on the solid phase carrier, and the signal of the labeling reagent emitted from the complex (in the case of gold colloid, a substance that can bind to the substance to be detected).
  • the substance to be detected can be detected by detecting (the solid phase carrier portion on which the substance is immobilized turns red).
  • the immunoassay method can be carried out at 5 to 35 ° C., preferably room temperature.
  • the method of the present invention it is possible to detect whether or not the patient is infected with the RS virus, and when the N protein is detected in the sample sample, it can be determined that the sample is infected with the RS virus.
  • the RS virus can be specifically recognized, and the antibody that recognizes the N protein includes other viruses such as adenovirus, Coxsackievirus, and the like. Echovirus, Herpes simplex virus, Human Metapneumovirus, Influenzavirus, Measlesvirus, Mumpsvirus, Parainfluenza virus (Mumpsvirus) Parainfluenzavirus) is not recognized, and these viruses are not falsely detected.
  • Echovirus Herpes simplex virus, Human Metapneumovirus, Influenzavirus, Measlesvirus, Mumpsvirus, Parainfluenza virus (Mumpsvirus) Parainfluenzavirus
  • a pharyngeal or nasal swab As the sample to be sample, a pharyngeal or nasal swab, a pharyngeal or nasal cavity lavage fluid, a nasal aspirate, saliva, serum, rectal wipe, stool, stool suspension, urine, corneal wipe, etc. may be used.
  • Example 1 Preparation of anti-RS virus N protein monoclonal antibody 1.
  • Preparation of RS virus N protein antigen RS virus was infected with susceptible mammalian cells, cultured for several days, and then the culture solution of RS virus-infected cells was inactivated by ultraviolet irradiation.
  • anti-N protein antibodies The acquired cell line was intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected. From the obtained ascites, IgG was purified by an affinity chromatography method using a protein A column to obtain a plurality of purified anti-RS virus N protein monoclonal antibodies (hereinafter, may be referred to as "anti-N protein antibodies").
  • Example 2 Immunoassay device for measuring RS virus 1. Immobilization of anti-RS virus N protein antibody on nitrocellulose membrane A solution obtained by diluting the anti-N protein antibody prepared in Example 1 with a buffer solution and an anti-mouse IgG antibody were prepared, and the nitrocellulose membrane lined with a PET film was prepared. An anti-N protein antibody was linearly applied to the sample pad side, and an anti-mouse IgG antibody was linearly applied to the absorber side. Then, the nitrocellulose membrane was sufficiently dried under warm air to obtain an anti-N protein antibody-immobilized membrane.
  • anti-RS virus N protein antibody on colored polystyrene particles
  • the anti-N protein antibody prepared in Example 1 was covalently bound to colored polystyrene particles, suspended in a suspension, and sufficiently dispersed by ultrasonic treatment. N-protein antibody-bound colored polystyrene particles were obtained. In the present specification, they are referred to as anti-N protein antibody-immobilized particles.
  • a predetermined amount of the antibody-immobilized particles prepared in step 2 was applied to a glass fiber non-woven fabric and sufficiently dried by warm airing. In the present specification, it is referred to as a marker pad.
  • RS virus test device The antibody-immobilized membrane prepared in 1 and the labeled pad prepared in 2 and 3 are bonded to other members (backing sheet, absorption band, sample pad) and cut into a width of 5 mm for RS virus test. It was a device.
  • the RS virus test device prepared in 4 contains a sample suspension containing a virus that causes respiratory infection (10 mM Tris (pH 8.0), 1% (w / v)). 50 ⁇ L of polyoxyethylene octylphenyl ether, 3% (w / v) arginine, 3% (w / v) BSA) was added, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes.
  • the immunoassay device using the anti-RS virus N protein antibody of the present invention reacts with RS virus but does not show cross-reactivity with other causative viruses of respiratory infections. From this, it was confirmed that it reacts specifically with the RS virus.
  • Example 3 High-sensitivity RS virus test device using anti-RS virus N protein monoclonal antibody
  • the anti-RS virus F protein monoclonal antibody anti-F protein antibody
  • Example 2 1. Preparation of Sensitive Anti-N Protein Antibody Immobilized Membrane
  • 2% (w / v) of trehalose was added as a disaccharide to the buffer solution for immobilizing the anti-N protein antibody, and 1.0 to 2.0% (w / v) of mannitol was further added to the nitro. After linearly applying to the cellulose membrane, the nitrocellulose membrane was sufficiently dried under warm air to obtain a highly sensitive anti-N protein antibody-immobilized membrane.
  • Example 2 4. Using a highly sensitive anti-N protein antibody-immobilized membrane.
  • the RS virus test device was prepared by the method described in the above, and a 2-fold serial dilution solution of the RS virus antigen was used in Example 2 5.
  • the results of the test according to the method described in Table 2 are shown in Table 2.
  • the color development can be visually confirmed at the application positions of both the anti-mouse IgG antibody and the anti-N protein antibody, it is judged as +. If the color development can be visually confirmed only at the application position of the anti-mouse IgG antibody and the color development cannot be visually confirmed at the application position of the anti-N protein antibody, it is judged as-. If the color development cannot be visually confirmed at the application position of the anti-mouse IgG antibody, it is judged to be invalid.
  • the antibody of the present invention can be used to specifically detect respiratory syncytial virus infection with high sensitivity. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

