JP5367583B2 - 免疫分析装置および免疫分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、免疫分析装置および免疫分析方法に関する。

近年、感染症の診断において、細菌やウイルス等の病原体を検出する診断キットが普及している。前記診断キットの中でも、イムノクロマトグラフィ法を利用した診断キットは、簡便かつ迅速に測定可能なため、汎用されている。前記診断キットを用いた前記イムノクロマトグラフィ法による測定原理は、つぎのとおりである。すなわち、まず、多孔質膜から形成され、前記多孔質膜の測定領域に抗体が固定された検体分析用具（試験片）を準備する。これに、試料（検体）と着色粒子で標識した標識化抗体とを加える。前記試料中に検出対象物である抗原が存在すると、前記抗原を介して、前記標識化抗体と前記固定化抗体とが複合体を形成し、前記着色粒子により、例えば、多孔質膜上の測定領域が着色する。前記標識としては、着色粒子の他に、酵素と、酵素反応により着色する基質との組み合わせもある。前記測定領域は、通常、ライン状である。着色が確認された場合は、試料中に検出対象物が存在するとして陽性と判定し、着色がなければ試料中に検出対象物が存在しないとして陰性と判定する。この判定は、目視でも可能であるが、判定の客観性および効率化等の観点から、検体分析用具の測定領域の着色を光学的に検出して判定する免疫分析装置が実用化されている（例えば、特許文献１等）。しかし、イムノクロマトグラフィ法を利用した診断キットでは、非特異的反応による着色や、試薬の経時的劣化による変色やゴミ等の付着等のような免疫反応以外による着色等のような異常な着色が生じる場合もある。目視観察によれば、これらの異常な着色を区別することも可能であるが、免疫分析装置の場合は、異常な着色であっても誤って検出してしまう場合がある。

特開２００５−２４３２３号公報

そこで、本発明は、検体分析用具の測定領域において、特異的免疫反応による正常な着色と、特異的免疫反応以外による異常な着色とを、区別可能な免疫分析装置および免疫分析方法を提供することを目的とする。

本発明の免疫分析装置は、検体分析用具における特異的免疫反応による色変化を検出して、試料中の検出対象物の存否を判定する免疫分析装置であって、
前記検体分析用具の色変化を検出するための光学検出手段と、
前記光学検出手段からの情報に基づき、前記検出対象物の存否を判定する判定手段とを含み、
前記光学検出手段は、前記特異的免疫反応による色変化を検出するための主波長と前記主波長以外の副波長とを含む、二波長以上の各光学シグナルを測定する光学シグナル測定手段を含み、
前記判定手段は、前記主波長の光学シグナルを含む前記二波長以上の各光学シグナルを比較し、予め定めた比較基準に基づき、前記特異的免疫反応による色変化と、前記特異的免疫反応以外の色変化とを区別する区別手段を含み、
前記判定手段において、
前記検体分析用具の色変化を検出しない場合、前記検出対象物が存在しないとして陰性と判定し、
前記検体分析用具の色変化を検出した場合、前記区別手段により、前記特異的免疫反応による色変化に区別した場合に、前記検出対象物が存在するとして陽性と判定し、前記特異的免疫反応以外による色変化に区別した場合に、判定無効と判定することを特徴とする。

本発明の免疫分析方法は、検体分析用具における特異的免疫反応による色変化を検出して、試料中の検出対象物の存否を判定する免疫分析方法であって、
前記検体分析用具の色変化を検出する光学検出工程と、
前記光学検出工程で得られた情報に基づき、前記検出対象物の存否を判定する判定工程とを含み、
前記光学検出工程は、前記特異的免疫反応による色変化を検出するための主波長と前記主波長以外の副波長とを含む、二波長以上の各光学シグナルを測定する光学シグナル測定工程を含み、
前記判定工程は、前記主波長の光学シグナルを含む前記二波長以上の各光学シグナルを比較し、予め定めた比較基準に基づき、前記特異的免疫反応による色変化と、前記特異的免疫反応以外の色変化とを区別する区別工程を含み、
前記判定工程において、
前記検体分析用具の色変化を検出しない場合、前記検出対象物が存在しないとして陰性と判定し、
前記検体分析用具の前記色変化を検出した場合、前記区別手段により、前記特異的免疫反応による色変化に区別した場合に、前記検出対象物が存在するとして陽性と判定し、前記特異的免疫反応以外の色変化に区別した場合に、判定無効と判定することを特徴とする。

本発明は、特異的免疫反応による色変化を検出するための主波長の吸光度に加え、前記主波長以外の副波長の吸光度を測定し、比較基準に基づいて判定を行うことにより、特異的免疫反応による正常な着色と、特異的免疫反応以外による異常な着色とを簡単に区別することが可能である。このため、本発明は、例えば、非特異的反応による着色やゴミの付着等の、免疫反応以外による着色等のような、異常着色による誤判定を回避することができるため、分析精度が高い。また、二波長以上の吸光度測定と、その結果による判定は、簡単に実施できるため、装置の構成も特に複雑にすることがない。

図１（Ａ）は、本発明の免疫分析装置の一例および前記免疫分析装置に用いる検体分析用具の一例を示す斜視図である。図１（Ｂ）は、図１（Ａ）に示す免疫分析装置の内部構成の模式図である。 図２（Ａ）は、本発明に用いる試験片の一例を示す斜視図である。図２（Ｂ）は、図２（Ａ）に示す試験片の平面図である。図２（Ｃ）は、図２（Ｂ）に示す試験片のＩ−Ｉ方向に見た断面図である。 図３は、本発明の免疫分析装置における測定手段と測定領域との関係の一例を示す模式図である。 図４（Ａ）は、本発明に用いる試験片のその他の例を示す平面図である。図４（Ｂ）は、図４（Ａ）に示す試験片のＩ−Ｉ方向に見た断面図である。図４（Ｃ）は、図４（Ａ）および（Ｂ）に示す試験片を封入した検体分析用具を示す平面図である。 図５（Ａ）、図５（Ｂ）および図５（Ｃ）は、本発明の分析方法における発色反応過程の一例を示す模式図である。 図６（Ａ）および図６（Ｂ）は、本発明に用いるフロースルー型試験片における検出工程の一例を示す模式図である。

本発明は、前述のように、検体分析用具における色変化の検出から、陰性、陽性および判定無効のいずれかに判定する。前記陰性とは、例えば、前記試料中に前記検出対象物が存在しないという判定結果である。前記陽性とは、例えば、前記試料中に前記検出対象物が存在するという判定結果である。前記判定無効とは、例えば、前記検出対象物の特異的免疫反応以外による色変化が検出されたため、判定を無効とする判定結果である。本発明において、前記陽性の判定は、例えば、前記色変化の程度（例えば、発色強度等）により、例えば、１＋、２＋、３＋等のように、ランク分けすることもできる。前記ランク分けの表記としては、前記１＋等に限られず、例えば、他の定量的または半定量的判定を示す表記等であってもよく、特に制限されない。本発明において、前記特異的免疫反応による色変化とは、例えば、目的の検出対象物との特異的な免疫反応による色変化をいう。

＜免疫分析装置＞
本発明の免疫分析装置は、前述のように、検体分析用具における特異的免疫反応による色変化を検出して、試料中の検出対象物の存否を判定する免疫分析装置であって、前記検体分析用具の色変化を検出するための光学検出手段と、前記光学検出手段からの情報に基づき、前記検出対象物の存否を判定する判定手段とを含み、前記光学検出手段は、前記特異的免疫反応による色変化を検出するための主波長と前記主波長以外の副波長とを含む、二波長以上の各光学シグナルを測定する光学シグナル測定手段を含み、前記判定手段は、前記主波長の光学シグナルを含む前記二波長以上の各光学シグナルを比較し、予め定めた比較基準に基づき、前記特異的免疫反応による色変化と、前記特異的免疫反応以外の色変化とを区別する区別手段を含み、前記判定手段において、前記検体分析用具の色変化を検出しない場合、前記検出対象物が存在しないとして陰性と判定し、前記検体分析用具の色変化を検出した場合、前記区別手段により、前記特異的免疫反応による色変化に区別した場合に、前記検出対象物が存在するとして陽性と判定し、前記特異的免疫反応以外による色変化に区別した場合に、判定無効と判定することを特徴とする。

本発明において、例えば、１つの検体分析用具で分析可能な検出対象物は、一種でもよいし、二種以上でもよい。後者の場合、例えば、各検出対象物について、特異的免疫反応による色変化を検出するための主波長がそれぞれ設定される。

前記一つの主波長に対して、前記副波長は、例えば、一波長であってもよいし、二波長以上であってもよく、特に制限されない。前者の場合、二波長分析の態様であり、前記判断手段において、主波長の光学シグナルと副波長の光学シグナルとを比較する。後者の場合、例えば、三波長以上の分析の形態であり、主波長の光学シグナルといずれか一つの副波長の光学シグナルとを比較してもよいし、主波長と各副波長の光学シグナルとを比較してもよい。前述のように、検出対象物が、二種類以上の場合、各主波長に対して、副波長は、前述のように、例えば、一波長であってもよいし、二波長以上であってもよい。また、各主波長に対して、例えば、同じ副波長を設定してもよいし、異なる副波長を設定してもよい。また、例えば、各検出対象物の各主波長を、それぞれ別の検出対象物の副波長としてもよい。特に、例えば、試料中にいずれの検出対象物が含まれるかを判断する場合は、このように、各主波長を、別の検出対象物の副波長に設定することが好ましい。これによって、複数の検出対象物のうち、いずれが含まれるかを、より精度よく判断することが可能となる。

前記光学シグナルの種類は、特に制限されないが、例えば、吸光度、反射率、透過率等があげられる。なお、通常、吸光度から反射率、吸光度から透過率、反射率から吸光度、透過率から吸光度をそれぞれ算出可能である。このため、本発明においては、例えば、いずれを測定しても、その他を間接的に測定できるといえる。

本発明の免疫分析装置は、前記区別手段において、前記比較基準が、前記主波長の光学シグナルと前記副波長の光学シグナルとの大小関係の基準値であり、前記大小関係の基準値に基づき、前記主波長の光学シグナルと前記副波長の光学シグナルとを比較し、前記比較結果から、前記特異的免疫反応による色変化と、前記特異的免疫反応以外の色変化とを区別するという態様であってもよい。例えば、一つの主波長に対して、二波長以上の副波長を設定した場合、前記主波長の光学シグナルと各副波長の光学シグナルとの大小関係を示す二種類以上の基準値を使用してもよい。

