JPS61189454A - 安定化された固定化抗体 - Google Patents

安定化された固定化抗体

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JPS61189454A
JPS61189454A JP3113885A JP3113885A JPS61189454A JP S61189454 A JPS61189454 A JP S61189454A JP 3113885 A JP3113885 A JP 3113885A JP 3113885 A JP3113885 A JP 3113885A JP S61189454 A JPS61189454 A JP S61189454A
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JP
Japan
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antibody
immobilized
soln
immobilizing antibody
solution
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JP3113885A
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Shoji Katsuki
勝木 昭次
Seitaro Muto
武藤 誠太郎
Fujiko Kitabori
北堀 不二子
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Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/531Production of immunochemical test materials

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  • General Physics & Mathematics (AREA)
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 星!上立上月全里 この発明は、安定化された固定化抗体に関する。 さら
に詳細には、免疫化学的測定に使用される固定化抗体に
おいて、免疫活性を損なうことなく長期保存できる安定
化きれた固定化抗体に関し、疾病の診断等の医療の分野
で利用される。
尖未技貫 近年、生体内の微量物質(例えば、ホルモン、癌関連物
質等)の定量法として、酵素免疫測定法(以下、’EI
A、という)、ラジオイムノアッセイなどが広く用いら
れ、すでに測定キットが実用に供されている。 これら
の測定法の内EIAの一例を具体的に示すと、固相に結
合させた抗体(以下ゝ固定化抗体」という)と酵素標識
した抗体(以下1酵素標識抗体」という)とで測定対象
物質(抗yi、)をサンドインチ状に固定化し、固定化
された状態の測定対象物質を反応系から分離する。 そ
して、結合した測定対象物質量の定量は、酵素標識抗体
の酵素と基質との反応によって生成する物質の量を測定
することにより行なわれる。 従って、EIAキットの
実用化にあたっては、固定化抗体の免疫活性を長期間安
定に保持することが重要な課題であり、このことは、E
IAに限らず、ラジオイムノアッセイなどにおいても同
様である。
この固定化抗体は、輸送および保存等の容易性から乾燥
された状態で提供されるのが好ましいが、多くの固定化
抗体は乾燥過程で免疫活性が著しく低下し、その上乾燥
状態で保存すると免疫活性がさらに低下する。 そのた
め、長期間にわたる保存にさいしては、通常、固定化抗
体は、適当な安定剤を含む緩衝液中に保存することが必
要であり、取扱いが不便であった。
他方、乾燥した固定化抗体を安定化する手段としては、
特開昭58−123459号公報記載の方法が知られて
いるが、長期間保存する場合、特に室温で保存する場合
には十分な効果を期待できなかった。
明が  しようとする間 点 この発明は、低温はいうまでもなく室温で長期間保存し
ても免疫活性が低下せず、かつ輸送・保存等に簡便な乾
燥した固定化抗体を提供するものである。
光jしυ1慇 この発明は、免疫化学的測定に用いる抗体を固相担体に
結合させ不溶化した固定化抗体において、該固定化抗体
をショ糖もしくはマンニトールまたはそれらの混合物を
保護剤として含有する水溶液で処理した後、乾燥してな
ることを特徴とする安定化された固定化抗体に関するも
のである。
この発明に使用される固相担体は、特に、限定されず、
免疫化学的測定暢利用できるすべての固相担体が使用で
きるが、好ましくはプラスチック、ガラスまたは紙を用
いてディスク状、ビーズ状またはチューブ状に形成され
たものがよく、プラスチック製マイクロプレートが最も
好ましい。
固相担体と抗体の結合は、物理的または化学的手法によ