感度の高い抗体、及びそれを用いた検査試薬の提供。　抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化した担体を用いる免疫測定方法により測定対象を検出する方法において、抗原、抗体又はその抗原結合性断片を含む溶液に二糖類及び糖アルコール類を添加して抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化した担体を用いることにより検出感度を上昇させて、測定対象を検出する免疫測定方法。

Description

免疫測定方法及び免疫測定器具
　本発明は、免疫測定方法及び免疫測定器具に関する。
　現在、各種抗体を用いた検査試薬が販売されている。しかしながら、例えば従来のＲＳウイルス検査試薬でＲＳウイルスの検出を行った場合、感度が充分ではなかった（特許文献１）。
特許第6454274号明細書
　上記の現状に鑑み、本発明は、感度の高い免疫測定方法、及びそれを用いた検査試薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは、抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化する際に、二糖類及び糖アルコール類を添加することにより、検出感度を向上させ得ることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化した担体を用いる免疫測定方法により測定対象を検出する方法において、抗原、抗体又はその抗原結合性断片を含む溶液に二糖類及び糖アルコール類を添加して抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化した担体を用いることにより検出感度を上昇させて、測定対象を検出する免疫測定方法。
[２]　 抗原、抗体又はその抗原結合性断片を含む溶液に１～４％(w/v)の二糖類及び0.5～４％（w/v)の糖アルコール類を添加して抗原、抗体又はその抗原結合性断片を担体に固定化する[１]の方法。
[３]　二糖類がトレハロース又はマルトースである、[１]又は[２]の方法。
[４]　糖アルコール類がマンニトール又はソルビトールである、[１]～[３]のいずれかの方法。
[５]　イムノクロマト法である、[１]～[４]のいずれかの方法。
[６]　抗体又はその抗原結合性断片が、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体又はその抗原結合性断片である、[１]～[５]のいずれかの方法。
[７]　抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化した検出用試薬であって、抗原、抗体又はその抗原結合性断片を含む検出領域に二糖類及び糖アルコール類を含む、検出感度が上昇した検出用試薬。
[８]　二糖類がトレハロース又はマルトースである、[７]の検出用試薬。
[９]　糖アルコール類がマンニトール又はソルビトールである、[７]又は[８]の検出用試薬。
[１０]　イムノクロマト法試薬である、[７]～[９]のいずれかの検出用試薬。
[１１]　抗体又はその抗原結合性断片が、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体又はその抗原結合性断片である、[７]～[１０]のいずれかの検出用試薬。
[１２]　検出感度が上昇した、抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化した検出用試薬の製造方法であって、抗原、抗体又はその抗原結合性断片を含む溶液に二糖類及び糖アルコール類を添加して抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化する製造方法。
[１３]　抗原、抗体又はその抗原結合性断片を含む溶液に１～４％(w/v)の二糖類及び0.5～４％（w/v)の糖アルコール類を添加して抗原、抗体又はその抗原結合性断片を担体に固定化する[１２]の製造方法。
[１４]　二糖類がトレハロース又はマルトースである、[１２]又は[１３]の製造方法。
[１５]　糖アルコール類がマンニトール又はソルビトールである、[１２]～[１４]のいずれかの製造方法。
[１６]　 検出用試薬がイムノクロマト法試薬である、[１２]～[１５]のいずれかの製造方法。
[１７]　抗体又はその抗原結合性断片が、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体又はその抗原結合性断片である、[１２]～[１６]のいずれかの製造方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-224865号の開示内容を包含する。
　本発明の方法は、免疫測定に抗原、抗体又はその抗原結合性断片を含んだ溶液に二糖類及び糖アルコール類を添加して抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化した担体を用いるので感度が高い。また、本発明により、本発明の新規な検出方法に用いる免疫測定器具が提供される。 
　本発明は測定対象を検出する免疫測定方法であり、担体に抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化し、固定化した担体で測定対象の蛋白質を捕捉し、捕捉された測定対象の蛋白質を検出する。
　本発明の方法により検出される測定対象は、インフルエンザウイルス抗原、アデノウイルス抗原、ＲＳウイルス抗原、ＨＡ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原、ＥＢＶ抗原、ＮＬＶ抗原等のウイルス抗原、クラミジア・トラコマティス抗原、溶連菌抗原、百日咳菌抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗原、レプトスピラ抗原、トレポネーマ・パリダム抗原、トキソプラズマ・ゴンディ抗原、ボレリア抗原、炭疽菌抗原、MRSA抗原等の細菌抗原、マイコプラズマ脂質抗原、ヒト繊毛性ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミンＢ類等のビタミン類、プロスタグランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、細菌等が産生する毒素、各種腫瘍マーカー、農薬、抗大腸菌抗体、抗サルモネラ抗体、抗ブドウ球菌抗体、抗カンピロバクター抗体、抗ウェルシュ菌抗体、抗腸炎ビブリオ菌抗体、抗ベロトキシン抗体、抗ヒトトランスフェリン抗体、抗ヒトアルブミン抗体、抗ヒト免疫グロブリン抗体、抗マイクログロブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗トロポニン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗クラミジア・トラコマティス抗体、抗ストレプトリジンO抗体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗β-グルカン抗体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ロタウイルス抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗パルボウイルス抗体、抗ＲＳウイルス抗体、抗ＲＦ抗体、病原微生物に由来する核酸成分に相補的なヌクレオチド等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　以下、測定対象をＲＳウイルスとした例として説明する。