前記主波長の光学シグナルと前記副波長の光学シグナルとの比較は、例えば、比を用いた比較、および、差分を用いた比較がある。

まず、前記光学シグナルが吸光度の場合における、前記比較の例について説明する。前記比を用いた比較では、例えば、前記区別手段において、前記主波長の吸光度と前記副波長の吸光度との比較が、下記式（１）で定義される前記主波長の吸光度（Ａ）と前記副波長の吸光度（Ｂ）との比（Ｒ）であり、前記大小関係の基準値が、前記比の基準値（Ｒｓ）であり、前記比の算出値（Ｒ）が前記比の基準値（Ｒｓ）以上の場合は、陽性と判定し、前記比の算出値（Ｒ）が前記比の基準値（Ｒｓ）未満の場合は、判定無効とする。また、前記比の算出値（Ｒ）が前記比の基準値（Ｒｓ）を超える場合に、陽性と判定し、前記比の算出値（Ｒ）が前記比の基準値（Ｒｓ）以下の場合に、判定無効としてもよい。
Ｒ＝Ａ／Ｂ （１）

前記比を用いた比較では、例えば、前記比が、下記式（１´）で定義される比の算出値（Ｒ´）であり、前記大小関係の基準値が、前記比の基準値（Ｒｓ´）であってもよい。この場合、前記比の算出値（Ｒ´）が前記比の基準値（Ｒｓ´）以下の場合は、陽性と判定し、前記比の算出値（Ｒ´）が前記比の基準値（Ｒｓ´）を超える場合は、判定無効である。また、前記比の算出値（Ｒ´）が前記比の基準値（Ｒｓ´）未満の場合に、陽性と判定し、前記比（Ｒ´）が前記基準値（Ｒｓ´）以上の場合に、判定無効としてもよい。
Ｒ´＝Ｂ／Ａ （１´）

前記差分を用いた比較では、例えば、前記区別手段において、前記主波長の吸光度と前記副波長の吸光度との比較が、下記式（２）で定義される前記主波長の吸光度（Ａ）と前記副波長の吸光度（Ｂ）との差分（Ｄ）であり、前記大小関係の基準値が、前記差分の基準値（Ｄｓ）であり、前記差分の算出値（Ｄ）が前記差分の基準値（Ｄｓ）以上の場合は、陽性と判定し、前記差分の算出値（Ｄ）が前記差分の基準値（Ｄｓ）未満の場合は、判定無効とする。また、前記差分（Ｄ）が前記基準値（Ｄｓ）を超える場合に、陽性と判定し、前記差分（Ｄ）が前記基準値（Ｄｓ）以下の場合に、判定無効としてもよい。
Ｄ＝Ａ−Ｂ （２）

前記差分を用いた比較では、例えば、前記差分が、下記式（２´）で定義される差分の算出値（Ｄ´）であり、前記大小関係の基準値が、前記差分の基準値（Ｄｓ´）であってもよい。この場合、前記差分の算出値（Ｄ´）が前記差分の基準値（Ｄｓ´）以下の場合は、陽性と判定し、前記差分の算出値（Ｄ´）が前記差分の基準値（Ｄｓ´）を超える場合は、判定無効とする。また、前記差分（Ｄ´）が前記基準値（Ｄｓ´）未満の場合に、陽性と判定し、前記差分（Ｄ´）が前記基準値（Ｄｓ´）以上の場合に、判定無効としてもよい。
Ｄ´＝Ｂ−Ａ （２´）

つぎに、前記光学シグナルが反射率の場合における、前記比較の例について説明する。前記比を用いた比較では、例えば、前記区別手段において、前記主波長の反射率と前記副波長の反射率との比較が、下記式（３）で定義される前記主波長の反射率（Ｐ）と前記副波長の反射率（Ｑ）との比（Ｒｒ）であり、前記大小関係の基準値が、比の基準値（Ｒｒｓ）であり、前記比の算出値（Ｒｒ）が前記比の基準値（Ｒｒｓ）以下の場合は、陽性と判定し、前記比の算出値（Ｒｒ）が前記比の基準値（Ｒｒｓ）を超える場合は、判定無効とする。また、前記比の算出値（Ｒｒ）が前記比の基準値（Ｒｒｓ）未満の場合に、陽性と判定し、前記比の算出値（Ｒｒ）が前記比の基準値（Ｒｒｓ）以上の場合に、判定無効としてもよい。
Ｒｒ＝Ｐ／Ｑ （３）

前記比を用いた比較では、例えば、前記比が、下記式（３´）で定義される前記主波長の反射率（Ｐ）と前記副波長の反射率（Ｑ）との比の算出値（Ｒｒ´）であり、前記大小関係の基準値が、前記比の基準値（Ｒｒｓ´）であってもよい。この場合、前記比の算出値（Ｒｒ´）が前記比の基準値（Ｒｒｓ´）以上の場合は、陽性と判定し、前記比の算出値（Ｒｒ´）が前記比の基準値（Ｒｒｓ´）未満の場合は、判定無効とする。また、前記比の算出値（Ｒｒ´）が前記比の基準値（Ｒｒｓ´）を超える場合に、陽性と判定し、前記比の算出値（Ｒｒ´）が前記比の基準値（Ｒｒｓ´）以下の場合に、判定無効としてもよい。
Ｒｒ´＝Ｑ／Ｐ （３´）

前記差分を用いた比較では、前記区別手段において、前記主波長の反射率と前記副波長の反射率との比較が、下記式（４）で定義される前記主波長の反射率（Ｐ）と前記副波長の反射率（Ｑ）との差分（Ｄｒ）であり、前記大小関係の基準値が、前記差分の基準値（Ｄｒｓ）であり、前記差分の算出値（Ｄｒ）が前記差分の基準値（Ｄｒｓ）以下の場合は、陽性と判定し、前記差分の算出値（Ｄｒ）が前記差分の基準値（Ｄｒｓ）を超える場合は、判定無効とする。また、前記差分の算出値（Ｄｒ）が前記差分の基準値（Ｄｒｓ）未満の場合に、陽性と判定し、前記差分の算出値（Ｄｒ）が前記差分の基準値（Ｄｒｓ）以上の場合に、判定無効としてもよい。
Ｄｒ＝Ｐ−Ｑ （４）

前記差分を用いた比較では、例えば、前記差分が、下記式（４´）で定義される前記主波長の反射率（Ｐ）と前記副波長の反射率（Ｑ）との差分（Ｄｒ´）であり、前記大小関係の基準値が、前記差分の基準値（Ｄｒｓ´）であってもよい。この場合、前記差分の算出値（Ｄｒ´）が前記差分の基準値（Ｄｒｓ´）以上の場合は、陽性と判定し、前記差分の算出値（Ｄｒ´）が前記差分の基準値（Ｄｒｓ´）未満の場合は、判定無効とする。また、前記差分の算出値（Ｄｒ´）が前記差分の基準値（Ｄｒｓ´）を超える場合に、陽性と判定し、前記差分の算出値（Ｄｒ´）が前記差分の基準値（Ｄｒｓ´）以下の場合に、判定無効としてもよい。なお、前記透過率についても、例えば、前記反射率と同じ式と判断方法とが適用できる。
Ｄｒ´＝Ｑ−Ｐ （４´）

前記比および差分についての基準値の設定は、特に制限されず、例えば、事前に、前記特異的免疫反応による正常な着色の場合と、前記特異的免疫反応以外による異常な着色の場合において、主波長の光学シグナルと副波長の光学シグナルとのデータを集め、前記データから基準値を設定してもよい。

前記判定手段において、前記検体分析用具の色変化を検出しない場合とは、例えば、前記主波長の光学シグナルが検出できない場合（例えば、検出限界未満）があげられる。また、前記判定手段において、前記主波長の光学シグナルを、予め定めた基準に基づき、前記検体分析用具の色変化を検出しないとして、陰性と判断し、前記区別手段により、前記特異的免疫反応による色変化と前記特異的免疫反応以外による色変化とに区別してもよい。

前記後者について、以下に例示する。前記光学シグナルが吸光度の場合、例えば、前記判定手段において、前記主波長の吸光度が、予め定めた基準値未満（または基準値以下）の場合は、陰性と判断し、前記主波長の吸光度が、前記基準値以上の（または前記基準値を超える）場合は、前記区別手段により、特異的免疫反応による色変化と、特異的免疫反応以外による色変化とに区別することが好ましい。また、前記光学シグナルが反射率または透過率の場合、例えば、前記判定手段において、前記主波長の反射率または透過率が、予め定めた基準値を超える（または基準値以上の）場合は、陰性と判断し、前記主波長の反射率または透過率が、前記基準値以下（または前記基準値未満）の場合は、前記区別手段により、特異的免疫反応による色変化と、特異的免疫反応以外による色変化とに区別することが好ましい。前記基準値の設定は、特に制限されず、例えば、事前に、前記特異的免疫反応による正常な着色の場合と、着色しない場合において、主波長の光学シグナルのデータを集め、前記データから基準値を設定してもよい。具体的には、例えば、目視により、正常に着色した検体分析用具と、着色していない検体分析用具とについて、同様に、前記主波長の光学シグナルのデータを集め、前記データから基準値を設定してもよい。また、例えば、検出限界濃度となるように、目的とする検出対象物の標準液を調製して、検体分析用具を用いて免疫反応を行い、前記主波長の光学シグナルのデータを集め、前記データから基準値を設定してもよい。

前記主波長と前記副波長との波長差は、例えば、１０ｎｍ以上であることが好ましく、２０ｎｍ以上であることがさらに好ましい。前記波長差は、例えば、１０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であり、より好ましくは、２０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲であり、さらに好ましくは、５０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲である。

本発明の免疫分析装置において、前記区別手段は、さらに、前記特異的免疫反応以外による色変化を、非特異的反応による色変化と、免疫反応以外による色変化とに区別してもよい。前記非特異的反応による色変化とは、例えば、検出対象物以外の物質による、非特異的な免疫反応による色変化をいう。前記免疫反応以外による色変化は、免疫反応に起因しない色変化であり、例えば、検体分析用具の試薬や部材の劣化による色変化、ゴミ等の異物の付着による色変化、傷や汚れ等による色変化等があげられる。

