JP2007333426A - サンドイッチイムノアッセイ法及びその検出装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】サンドイッチイムノアッセイ法により検体中のウイルス等の被検出物質を検出する方法であって、偽陰性を防止することができる検出方法を提供することを目的とする。
【解決手段】固相支持体上の反応領域に被検出物質と同一、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質を固定化することにより、測定方法の確認および標識試薬の免疫学的機能を確認することができ、これにより偽陰性を防止することができる。
【選択図】なし
【解決手段】固相支持体上の反応領域に被検出物質と同一、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質を固定化することにより、測定方法の確認および標識試薬の免疫学的機能を確認することができ、これにより偽陰性を防止することができる。
【選択図】なし
Description
本発明は、検体中の被検出物質の存在を免疫学的特異的反応を利用してサンドイッチイムノアッセイ法により検出する検出装置およびそれを用いて検出する方法に関するものである。
免疫学的測定法において、試料中のウイルス等の被検出物質を検出するため、標識物質に抗体等の被検出物質を捕捉する捕捉物質を結合させた、捕捉物質と標識物質の結合体（この結合体を標識試薬という）が利用されている。また、これらの原理に基づいた測定方法が提案されている。（例えば特許文献１および２）
このような測定法の一つであるサンドイッチイムノアッセイ法による検出および半定量する検出装置（診断キット）は、近年インフルエンザなど流行期に臨床現場で迅速測定のために使用されている。しかし、患者から実際に採取された検体の分析において、被検出物質が検体中に存在しているにも係わらず陰性と判断されてしまういわゆる偽陰性が問題となっている。
病原体の感染を測定する際に偽陰性の問題が生じると、疾患に関して誤った情報を与えるため、原因特定を遅らせるばかりでなく、不適切な措置を講じることになり病状がより重篤になる等の重大な結果をもたらすこともあり得る。したがって偽陰性を抑えることは簡易検査方法の主要な使用目的から見て、極めて重要な課題である。しかし、従来のサンドイッチイムノアッセイ法ではかかる偽陰性を防ぐ手段が講じられていなかった。
なお、従来のラテラルフロータイプの検出装置による検出方法では、液体がテストライン（担体上に固定化された捕捉試薬部）に到達したか否かを確認するためにテストラインの下流に抗マウス抗体を固定化する方法が報告されている（例えば特許文献１参照）。しかし、かかる方法では偽陰性を防止することはできない。
病原体の感染を測定する際に偽陰性の問題が生じると、疾患に関して誤った情報を与えるため、原因特定を遅らせるばかりでなく、不適切な措置を講じることになり病状がより重篤になる等の重大な結果をもたらすこともあり得る。したがって偽陰性を抑えることは簡易検査方法の主要な使用目的から見て、極めて重要な課題である。しかし、従来のサンドイッチイムノアッセイ法ではかかる偽陰性を防ぐ手段が講じられていなかった。
なお、従来のラテラルフロータイプの検出装置による検出方法では、液体がテストライン（担体上に固定化された捕捉試薬部）に到達したか否かを確認するためにテストラインの下流に抗マウス抗体を固定化する方法が報告されている（例えば特許文献１参照）。しかし、かかる方法では偽陰性を防止することはできない。
本発明は、サンドイッチイムノアッセイ法により検体中のウイルス等の被検出物質を検出する方法であって、偽陰性を防止することができる検出方法を提供することを目的とする。
本発明者等は、前記課題を克服する手段を鋭意検討した結果、固相支持体上の反応領域に被検出物質と同一、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質を固定化することにより、測定方法の確認および標識試薬の免疫学的機能を確認できることを見出し、本発明に至った。
即ち本発明は、シート状の固相支持体上に少なくとも下記（ａ）〜（ｃ）を含む、検体中の被検出物質をサンドイッチイムノアッセイ法で検出する検出装置に関する。
（ａ）被検出物質を含むと推定される検体と、前記被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬との混合物を供給する供給部、
（ｂ）前記被検出物質−前記標識試薬複合体を特異的に結合捕捉し得る第２の捕捉物質を固定化した捕捉試薬部、
（ｃ）前記標識試薬が特異的に結合する物質を固定化した対照部であって、前記物質が、被検出物質と同一物質、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質である、対照部。
本発明の更に好ましい実施態様は、上記装置において被検出物質がインフルエンザウイルス抗原であり、第１の捕捉物質が抗インフルエンザウイルス抗体である。
また本発明の更に好ましい実施態様は、検出装置がラテラルフロータイプの検出装置である。
即ち本発明は、シート状の固相支持体上に少なくとも下記（ａ）〜（ｃ）を含む、検体中の被検出物質をサンドイッチイムノアッセイ法で検出する検出装置に関する。
（ａ）被検出物質を含むと推定される検体と、前記被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬との混合物を供給する供給部、
（ｂ）前記被検出物質−前記標識試薬複合体を特異的に結合捕捉し得る第２の捕捉物質を固定化した捕捉試薬部、
（ｃ）前記標識試薬が特異的に結合する物質を固定化した対照部であって、前記物質が、被検出物質と同一物質、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質である、対照部。
本発明の更に好ましい実施態様は、上記装置において被検出物質がインフルエンザウイルス抗原であり、第１の捕捉物質が抗インフルエンザウイルス抗体である。
また本発明の更に好ましい実施態様は、検出装置がラテラルフロータイプの検出装置である。
本発明はまた、上記装置を用いる、サンドイッチイムノアッセイ法による検体中の被検出物質を検出する方法であって、下記工程を含むことにより偽陰性を防止することを特徴とする方法に関する。
（i）被検出物質を含むと推定される検体と、前記被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬を混合する工程、
（ii）前記混合液を上記装置の供給部（ａ）から供給する工程、
（iii）前記装置の捕捉試薬部（ｂ）上の標識試薬の存在と対照部（ｃ）上の標識試薬の存在の有無を確認する工程、
（iv）前記装置の捕捉試薬部（ｂ）及び対照部（ｃ）双方に標識試薬が存在する場合には「陽性」、捕捉試薬部（ｂ）には標識試薬が存在せず、対照部（ｃ）にのみ標識試薬が存在する場合には「陰性」、及び対照部（ｃ）に標識試薬が存在しない場合には「無効」、と判定する工程。
（i）被検出物質を含むと推定される検体と、前記被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬を混合する工程、
（ii）前記混合液を上記装置の供給部（ａ）から供給する工程、
（iii）前記装置の捕捉試薬部（ｂ）上の標識試薬の存在と対照部（ｃ）上の標識試薬の存在の有無を確認する工程、
（iv）前記装置の捕捉試薬部（ｂ）及び対照部（ｃ）双方に標識試薬が存在する場合には「陽性」、捕捉試薬部（ｂ）には標識試薬が存在せず、対照部（ｃ）にのみ標識試薬が存在する場合には「陰性」、及び対照部（ｃ）に標識試薬が存在しない場合には「無効」、と判定する工程。
本発明の更なる他の実施態様は、検体中の被検出物質を、被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬と、被検出物質−標識試薬複合体を特異的に結合捕捉し得る、支持体に固定化された第２の捕捉物質とを用いるサンドイッチイムノアッセイ法により検出する方法であって、被検出物質と同一物質、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質を前記支持体に固定化し、前記物質に対する標識試薬の反応性を確認することにより検出方法の有効性を判定することを特徴とする方法、である。