　測定対象が例えばＲＳウイルスである場合、抗体又はその抗原結合性断片として抗ＲＳウイルス抗体を用いる。
　本発明において、抗ＲＳウイルス抗体は、ＲＳウイルスを特異的に認識する抗体であり、具体的にはＲＳウイルスの蛋白質を抗原として特異的に認識し、結合する。ＲＳウイルスの蛋白質として、細胞融合に関連するＦ蛋白質、Ｎ蛋白質等が挙げられる。Ｎ蛋白質は核蛋白質とも呼ばれ、391のアミノ酸残基からなる。Ｎ蛋白質は、ヌクレオカプシドと呼ばれるリボ核蛋白質複合体の構成成分であり、ＲＳウイルスのゲノムＲＮＡを囲みらせん構造を形成している。好ましくは、抗ＲＳウイルス抗体Ｎ蛋白質に対する抗体を用いる。
　本発明は、抗ＲＳウイルス抗体を担体に固定化する際に、二糖類及び糖アルコール類を添加することにより、ＲＳウイルスの検出感度を向上させ得る。
　二糖類としては、トレハロース、マルトースが挙げられる。
　糖アルコール類としては、マンニトール、ソルビトールが挙げられる。
　固相化に用いる抗ＲＳウイルス抗体溶液に二糖類及び糖アルコール類を添加すればよい。抗ＲＳウイルス抗体溶液は、抗体をリン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）等の緩衝液に溶解させて作製する。このときの抗体濃度は数十pg/mL～数g/mLである。二糖類の濃度は、0.5～10％（w/v)、好ましくは１～５％（w/v)、さらに好ましくは１～４％(w/v)、特に好ましくは１～３％(w/v)である。糖アルコールの濃度は、0.2～10％（w/v)、好ましくは0.5～５％（w/v)、さらに好ましくは0.5～４％(w/v)、特に好ましくは0.5～３％(w/v)である。これらの溶液を担体に例えば線上に塗布し乾燥させればよい。
　抗体溶液に二糖類及び糖アルコールを添加して固定化することにより、二糖類及び糖アルコールを添加しない場合に比較し、ＲＳウイルス抗原の検出感度が1.5倍以上、好ましくは1.75倍以上、さらに好ましくは２倍以上上昇する。
　本発明は抗ＲＳウイルス抗体を基に、抗原結合部位のみを分離させた抗原結合性断片も本発明の方法に使用することができる。すなわち、公知の方法により作製された、Fab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖抗体(scFv)、dsFv、diabody、minibodyなどの特異的な抗原結合性を有する断片（抗原結合性断片）を用いる場合もこれらの断片はモノクローナル抗体に包含され、本発明の範囲に含まれる。また、モノクローナル抗体のクラスはIgGに限定されず、IgMやIgYでもよい。
　本発明の方法に用いるモノクローナル抗体は、公知の免疫学的手法を用い、目的の抗原を含む複合体や抽出物、あるいは抗原又はそれらの部分ペプチドを被免疫動物に免疫し、被免疫動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製することにより得ることができる。免疫に用いるペプチドの長さは特に限定されないが、好ましくは５アミノ酸以上、より好ましくは１０アミノ酸以上のペプチドを用いて免疫原とすることができる。免疫原は培養液から得ることもできるが、任意の抗原をコードするＤＮＡをプラスミドベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して発現させることにより得ることもできる。免疫原とする任意の抗原またはその部分ペプチドは以下に例示するようなタンパク質と融合タンパク質として発現させ、精製の後、または未精製のまま免疫原として用いることもできる。融合タンパク質の作製には、当業者が「タンパク質発現・精製タグ」として一般的に用いる、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ＦＲＡＧタグ、ポリヒスチジンタグなどが利用できる。これらとの融合タンパク質は、消化酵素を用いて任意の抗原あるいはその部分ペプチド部分とそれ以外のタグ部分とを切断し、分離精製した後に免疫原として用いることが好ましい。 
　免疫した動物からのモノクローナル抗体の調製は、周知のケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）により容易に行うことができる。すなわち、免役した動物から、脾細胞やリンパ球等の抗体産生細胞を回収し、これを常法によりマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングし、クローニングされた各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のうち、動物の免疫に用いた抗原と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を選択する。
　腹水や培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、公知のイムノグロブリン精製法を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過法などが挙げられる。また免疫動物種とモノクローナル抗体のクラスに応じて、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬのいずれかを結合させた担体を用いたアフィニティクロマトグラフィー法によっても精製することが可能である。
　本発明の免疫測定方法では、上記のようにして作製したモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片（以下、実施例の前までの記述において、文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、「抗体」は、「抗体又はその抗原結合性断片」を意味する）と検体中の抗原との抗原抗体反応を利用した免疫測定により測定する。このための免疫測定法としては、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法、免疫染色法、サンドイッチ法など、当業者にとって周知のいずれの方法も用いることができる。なお、本発明において、「測定」には、定量、半定量、検出のいずれもが包含される。
　免疫測定としては、サンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法においては、２つの抗体で抗原を挟む形で複合体を形成させ、該複合体を検出する。サンドイッチ法自体は免疫測定の分野において周知であり、例えばイムノクロマトグラフィー法やELISA法により行うことができる。これらのサンドイッチ法自体はいずれも周知であり、本発明の方法は、上記したＮ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体を用いること以外は、周知のサンドイッチ法により行うことができる。
　サンドイッチ法には、抗原を認識する１種類又は２種類以上の抗体（固相に固定化される抗体と、標識抗体）が用いられる。２種類以上の抗体を用いる場合、これらの２種類の抗体のうち、少なくともいずれか一方が、上記したＮ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体である。また、同じ２つの抗体で抗原を挟んで複合体を形成させてもよい。