本発明の免疫分析装置の前記区別手段において、前記特異的免疫反応以外による色変化について、前記非特異的反応による色変化と、前記ゴミ等による色変化とを区別するための方法としては、例えば、以下の方法があげられる。この方法は、前記試料中に第１検出対象物、およびこれとは別の第２検出対象物のいずれが含まれるかを検出する方法の一例であり、２つの異なる標識物質を用い、３つの測定波長で測定を行う方法である。まず、第１検出対象物に対する抗体を第１標識物質で標識した第１標識化抗体と、第２検出対象物に対する抗体を第２標識物質で標識した第２標識化抗体とを準備する。なお、前記第１標識物質と前記第２標識物質とは、異なる吸収ピークを持つものを選択する。つぎに、検体分析用具の多孔質膜上に、前記第１検出対象物に対する抗体および前記第２検出対象物に対する抗体をそれぞれ別個に固定化して、測定領域を形成する。前記多孔質膜上の一端側に、前記二種類の標識化抗体を配置し、試料を適用し、毛細管現象等を利用して、前記二種類の標識化抗体および前記試料を前記測定領域に移動させる。そして、第１標識物質を検出するための主波長、第２標識物質を検出するための主波長および前記二つの標識物質の各主波長とは異なる波長（第３波長）の光を、前記測定領域に照射して、第１検出対象物に対する抗体を固定化した領域の吸光度と、第２検出対象物に対する抗体を固定化した領域の吸光度とを測定する。なお、前記第１標識物質の主波長および前記第２標識物質の主波長は、それぞれ、各吸収ピークを示す波長付近に設定する。この形態において、前記第１標識物質に対する副波長は、前記第２標識物質の主波長および前記第３波長であり、前記第２標識物質に対する副波長は、前記第１標識物質の主波長および前記第３波長である。ついで、前記各吸光度から、以下のようにして判定を行う。前記第１標識物質の主波長の吸光度（吸光度ａ）、前記第２標識物質の主波長の吸光度（吸光度ｂ）および第３波長の吸光度（吸光度ｃ）の全ての吸光度が小さい場合は、第１検出対象物および第２検出対象物共に「陰性」と判定する。前記吸光度ａは大きく、前記吸光度ｂおよび前記吸光度ｃは小さい場合には、前記特異的免疫反応によって第１検出対象物と反応した色変化とし、第１検出対象物は「陽性」、第２検出対象物は「陰性」と判定する。前記吸光度ｂは大きく、前記吸光度ａおよび前記吸光度ｃは小さい場合には、前記特異的免疫反応によって第２検出対象物と反応した色変化とし、第１検出対象物について「陰性」、第２検出対象物について「陽性」と判定する。前記吸光度ａおよび前記吸光度ｂは大きく、前記吸光度ｃは小さい場合には、第１標識化抗体および第２標識化抗体のいずれかが、前記非特異的反応により前記測定領域に結合した色変化とし、非特異的反応により「判定無効」と判定する。さらに、前記吸光度a、吸光度ｂおよび吸光度ｃの全ての吸光度が大きい場合には、前記ゴミ等による色変化とし、ゴミ等により「判定無効」と判定する。このように、前記方法においては、前記吸光度ａ、吸光度ｂおよび吸光度ｃの大小関係から、前記特異的免疫反応による色変化と、前記非特異的反応による色変化と、前記ゴミ等による色変化とを区別して判定可能である。なお、この方法は、一例であり、本発明を制限するものではない。また、前記検出対象物に応じて、前記標識化抗体および固定化抗体に代えて、例えば、標識化抗原および固定化抗原を適宜使用できる。

本発明の免疫分析装置において、前記検体分析用具は、測定領域と、前記測定領域に固定された、前記検出対象物に結合可能な固定化抗体または固定化抗原（以下、「固定化抗体等」ともいう）とを含み、試料と、色変化により識別可能な標識で標識された、前記検出対象物に結合可能な標識化抗体等とを、前記検体分析用具の前記測定領域に導入し、前記試料中に検出対象物が存在する場合は、前記標識化抗体等が、前記検出対象物を介して、前記固定化抗体等に結合して複合体を形成することにより、前記測定領域において前記標識による色変化が生じ、前記測定領域の前記色変化を前記光学検出手段により検出するという態様であってもよい。本態様は、後述するように、固定化抗体と標識化抗体という二種類の抗体を用いた態様でもよいし、固定化抗原と標識化抗体とを用いた態様でもよいし、固定化抗体と標識化抗原とを用いた態様でもよいし、固定化抗原と標識化抗原という二種類の抗原を用いた態様でもよい。このように、固定化した抗体または抗原と、標識化した抗体または抗原という、二種類の試薬を用いた態様としては、検体分析用具の構成により、例えば、ラテラルフロー型と、フロースルー型とに大別できる。また、例えば、試料や、抗体等の試薬が移動できることから、流路を備えることが好ましい。前記流路は、例えば、多孔質膜における孔構造でもよいし、基板に設けられた溝でもよい。前記検体分析用具は、例えば、前記測定領域を含む多孔質膜を備えていることが好ましい。

本発明において、前記標識化抗体および標識化抗原の標識は、例えば、着色不溶性担体粒子であり、前記色変化が、前記着色不溶性担体粒子を含む前記複合体の形成による、前記測定領域の着色であってもよい。また、前記標識が、例えば、酵素であり、前記色変化が、前記複合体に含まれる前記酵素との酵素反応によって基質が着色することによる前記測定領域の着色であってもよい。

本発明において、例えば、前記検出対象物が複数種類であり、前記測定領域に、前記各検出対象物に応じた複数種類の固定化抗体等が固定され、前記各検出対象物に応じた複数種類の標識化抗体または標識化抗原を、前記測定領域に導入するという態様であってもよい。

本発明の免疫分析装置において、前記光学シグナル測定手段は、特に制限されず、測定する光学シグナルの種類に応じて適宜決定できるが、例えば、前記光学シグナルが、前記吸光度の場合には、吸光度測定手段を含むのが好ましく、前記反射率の場合には、反射率測定手段を含むのが好ましく、前記透過率の場合には、透過率測定手段を含むのが好ましい。また、前記光学シグナル測定手段は、例えば、前記吸光度測定手段、反射率測定手段および透過率測定手段からなる群から選択されるいずれか一つを有してもよいし、いずれか２つまたは全てを有してもよい。

つぎに、本発明について例をあげて詳細に説明する。

本発明において、前記試料は、例えば、検体等を含んでいればよく、特に制限されない。前記試料は、例えば、前記検体を処理して調製してもよい。前記処理としては、特に制限されないが、例えば、抽出処理、希釈処理、ろ過処理等があげられる。前記抽出処理の場合、例えば、前記検体を処理液に添加し、前記検体中の抗原または抗体を抽出し、これを試料としてもよい。前記検体は、例えば、液状のものが好ましいが、これに限定されず、例えば、固体状でもよい。前記検体が固体状の場合には、例えば、前記処理液中に、前記検体を溶解、懸濁または分散した液を試料としてもよいし、さらに、ろ過した液を試料としてもよい。前記各種処理に用いる処理液としては、特に限定されないが、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液等があげられる。前記各種処理液には、例えば、界面活性剤、安定化剤、抗菌剤等を適宜添加してもよい。前記ろ過処理は、特に制限されないが、例えば、メンブレンフィルター等を用いてもよい。前記検体としては、例えば、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔ぬぐい液、鼻汁、咽頭ぬぐい液、含漱液、唾液、全血、血清、血漿、便、尿、髄液等の生体試料、動物および植物等の食物や加工食品等の食品、環境検査における河川の水等があげられ、特に限定されない。

本発明において、前記検出対象物としては、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、ノロウイルス、麻疹ウイルス、ロタウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヘルペスウイルス、マイコプラズマ、梅毒トレポネーマ、クラミジア・トラコマチス、結核菌、大腸菌群、Ａ群溶血性連鎖球菌（Ａ群溶連菌）、Ｂ群溶血性連鎖球菌（Ｂ群溶連菌）、肺炎球菌、ブドウ球菌、ＭＲＳＡ、レジオネラ、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、ベロ毒素、サルモネラ、クロストリジウム・ディフィシル、ヘリコバクター・ピロリ、ＣＲＰ、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗原、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、トロポニンＴ、トロポニンＩ、ミオグロビン、Ｄ−ダイマー、便中ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ、ＩｇＥ抗体等の病原体抗原、抗体、癌マーカー、ホルモン等の生体成分等があげられるが、これらに限られず、例えば、残留農薬、環境ホルモン、食品中のアレルギー物質等もあげられ、特に制限されない。本発明において、前記検出対象物は、一種類でもよく、二種類以上を組み合わせてもよい。

本発明において、色変化を生じる特異的免疫反応の種類は、特に制限されず、公知の免疫反応が採用できる。

具体的には、第１の例として、検出試薬として、検出対象物に特異的に反応する抗体を使用する方法があげられる。前記抗体としては、例えば、検体分析用具の測定領域に固定された固定化抗体と、標識が結合した標識化抗体とを使用するのが好ましい。このような抗体を使用すれば、例えば、前記試料中に検出対象物が存在する場合、前記検出対象物と前記固定化抗体および標識化抗体とが免疫反応により結合して、前記検体分析用具の測定領域上で、複合体を形成する。

また、第２の例として、検出試薬として、前記検出対象物が特異的に反応する抗原と、前記検出対象物に特異的に反応する抗体とを使用する方法があげられる。前記抗原は、例えば、検体分析用具の測定領域に固定された固定化抗原であることが好ましく、前記抗体は、例えば、標識が結合した標識化抗体であることが好ましい。このような検出試薬を使用すれば、例えば、前記試料中に前記検出対象物が存在する場合、前記検出対象物と前記固定化抗原および標識化抗体とが免疫反応により結合して、前記検体分析用具の測定領域上で、複合体を形成する。

また、第３の例として、検出試薬として、前記検出対象物が特異的に反応する抗原を使用する方法があげられる。前記抗原としては、例えば、検体分析用具の測定領域に固定された固定化抗原と、標識が結合した標識化抗原とを使用することが好ましい。このような検出試薬を使用すれば、例えば、前記試料中に前記検出対象物が存在する場合、前記検出対象物と前記固定化抗原および標識化抗原とが免疫反応により結合して、前記検体分析用具の測定領域上で、複合体を形成する。

このように免疫反応により形成された複合体について、後述するように、前記標識化抗体または標識化抗原における標識の種類に応じて、色変化を測定すればよい。

本発明において、前記標識化抗体または前記標識化抗原は、特に限定されず、例えば、標識として着色不溶性担体粒子を結合させた抗体または抗原でもよく、標識として酵素を結合させた抗体または抗原でもよい。