本発明により、サンドイッチイムノアッセイ法によってウイルス等の被検出物質を検出する際の偽陰性の発生を抑制することができる。偽陰性の発生には様々な理由が考えられるが、特に被検出物質に結合する第１の捕捉物質の変性や、生体由来の成分による妨害が原因の一つと考えられる。本発明の装置及び方法では、被検出物質と同一物質、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質を固相支持体上に固定化した対照部を用いることにより、検出に用いられる標識試薬と被検出物質との反応性を、対照部において精度よく確認することができる。すなわち、標識試薬の免疫学的機能が保持されて被検出物質との反応が正しく行われたか否かを対照部において判定することができ、それにより偽陰性の発生を抑制することができる。
以下本発明の装置及び方法を説明する。
本発明の装置は、サンドイッチイムノアッセイ法によりウイルス等の被検出物質を検出する方法であって、下記（ａ）〜（ｃ）を含む装置である。
（ａ）被検出物質を含むと推定される検体と、前記被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬との混合物を供給する供給部、
（ｂ）前記被検出物質−前記標識試薬複合体を特異的に結合捕捉し得る第２の捕捉物質を固定化した捕捉試薬部、
（ｃ）前記標識試薬が特異的に結合する物質を固定化した対照部であって、前記物質が、被検出物質と同一物質、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質である、対照部。
本発明の特徴は、被検出物質と同一物質、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質を対照物質として使用することにより、偽陰性を防止するものである。
本発明の装置は、サンドイッチイムノアッセイ法によりウイルス等の被検出物質を検出する方法であって、下記（ａ）〜（ｃ）を含む装置である。
（ａ）被検出物質を含むと推定される検体と、前記被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬との混合物を供給する供給部、
（ｂ）前記被検出物質−前記標識試薬複合体を特異的に結合捕捉し得る第２の捕捉物質を固定化した捕捉試薬部、
（ｃ）前記標識試薬が特異的に結合する物質を固定化した対照部であって、前記物質が、被検出物質と同一物質、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質である、対照部。
本発明の特徴は、被検出物質と同一物質、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質を対照物質として使用することにより、偽陰性を防止するものである。
サンドイッチイムノアッセイ法
本発明において用いる、サンドイッチイムノアッセイ法とは、被検出物質に特異的に結合する第一の捕捉物質（あるいはリガンド）に標識物質を結合した標識試薬と、固相支持体に固定化した被検出物質に特異的に結合する第二の捕捉物質（あるいはリガンド）とを用いて、検体中の被検出物質を固相支持体上に捕捉し、標識試薬の標識を検出することにより被検出物質を検出する方法をいう。
本発明において用いる、サンドイッチイムノアッセイ法とは、被検出物質に特異的に結合する第一の捕捉物質（あるいはリガンド）に標識物質を結合した標識試薬と、固相支持体に固定化した被検出物質に特異的に結合する第二の捕捉物質（あるいはリガンド）とを用いて、検体中の被検出物質を固相支持体上に捕捉し、標識試薬の標識を検出することにより被検出物質を検出する方法をいう。
被検出物質並びに第１及び第２捕捉物質
本発明において用いることのできる捕捉物質とは、被検出物質と特異的に結合する物質を意味する。そして、被検出物質とは、捕捉物質によって特異的に結合される検出の対象とされる物質を意味する。よって、本発明において、例えば被検出物質が、インフルエンザウイルス抗原である場合には、その被検出物質と免疫学的な特異反応する抗体が捕捉物質となり、逆に該抗体を被検出物質として分析を行ないたい場合は、インフルエンザウイルス抗原を捕捉物質として用いることが可能であるので、捕捉物質はまた被検出物質にもなり得る。なお、本発明で用いる、「特異的に反応する」や、「特異的に結合する」とは、二つの物質間に起こる選択的な反応性をいい、例としては、抗原抗体反応のような免疫学的な特異反応や受容体とそのリガンドとの反応などの特異的反応や特異的結合を意味する。
本発明において用いることのできる捕捉物質とは、被検出物質と特異的に結合する物質を意味する。そして、被検出物質とは、捕捉物質によって特異的に結合される検出の対象とされる物質を意味する。よって、本発明において、例えば被検出物質が、インフルエンザウイルス抗原である場合には、その被検出物質と免疫学的な特異反応する抗体が捕捉物質となり、逆に該抗体を被検出物質として分析を行ないたい場合は、インフルエンザウイルス抗原を捕捉物質として用いることが可能であるので、捕捉物質はまた被検出物質にもなり得る。なお、本発明で用いる、「特異的に反応する」や、「特異的に結合する」とは、二つの物質間に起こる選択的な反応性をいい、例としては、抗原抗体反応のような免疫学的な特異反応や受容体とそのリガンドとの反応などの特異的反応や特異的結合を意味する。
本発明でいう被検出物質又は捕捉物質の例としては、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ＨＡＶ、ＨＢｃ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＮＬＶノーウォーク様ウイルス、ロタウイルス、パルボウイルス、等のウイルスもしくはそれらの構成部分又はそれらに対する抗体、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、炭疽菌、ＭＲＳＡ抗原等の細菌もしくはそれらの構成部分又はそれらに対する抗体、マイコプラズマ脂質、大腸菌、サルモネラ、ブドウ球菌、カンピロバクター、ウェルシュ菌、腸炎ビブリオ菌、ベロトキシン、ヒトトランスフェリン、ヒトアルブミン、ヒト免疫グロブリン、マイクログロブリン、ＣＲＰ、トロポニン、ＨＣＧ、抗ラミジア・トラコマティス、ストレプトリジンＯ、β−グルカン、ＨＢｅ、ＨＢｓ、ＲＦもしくはそれらの構成部分又はそれらに対する抗体、あるいは、ヒト繊毛製ゴナドトロピン等のペプチドホルモン又はそれらに対する抗体、ステロイドホルモン等のステロイド又はそれらに対する抗体、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類又はそれらに対する抗体、ビタミンＢ類等のビタミン類又はそれらに対する抗体、プロスタングランジン類又はそれらに対する抗体、テトラサイクリン等の抗生物質又はそれらに対する抗体、細菌等が産生する毒素又はそれらに対する抗体、各種腫瘍マーカー又はそれらに対する抗体、農薬又はそれらに対する抗体、または、病原微生物に由来する核酸配列に相補的なポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド等を挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明の検出装置及び方法において、被検出物質がインフルエンザウイルスであるときに極めて有用である。このとき、捕捉物質としては、抗インフルエンザウイルス抗体を用いることが好ましい。
抗インフルエンザウイルス抗体としては、抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体、抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体が挙げられる。これらの中で、抗インフルエンザウイルス抗体、特に抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体とラテックス粒子とからなる標識試薬の調製において、本発明の調整方法が良好である。なお、本発明において用いることのできる、これらの捕捉物質は、市販品であっても、また公知の方法で自ら調製したものであっても構わない。