　サンドイッチ法を検出原理とする免疫測定において、抗体が固定化される固相としては、抗体を公知技術により固定可能なものは全て用いることができ、例えば、毛細管作用を有する多孔性薄膜（メンブレン）、粒子状物質、試験管、樹脂平板など公知のものを任意に選択できる。また、抗体を標識する物質としては、酵素、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色粒子、コロイド粒子などを用いることができる。前述の種々の材料による免疫測定法の中でも、特に臨床検査の簡便性と迅速性の観点から、メンブレンを用いたラテラルフロー式の免疫測定法であるイムノクロマト法が好ましい。
　本発明では、本発明者らは、抗ＲＳウイルス抗体を固定化する際に、二糖類及び糖アルコール類を添加することにより、ＲＳウイルスの検出感度を向上させ得るラテラルフロー式に免疫測定を行うことができる免疫測定器具をも提供する。本発明が提供する免疫測定器具は、測定対象物（抗原）を捕捉する抗体（抗体１）が固定化された検出領域を有する担体、移動可能な標識抗体（抗体２）を有する標識体領域、検体を滴加するサンプルパッド、展開された検体液を吸収する吸収帯、これら部材を１つに貼り合わせるためのバッキングシートから成り、抗体１および抗体２の少なくとも一方が本発明のＮ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体である免疫測定器具である。該免疫測定器具をイムノクロマト試験片とも呼ぶ。
　担体は、被検出物質（抗原）を捕捉するための抗体を固定化する性能を持つ材料であり、かつ液体が水平方向に通行することを妨げない性能を持つ。好ましくは、毛細管作用を有する多孔性薄膜であり、液体及びそれに分散した成分を吸収により輸送可能な材料である。担体を成す材質は特に限定されるものではなく、例えばセルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ガラス繊維、ナイロン、ポリケトンなどが挙げられる。このうちニトロセルロースを用いて薄膜としたものがより好ましい。抗体を固定化したメンブレンを抗体固定化メンブレンと呼ぶ。
　標識体領域は、標識抗体を含む多孔性基材から成り、基材の材質は一般的に用いられているガラス繊維や不織布等を用いることができる。該基材は、多量の標識抗体を含浸させるために、厚さ0.3mm～0.6mm程度のパッド状であることが好ましい。標識抗体を含浸させ乾燥させた多孔性基材を乾燥パッドとも呼ぶ。
　標識抗体の標識には、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素、金コロイドのような金属コロイド、シリカ粒子、セルロース粒子、着色ポリスチレン粒子及び着色ラテックス粒子等が用いられることが多い。金属コロイド粒子、着色ポリスチレン粒子や着色ラテックス粒子等の着色粒子を用いる場合には、これらの標識試薬が凝集することによって着色が生じるので、この着色を測定する。抗体を固定化した粒子を抗体固定化粒子と呼ぶ。抗体の固定化量は、特に限定されないが、標識領域に数ngから数十μg存在すればよい。
　検出領域は、被検出物質（抗原）を捕捉する抗体が固定化された担体の一部の領域を指す。検出領域は、抗原を捕捉するための抗体を固定化した領域を少なくとも１つ設ける。検出領域は担体に含まれていればよく、担体上に抗体を固定化すればよい。上記のように、検出領域に抗ＲＳウイルス抗体を固定化するときに、抗ＲＳウイルス抗体溶液に二糖類及び糖アルコール類を添加する。抗体の固定化量は、特に限定されないが検出領域に数ngから数十μg固定化すればよい。本発明の検出領域は、二糖類及び糖アルコールを検出可能に含んでいる。
　サンプルパッドは、検体を滴加するための部位であり、多孔性材料である。サンプルパッドは免疫測定器具の最も上流にある部位である。該材料には一般的に用いられるろ紙、ガラス繊維、不織布等を用いることができる。多量の検体を免疫測定に用いるために、厚さ0.3mm～1mm程度のパッド状であることが好ましい。検体には、検体を他の溶液に浮遊して得られる試料等、検体を用いて調製された試料も含む。
　吸収帯は、担体に供給され検出領域で反応に関与しなかった成分を吸収するための部材である。該材料には、一般的な天然高分子化合物、合成高分子化合物等からなる保水性の高いろ紙、スポンジ等を用いることができるが、検体の展開促進のためには吸水性が高いものが好ましい。
　バッキングシートは、前述の全ての材料、すなわち担体、サンプルパッド、標識体領域、吸収帯等が、部分的な重なりをもって貼付し固定されるための部材である。バッキングシートは、これらの材料が最適な間隔で配置し固定されるのであれば、必ずしも必要ではないが、製造上あるいは使用上の利便性から、一般的には用いた方が好ましい。
　本発明の免疫測定器具には、さらに対照表示領域(部材）が存在していてもよい。対照表示領域は試験が正確に実施されたことを示す部位である。例えば、対照表示領域は、検出領域の下流に存在し、検体試料が検出領域を通過し、対照表示領域に到達したときに着色等によりシグナルを発する。対照表示領域には、標識担体を結合させた抗体に結合する物質を固相化しておいてもよいし、検体が到達したときに色が変化するpHインジケーター等の試薬を固相化しておいてもよい。標識担体を結合させた抗体がマウスモノクローナル抗体の場合、抗マウスIgG抗体を用いればよい。
　免疫測定器具の大きさは限定されないが、例えば、縦の長さ数cm～十数cm、横の長さ数mm～数cm程度である。
　本発明の免疫測定器具は、格納容器内に収められていてもよく、該格納容器により、例えば紫外線や空気中の湿気による劣化を防ぐことができる。また、汚染性、感染性の有る検体試料を用いる場合、格納容器によりアッセイを行う試験者が汚染又は感染するのを防止することができる。例えば適当な大きさの樹脂製ケースを格納容器として用い、該ケース中に本発明の器具を収納すればよい。格納容器とその中に納められた免疫測定器具を、一体として免疫測定デバイスという場合がある。
　本発明の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体を含むＲＳウイルス検出用試薬は前記免疫測定器具を含む。また、本発明の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体を含むＲＳウイルス検出用キットは前記免疫測定器具を含む。該キットは、他にブロッシャー、検体採取器具等を含んでいてもよい。
　該方法においては、抗体１を固定化した固相担体に毛管現象を利用して、着色ポリスチレン粒子や金コロイド等の適当な標識物質で標識した被検出物質（標識試薬）と結合し得る抗体２と被検出物質の複合体を展開移動させる。この結果、固定化した物質-被検出物質-標識試薬の複合体が固相担体上に形成され、該複合体から発する標識試薬のシグナル（金コロイドの場合は、被検出物質と結合し得る物質を固定化した固相担体部分が赤くなる）を検出することにより、被検出物質を検出することができる。該免疫測定方法は、５～３５℃、好ましくは室温で行うことができる。
　本発明の方法により、ＲＳウイルスに感染しているか否かを検出することができ、被検体試料中にＮ蛋白質が検出された場合に、ＲＳウイルスに感染していると判断することができる。
　本発明のＮ蛋白質を認識する抗体を用いた場合、ＲＳウイルスを特異的に認識することができ、Ｎ蛋白質を認識する抗体は、他のウイルス、例えばアデノウイルス（Adenovirus)、コクサッキーウイルス（Coxsackievirus）、エコーウイルス（Echo virus）、単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）、ヒトメタニューモウイルス（Human Metapneumovirus)、インフルエンザウイルス（Influenza virus)、麻疹ウイルス（Measles virus）、ムンプスウイルス（Mumps virus）、パラインフルエンザウイルス（Parainfluenza virus）を認識することはなく、これらのウイルスを誤検出することはない。