本発明において、前記着色不溶性担体粒子としては、特に限定されず、例えば、着色ラテックス粒子、金属コロイド粒子、着色ポリメチルメタクリレート粒子、着色ポリ乳酸粒子、着色多孔性ガラス粒子、着色シリカ粒子、着色アガロース粒子、着色デキストラン粒子等があげられる。前記着色ラテックス粒子としては、特に限定されないが、例えば、青色ラテックス粒子、赤色ラテックス粒子等があげられる。前記金属コロイド粒子としては、特に限定されないが、例えば、金コロイド粒子、白金コロイド粒子等があげられる。前記着色不溶性担体粒子の平均粒子径は、特に限定されず、前記着色ラテックス粒子の場合には、例えば、０．０５μｍ〜５μｍの範囲であり、好ましくは、０．１μｍ〜１μｍの範囲であり、前記金属コロイド粒子の場合には、例えば、２ｎｍ〜１００ｎｍの範囲であり、好ましくは、１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲である。本発明において、前記検出対象物が二以上の場合、前記着色不溶性担体粒子としては、例えば、着色の異なる二種類以上の前記着色不溶性担体粒子を用いるのが好ましい。前記着色の異なる二種類以上の着色不溶性担体粒子を用いる場合、各粒子の前記吸収ピークの波長差は、例えば、１０ｎｍ以上であることが好ましく、２０ｎｍ以上であることがさらに好ましい。前記波長差は、例えば、１０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であり、より好ましくは、２０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲であり、さらに好ましくは、５０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲である。各着色不溶性担体粒子の吸収ピークの波長またはその近傍波長を、それぞれ、前記各着色不溶性担体粒子による色変化を検出するための主波長とすることが好ましい。また、ある着色不溶性担体粒子に対しては、前述のように、異なる着色不溶性担体粒子による色変化を検出するための主波長を、副波長として設定してもよい。

本発明において、前記酵素としては、反応によって基質を着色させるものであればよく、特に限定されないが、例えば、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等があげられる。

本発明において、前記基質としては、前記酵素に反応して着色するものであればよく、特に限定されない。前記基質としては、例えば、２，２´−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、３，３´，５，５´−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、４−メチルウムベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（４ＭＵＧ）、３−（２´−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３´´−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＧＰＤ）等があげられる。

本発明において、前記検出対象物が二以上の場合、前記酵素と基質との反応による着色は、例えば、それぞれ異なる着色が好ましい。この場合、各検出対象物に対する前記酵素と基質は、例えば、それぞれ、反応時の着色が異なる組み合わせが好ましい。各着色の前記吸収ピークの波長差は、例えば、前述の範囲があげられる。各着色の吸収ピークの波長またはその近傍波長を、それぞれ、前記着色による色変化を検出するための主波長とすることが好ましい。また、ある着色に対しては、異なる着色による色変化を検出するための主波長を、副波長として設定してもよい。

本発明において、前記標識化抗体の抗体としては、検出対象物に結合可能な抗体であれば特に限定されず、例えば、前記検出対象物として例示した、前述の各種抗原に結合可能な抗体や、各種抗体に結合可能な抗体があげられる。前記抗体の種類は、特に制限されないが、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＹ等があげられる。前記抗体は、例えば、免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２等の抗体フラグメント等があげられ、特に制限されない。また、前記抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳類、ニワトリ等の鳥類等由来の血清から、従来公知の方法により作製してもよく、あるいは市販の各種抗体を利用してもよく、特に制限されない。さらに、前記抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、前記検出対象物等に応じて適宜設定できる。本発明において、前記固定化抗体の抗体としては、例えば、前記標識化抗体と同様に、前記検出対象物に結合可能な抗体があげられる。前記固定化抗体の種類や調製方法は、例えば、前記標識化抗体と同様である。

本発明において、前記標識化抗原の抗原としては、検出対象物と結合可能な抗原であれば特に限定されず、例えば、前記検出対象物として例示した、前述の各種抗体に結合可能な抗原があげられる。また、本発明において、前記固定化抗原の抗原としては、特に限定されず、例えば、前記標識化抗原と同様に、前記検出対象物に結合可能な抗原があげられる。本発明において、前記標識化抗原および前記固定化抗原の作製方法は、例えば、従来公知の方法等があげられ、特に制限されない。

本発明において、前記主波長および副波長の範囲は、特に制限されず、例えば、検出する色変化に応じ適宜決定することができる。具体例として、特異的免疫反応による色変化が青色の着色の場合、主波長を、例えば、６００〜６６０ｎｍの範囲（例えば、６１０ｎｍ）で設定し、副波長を、例えば、５００〜５５０ｎｍの範囲（例えば、５２５ｎｍ）で設定してもよい。また、具体例として、特異的免疫反応による色変化が赤色の着色の場合、主波長を、例えば、５００〜５５０ｎｍの範囲（例えば、５２５ｎｍ）で設定し、副波長を、例えば、６００〜６６０ｎｍの範囲（例えば、６１０ｎｍ）で設定してもよい。

つぎに、本発明の免疫分析装置について、光学シグナルとして反射率を測定する例をあげて説明する。ただし、本発明の免疫分析装置は、以下の例に限定されない。

図１に、本例の免疫分析装置を示す。図１（Ａ）は、本例の免疫分析装置および前記免疫分析装置に用いる検体分析用具の斜視図であり、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）に示す前記免疫分析装置の内部構成の模式図である。両図において、同一部分には同一符号を付している。図１（Ａ）に示すように、本例の免疫分析装置１は、箱型の装置本体の正面に、検体分析用具２を挿入する複数の挿入口１１が形成されている。検体分析用具２は、ケース体２１の中に試験片（図１には図示せず）が収容されているという構成である。前記ケース体２１上面には、試料を供給するための試料孔２２と、試験片の測定領域が露出した計測窓２３が形成されている。試験片の構成については、後述する。

図１（Ｂ）に示すように、本例の免疫分析装置１は、測定手段４、および制御分析部５を含み、これらが、光学シグナル測定手段を含む光学検出手段および判定手段となる。前記測定手段４は、光源部４１および受光部４２を含み、Ｘ方向４５に移動可能である。本例において、前記光源部４１および前記受光部４２は、前記免疫分析装置１内に挿入される前記検体分析用具２の上方に配置され、前記光源部４１から照射された照射光の反射光を、前記受光部４２により測定可能である。前記光源部４１は、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）や半導体レーザーダイオード（ＬＤ）等で構成される。前記受光部４２は、例えば、フォトダイオード、光電子増倍管（フォトマル）、ＣＣＤイメージセンサ等から構成される。本例において、前記受光部４２は、前記二波長光の照射による反射光を、時間差で交互に測定する。前記制御分析部５は、前記測定手段４の前記光源部４１および前記受光部４２における光照射と受光とを制御する制御手段、および測定した前記反射光から反射率を算出して陽性または陰性等を判定する判定手段とを含む。本例において、前記判定手段は、例えば、ＣＰＵ、メモリー、入力端末および出力端末から構成される。前記入力端末としては、例えば、キーボードやタッチパネルがあげられる。前記出力端末は、例えば、ディスプレイやプリンターがあげられる。なお、制御分析部５は、全部が本例の装置本体の中に配置されていてもよいし、全部または一部が、装置本体外部に配置されていてもよい。例えば、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）内に、制御手段を構成してもよい。また、ＣＰＵにおいて、例えば、前記判定手段による陽性、陰性および判定無効の判定ないし区別が実行される。なお、判定手段で用いる前述の各種の判断基準値は、例えば、予めメモリーに記憶させて判定の際に参照してもよいし、入力手段でＣＰＵに入力して参照してもよい。

つぎに、図２に、本例における前記試験片３を示す。図２（Ａ）は、前記試験片３の斜視図であり、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）に示す前記試験片３の平面図（上面図）であり、図２（Ｃ）は、図２（Ｂ）に示す前記試験片３のＩ−Ｉ方向にみた断面図である。前記三図において、同一部分には同一符号を付している。図示のように、本例の試験片３は、ラテラルフロー型である。前記試験片３は、支持体３１上の中央部に、多孔質膜３２が配置されている。前記多孔質膜３２上には、前記固定化抗体がライン状に固定され、ライン状の測定領域３６ａ、３６ｂおよび３６ｃが形成されている。本例において、前記測定領域３６ａは、抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体が固定化されたＡ型インフルエンザウイルス検出領域であり、前記測定領域３６ｂは、抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体が固定化されたＢ型インフルエンザウイルス検出領域であり、前記測定領域３６ｃは、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体が固定化されたコントロール検出領域である。前記多孔質膜３２の一端側（図において左）の上には、標識化抗体含浸パッド３３の一部が積層して配置され、さらにその上に、サンプルパッド３４が配置されている。本例において、前記標識化抗体含浸パッド３３は、青色ラテックス標識抗Ａ型インフルエンザモノクローナル抗体および赤色ラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザモノクローナル抗体が含浸されている。前記多孔質膜３２の他端側（図において右）の上には、吸収パッド３５の一部が積層して配置されている。前述のように、前記試験片３は、前記ケース体２１内に収容されており、前記測定領域３６ａ、３６ｂおよび３６ｃは、前記計測窓２３に位置して露出しており、サンプルパッド３４は、前記試料孔２２の下に位置している。

本発明において、前記多孔質膜は、特に制限されないが、毛細管作用を奏するものが好ましく、例えば、セルロース膜、酢酸セルロース、ニトロセルロース等のセルロース誘導体膜、ガラスフィルター、濾紙等があげられる。本発明において、前記多孔質膜の形状は、特に限定されず、例えば、長方形、円形等があげられる。本発明において、前記多孔質膜の大きさは、特に制限されず、適宜設定できる。

前記支持体の材質としては、特に制限されず、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリエステル、酢酸セルロース等から形成されたものが使用でき、その形状としては、フィルム状、シート状、板状のいずれでもよい。前記支持体の形状および大きさは、特に制限されず、前記試験片の構成に応じて、適宜設定できる。

前記標識化抗体含浸パッドの材質としては、特に制限されず、例えば、ポリエチレン、グラスファイバー、レーヨン、ナイロン、紙、セルロース等があげられる。本例において、前記標識化抗体含浸パッド３３は、例えば、前記標識化抗体を含む緩衝液を含浸させ、乾燥させて作製する。前記緩衝液としては、特に限定されず、例えば、前述の緩衝液等があげられる。本発明において、前記標識化抗体含浸パッドの形状および大きさは、特に制限されず、適宜設定できる。

前記サンプルパッドの材質としては、特に制限されず、例えば、前記標識化抗体含浸パッドであげた材料等を用いてもよい。前記サンプルパッドの形状および大きさは、特に制限されず、適宜設定できる。そして、前記吸収パッドの材質としても、同様に特に制限されず、例えば、前記サンプルパッドの材料等があげられる。前記吸収パッドの形状および大きさは、特に制限されず、適宜設定できる。

本例の試験片では、前記多孔質膜３２の幅方向に伸びる三本のライン状に測定領域を形成したが、本発明はこれに限定されず、測定領域の個数は、例えば、１〜１０個の範囲で自由に設定でき、また測定領域の形状も、ライン状以外に、例えば、矩形、円形等があげられる。

前記ケース体の材質としては、特に限定されず、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ樹脂等があげられる。

つぎに、本例の免疫分析装置を用いた免疫分析方法の一例について、図１〜３に基づき説明する。なお、図３は、図１における測定手段と測定領域との関係を示す図である。また、本発明の免疫分析装置は、これには制限されない。