抗インフルエンザウイルス抗体としては、抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体、抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体が挙げられる。これらの中で、抗インフルエンザウイルス抗体、特に抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体とラテックス粒子とからなる標識試薬の調製において、本発明の調整方法が良好である。なお、本発明において用いることのできる、これらの捕捉物質は、市販品であっても、また公知の方法で自ら調製したものであっても構わない。
標識試薬
本発明において用いる標識試薬とは、被検出物質を捕捉する第１の捕捉物質と適当な標識物質を結合させた結合体（コンジュゲート）である。標識物質には、通常イムノアッセイにおいて用いられる標識物質はいずれも用いることができる。例えば、金コロイド粒子等の金属コロイド粒子、セレニウムコロイド粒子等の非金属コロイド粒子、着色樹脂物質、染料コロイド粒子及び着色リポソーム等の不溶性状粒子やアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の発色反応を触媒する酵素、蛍光色素、放射性同位体等が挙げられる。本発明において用いる標識物質は、市場より入手可能な市販品であってよい。
本発明において用いる標識試薬とは、被検出物質を捕捉する第１の捕捉物質と適当な標識物質を結合させた結合体（コンジュゲート）である。標識物質には、通常イムノアッセイにおいて用いられる標識物質はいずれも用いることができる。例えば、金コロイド粒子等の金属コロイド粒子、セレニウムコロイド粒子等の非金属コロイド粒子、着色樹脂物質、染料コロイド粒子及び着色リポソーム等の不溶性状粒子やアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の発色反応を触媒する酵素、蛍光色素、放射性同位体等が挙げられる。本発明において用いる標識物質は、市場より入手可能な市販品であってよい。
対照部
本発明の検出装置の重要な特徴は、前記のように固相支持体上の対照部に、前記標識試薬が特異的に結合する物質を固定化されていて、この物質が、被検出物質と同一、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質であることである。
ここでいう免疫学的特異反応性とは、抗原認識分子である免疫グロブリンや抗原レセプターの抗原結合部位と抗原の抗原決定基との結合、を表す。また「被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質」であるとは、例えば、被検出物質が抗原であり、標識試薬の捕捉物質部分が前記抗原に対する抗体である場合には、前記抗体が認識する前記抗原のエピトープを含む物質が挙げられる。すなわち、捕捉物質が免疫グロブリンである場合には、前記免疫グロブリンが認識する抗原決定基を有する物質が挙げられる。これらの物質は、市販のものであってもよく、また当業者であれば公知の方法で調製することができる。
本発明の検出装置の重要な特徴は、前記のように固相支持体上の対照部に、前記標識試薬が特異的に結合する物質を固定化されていて、この物質が、被検出物質と同一、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質であることである。
ここでいう免疫学的特異反応性とは、抗原認識分子である免疫グロブリンや抗原レセプターの抗原結合部位と抗原の抗原決定基との結合、を表す。また「被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質」であるとは、例えば、被検出物質が抗原であり、標識試薬の捕捉物質部分が前記抗原に対する抗体である場合には、前記抗体が認識する前記抗原のエピトープを含む物質が挙げられる。すなわち、捕捉物質が免疫グロブリンである場合には、前記免疫グロブリンが認識する抗原決定基を有する物質が挙げられる。これらの物質は、市販のものであってもよく、また当業者であれば公知の方法で調製することができる。
更に詳細に説明すると、例えば、被検出物質がインフルエンザウイルス抗原の場合は、標識試薬は前記インフルエンザウイルス抗原の抗原決定基と結合することが可能である免疫グロブリン（例えば、抗インフルエンザウイルスモノクロナール抗体等の抗体）と標識物質の結合体であって、前記対照部の物質としては、前記インフルエンザウイルス抗原、または、該インフルエンザウイルス抗原と同一の抗原決定基を有する不活化されたインフルエンザウイルス抗原、あるいは前記インフルエンザウイルス抗原の抗原決定基を有するタンパク質、あるいは前記インフルエンザウイルス抗原の抗原決定基と同様の機能を有するタンパク質等を用いる。
装置の具体的な態様について以下に説明する。
本発明の装置の実施態様を図１を用いて説明する。
図１はラテラルフロータイプのサンドイッチイムノアッセイ装置である。装置の基本的な構成は、ｆで示されるバッキングシート上にｄで示される固相支持体シートを接着したものである。固相支持体の材質によってバッキングシートは無くてもよい。また、バッキングシートの材質は限定されないが、例えばプラスチック、紙、金属（例えばアルミニウム）等の材質が挙げられる。
シート状の固相支持体の材質は、紙やニトロセルロースなどの多孔質物質、または繊維状マトリクス、薄層クロマトグラフに用いられるシリカ、微細顆粒セルロース、ナイロン６，６などの担体が挙げられる。
本発明の装置の実施態様を図１を用いて説明する。
図１はラテラルフロータイプのサンドイッチイムノアッセイ装置である。装置の基本的な構成は、ｆで示されるバッキングシート上にｄで示される固相支持体シートを接着したものである。固相支持体の材質によってバッキングシートは無くてもよい。また、バッキングシートの材質は限定されないが、例えばプラスチック、紙、金属（例えばアルミニウム）等の材質が挙げられる。
シート状の固相支持体の材質は、紙やニトロセルロースなどの多孔質物質、または繊維状マトリクス、薄層クロマトグラフに用いられるシリカ、微細顆粒セルロース、ナイロン６，６などの担体が挙げられる。
固相支持体は、少なくとも、検体と標識試薬の混合物を供給する供給部ａ、第２の捕捉物質が固定化された捕捉試薬部ｂ、及び標識試薬に対する特異反応性が被検出物質と同等な物質を固定化した対照部ｃ、を有する。なお、捕捉試薬部ｂと対照部ｃは、供給部ａから液体の流れる方向に、双方が同じ距離に位置していてもよく、また、異なる距離に位置していてもよい。異なる距離である場合には、いずれの順番（ａ−ｂ−ｃの順番あるいは、ａ−ｃ−ｂの順番）で並んでいてもよい。ただし、捕捉試薬部に確実に標識試薬を流すという観点からは、ａ−ｂ−ｃの順番であることが望ましい。
供給部ａでは、検体と、検体中の被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬との混合物が供給される。供給部から検体溶液が供給されるため、供給部には特に吸水性担体を用いることが好ましい。吸水性担体としては例えば、セルロース、グラスファイバー、ポリプロピレン等が挙げられる。
捕捉試薬部ｂには、上述した第２の捕捉物質が固定化されている。固定化は、例えば、バッファー液に溶解あるいは懸濁した捕捉物質を塗布して、乾燥することにより行うことができる。
対照部ｃには、上記標識試薬が特異的に結合する物質が固定化されている。固定化は、例えば、バッファー液に溶解あるいは懸濁した物質を塗布して、乾燥することにより行うことができる。
捕捉試薬部ｂには、上述した第２の捕捉物質が固定化されている。固定化は、例えば、バッファー液に溶解あるいは懸濁した捕捉物質を塗布して、乾燥することにより行うことができる。