　また、ＲＳウイルスのＦ蛋白質を認識する抗体を用いた場合に検出できない臨床分離株でも、本発明のＲＳウイルスのＮ蛋白質を認識する抗体を用いた場合に検出することができる。
　被検体試料としては、検体として、咽頭若しくは鼻腔ぬぐい液、咽頭若しくは鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、唾液、血清、直腸拭い液、便、便懸濁液、尿、角膜拭い液等を用いればよい。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１　抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体の作製
１．ＲＳウイルスＮ蛋白質抗原の調製
　ＲＳウイルスを感受性のある哺乳類細胞に感染させ、数日間培養した後にＲＳウイルス感染細胞の培養液を紫外線照射で不活化したものを用いた。
２．ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体の作製
　１．のRSウイルス不活化抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから腸骨リンパ節を摘出する、「マウス腸骨リンパ節法」(Sado Y et al., Acta Histochem. Cytochem. 39: 89-94 (2006))により抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が複数得られた。
　取得した細胞株をプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から、プロテインAカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法によりIgGを精製し、精製抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体（以下、「抗Ｎ蛋白質抗体」と称することがある）を複数得た。
　以下の実施例では複数得られた抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体のうち、反応性および特異性を考慮して選択した抗体を用いた。
実施例２　ＲＳウイルスを測定する免疫測定器具
１．抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
　実施例１で作製した抗Ｎ蛋白質抗体を緩衝液で希釈した液及び抗マウスIgG抗体を準備し、PETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンのサンプルパッド側に抗Ｎ蛋白質抗体、吸収体側に抗マウスIgG抗体をそれぞれ線状に塗布した。その後、ニトロセルロースメンブレンを温風下で十分に乾燥させ、抗Ｎ蛋白質抗体固定化メンブレンを得た。
２．抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
　実施例１で作製した抗Ｎ蛋白質抗体を着色ポリスチレン粒子に共有結合させ、浮遊液に懸濁し、超音波処理により十分に分散させた、抗Ｎ蛋白質抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本明細書において、抗Ｎ蛋白質抗体固定化粒子と呼ぶ。
３．抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布及び乾燥
　２で作製した抗体固定化粒子をグラスファイバー不織布に所定量塗布し、温風化で十分に乾燥させた。本明細書において、標識体パッドと呼ぶ。
４．ＲＳウイルス検査デバイスの作製
　１で作製した抗体固定化メンブレンと２および３で作製した標識体パッドを他部材（バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド）と貼り合せて5mm幅に切断し、ＲＳウイルス検査デバイスとした。
５．ＲＳウイルス検査デバイスの特異性及び正確性の確認
　４で作製したＲＳウイルス検査デバイスに、呼吸器感染症を引き起こすウイルスを含む検体浮遊液（10mM Tris（pH8.0）、1%(w/v)ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、3%(w/v)アルギニン、3%(w/v)BSA）を50μＬ滴加し、5分間静置した。
　抗マウスIgG抗体及び抗Ｎ蛋白質抗体の両方の塗布位置で発色を目視で確認できた場合に＋と判定する。抗マウスIgG抗体の塗布位置のみで発色を目視で確認でき、抗Ｎ蛋白質抗体の塗布位置で発色を目視で確認できない場合は－と判定する。また、抗マウスIgG抗体の塗布位置で発色を目視で確認できない場合は無効と判定する。
　結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示された通り、本発明の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体を用いた免疫測定器具は、ＲＳウイルスに反応するものの、他の呼吸器感染症の病因ウイルスに対して交差反応性を示さないことから、ＲＳウイルスに対して特異的に反応することが確認できた。
実施例３　抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体を用いた高感度ＲＳウイルス検査デバイス
　実施例２で作製の抗Ｎ蛋白質抗体を用いたＲＳウイルス検査デバイスでは、抗ＲＳウイルスＦ蛋白質モノクローナル抗体（抗Ｆ蛋白質抗体）を用いて作製した検査デバイスと比較して、ＲＳウイルス抗原の検出感度が低いことが確認された。
　実施例２　１．にて抗Ｎ蛋白質抗体をニトロセルロースメンブレンへ固定化をする際に、二糖類及び糖アルコール類を添加することにより、抗F蛋白質抗体を用いた検査デバイスと同等の感度となった。
１．高感度化抗Ｎ蛋白質抗体固定化メンブレンの作製
　実施例２　１．にて、抗Ｎ蛋白質抗体を固定化する際の緩衝液に2%(w/v)のトレハロースを二糖類として添加し、さらに1.0～2.0%(w/v)のマンニトールを添加したものをニトロセルロースメンブレンに線状に塗布した後、ニトロセルロースメンブレンを温風下で十分に乾燥させ、高感度化抗Ｎ蛋白質抗体固定化メンブレンを得た。
２．高感度化抗Ｎ蛋白質抗体固定化メンブレンの評価
　高感度化抗Ｎ蛋白質抗体固定化メンブレンを用いて実施例２　４．に記載の方法でＲＳウイルス検査デバイスを調製し、ＲＳウイルス抗原の2倍段階希釈液を用いて実施例２　５．に記載の方法に従って試験した結果を表２に示す。
　抗マウスIgG抗体及び抗Ｎ蛋白質抗体の両方の塗布位置で発色を目視で確認できた場合に＋と判定する。抗マウスIgG抗体の塗布位置のみで発色を目視で確認でき、抗Ｎ蛋白質抗体の塗布位置で発色を目視で確認できない場合は－と判定する。また、抗マウスIgG抗体の塗布位置で発色を目視で確認できない場合は無効と判定する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　二糖類及びマンニトールを添加することによる2倍の感度上昇が確認された。
　本発明の抗体を用いてＲＳウイルス感染症を高感度で特異的に検出することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (17)