まず、咽頭部内壁を綿棒で拭って検体を採取する。そして、前記綿棒を前記抽出液に浸して前記検体を抽出し、試料を調製する。

つぎに、前記試料孔２２に、前記試料を滴下する。前記試料滴下後３０秒以内に、前記検体分析用具２を、前記挿入口１１に挿入する。前記滴下により、前記試料は、前記試料孔２２下部の前記サンプルパッド３４を介して前記標識化抗体含浸パッド３３に供給され、さらに、前記標識化抗体含浸パッド３３に含浸された前記標識化抗体を溶解する。前記試料が検出対象物である抗原を含む場合には、抗原抗体反応により、前記標識化抗体と前記抗原とが結合し、抗原−標識化抗体結合体を形成する。そして、前記抗原−標識化抗体結合体は、前記多孔性膜３２に展開され、前記測定領域の前記固定化抗体に結合して複合体を形成する。前記複合体の形成により、測定領域３６ａ〜３６ｃが発色する。この一連の反応について、図５（Ａ）、図５（Ｂ）および図５（ｃ）の模式図に基づき、具体的に説明する。前記図５の各図において、図１から図３と同一部分には同一符号を付している。図５（Ａ）に示すように、測定領域３６に固定化抗体６が固定された多孔質膜３２を準備する。前記多孔質膜３２の前記測定領域３６が位置する側と反対側（図において左側）の一端に、抗原８を含む試料および標識化抗体７を導入する。同図において、７１が抗体であり、７２は標識である。図５（Ｂ）に示すように、前記標識化抗体７は、前記抗原８と結合して抗原−標識化抗体結合体９を形成し、矢印で示すように、前記結合体９は、毛細管現象により、前記多孔質膜３２内を長手方向に移動して前記測定領域３６に到達する。ついで、図５（Ｃ）に示すように、前記結合体９は、前記抗原８を介して前記固定化抗体６と結合して複合体１０を形成し、これによって前記測定領域３６が前記標識７２によって着色する。前記着色を、主波長および副波長の光４３を照射することによって検出する。本例において、前記試料に、Ａ型インフルエンザ抗原が含まれる場合には、前記測定領域３６ａが青色に発色し、Ｂ型インフルエンザ抗原が含まれる場合には、前記測定領域３６ｂが赤色に発色する。また、前記測定領域３６ｃは、前記両方の前記標識化抗体が結合すると、青色と赤色の両方の発色によって、結果、紫色に発色するため、前記各標識化抗体が前記測定領域に展開（到達）したことを確認できる。前記測定領域３６に保持されなかった試料は、前記吸収パッド３５に吸収される。

試料滴下から所定時間経過後、前記測定手段４により、つぎのようにして、前記測定領域の発色を測定する。前記所定時間は、特に限定されないが、例えば、５〜１５分の範囲である。そして、前記測定手段４は、前記光源部４１により、前記試験片３の前記測定領域３６ａ、３６ｂおよび３６ｃを含む前記多孔質膜３２上に、６１０ｎｍおよび５２５ｎｍの二種類の前記照射光４３を照射し、前記受光部４２により、各波長の反射光４４を、０．１秒以下の時間差で交互に測定する。前記測定手段４は、前記検体分析用具２の上方を、Ｘ方向４５（前記検体分析用具２の短手方向）に、前述の測定を繰り返しながら移動することにより、全測定領域を含む領域の前記反射光４４を測定する。本例においては、前記３６ａの測定ラインでは、６１０ｎｍが主波長になり、５２５ｎｍが副波長になり、前記３６ｂの測定ラインでは、５２５ｎｍが主波長になり、６１０ｎｍが副波長となる。

つぎに、前記制御分析部５において、反射光の測定値から反射率を算出する。前記反射率は、例えば、白色のコントロール片の反射光の測定値に対する前記測定ラインの反射光の測定値の割合で算出してもよい。つぎに、まず、主波長の反射率を基準値と比較し、基準値よりも大きい場合は、「陰性」と判断し、基準値以下の場合は、主波長の反射率（Ｐ）と副波長の反射率（Ｑ）との比（Ｒｒ＝Ｐ／Ｑ）を求める。そして、予め定めた比の基準値（Ｒｒｓ）と前記比の算出値（Ｒｒ）とを比較し、前記比の算出値（Ｒｒ）が前記比の基準値（Ｒｒｓ）以下の場合は、正常な着色であるから「陽性」と判定し、前記比の算出値（Ｒｒ）が前記比の基準値（Ｒｒｓ）を超える場合は、異常な着色であるから「判定無効」と判定する。そして、これらの判定結果を、前記出力端末で出力する。なお、これらの判定結果は、メモリーに記憶させてもよい。また、前記判定方法に代えて、前記比の算出値（Ｒｒ）が前記比の基準値（Ｒｒｓ）未満の場合に「陽性」と判定し、前記比の算出値（Ｒｒ）が前記比の基準値（Ｒｒｓ）以上の場合に「判定無効」と判定してもよい。なお、本例では、反射光の測定値から反射率を算出したが、例えば、前記制御分析部５において、透過率または吸光度を算出し、基準値と比較してもよい。

本例では、ラテラルフロー型の試験片を用いたが、前述のように、フロースルー型の試験片を用いてもよい。図６（Ａ）および図６（Ｂ）に、フロースルー型試験片における一連の検出工程を模式的に示す。前記両図において、図１から図５と同一部分には、同一符号を付している。図６（Ａ）に示すように、多孔質膜３２の上面の一部に測定領域３６を形成し、前記測定領域３６に固定化抗体６を固定する。また、多孔質膜３２の下には、吸収パッド３５を接触状態で配置する。前記多孔質膜３２の測定領域３６の上方から、抗原８を含む試料および標識化抗体７を導入する。図６（Ｂ）に示すように、標識化抗体７は抗原８と結合して抗原−標識化抗体結合体９を形成し、かつ、前記結合体９は、前記抗原８を介して前記固定化抗体６と結合して複合体１０を形成し、これによって前記測定領域３６が標識７２により着色する。また、試料中の他の液体等は、矢印で示すように、前記多孔質膜３２の厚み方向に浸透し、前記吸収パッド３５で吸収される。そして、前記光源部４１により、主波長および副波長の光４３を照射して、前記着色を検出する。本例において、前記受光部４２は、前記二波長光の照射による反射光４４を、時間差で交互に測定する。なお、本例は、光学シグナルを反射率としたが、これには制限されない。光学シグナルが、吸光度または透過率の場合、例えば、前記測定手段４を前記検体分析用具２の下方に配置して、透過光を測定し、前記制御分析部５で、吸光度または透過率を算出してもよい。この場合、前記検体分析用具２において、前記計測窓２３は、光の照射部であり、この反対側に、透過率を検出するための、試験片の測定領域３６が露出した計測窓が形成されていることが好ましい。

＜免疫分析方法＞
つぎに、本発明の免疫分析方法は、前述のように、検体分析用具における特異的免疫反応により色変化を検出して、試料中の検出対象物の存否を判定する免疫分析方法であって、前記検体分析用具の前記色変化を検出する光学検出工程と、前記光学検出工程で得られた情報に基づき、前記検出対象物の存否を判定する判定工程とを含む。特に示さない限り、前記本発明の免疫分析装置で説明した方法を、適用できる。

前記光学検出工程は、前記特異的免疫反応による色検出を検出するための主波長と、前記主波長以外の副波長とを含む、二波長以上の各光学シグナルを測定する光学シグナル測定工程を含む。前記光学検出工程は、例えば、前記光学シグナル測定工程以外のその他の工程を含んでもよい。前記その他の工程としては、特に制限されない。

前記判定工程は、前記二波長以上の各光学シグナルを比較し、予め定めた比較基準に基づき、前記特異的免疫反応による色変化と、前記特異的免疫反応以外の色変化とを区別する区別工程を含む。前記判定工程は、例えば、前記区別工程以外のその他の工程を含んでもよい。前記その他の工程としては、特に制限されない。

本発明の免疫分析方法において、前記光学シグナルの種類は、特に制限されないが、例えば、吸光度、反射率、透過率等があげられる。

前記区別工程において、前記比較基準は、例えば、前記主波長の光学シグナルと前記副波長の光学シグナルとの大小関係の基準値であり、前記大小関係の基準値に基づき、前記主波長の光学シグナルと前記副波長の光学シグナルとを比較し、前記比較結果から、前記特異的免疫反応による色変化と、前記特異的免疫反応以外の色変化とを区別するという態様であってもよい。前記副波長は、前述のように、例えば、一波長であってもよいし、二波長以上であってもよい。本発明の免疫分析方法は、例えば、前者のように、二波長分析の態様であってもよいし、後者のように、三波長以上の波長を用いてもよい。

本発明の免疫分析方法において、前記主波長の光学シグナルと前記副波長の光学シグナルの比較は、前述のように、例えば、比を用いた比較、差分を用いた比較がある。

前記判定工程において、例えば、前記主波長の光学シグナルを、予め定めた基準に基づき、前記検体分析用具の色変化を検出しないとして、陰性と判定し、前記区別工程において、前記特異的免疫反応による色変化と前記特異的免疫反応以外による色変化とに区別することが好ましい。

前記判定工程において、例えば、前記主波長の吸光度が、予め定めた基準値未満（または基準値以下）の場合は、陰性と判定し、前記主波長の吸光度が、前記基準値以上の（または前記基準値を超える）場合に、前記区別工程において、前記特異的免疫反応による色変化と前記特異的免疫反応以外による色変化とに区別することが好ましい。前記基準値設定は、特に制限されず、例えば、前述のように、事前に集めたデータから基準値を設定してもよい。

前記区別工程において、さらに、前記特異的免疫反応以外による色変化を、非特異的反応による色変化と、免疫反応以外による色変化とに区別してもよい。前記非特異的反応による色変化および前記免疫反応以外による色変化とは、例えば、前述のとおりである。前記特異的免疫反応以外による色変化を、前記２つの色変化に区別する方法は、例えば、前述のとおりである。

つぎに、本発明の免疫分析装置の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は、下記の実施例および比較例に限定ないし制限されない。

（実施例１）
本例では、図１に示す免疫分析装置を用いて、試料中のＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスを検出した。本例において、図４に示す検体分析用具を用いた。図４（Ａ）は、試験片３の平面図（上面図）であり、図４（Ｂ）は、図４（Ａ）に示す前記試験片３のＩ−Ｉ方向に見た断面図であり、図４（Ｃ）は、図４（Ａ）および（Ｂ）に示す前記試験片３をケース体２１に収容した検体分析用具２の平面図（上面図）である。同図において、図１から図３と同一部分には同一符号を付している。この検体分析用具２はコントロール検出領域３６ｃが形成されていない以外は、図１から図３に示す検体分析用具と同じ構成である。