対照部ｃには、上記標識試薬が特異的に結合する物質が固定化されている。固定化は、例えば、バッファー液に溶解あるいは懸濁した物質を塗布して、乾燥することにより行うことができる。
なお、供給部ａから供給された検体液は、少なくとも捕捉試薬部ｂと対照部ｃにまでいきわたり、それぞれの部において反応が行われることが必要である。供給部ａから供給された検体液は例えば毛細管現象等を利用して流すことができる。
さらに固相支持体シートの末端には吸水性担体を備えることにより、捕捉試薬部ｂおよび対照部ｃを通過した溶液を取り除くことができ、分析される検体液の総量を増加させて試験の感度を上昇させることができるため理由から好ましい。
さらに固相支持体シートの末端には吸水性担体を備えることにより、捕捉試薬部ｂおよび対照部ｃを通過した溶液を取り除くことができ、分析される検体液の総量を増加させて試験の感度を上昇させることができるため理由から好ましい。
次に本発明の方法について説明する。
本発明の方法は、検体中の被検出物質を、被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬と、被検出物質−標識試薬複合体に特異的に結合捕捉し得る担体に固定化された第２の捕捉物質とを用いるサンドイッチイムノアッセイ法により検出する方法であって、被検出物質と同一物質、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質を前記担体に固定化し、前記物質に対する標識試薬の反応性を確認することにより検出方法の有効性を判定することを含む方法、である。
本発明の方法は、検体中の被検出物質を、被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬と、被検出物質−標識試薬複合体に特異的に結合捕捉し得る担体に固定化された第２の捕捉物質とを用いるサンドイッチイムノアッセイ法により検出する方法であって、被検出物質と同一物質、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質を前記担体に固定化し、前記物質に対する標識試薬の反応性を確認することにより検出方法の有効性を判定することを含む方法、である。
本発明の方法の他の実施態様は、上述した検出装置を用いて、サンドイッチイムノアッセイ法による検体中の被検出物質を検出する方法であって、下記工程を含むことにより偽陰性を防止することを特徴とする方法である。
（i）被検出物質を含むと推定される検体と、前記被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬を混合する工程、
（ii）前記混合液を請求項１〜３のいずれかに記載の装置の供給部（ａ）から供給する工程、
（iii）前記装置の捕捉試薬部（ｂ）上の標識試薬の存在と対照部（ｃ）上の標識試薬の存在の有無を確認する工程、
（iv）前記装置の捕捉試薬部（ｂ）及び対照部（ｃ）双方に標識試薬が存在する場合には「陽性」、捕捉試薬部（ｂ）には標識試薬が存在せず、対照部（ｃ）にのみ標識試薬が存在する場合には「陰性」、及び対照部（ｃ）に標識試薬が存在しない場合には「無効」、と判定する工程。
（i）被検出物質を含むと推定される検体と、前記被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬を混合する工程、
（ii）前記混合液を請求項１〜３のいずれかに記載の装置の供給部（ａ）から供給する工程、
（iii）前記装置の捕捉試薬部（ｂ）上の標識試薬の存在と対照部（ｃ）上の標識試薬の存在の有無を確認する工程、
（iv）前記装置の捕捉試薬部（ｂ）及び対照部（ｃ）双方に標識試薬が存在する場合には「陽性」、捕捉試薬部（ｂ）には標識試薬が存在せず、対照部（ｃ）にのみ標識試薬が存在する場合には「陰性」、及び対照部（ｃ）に標識試薬が存在しない場合には「無効」、と判定する工程。
上記方法の各工程について具体的に説明する。
患者等から採取した検体をバッファー等の検体希釈液中に溶解あるいは懸濁させて、任意に濾過等の前処理を行い、上述した標識試薬と混合する。この検体希釈液あるいは標識試薬を希釈する液体は、被検出物質と捕捉物質との反応を阻害するものでなければいずれのものも用いることができるが、例えば、塩及びｐＨを一定に維持するための緩衝剤が含まれる。さらに検体浮遊液には特異的な凝集反応を阻害しない範囲で非特異反応を減じる目的で界面活性剤を含有させることが可能である。その他、非特異反応を減じる目的でウシ血清アルブミン、イムノグロブリン、カゼイン等のタンパク質、ウサギやマウス等の血清等も含有させることができる。また、このとき標識試薬と被検出物質が十分に反応するように反応温度や時間を調整してもよい。
次に、標識試薬と検体との混合液を供給部から供給する。供給量、供給方法等は、当業者であれば適宜決定できる事項である。
患者等から採取した検体をバッファー等の検体希釈液中に溶解あるいは懸濁させて、任意に濾過等の前処理を行い、上述した標識試薬と混合する。この検体希釈液あるいは標識試薬を希釈する液体は、被検出物質と捕捉物質との反応を阻害するものでなければいずれのものも用いることができるが、例えば、塩及びｐＨを一定に維持するための緩衝剤が含まれる。さらに検体浮遊液には特異的な凝集反応を阻害しない範囲で非特異反応を減じる目的で界面活性剤を含有させることが可能である。その他、非特異反応を減じる目的でウシ血清アルブミン、イムノグロブリン、カゼイン等のタンパク質、ウサギやマウス等の血清等も含有させることができる。また、このとき標識試薬と被検出物質が十分に反応するように反応温度や時間を調整してもよい。
次に、標識試薬と検体との混合液を供給部から供給する。供給量、供給方法等は、当業者であれば適宜決定できる事項である。
次に捕捉試薬部（ｂ）上の標識試薬の存在と対照部（ｃ）上の標識試薬の存在の有無を確認する。すなわち、標識試薬が例えば着色粒子のように着色により目視で確認できるものについては、捕捉試薬部及び対照部に着色があるか否かを確認する。
次に捕捉試薬部（ｂ）及び対照部（ｃ）の双方に標識試薬が存在する場合（例えば、着色がある場合）には「陽性」と判断し、捕捉試薬部（ｂ）には標識試薬が存在せず、対照部（ｃ）にのみ標識試薬が存在する場合には「陰性」と判断する。もし対照部（ｃ）に標識試薬が存在しない場合には、捕捉試薬部（ｂ）に標識試薬があるか否かにかかわらず「無効」、と判定する。無効と判定されたものは、被検出物質の検出が何らかの原因により阻害されているから、再度検査する必要があることを意味する。
次に捕捉試薬部（ｂ）及び対照部（ｃ）の双方に標識試薬が存在する場合（例えば、着色がある場合）には「陽性」と判断し、捕捉試薬部（ｂ）には標識試薬が存在せず、対照部（ｃ）にのみ標識試薬が存在する場合には「陰性」と判断する。もし対照部（ｃ）に標識試薬が存在しない場合には、捕捉試薬部（ｂ）に標識試薬があるか否かにかかわらず「無効」、と判定する。無効と判定されたものは、被検出物質の検出が何らかの原因により阻害されているから、再度検査する必要があることを意味する。
上記方法により、被検出物質との結合に関与しなかった標識試薬は、固相支持体上の対照部に固定化された、少なくとも被検出物質と同一の特異反応性を有する前記物質と特異反応によって結合する。即ち、対照部での結合が、標識試薬と被検出物質の結合と同じ特異反応で行われるので、そのサンドイッチイムノアッセイが、この検出原理に基づいて行われたかどうかを、極めて正確に確認することが可能である。
[実施例１]
実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。
１．抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体の作製
精製Ａ型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。
得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。