  1. 　抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化した担体を用いる免疫測定方法により測定対象を検出する方法において、抗原、抗体又はその抗原結合性断片を含む溶液に二糖類及び糖アルコール類を添加して抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化した担体を用いることにより検出感度を上昇させて、測定対象を検出する免疫測定方法。
  2. 　抗原、抗体又はその抗原結合性断片を含む溶液に１～４％(w/v)の二糖類及び0.5～４％（w/v)の糖アルコール類を添加して抗原、抗体又はその抗原結合性断片を担体に固定化する請求項１記載の方法。
  3. 　二糖類がトレハロース又はマルトースである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　糖アルコール類がマンニトール又はソルビトールである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　イムノクロマト法である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　抗体又はその抗原結合性断片が、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体又はその抗原結合性断片である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化した検出用試薬であって、抗原、抗体又はその抗原結合性断片を含む検出領域に二糖類及び糖アルコール類を含む、検出感度が上昇した検出用試薬。
  8. 　二糖類がトレハロース又はマルトースである、請求項７記載の検出用試薬。
  9. 　糖アルコール類がマンニトール又はソルビトールである、請求項７又は８に記載の検出用試薬。
  10. 　イムノクロマト法試薬である、請求項７～９のいずれか１項に記載の検出用試薬。
  11. 　抗体又はその抗原結合性断片が、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体又はその抗原結合性断片である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の検出用試薬。
  12. 　検出感度が上昇した、抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化した検出用試薬の製造方法であって、抗原、抗体又はその抗原結合性断片を含む溶液に二糖類及び糖アルコール類を添加して抗原、抗体又はその抗原結合性断片を固定化する製造方法。
  13. 　抗原、抗体又はその抗原結合性断片を含む溶液に１～４％(w/v)の二糖類及び0.5～４％（w/v)の糖アルコール類を添加して抗原、抗体又はその抗原結合性断片を担体に固定化する請求項１２記載の製造方法。
  14. 　二糖類がトレハロース又はマルトースである、請求項１２又は１３に記載の製造方法。
  15. 　糖アルコール類がマンニトール又はソルビトールである、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の製造方法。
  16. 　検出用試薬がイムノクロマト法試薬である、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の製造方法。
  17. 　抗体又はその抗原結合性断片が、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体又はその抗原結合性断片である、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の製造方法。
PCT/JP2020/046257 2019-12-12 2020-12-11 免疫測定方法及び免疫測定器具 WO2021117862A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20900363.1A EP4075132A4 (en) 2019-12-12 2020-12-11 IMMUNOASSAY PROCEDURE AND IMMUNOASSAY DEVICE
US17/784,417 US20230003724A1 (en) 2019-12-12 2020-12-11 Immunoassay method and immunoassay apparatus
CN202080085881.5A CN114829935A (zh) 2019-12-12 2020-12-11 免疫测定方法及免疫测定工具