＜インフルエンザウイルス検出用の検体分析用具の作製＞
本例に用いる検体分析用具を、以下のようにして作製した。

（１）青色ラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体液の調製
まず、青色ラテックス粒子（粒子径０．３μｍ、セラダイン社製）を、２０ｍｍｏｌ／Ｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁した。さらに、抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（フィッツジェラルド社製）を添加して、室温で６０分間反応させた。前記反応液を遠心分離して、上清を除去後、１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン含有ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）を加えて再懸濁した。前記再懸濁液を遠心分離後、上清を除去した。回収した抗体を、下記組成のラテックス分散用緩衝液に懸濁し、青色ラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体液を調製した。

（ラテックス分散用緩衝液の組成）
成分 濃度
トリス緩衝液（ｐＨ８．４） ２５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １ｗ／ｖ％

（２）赤色ラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体液の調製
赤色ラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体液は、前記青色ラテックス粒子に代えて、赤色ラテックス粒子（粒子径０．３μｍ、セラダイン社製）を用い、前記抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体に代えて、抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（フィッツジェラルド社製）を用いた以外は、前記青色ラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体液と同様にして、調製した。

（３）構成部材の作製
まず、以下のようにして、試験片の構成部材を準備した。

標識化抗体含浸パッドの作製
前記青色ラテックス標識抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体液および前記赤色ラテックス標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体液を１：１（体積比）の比率で混合した。前記混合液を、幅１ｃｍ、長さ３０ｃｍに裁断したガラスフィルター（ミリポア社製）に含浸させ、７０℃で４５分間乾燥機で乾燥し、標識化抗体含浸パッド３３を作製した。

抗体固定化膜の作製
ニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製）を幅３ｃｍ、長さ３０ｃｍの帯状に裁断した。このメンブレンを、抗体塗布装置（バイオドット社製）にセットし、帯の長手方向一端から１１ｍｍのライン上に、抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（フィッツジェラルド社製）を塗布し、測定領域３６ａとした。また、帯の長手方向一端から１５ｍｍのライン上に、抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（フィッツジェラルド社製）を塗布し、測定領域３６ｂとした。前記抗体を塗布したメンブレンを、４０℃で２０分間、乾燥機で乾燥させ、抗体固定化膜３２を作製した。

サンプルパッド、吸収パッドおよび支持体の作製
サンプルパッド３４は、ろ紙（ミリポア社製）を幅２．６ｃｍ、長さ３０ｃｍに裁断して作製した。吸収パッド３５は、ろ紙（ワットマン社製）を幅２．９ｃｍ、長さ３０ｃｍに裁断して作製した。支持体３１は、両面テープ付のプラスチックシートを幅７．７ｃｍ、長さ３０ｃｍに裁断して作製した。

（４）試験片の作製
以下のようにして、試験片３を作製した。なお、図４において、左側を上流、右側を下流とした。まず、前記支持体３１の中央に、前記抗体固定化膜３２を、前記測定領域３６ａを上流側（図において左側）にして貼付した。前記抗体固定化膜３２の前記測定領域３６ｂ側端部から、下流側（図において右側）の前記支持体３１端部上に、前記吸収パッド３５を貼付した。そして、前記抗体固定化膜３２の前記測定領域３６ａ側端部から、上流側の前記支持体３１端部上に、前記抗体固定化膜３２と長手方向に１ｍｍ重なるようにして、前記標識化抗体含浸パッド３３を貼付し、その上に前記サンプルパッド３４を積層した。各構成部材を前述のように積層した後、４ｍｍ幅の短冊状に裁断し、幅４ｍｍ、長さ７７ｍｍの試験片３を作製した。

（５）検体分析用具の作製
前記試験片３を、試料孔２２および計測窓２３を備えたケース体２１に封入し、本例に用いる検体分析用具２を作製した。

＜インフルエンザウイルスの検出＞
前記検体分析用具２を用いて、以下のようにして、検体中のインフルエンザウイルスを分析した。前記検体としては、トラップ付気管カテーテルで採取した鼻腔吸引液を使用した。なお、本例では、下記（６）に示すＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、前記検体中のインフルエンザウイルスの存否を確認し、前記ウイルスの存否を確認した検体について、本例の免疫分析装置および目視により、前記ウイルスの存否を判定した。

（６）ＲＴ−ＰＣＲ法によるインフルエンザウイルスの検出
本例では、Ｗａｎｇｄｏｎｇ Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ．Ｈ．ＥｖａｎｓによるＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスのマトリックス蛋白検出方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９１年、３３巻、１６５−１８９頁）を用いて、前記ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。

（７）免疫分析装置によるインフルエンザウイルスの検出
前記ＲＴ−ＰＣＲ法により、インフルエンザウイルスが検出されなかった陰性検体４例、Ａ型インフルエンザウイルスが検出されたＡ型陽性検体３例およびＢ型インフルエンザウイルスが検出されたＢ型陽性検体３例について、つぎのようにして、前記検体分析用具２を用いて測定した。まず、前記鼻腔吸引液を下記組成の検体抽出液に懸濁し、前記懸濁液１２０μＬを、前記試料孔２２に滴下した。滴下１５分後に、本例の免疫分析装置１を用いて、異なる二波長（６１０ｎｍ、５２５ｎｍ）の光を前記測定領域３６ａおよび３６ｂを含む領域に照射し、前記測定領域の反射率を測定した。なお、前記Ａ型インフルエンザウイルスは、６１０ｎｍを主波長とし、５２５ｎｍを副波長とした。また、前記Ｂ型インフルエンザウイルスは、５２５ｎｍを主波長とし、６１０ｎｍを副波長とした。

（検体抽出液の組成）
成分 濃度
トリス緩衝液（ｐＨ７．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｗｅｅｎ２０ ０．５ｗ／ｖ％
ＮａＣｌ ０．９ｗ／ｖ％
ＢＳＡ １ｗ／ｖ％

つぎに、得られた各反射率を用いて、前述と同様にして、前記インフルエンザウイルスの存否を判定した。なお、本例において、陰性の判定に用いる前記主波長の反射率の基準値は９９％とした。また、算出する比は、前述の「Ｒｒ＝Ｐ／Ｑ」とし、前記比の基準値（Ｒｒｓ）は、０．９９とした。

（８）目視によるインフルエンザウイルスの検出
また、前記測定領域３６ａおよび３６ｂの着色の有無を目視により確認し、前記インフルエンザウイルスの存否を判定した。前記目視による判定において、前記測定領域３６ａが青色の場合はＡ型インフルエンザ陽性、前記測定領域３６ｂが赤色の場合はＢ型インフルエンザ陽性、各測定領域に着色のない場合は各インフルエンザ陰性、各測定領域の着色が青色または赤色以外の場合、ゴミの付着の場合または膜の傷の場合は判定無効と判定した。

（比較例１）
本例では、前記異なる二波長の光に代えて、Ａ型インフルエンザウイルスの検出には、６１０ｎｍの波長光のみを照射し、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出には、５２５ｎｍの波長光のみを照射した以外は、実施例１と同様にして測定した。また、本例では、主波長の反射率が９９％を超える場合に陰性と判定し、前記主波長の反射率が９９％以下の場合に陽性と判定した。

下記表１に、実施例１および比較例１の分析結果を示す。同表において、「−」は陰性を示し、「＋」は陽性を示す。同表に示すように、１０検体中、比較例１では３検体（検体Ｎｏ．３、Ｎｏ．４およびＮｏ．１０）が目視判定と一致しなかったのに対し、実施例１では全て目視判定と一致した。検体Ｎｏ．３は、ＲＴ−ＰＣＲ法によると、Ａ型およびＢ型共に陰性だが、検体由来の非特異的反応により、目視判定では、Ａ型検出用の測定領域３６ａに紫色の発色が確認された。前記非特異的反応による発色について、比較例１の分析方法では、Ａ型陽性と判定され、誤った結果となった。一方、実施例１の分析方法では、Ａ型の分析は判定無効と判定され、前記非特異的反応による発色について、正しく判定された。また、検体Ｎｏ．４は、ＲＴ−ＰＣＲ法によると、Ａ型およびＢ型共に陰性の検体であるが、Ｂ型検出用の測定領域３６ｂに付着した汚れにより、目視判定では、Ｂ型について判定無効と判定された。前記測定領域の汚れについて、比較例１の分析方法では、Ｂ型陽性と判定され、誤った結果となった。一方、実施例１の分析方法では、Ｂ型の分析は判定無効と判定され、前記測定領域の汚れについて、正しく判定された。さらに、検体Ｎｏ．１０は、ＲＴ−ＰＣＲ法によると、Ａ型インフルエンザ陰性およびＢ型インフルエンザ陽性の検体であるが、検体由来の非特異的反応により、目視判定では、Ａ型検出用の測定領域３６ａに紫色の発色が確認された。前記非特異的反応による発色について、比較例１の分析方法では、Ａ型陽性と判定され、誤った結果となった。一方、実施例１の分析方法では、Ａ型の分析は判定無効と判定され、前記測定領域の汚れについて、正しく判定された。なお、Ｂ型検出用の測定領域３６ｂに確認された赤色の発色については、比較例１および実施例１共に、正しく判定された。

（実施例２）
本例では、図１に示す免疫分析装置１を用いて、実施例１と同様に、検体中のＡ群溶血性連鎖球菌（以下、Ａ群溶連菌という。）を検出した。本例において、試験片としては、前記標識化抗体含浸パッド３３が、抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体および抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体に代えて、抗Ａ群溶連菌抗体を含み、一つのライン状の測定領域３６ａを有し、各パッドおよび各膜の大きさが、後述のように異なること以外は、実施例１と同じ構成の試験片を用いた。

＜Ａ群溶連菌検出用試験片の作製＞
本例に用いる試験片３を、以下のようにして作製した。

（１）青色ラテックス標識抗Ａ群溶連菌ポリクローナル抗体液の作製
本例では、前記抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体に代えて、前記抗Ａ群溶連菌ポリクローナル抗体（ヤギ、フィッツジェラルド社製）を用いた以外は、実施例１と同様にして、青色ラテックス標識抗Ａ群溶連菌ポリクローナル抗体液を調製した。

（２）試験片の作製
以下のようにして、試験片を構成する各構成部材を準備した。本例の試験片は、実施例１の各構成部材に代えて、これらの構成部材を用いた以外は、実施例１と同様にして作製した。

標識化抗体含浸パッドの作製
本例では、前記ガラスフィルターの長さを、３０ｃｍに代えて２５ｃｍとし、前記混合液に代えて、前記青色ラテックス標識抗Ａ群溶連菌ポリクローナル抗体液を用いた以外は、実施例１と同様にして、標識化抗体含浸パッド３３を作製した。