取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水をそれぞれProteinAカラムクロマトグラフィー（アマシャム社製）を用いたアフィニティ精製によってＩｇＧを精製し、２種類の精製抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を得た。
２．ラテックス粒子結合抗体の調製
ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸・１水和物、同仁化学社製）を精製水で５０ｍＭ（ｐＨ６．０）に調製した溶液に、１．で作成した抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を透析した。透析した抗体液を４℃、１０，０００ × ｇ、１０分間遠心分離を行なった。上清を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体溶液とした。
また正常マウスモノクロナール抗体（ＤＡＫＯ社製）を、ＭＥＳ（同仁化学社製）を精製水で５０ｍＭ（ｐＨ６．０）に調製した溶液に透析した。透析した抗体液を４℃、１０，０００ × ｇ、１０分間遠心分離を行なった。上清を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを被検出物質を検出する機能を有さない（モデル）抗体溶液とした。
実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。
１．抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体の作製
精製Ａ型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。
得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。
取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水をそれぞれProteinAカラムクロマトグラフィー（アマシャム社製）を用いたアフィニティ精製によってＩｇＧを精製し、２種類の精製抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を得た。
２．ラテックス粒子結合抗体の調製
ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸・１水和物、同仁化学社製）を精製水で５０ｍＭ（ｐＨ６．０）に調製した溶液に、１．で作成した抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を透析した。透析した抗体液を４℃、１０，０００ × ｇ、１０分間遠心分離を行なった。上清を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体溶液とした。
また正常マウスモノクロナール抗体（ＤＡＫＯ社製）を、ＭＥＳ（同仁化学社製）を精製水で５０ｍＭ（ｐＨ６．０）に調製した溶液に透析した。透析した抗体液を４℃、１０，０００ × ｇ、１０分間遠心分離を行なった。上清を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを被検出物質を検出する機能を有さない（モデル）抗体溶液とした。
３．ラテックス粒子への抗体の結合
０．５６ｍｇ／ｍＬになるよう５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）で調製した下記の抗体溶液それぞれ０．８ｍＬに１０％着色ラテックス粒子（セラダイン社製）を２０μＬ加え、攪拌した。その後５８℃で２０分間加温した。次に、４℃、５，０００ｘｇ、１５分間遠心分離を行ない、沈殿した抗体結合着色ラテックス粒子をＭＥＳ（同仁化学社製）を精製水で５０ｍＭ（ｐＨ６．０）に調製した溶液で再懸濁し、抗体結合着色ラテックス粒子とした。
（用いた抗体溶液）
（１）抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体
（２）正常マウスモノクローナル抗体
０．５６ｍｇ／ｍＬになるよう５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）で調製した下記の抗体溶液それぞれ０．８ｍＬに１０％着色ラテックス粒子（セラダイン社製）を２０μＬ加え、攪拌した。その後５８℃で２０分間加温した。次に、４℃、５，０００ｘｇ、１５分間遠心分離を行ない、沈殿した抗体結合着色ラテックス粒子をＭＥＳ（同仁化学社製）を精製水で５０ｍＭ（ｐＨ６．０）に調製した溶液で再懸濁し、抗体結合着色ラテックス粒子とした。
（用いた抗体溶液）
（１）抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体
（２）正常マウスモノクローナル抗体
ラテックス粒子溶液の濃度（吸光度）は、分光光度計Ｕ−３０００（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）を用いて、波長８２０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。
４．装置Ｉの作成
（１）固相用Ａ型インフルエンザウイルス抗原の調製
インフルエンザウイルスは、国際特許公開番号ＷＯ９６／１５２３１に従って、インフルエンザＡに感染した無タンパク質Ｖｅｒｏ細胞培養物からか、または感染した胚を含む卵の尿嚢液から得た。
細胞培養からインフルエンザウイルス調製物を生産するために、感染したＶｅｒｏ細胞培養の上清液を、ホルマリンと混合し（最終濃度０．０２５％）、そしてウイルスを３２℃で２４時間不活化した。この材料を、０−５０％サッカロース連続勾配中のゾーン遠心分離、ＤＮａｓｅ処理、ダイアフィルトレーション、および滅菌濾過により精製し、固相用Ａ型インフルエンザウイルス抗原とした。
（１）固相用Ａ型インフルエンザウイルス抗原の調製
インフルエンザウイルスは、国際特許公開番号ＷＯ９６／１５２３１に従って、インフルエンザＡに感染した無タンパク質Ｖｅｒｏ細胞培養物からか、または感染した胚を含む卵の尿嚢液から得た。
細胞培養からインフルエンザウイルス調製物を生産するために、感染したＶｅｒｏ細胞培養の上清液を、ホルマリンと混合し（最終濃度０．０２５％）、そしてウイルスを３２℃で２４時間不活化した。この材料を、０−５０％サッカロース連続勾配中のゾーン遠心分離、ＤＮａｓｅ処理、ダイアフィルトレーション、および滅菌濾過により精製し、固相用Ａ型インフルエンザウイルス抗原とした。
（２）抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体および固相用Ａ型インフルエンザウイルス抗原固定化固相支持体の作成
トリス（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ７．５）に調製した。上記１．に記載した抗体とは異なる抗原結合部位を有する抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。透析した抗体液を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で２．９６ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したものを固相抗体液とした。
リン酸（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ８．０）に調製した。４．に記載した固相用Ａ型インフルエンザウイルス抗原を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭ（ｐＨ８．０）リン酸液で０．５９ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈したものを固相Ａ型インフルエンザウイルス抗原液とした。