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-224865 2019-12-12
JP2019224865A JP2021092517A (ja) 2019-12-12 2019-12-12 免疫測定方法及び免疫測定器具

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021117862A1 true WO2021117862A1 (ja) 2021-06-17

Family

ID=76313162

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/046257 WO2021117862A1 (ja) 2019-12-12 2020-12-11 免疫測定方法及び免疫測定器具

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230003724A1 (ja)
EP (1) EP4075132A4 (ja)
JP (1) JP2021092517A (ja)
CN (1) CN114829935A (ja)
TW (1) TW202136779A (ja)
WO (1) WO2021117862A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113588948A (zh) * 2021-08-03 2021-11-02 江苏量界生物技术有限公司 一种基于elisa法定量检测新型冠状病毒n蛋白的试剂盒

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61189454A (ja) * 1985-02-18 1986-08-23 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd 安定化された固定化抗体
JPS63133065A (ja) * 1986-11-25 1988-06-04 Konica Corp 生物活性物質の安定化方法
JPH0154274B2 (ja) 1983-08-23 1989-11-17 Mitsubishi Electric Corp
JPH1038883A (ja) * 1996-07-24 1998-02-13 Eiken Chem Co Ltd 抗原活性の安定化方法
JPH11153600A (ja) * 1997-11-21 1999-06-08 Fujirebio Inc 免疫測定用試験片及び該試験片を用いる測定法
JP2005300401A (ja) * 2004-04-14 2005-10-27 Denka Seiken Co Ltd タンパク質の膜固定化方法
JP2007315883A (ja) * 2006-05-25 2007-12-06 Denka Seiken Co Ltd 免疫測定用ラテックス組成物
JP2008203135A (ja) * 2007-02-21 2008-09-04 Denka Seiken Co Ltd 検査デバイスの標識体部の形成方法及びラテラルフロー免疫測定用検査デバイス
JP2010014685A (ja) * 2008-07-04 2010-01-21 Bio Matrix Research Inc タンパク質安定化溶液
WO2014203988A1 (ja) * 2013-06-21 2014-12-24 アルフレッサファーマ株式会社 Ｒｓｖを検出するためのイムノクロマトグラフィー装置
US20150268257A1 (en) * 2012-10-22 2015-09-24 Securetec Detektions-Systeme Ag Method and device for detecting illegal drugs
JP2015200517A (ja) * 2014-04-04 2015-11-12 田中貴金属工業株式会社 免疫クロマト分析方法
JP2017129533A (ja) * 2016-01-22 2017-07-27 田中貴金属工業株式会社 クロマトグラフ媒体
JP2018044920A (ja) * 2016-09-16 2018-03-22 大蔵製薬株式会社 イムノクロマトグラフィー用試薬組成物
JP6464308B1 (ja) * 2018-09-27 2019-02-06 積水メディカル株式会社 イムノクロマト用試験片