抗体固定化膜の作製
本例では、前記ニトロセルロースメンブレンの長さを、３０ｃｍに代えて２５ｃｍとし、前記抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体に代えて、抗Ａ群溶連菌ポリクローナル抗体（ウサギ、フィッツジェラルド社製）を用い、ニトロセルロースメンブレン端部から１５ｍｍのライン上の測定領域３６ｂに抗体を塗布しなかった以外は、実施例１と同様にして、抗体固定化膜３２を作製した。

サンプルパッド、吸収パッドおよび支持体の作製
本例では、前記ガラスフィルター、ろ紙およびプラスチックシートの長さを、３０ｃｍに代えて２５ｃｍとした以外は、実施例１と同様にして、サンプルパッド３４、吸収パッド３５および支持体３１を作製した。

＜Ａ群溶連菌の検出＞
前記検体分析用具２を用いて、以下のようにして、検体中のＡ群溶連菌を分析した。前記検体としては、綿棒で採取した咽頭ぬぐい液を使用した。なお、本例では、下記（３）に示す培養法を用いて、前記検体中のＡ群溶連菌の存否を確認し、前記Ａ群溶連菌の存否を確認した検体について、本例の免疫分析装置および目視により、前記Ａ群溶連菌の存否を判定した。

（３）培養法によるＡ群溶連菌の検出
本例では、以下のようにして検体を培養した。まず、前記検体を生理食塩水に懸濁し、前記懸濁液をヒツジ血液寒天培地に塗抹し、３６℃の炭酸ガスインキュベータ内で１〜２日間培養した。培養終了後、β溶血を示すコロニーを採取し、前述と同様にして培養した。得られたコロニーを、ラテックス凝集法キット（三菱化学メディエンス社製）を用いて群別し、検体中のＡ群溶連菌の存否を確認した。

（４）免疫分析装置によるＡ群溶連菌の検出
前記培養法により、Ａ群溶連菌が検出されなかった陰性検体４例、Ａ群溶連菌が検出された陽性検体４例について、つぎのようにして、本例の検体分析用具２を用いて測定した。まず、前記咽頭ぬぐい液を、抽出液Ａ（０．２ｍｏｌ／Ｌクエン酸水溶液）０．４ｍＬと抽出液Ｂ（２ｍｏｌ／Ｌ亜硝酸ナトリウム水溶液）０．２ｍＬとの混合液に懸濁し、１分間放置して抽出処理した。前記抽出処理液を、抽出液Ｃ（１ｍｏｌ／Ｌトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）０．１ｍＬを用いて中和し、得られた処理済検体液を試料とした。この試料９０μＬを、前記試料孔２２に滴下し、滴下１０分後に、本例の免疫分析装置１を用いて、異なる二波長（６１０ｎｍ、５２５ｎｍ）の光を前記測定領域３６ａを含む領域に照射し、前記測定領域３６ａの反射率を測定した。なお、前記Ａ群溶連菌は、６１０ｎｍを主波長とし、５２５ｎｍを副波長とした。

つぎに、得られた各反射率を用いて、前記Ａ群溶連菌の存否を判定した。なお、本例では、実施例１と同じ基準値および判定方法を用いて判定した。

（５）目視によるＡ群溶連菌の検出
また、前記測定領域３６ａの着色の有無を目視により確認し、前記Ａ群溶連菌の存否を判定した。前記目視による判定において、前記測定領域３６ａが青色の場合は陽性、着色のない場合は陰性、着色が青色以外の場合およびゴミの付着または膜の傷の場合は判定無効と判定した。

（比較例２）
本例では、前記異なる二波長の光に代えて、６１０ｎｍの波長光のみを照射した以外は、実施例２と同様にして測定した。また、本例では、主波長の反射率が９９％を超える場合に陰性と判定し、前記主波長の反射率が９９％以下の場合に陽性と判定した。

下記表２に、実施例２および比較例２の分析結果を示す。同表において、「−」は陰性を示し、「＋」は陽性を示す。同表に示すように、８検体中、比較例１では２検体（検体Ｎｏ．３およびＮｏ．４）が目視判定と一致しなかったのに対し、実施例１では全て目視判定と一致した。検体Ｎｏ．３は、培養法によると陰性の検体であり、目視判定では、着色はみられなかったが、前記測定領域３６ａの膜の傷により、判定無効と判定された。前記測定領域の傷について、比較例２の分析方法では、陽性と判定され、誤った結果となった。一方、実施例２の分析方法では、判定無効と判定され、前記傷について正しく判定された。また、検体Ｎｏ．４は、培養法によると陰性の検体であるが、前記測定領域３６ａに付着したゴミ（髪の毛）により、目視判定では、判定無効と判定された。前記測定領域のゴミについて、比較例２の分析方法では陽性と判定され、誤った結果となった。一方、実施例２の分析方法では、判定無効と判定され、前記測定領域のゴミについて、正しく判定された。

（実施例３）
本例では、図１に示す免疫分析装置１を用いて、検体中のＲＳウイルスを検出した。本例において、試験片としては、前記青色ラテックス粒子に代えて、金コロイド粒子を含み、前記標識化抗体含浸パッド３３が、抗Ａ群溶連菌抗体に代えて、抗ＲＳウイルス抗体を含む以外は、実施例２と同じ構成の試験片を用いた。

＜ＲＳウイルス検出用試験片の作製＞
本例に用いる試験片を、以下のようにして作製した。

（１）金コロイド標識抗ＲＳウイルスモノクローナル抗体液の作製
本例では、前記青色ラテックス粒子に代えて、金コロイド粒子（粒子径２０ｎｍ、ＢＢＩ社製）を用い、前記抗Ａ群溶連菌ポリクローナル抗体に代えて、抗ＲＳウイルスモノクローナル抗体（フィッツジェラルド社製）を用い、前記ラテックス分散用緩衝液に代えて、金コロイド分散用緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液、ｐＨ８．０）を用いた以外は、実施例２と同様にして、金コロイド標識抗ＲＳウイルスモノクローナル抗体液を調製した。

（２）試験片の作製
本例の試験片は、前記標識化抗体含浸パッド、前記抗体固定化膜および前記サンプルパッドとして、実施例２の各構成部材に代えて、以下の各構成部材を用いた以外は、実施例２と同様にして、作製した。

標識化抗体含浸パッドの作製
本例では、前記青色ラテックス標識抗Ａ群溶連菌ポリクローナル抗体液に代えて、前記金コロイド標識抗ＲＳウイルスモノクローナル抗体液を用いた以外は、実施例２と同様にして、標識化抗体含浸パッド３３を作製した。

抗体固定化膜の作製
本例では、抗Ａ群溶連菌ポリクローナル抗体に代えて、抗ＲＳウイルスモノクローナル抗体（フィッツジェラルド社製）を用いた以外は、実施例２と同様にして、抗体固定化膜３２を作製した。

サンプルパッドの作製
本例では、前記ガラスフィルターに代えて、ろ紙（ミリポア社製）を用いた以外は、実施例２と同様にして、サンプルパッド３４を作製した。

＜ＲＳウイルスの検出＞
前記検体分析用具２を用いて、以下のようにして、検体中のＲＳウイルスを分析した。前記検体としては、前記鼻腔吸引液を使用した。なお、本例では、下記（３）に示すＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、前記検体中のＲＳウイルスの存否を確認し、前記ＲＳウイルスの存否を確認した検体について、本例の免疫分析装置および目視により、前記ＲＳウイルスの存否を判定した。

（３）ＲＴ−ＰＣＲ法によるＲＳウイルスの検出
本例では、Ｊ．ＳｔｏｃｋｔｏｎらによるＲＳウイルスの検出方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９８年、３６巻、１０号、２９９０−２９９５頁）を用いて、前記ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。

（４）免疫分析装置によるＲＳウイルスの検出
前記ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＲＳウイルスが検出されなかった陰性検体４例、ＲＳウイルスが検出された陽性検体４例について、前記インフルエンザウイルス検出用試験片に代えて、前記ＲＳウイルス検出用試験片を用いた以外は、前記実施例２と同様にして測定した。なお、前記ＲＳウイルスは、５２５ｎｍを主波長とし、６１０ｎｍを副波長とした。

つぎに、得られた各反射率を用いて、前記ＲＳウイルスの存否を判定した。なお、本例では、実施例２と同じ基準値および判定方法を用いた。

（５）目視によるＲＳウイルスの検出
また、前記測定領域３６ａの着色の有無を目視により確認し、前記ＲＳウイルスの存否を判定した。前記目視による判定において、前記測定領域３６ａが赤色の場合は陽性、着色のない場合は陰性、着色が赤色以外の場合およびゴミの付着または膜の傷の場合は判定無効と判定した。

（比較例３）
本例では、前記異なる二波長の光に代えて、５２５ｎｍの波長光のみを照射した以外は、実施例３と同様にして測定した。また、本例では、比較例２と同じ基準値および判定方法を用いて、検体中のＲＳウイルスの存否を判定した。

下記表３に、実施例３および比較例３の分析結果を示す。同表において、「−」は陰性を示し、「＋」は陽性を示す。同表に示すように、８検体中、比較例３では２検体（検体Ｎｏ．３およびＮｏ．４）が目視判定と一致しなかったのに対し、実施例３では全て目視判定と一致した。検体Ｎｏ．３は、ＲＴ−ＰＣＲ法では陰性の検体であり、目視判定では、着色は観察されなかったが、前記測定領域３６ａの膜の傷により、判定無効と判定された。前記測定領域の傷について、比較例３の分析方法では、陽性と判定され、誤った結果となった。一方、実施例３の分析方法では、判定無効と判定され、前記傷について正しく判定された。また、検体Ｎｏ．４は、ＲＴ−ＰＣＲ法では陰性の検体であるが、前記測定領域３６ａに付着したゴミ（糸くず）により、目視判定では判定無効と判定された。前記測定領域のゴミについて、比較例３の分析方法では陽性と判定され、誤った結果となった。一方、実施例３の分析方法では、判定無効と判定され、前記測定領域のゴミについて、正しく判定された。

本発明は、特異的免疫反応による正常な着色と、非特異的反応や測定領域上のゴミや傷等による異常な着色とを区別して判定可能である。本発明は、臨床検査、生化学検査、医学研究等の分野に適用可能であり、その用途は限定されず、広い分野に適用可能である。