トリス（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ７．５）に調製した。上記１．に記載した抗体とは異なる抗原結合部位を有する抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。透析した抗体液を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で２．９６ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したものを固相抗体液とした。
リン酸（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ８．０）に調製した。４．に記載した固相用Ａ型インフルエンザウイルス抗原を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭ（ｐＨ８．０）リン酸液で０．５９ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈したものを固相Ａ型インフルエンザウイルス抗原液とした。
固相支持体としてニトロセルロースシート（ミリポア社製）を５ｍｍｘ３０ｍｍに裁断し、その下端から７ｍｍの位置に固相抗体液を、２２ｍｍの位置に固相抗原液をバイオジエット（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて線状に塗布し、４５℃で６０分間乾燥して固相化して、それぞれ捕捉試薬部及び対照部を作成した。
次に、部材を固定し、かつ強度を増すため、ニトロセルロースシートの抗体塗布面（この面を上面とする）の反対側（この面を下面とする）にプラスチック製バッキングシート（ＢｉｏＤｏｔ社製）を接着した。その上端から５ｍｍの位置まで吸水性担体（４７０、ワットマン社製）、下端から２ｍｍの位置まで検体供給用吸水性担体（４６２、アドバンテック東洋社製）を重ねた（図１、２参照）。以上のようにして作成した装置を、装置Ｉと呼ぶ。
５．比較装置ｉの作成
（１）抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体および固相用抗マウス抗体固定化固相支持体の作成
トリス（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ７．５）に調製した。１．に記載した抗体とは異なる抗原結合部位を有する抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。透析した抗体液を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で２．９６ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈したものを固相抗体液とした。
リン酸（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ８．０）に調製した。抗マウス抗体（正常マウス抗体に対する抗体）（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ。ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭ（ｐＨ８．０）リン酸液で２．０ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈したものを固相抗マウス抗体液とした。
（１）抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体および固相用抗マウス抗体固定化固相支持体の作成
トリス（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ７．５）に調製した。１．に記載した抗体とは異なる抗原結合部位を有する抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。透析した抗体液を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で２．９６ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈したものを固相抗体液とした。
リン酸（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ８．０）に調製した。抗マウス抗体（正常マウス抗体に対する抗体）（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ。ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭ（ｐＨ８．０）リン酸液で２．０ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈したものを固相抗マウス抗体液とした。
固相支持体としてニトロセルロースシート（ミリポア社製）を５ｍｍｘ３０ｍｍに裁断し、その下端から７ｍｍの位置に固相抗体液を、２２ｍｍの位置に抗マウス抗体液をバイオジエット（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて線状に塗布し、４５℃で６０分間乾燥して固相化して、それぞれ捕捉試薬部及び対照部を作成した。
次に、部材を固定し、かつ強度を増すため、ニトロセルロースシートの抗体塗布面（この面を上面とする）の反対側（この面を下面とする）にプラスチック製バッキングシート（ＢｉｏＤｏｔ社製）を接着した。その上端から５ｍｍの位置まで吸水性担体（４７０、ワットマン社製）、下端から２ｍｍの位置まで検体供給用吸水性担体（４６２、アドバンテック東洋社製）を重ねた。以上のようにして作成した装置を、装置ｉと呼ぶ。
６．Ａ型インフルエンザウイルスの検出方法
Ａ型インフルエンザウイルスを含む検体をＡＤＡ（Ｓｉｇｍａ社製）５０ｍＭ（ｐＨ８．５）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ナカライテスク社製）２％、アルギニン塩酸塩（味の素社製）５％を含む緩衝液で１０００倍になるように希釈した。希釈したサンプル３００μＬと３．で得られた抗体結合ラテックス粒子をラテックス浮遊液で吸光度８２０ｎｍ＝２．５になるよう希釈した溶液４μＬを混合した液に、４．および５．で作製した各装置の抗体固相支持体の下端を浸漬して展開させ、１０分後に目視判定をした。その結果を表１に示した。
Ａ型インフルエンザウイルスを含む検体をＡＤＡ（Ｓｉｇｍａ社製）５０ｍＭ（ｐＨ８．５）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ナカライテスク社製）２％、アルギニン塩酸塩（味の素社製）５％を含む緩衝液で１０００倍になるように希釈した。希釈したサンプル３００μＬと３．で得られた抗体結合ラテックス粒子をラテックス浮遊液で吸光度８２０ｎｍ＝２．５になるよう希釈した溶液４μＬを混合した液に、４．および５．で作製した各装置の抗体固相支持体の下端を浸漬して展開させ、１０分後に目視判定をした。その結果を表１に示した。
表１において、「＋」は捕捉試薬部および対照部双方の青いラインを確認できること、「±」は捕捉試薬部の青い色が確認できるが非常に色が薄くかつ対象部の青いラインを確認できること、「−」は捕捉試薬部の青いラインを確認できずかつ対照部の青いラインを確認できること、「無効」は捕捉試薬部の色によらず対照部の青いラインを確認できないことを示す。
抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体を用いた（１）の抗体結合ラテックスを用いた実験では、装置による判定に差は見られない（装置Ｉ及び装置ｉいずれも＋で陽性と判断された）。しかし抗体結合ラテックスの抗体が抗インフルエンザウイルス抗体でない（２）の抗体結合ラテックスを用いた場合、比較装置ｉでは抗体結合ラテックスの抗体が抗インフルエンザウイルス抗体でないにも関わらず対照部が着色されるため「陰性」と判定されるのに対し、本発明の装置Ｉでは対照部にも標識試薬が結合しないため着色されず、「無効」と判定される。このように、抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体の免疫学的機能を保持していない標識試薬（正常マウス抗体）による偽陰性を検出することができた。