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU609332B2 (en) * 1988-11-09 1991-04-26 Biotrack, Inc. Method and composition of stabilizing and solubilizing latex reagents
JP4171135B2 (ja) * 1999-04-28 2008-10-22 積水化学工業株式会社 免疫クロマトグラフィー装置
JP5575377B2 (ja) * 2008-07-18 2014-08-20 シスメックス株式会社 抗ｒｓウイルスモノクローナル抗体を用いたｒｓウイルス検出用キット及びイムノクロマトグラフィー用試験具、並びに新規な抗ｒｓウイルスモノクローナル抗体
CN105753981B (zh) * 2016-03-08 2019-10-08 湖北工业大学 抗人呼吸道合胞病毒n蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
US20210293806A1 (en) * 2018-10-23 2021-09-23 Sekisui Medical Co., Ltd. Immunochromatographic test strip
US20220163543A1 (en) * 2019-03-04 2022-05-26 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Dried reagent polysaccharide surface area stabilization

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0154274B2 (ja) 1983-08-23 1989-11-17 Mitsubishi Electric Corp
JPS61189454A (ja) * 1985-02-18 1986-08-23 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd 安定化された固定化抗体
JPS63133065A (ja) * 1986-11-25 1988-06-04 Konica Corp 生物活性物質の安定化方法
JPH1038883A (ja) * 1996-07-24 1998-02-13 Eiken Chem Co Ltd 抗原活性の安定化方法
JPH11153600A (ja) * 1997-11-21 1999-06-08 Fujirebio Inc 免疫測定用試験片及び該試験片を用いる測定法
JP2005300401A (ja) * 2004-04-14 2005-10-27 Denka Seiken Co Ltd タンパク質の膜固定化方法
JP2007315883A (ja) * 2006-05-25 2007-12-06 Denka Seiken Co Ltd 免疫測定用ラテックス組成物
JP2008203135A (ja) * 2007-02-21 2008-09-04 Denka Seiken Co Ltd 検査デバイスの標識体部の形成方法及びラテラルフロー免疫測定用検査デバイス
JP2010014685A (ja) * 2008-07-04 2010-01-21 Bio Matrix Research Inc タンパク質安定化溶液
US20150268257A1 (en) * 2012-10-22 2015-09-24 Securetec Detektions-Systeme Ag Method and device for detecting illegal drugs
WO2014203988A1 (ja) * 2013-06-21 2014-12-24 アルフレッサファーマ株式会社 Ｒｓｖを検出するためのイムノクロマトグラフィー装置
JP2015200517A (ja) * 2014-04-04 2015-11-12 田中貴金属工業株式会社 免疫クロマト分析方法
JP2017129533A (ja) * 2016-01-22 2017-07-27 田中貴金属工業株式会社 クロマトグラフ媒体
JP2018044920A (ja) * 2016-09-16 2018-03-22 大蔵製薬株式会社 イムノクロマトグラフィー用試薬組成物
JP6464308B1 (ja) * 2018-09-27 2019-02-06 積水メディカル株式会社 イムノクロマト用試験片

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOHLER ET AL., NATURE, vol. 256, 1975, pages 495 - 497
SADO Y ET AL., ACTA HISTOCHEM. CYTOCHEM, vol. 39, 2006, pages 89 - 94
See also references of EP4075132A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113588948A (zh) * 2021-08-03 2021-11-02 江苏量界生物技术有限公司 一种基于elisa法定量检测新型冠状病毒n蛋白的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021092517A (ja) 2021-06-17
US20230003724A1 (en) 2023-01-05
EP4075132A1 (en) 2022-10-19
CN114829935A (zh) 2022-07-29
EP4075132A4 (en) 2023-06-21
TW202136779A (zh) 2021-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102227648B1 (ko) B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법
KR102099370B1 (ko) 인플루엔자 a형 바이러스의 검출 키트
RU2366662C2 (ru) Моноклональное антитело к вирусу типа а гриппа и устройство для иммунного анализа с использованием антитела
KR102173675B1 (ko) 생체 점막 유래 검체 측정 면역검정에 있어서 위음성을 억제하는 방법
KR20160052598A (ko) A형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법
JP2024012473A (ja) Ｒｓウイルスを検出するための検出用試薬又はキット及びｒｓウイルスを検出する方法
RU2366663C2 (ru) Устройство для иммунного анализа с использованием антитела к вирусу гриппа типа b
WO2021117862A1 (ja) 免疫測定方法及び免疫測定器具
WO2022024925A1 (ja) シグナルの低下を改善した検査試薬
WO2016194797A1 (ja) 被検対象の検出方法並びにそのための免疫測定器具及びモノクローナル抗体
JP2007333426A (ja) サンドイッチイムノアッセイ法及びその検出装置
WO2021095762A1 (ja) 抗ｒｓウイルスｎ蛋白質を認識する抗体、並びに該抗体を用いた免疫測定方法及び免疫測定器具
JP2019207248A (ja) 被検対象の検出方法並びにそのための免疫測定器具及びモノクローナル抗体
JP7256144B2 (ja) アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具
JP7372196B2 (ja) マイコプラズマ・ニューモニエの免疫測定方法及び免疫測定器具
US20230288418A1 (en) Adenovirus immunization measurement method and immunization measurement device
JP6943789B2 (ja) モノクローナル抗体および非特異反応抑制剤
JP6962834B2 (ja) モノクローナル抗体および非特異反応抑制剤
JP2004219346A (ja) 犬下痢症ウイルス抗原検出用キット

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20900363

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020900363

Country of ref document: EP

Effective date: 20220712