１ 免疫分析装置
１１ 挿入口
２ 検体分析用具
２１ ケース体
２２ 試料孔
２３ 計測窓
３ 試験片
３１ 支持体
３２ 多孔質膜、抗体固定化膜
３３ 標識化抗体含浸パッド
３４ サンプルパッド
３５ 吸収パッド
３６、３６ａ、３６ｂ、３６ｃ 測定領域
４ 測定手段、光学検出手段
４１ 光源部
４２ 受光部
４３ 照射光
４４ 反射光
４５ Ｘ方向
５ 制御分析部、判定手段
６ 固定化抗体
７ 標識化抗体
７１ 抗体
７２ 標識
８ 抗原
９ 抗原−標識化抗体結合体
１０ 複合体

Claims (23)

1. 検体分析用具における特異的免疫反応による色変化を検出して、試料中の検出対象物の存否を判定する免疫分析装置であって、
   前記検体分析用具の色変化を検出するための光学検出手段と、
   前記光学検出手段からの情報に基づき、前記検出対象物の存否を判定する判定手段とを含み、
   前記光学検出手段は、前記特異的免疫反応による色変化を検出するための主波長と前記主波長以外の副波長とを含む、二波長以上の各光学シグナルを測定する光学シグナル測定手段を含み、
   前記判定手段は、前記主波長の光学シグナルと前記副波長の光学シグナルとを比較し、予め定めた前記主波長の光学シグナルと前記副波長の光学シグナルとの大小関係の基準値に基づき、前記比較結果から、前記特異的免疫反応による色変化と、前記特異的免疫反応以外の色変化とを区別する区別手段を含み、
   前記判定手段において、
   前記主波長の光学シグナルと、予め定めた基準とに基づき、
   前記検体分析用具の色変化を検出しない場合は、前記検出対象物が存在しないとして陰性と判定し、
   前記検体分析用具の色変化を検出した場合は、前記区別手段により、前記特異的免疫反応による色変化に区別した場合に、前記検出対象物が存在するとして陽性と判定し、前記特異的免疫反応以外による色変化に区別した場合に、判定無効と判定することを特徴とする免疫分析装置。
2. 前記光学シグナルが、吸光度、反射率および透過率からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１記載の免疫分析装置。
3. 前記光学シグナルが、吸光度であり、
   前記区別手段において、下記式（１）で定義される前記主波長の吸光度（Ａ）と前記副波長の吸光度（Ｂ）との比（Ｒ）により、前記主波長の吸光度と前記副波長の吸光度とを比較し、
   前記大小関係の基準値が、前記比についての基準値（Ｒｓ）であり、
   前記比（Ｒ）が前記基準値（Ｒｓ）以上の場合は、陽性と判定し、
   前記比（Ｒ）が前記基準値（Ｒｓ）未満の場合は、判定無効と判定する請求項１または２記載の免疫分析装置。
   Ｒ＝Ａ／Ｂ （１）
4. 前記光学シグナルが、吸光度であり、
   前記区別手段において、下記式（２）で定義される前記主波長の吸光度（Ａ）と前記副波長の吸光度（Ｂ）との差分（Ｄ）により、前記主波長の吸光度と前記副波長の吸光度とを比較し、
   前記大小関係の基準値が、前記差分についての基準値（Ｄｓ）であり、
   前記差分（Ｄ）が前記基準値（Ｄｓ）以上の場合は、陽性と判定し、
   前記差分（Ｄ）が前記基準値（Ｄｓ）未満の場合は、判定無効と判定する請求項１または２記載の免疫分析装置。
   Ｄ＝Ａ−Ｂ （２）
5. 前記光学シグナルが、吸光度であり、
   前記判定手段において、前記主波長の吸光度が、予め定めた基準値未満の場合は、前記検体分析用具の色変化を検出しないとして、陰性と判断し、
   前記主波長の吸光度が前記基準値以上の場合に、前記区別手段により、前記特異的免疫反応による色変化と前記特異的免疫反応以外による色変化とに区別する、請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫分析装置。
6. 前記主波長と前記副波長との波長差が、１０ｎｍ以上である請求項１から５のいずれか一項に記載の免疫分析装置。
7. 前記区別手段において、さらに、前記特異的免疫反応以外による色変化を、非特異的反応による色変化と、免疫反応以外による色変化とに区別する請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫分析装置。
8. 前記検体分析用具は、測定領域と、前記測定領域に固定された、前記検出対象物に結合可能な固定化抗体または固定化抗原とを含み、
   前記試料と、色変化により識別可能な標識で標識された、前記検出対象物に結合可能な標識化抗体または前記検出対象物に結合可能な標識化抗原とを、前記検体分析用具の前記測定領域に導入し、
   前記試料中に前記検出対象物が存在する場合は、前記標識化抗体または前記標識化抗原が、前記検出対象物を介して、前記固定化抗体または前記固定化抗原に結合して複合体を形成することにより、前記測定領域において前記標識による色変化が生じ、
   前記測定領域の前記色変化を前記光学検出手段により検出する請求項１から７のいずれか一項に記載の免疫分析装置。
9. 前記標識が、着色不溶性担体粒子であり、前記色変化が、前記着色不溶性担体粒子を含む前記複合体の形成による、前記測定領域の着色である請求項８記載の免疫分析装置。
10. 前記標識が、酵素であり、前記色変化が、前記複合体に含まれる前記酵素との酵素反応によって基質が着色することによる前記測定領域の着色である請求項８記載の免疫分析装置。
11. 前記検出対象物が複数種類であり、前記測定領域に、前記各検出対象物に応じた複数種類の固定化抗体または固定化抗原が固定され、前記各検出対象物に応じた複数種類の標識化抗体または標識化抗原を、前記測定領域に導入する請求項８から１０のいずれか一項に記載の免疫分析装置。
12. 前記測定領域において、前記各検出対象物に応じた前記複数種類の固定化抗体または固定化抗原は、それぞれ別個に固定されている、請求項１１記載の免疫分析装置。
13. 前記光学シグナル測定手段が、前記二波長以上の各光学シグナルを測定する吸光度測定手段、反射率測定手段および透過率測定手段からなる群から選択される少なくとも一つの手段を含む請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫分析装置。
14. 検体分析用具における特異的免疫反応による色変化を検出して、試料中の検出対象物の存否を判定する免疫分析方法であって、
    前記検体分析用具の色変化を検出する光学検出工程と、
    前記光学検出工程で得られた情報に基づき、前記検出対象物の存否を判定する判定工程とを含み、
    前記光学検出工程は、前記特異的免疫反応による色変化を検出するための主波長と前記主波長以外の副波長とを含む、二波長以上の各光学シグナルを測定する光学シグナル測定工程を含み、
    前記判定工程は、前記主波長の光学シグナルと前記副波長の光学シグナルとを比較し、予め定めた前記主波長の光学シグナルと前記副波長の光学シグナルとの大小関係の基準値に基づき、前記比較結果から、前記特異的免疫反応による色変化と、前記特異的免疫反応以外の色変化とを区別する区別工程を含み、
    前記判定工程において、
    前記主波長の光学シグナルと、予め定めた基準とに基づき、前記検体分析用具の色変化を検出しない場合は、前記検出対象物が存在しないとして陰性と判定し、
    前記検体分析用具の前記色変化を検出した場合は、前記区別手段により、前記特異的免疫反応による色変化に区別した場合に、前記検出対象物が存在するとして陽性と判定し、前記特異的免疫反応以外の色変化に区別した場合に、判定無効と判定することを特徴とする免疫分析方法。
15. 前記光学シグナルが、吸光度、反射率および透過率からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１４記載の免疫分析方法。
16. 前記光学シグナルが、吸光度であり、
    前記区別工程において、下記式（１）で定義される前記主波長の吸光度（Ａ）と前記副波
    長の吸光度（Ｂ）との比（Ｒ）により、前記主波長の吸光度と前記副波長の吸光度とを比較し、
    前記大小関係の基準値が、前記比についての基準値（Ｒｓ）であり、
    前記比（Ｒ）が前記基準値（Ｒｓ）以上の場合は、陽性と判定し、
    前記比（Ｒ）が前記基準値（Ｒｓ）未満の場合は、判定無効と判定する請求項１４または１５記載の免疫分析方法。
    Ｒ＝Ａ／Ｂ （１）
17. 前記光学シグナルが、吸光度であり、
    前記区別工程において、下記式（２）で定義される前記主波長の吸光度（Ａ）と前記副波長の吸光度（Ｂ）との差分（Ｄ）により、前記主波長の吸光度と前記副波長の吸光度とを比較し、
    前記大小関係の基準値が、前記差分についての基準値（Ｄｓ）であり、
    前記差分（Ｄ）が前記基準値（Ｄｓ）以上の場合は、陽性と判定し、
    前記差分（Ｄ）が前記基準値（Ｄｓ）未満の場合は、判定無効と判定する請求項１４または１５記載の免疫分析方法。
    Ｄ＝Ａ−Ｂ （２）
18. 前記光学シグナルが、吸光度であり、
    前記判定工程において、前記主波長の吸光度が、予め定めた基準値未満の場合は、前記検
    体分析用具の色変化を検出しないとして、陰性と判定し、
    前記主波長の吸光度が前記基準値以上の場合に、前記区別工程において、前記特異的免疫反応による色変化と前記特異的免疫反応以外による色変化とに区別する、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の免疫分析方法。
19. 前記主波長と前記副波長の波長差が、１０ｎｍ以上である請求項１４から１８のいずれか一項に記載の免疫分析方法。
20. 前記区別工程において、さらに、前記特異的免疫反応以外による色変化を、非特異的反応による色変化と、免疫反応以外による色変化とに区別する請求項１４から１９のいずれか一項に記載の免疫分析方法。
21. 前記検体分析用具は、測定領域と、前記測定領域に固定された、前記検出対象物に結合可能な固定化抗体または固定化抗原とを含み、
    前記試料と、色変化により識別可能な標識で標識された、前記検出対象物に結合可能な標識化抗体または前記検出対象物に結合可能な標識化抗原とを、前記検体分析用具の前記測定領域に導入し、
    前記試料中に前記検出対象物が存在する場合は、前記標識化抗体または前記標識化抗原が、前記検出対象物を介して、前記固定化抗体または前記固定化抗原に結合して複合体を形成することにより、前記測定領域において前記標識による色変化が生じ、
    前記測定領域の前記色変化を前記光学検出工程において検出する、請求項１４から２０のいずれか一項に記載の免疫分析方法。
22. 前記検出対象物が複数種類であり、前記測定領域に、前記各検出対象物に応じた複数種類の固定化抗体または固定化抗原が固定され、前記各検出対象物に応じた複数種類の標識化抗体または標識化抗原を、前記測定領域に導入する請求項２１記載の免疫分析方法。
23. 前記測定領域において、前記各検出対象物に応じた前記複数種類の固定化抗体または固定化抗原は、それぞれ別個に固定されている、請求項２２記載の免疫分析方法。

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