[実施例２]
１．ラテックス粒子結合抗体の調製
ＭＥＳ（同仁化学社製）を精製水で５０ｍＭ（ｐＨ６．０）に調製した溶液に、抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を透析した。透析した抗体液を４℃、１０，０００ × ｇ、１０分間遠心分離を行なった。上清を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体溶液とした。
１．ラテックス粒子結合抗体の調製
ＭＥＳ（同仁化学社製）を精製水で５０ｍＭ（ｐＨ６．０）に調製した溶液に、抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を透析した。透析した抗体液を４℃、１０，０００ × ｇ、１０分間遠心分離を行なった。上清を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体溶液とした。
２．ラテックス粒子への抗体の結合
０．５６ｍｇ／ｍＬになるよう５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）で調製した１．で作成した抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体溶液０．８ｍＬに１０％着色ラテックス粒子（セラダイン社製）を２０μＬ加え、攪拌した。その後５８℃、２０分間加温した。４℃、５，０００ｘｇ、１５分間遠心分離を行ない、沈殿した抗体結合着色ラテックス粒子をＭＥＳ（同仁化学社製）を精製水で５０ｍＭ（ｐＨ６．０）に調製した溶液で再懸濁し抗体結合着色ラテックス粒子とした。
０．５６ｍｇ／ｍＬになるよう５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）で調製した１．で作成した抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体溶液０．８ｍＬに１０％着色ラテックス粒子（セラダイン社製）を２０μＬ加え、攪拌した。その後５８℃、２０分間加温した。４℃、５，０００ｘｇ、１５分間遠心分離を行ない、沈殿した抗体結合着色ラテックス粒子をＭＥＳ（同仁化学社製）を精製水で５０ｍＭ（ｐＨ６．０）に調製した溶液で再懸濁し抗体結合着色ラテックス粒子とした。
ラテックス粒子溶液の濃度（吸光度）は、分光光度計Ｕ−３０００（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）を用いて、波長８２０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。
３．装置ＩＩの作成
（１）固相用Ａ型インフルエンザウイルス抗原の調製
インフルエンザウイルスは、国際特許番号ＷＯ９６／１５２３１に従って、インフルエンザＡに感染した無タンパク質Ｖｅｒｏ細胞培養物からか、または感染した胚を含む卵の尿嚢液から得た。
細胞培養からインフルエンザウイルス調製物を生産するために、感染したＶｅｒｏ細胞培養の上清液を、ホルマリンと混合し（最終濃度０．０２５％）、そしてウイルスを３２℃で２４時間不活化した。この材料を、０−５０％サッカロース連続勾配中のゾーン遠心分離、ＤＮａｓｅ処理、ダイアフィルトレーション、および滅菌濾過により精製し、固相用Ａ型インフルエンザウイルス抗原とした。
（１）固相用Ａ型インフルエンザウイルス抗原の調製
インフルエンザウイルスは、国際特許番号ＷＯ９６／１５２３１に従って、インフルエンザＡに感染した無タンパク質Ｖｅｒｏ細胞培養物からか、または感染した胚を含む卵の尿嚢液から得た。
細胞培養からインフルエンザウイルス調製物を生産するために、感染したＶｅｒｏ細胞培養の上清液を、ホルマリンと混合し（最終濃度０．０２５％）、そしてウイルスを３２℃で２４時間不活化した。この材料を、０−５０％サッカロース連続勾配中のゾーン遠心分離、ＤＮａｓｅ処理、ダイアフィルトレーション、および滅菌濾過により精製し、固相用Ａ型インフルエンザウイルス抗原とした。
（２）抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体および固相用Ａ型インフルエンザウイルス抗原固定化固相支持体の作成
トリス（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ７．５）に調製した。１．に記載した抗体とは異なる抗原結合部位を有する抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。透析した抗体液を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で２．９６ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈したものを固相抗体液とした。
トリス（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ７．５）に調製した。１．に記載した抗体とは異なる抗原結合部位を有する抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。透析した抗体液を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で２．９６ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈したものを固相抗体液とした。
リン酸（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ８．０）に調製した。３．に記載した固相用Ａ型インフルエンザウイルス抗原を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭ（ｐＨ８．０）リン酸液で０．５９ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈したものを固相Ａ型インフルエンザウイルス抗原液とした。
固相支持体としてニトロセルロースシート（ミリポア社製）を５ｍｍｘ３０ｍｍに裁断し、その下端から７ｍｍの位置に固相抗体液を、２２ｍｍの位置に固相抗原液をバイオジエット（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて線状に塗布し、４５℃で６０分間乾燥して固相化した。
固相支持体としてニトロセルロースシート（ミリポア社製）を５ｍｍｘ３０ｍｍに裁断し、その下端から７ｍｍの位置に固相抗体液を、２２ｍｍの位置に固相抗原液をバイオジエット（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて線状に塗布し、４５℃で６０分間乾燥して固相化した。
次に、部材を固定し、かつ強度を増すため、ニトロセルロースシートの抗体塗布面（この面を上面とする）の反対側（この面を下面とする）にプラスチック製バッキングシート（ＢｉｏＤｏｔ社製）を接着した。その上端から５ｍｍの位置まで吸水性担体（４７０、ワットマン社製）、下端から２ｍｍの位置まで検体供給用吸水性担体（４６２、アドバンテック東洋社製）を重ねた（図１、２参照）。このようにして作成した装置を装置ＩＩと呼ぶ。
４．比較装置ｉｉの作成
トリス（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ７．５）に調製した。１．に記載した抗体とは異なる抗原結合部位を有する抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。透析した抗体液を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で２．９６ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈したものを固相抗体液とした。
トリス（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ７．５）に調製した。１．に記載した抗体とは異なる抗原結合部位を有する抗Ａ型インフルエンザウイルスマウスモノクローナル抗体を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。透析した抗体液を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で２．９６ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈したものを固相抗体液とした。
リン酸（ナカライテスク社製）を精製水で１０ｍＭ（ｐＨ８．０）に調製した。抗マウス抗体（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ。ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した。濾過した溶液を１０ｍＭ（ｐＨ８．０）リン酸液で２．０ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈したものを固相抗マウス抗体液とした。
固相支持体としてニトロセルロースシート（ミリポア社製）を５ｍｍｘ３０ｍｍに裁断し、その下端から７ｍｍの位置に固相抗体液を、２２ｍｍの位置に抗マウス抗体液をバイオジエット（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて線状に塗布し、４５℃で６０分間乾燥して固相化した。
固相支持体としてニトロセルロースシート（ミリポア社製）を５ｍｍｘ３０ｍｍに裁断し、その下端から７ｍｍの位置に固相抗体液を、２２ｍｍの位置に抗マウス抗体液をバイオジエット（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて線状に塗布し、４５℃で６０分間乾燥して固相化した。
次に、部材を固定し、かつ強度を増すため、ニトロセルロースシートの抗体塗布面（この面を上面とする）の反対側（この面を下面とする）にプラスチック製バッキングシート（ＢｉｏＤｏｔ社製）を接着した。その上端から５ｍｍの位置まで吸水性担体（４７０、ワットマン社製）、下端から２ｍｍの位置まで検体供給用吸水性担体（４６２、アドバンテック東洋社製）を重ねた。このようにして作成した装置を装置ｉｉと呼ぶ。
５．Ａ型インフルエンザウイルスの検出方法
Ａ型インフルエンザウイルス感染している患者Ａ〜Ｅの鼻腔より一人の患者につき２本ずつ滅菌綿棒を用いて拭い液を採取し、１本をチューブ内に分注したＡＤＡ（Ｓｉｇｍａ社製）５０ｍＭ（ｐＨ８．５）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ナカライテスク社製）２％、アルギニン塩酸塩（味の素社製）５％を含む緩衝液０．４ｍＬ中にそれぞれ浮遊し、試験用試料を作製した。試験用試料３００μＬと２．で得られた抗体結合ラテックス粒子をラテックス浮遊液で吸光度８２０ｎｍ＝２．５になるよう希釈した溶液４μＬを混合した液に、３．および４．で作製した抗体固相支持体の下端を浸漬して展開させ、１０分後に目視判定をした。その結果を表２に示した。なお、患者Ａ〜ＥがＡ型インフルエンザウイルスに感染していることを分離培養試験により確認した。
Ａ型インフルエンザウイルス感染している患者Ａ〜Ｅの鼻腔より一人の患者につき２本ずつ滅菌綿棒を用いて拭い液を採取し、１本をチューブ内に分注したＡＤＡ（Ｓｉｇｍａ社製）５０ｍＭ（ｐＨ８．５）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ナカライテスク社製）２％、アルギニン塩酸塩（味の素社製）５％を含む緩衝液０．４ｍＬ中にそれぞれ浮遊し、試験用試料を作製した。試験用試料３００μＬと２．で得られた抗体結合ラテックス粒子をラテックス浮遊液で吸光度８２０ｎｍ＝２．５になるよう希釈した溶液４μＬを混合した液に、３．および４．で作製した抗体固相支持体の下端を浸漬して展開させ、１０分後に目視判定をした。その結果を表２に示した。なお、患者Ａ〜ＥがＡ型インフルエンザウイルスに感染していることを分離培養試験により確認した。
表２において、「＋」は捕捉試薬部および対照部双方の青いラインを確認できること、「±」は捕捉試薬部の青い色が確認できるが非常に色が薄くかつ対象部の青いラインを確認できること、「−」は捕捉試薬部の青いラインを確認できずかつ対照部の青いラインを確認できること、「無効」は捕捉試薬部の色によらず対照部の青いラインを確認できないことを示す。
患者Ａ〜Ｄではいずれの装置を用いても「＋」（陽性）と判定された。しかし、患者Ｅの検出では、比較の装置ｉｉを用いた場合には「−」（陰性）と判定されたのに対し、本発明の装置ＩＩを用いた場合には「無効」と判定された。すなわち、患者Ｅは本来「＋」（陽性）と判定されるべきであるが、捕捉試薬部および対照部双方の青いラインを確認できず「陽性」と判断できなかった。これは、何らかの理由により、Ａ型インフルエンザウイルス抗原と捕捉物質である抗体に結合しなかったためと考えられる。このようなケースにおいて従来の比較装置ｉｉでは「陰性」と判断されてしまい、いわゆる偽陰性を生じた。一方、本発明の装置ＩＩでは「無効」の判定、すなわち、本検出方法では有効に検出ができないケースであることが示され、偽陰性を回避することができた。
ａ：供給部
ｂ：捕捉試薬部
ｃ：対照部
ｄ：固相支持体
ｅ：吸水性担体
ｆ：バッキングシート
ｂ：捕捉試薬部
ｃ：対照部
ｄ：固相支持体
ｅ：吸水性担体
ｆ：バッキングシート
Claims (5)
- シート状の固相支持体上に少なくとも下記（ａ）〜（ｃ）を含む、検体中の被検出物質をサンドイッチイムノアッセイ法で検出する検出装置：
（ａ）被検出物質を含むと推定される検体と、前記被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬との混合物を供給する供給部、
（ｂ）前記被検出物質−前記標識試薬複合体を特異的に結合捕捉し得る第２の捕捉物質を固定化した捕捉試薬部、
（ｃ）前記標識試薬が特異的に結合する物質を固定化した対照部であって、前記物質が、被検出物質と同一物質、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質である、対照部。 - 被検出物質がインフルエンザウイルス抗原であり、第１の捕捉物質が抗インフルエンザウイルス抗体である請求項１に記載の検出装置。
- 検出装置がラテラルフロータイプの検出装置である請求項１または２に記載の検出装置。
- 請求項１〜３のいずれかに記載の装置を用いる、サンドイッチイムノアッセイ法による検体中の被検出物質を検出する方法であって、下記工程を含むことにより偽陰性を防止することを特徴とする方法：
（i）被検出物質を含むと推定される検体と、前記被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬を混合する工程、
（ii）前記混合液を請求項１〜３のいずれかに記載の装置の供給部（ａ）から供給する工程、
（iii）前記装置の捕捉試薬部（ｂ）上の標識試薬の存在と対照部（ｃ）上の標識試薬の存在の有無を確認する工程、
（iv）前記装置の捕捉試薬部（ｂ）及び対照部（ｃ）双方に標識試薬が存在する場合には「陽性」、捕捉試薬部（ｂ）には標識試薬が存在せず、対照部（ｃ）にのみ標識試薬が存在する場合には「陰性」、及び対照部（ｃ）に標識試薬が存在しない場合には「無効」、と判定する工程。 - 検体中の被検出物質を、被検出物質に特異的に結合する第１の捕捉物質に標識物質が結合した標識試薬と、被検出物質−標識試薬複合体を特異的に結合捕捉し得る、支持体に固定化された第２の捕捉物質とを用いるサンドイッチイムノアッセイ法により検出する方法であって、被検出物質と同一物質、または被検出物質の標識試薬への免疫学的特異反応性と同一な被検出物質に対する反応性を有する物質を前記支持体に固定化し、前記物質に対する標識試薬の反応性を確認することにより検出方法の有効性を判定することを特徴とする方法。
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