り行なわれ、通常は吸着により行うのが便利である。
この発明における測定対象物質は、特に限定されず、何
らかの方法で抗体が得られるものであれば対象となり得
る。
それら測定対象物質としては、例えばインスリン、各種
免疫グロブリン、各種インターフェロンlt下’IFN
、という)、α−フェトプロティン(以下’AFP、い
う)、プロティンC、フェリチン、癌胎児性抗原、β、
−ミクログロブリン、フィブリン分解産物などが挙げら
れる。
固相担体に固定化される抗体には、モノクロナール抗体
およびポリクロナール抗体が包含され、これらの抗体は
慣用の方法で産生される。
この発明に使用される保護剤としては、ショ糖もしくは
マンニトールまたはこれらの混合物が用いられ、ショ糖
が特に好ましい、 これらの保護剤は、水性溶媒に溶解
して月いられるが、水性溶媒としては、通常、リン酸緩
衝化生理食塩水などの緩衝液が用いられ、中でも牛血清
または/および牛血清アルブミン(以下’BSA。
という)を含有する緩衝液が特に好ましい。
水溶液中の保護剤の濃度は、保護剤の種類、固定化抗体
を保存する条件などにより異なるが、通常0.1〜15
%(重量、以下同じ)、好ましくは0.25〜10%、
さらに好ましくは0.5〜5%の範囲から適宜選択きれ
る。
固定化抗体の保護処理は、固定化抗体と上記保護剤含有
水溶液との接触により行なわれる。
処理時間は特に限定されないが、通常、2分間で十分で
ある。 また、2回以上接触操作をくり返し行なっても
よい。
保護剤含有水溶液で処理した後の固定化抗体の乾燥は、
自然乾燥、通気乾燥または減圧乾燥のいずれでもよい、
 乾燥温度は、免疫活性の低下を防止するため、常温以
下、例えば、2〜10°C程度の温度で行なうのが特に
好ましい。
以下、この発明を実施例および試験例により説明する。
衷及萱 以下の実施例において、使用した各抗体は次の通りであ
る。
i)抗ブタインスリンポリクロナール抗体ニブタインス
リン(シグマ社製)を抗原とししてモルモットから得ら
れたポリクロナール抗体 ii)抗ヒトAFPモノクロナール抗体:藤沢薬品工業
(株)製、製品番号FLAiii)抗ヒトIFN−αモ
ノクロナール抗体8藤沢薬品工業(株)製、製品番号 LA−06 実施例1 抗ブタインスリンポリクロナール抗体を50mM炭酸ナ
トリウム緩衝液(pH9,6、以下「緩衝液1」という
)で10ttg/mlに希釈し、その溶液をマイクロプ
レートのウェルに200μ!加えた。 室温で1時間放
置後、抗体溶液を吸引除去した。  061%BSA含
有リン酸緩衝化(10mM)生理食塩水(pH7,2、
以下「緩衝液2」という)にショ糖を所定濃度に溶解し
た溶液をウェルに満たし、吸引除去する操作を2回行な
う、 さらに、上記ンBII溶液をウェルに満たした1
時間放置した後、吸引除去する。
その後、清浄な紙の上で、ウェル開口部を下に向け、水
きりを行なった後、室温で2時間減圧乾燥して、シE1
[で安定化きれた固定化抗ブタインスリン抗体を得た。
実施例2 抗ヒトAFPモノクロナール抗体を緩衝液1で5μg/
mlに希釈し、その溶液をマイクロプレートのウェルに
300μm加えた。 以下、実施例1と同様に処理して
、ショ糖で安定化された固定化抗ヒトAFP抗体を得た
実施例3 抗ヒトIFN−α−モノクロナール抗体を緩衝液1で5
μg/mlに希釈し、マイクロプレートのウェルに30
0μl加えた。 以下、実施例1と同様に処理して、シ
ョ糖で安定化された固定化抗ヒトIFN−α抗体を得た
実施例4 抗ブタインスリンポリクロナール抗体を緩衝液1で10
μs/mlに希釈し、その溶液をマイクロプレートのウ
ェルに200μl加えた。
室温で1時間放置後、抗体溶液を吸引除去した。 マン
ニトールを緩衝液2に所定濃度溶解した溶液をウェルに
満たし、以下実施例1と同+i +、: m 理し、マ
ンニトールで安定化された固定化抗ブタインスリン抗体
を得た。
上記の各実施例で得られた固定化抗体の安定性試験をE
IAにより行なった。 使用した試薬、試験方法、試験
結果は次の通りである。
1)試薬 a)酵素標識抗体の作成 ナカネら[ザ ジャーナル 才ブ ヒ ストケミストリー アンド サイトケ ミストリー(The  Journalor  H4s
tochemistryand  Cytochemi
stry)、第22巻、1084頁 1974年]、ヨ
シタケら[ザ ジャーナル オプ バイオケミストリ−(The Journal  of  Bio− chemf st ry)、第92巻 1413〜1424頁 1982年] などの方法に従って、抗体またはその Fab’にパーオキシダーゼ(シグマ 社製、以下’PODJという)を結合 させた酵素標識抗体を作成した。
各抗原について、使用した抗体およ び作成した酵素標識抗体は次の通りで ある。
ブタインスリン  実施例で用いた抗ブタインスリンポ
リクロナール抗体 のFab’にPODを結合 させた。
ヒトAFP     抗ヒトAFPモノクロナール抗体
(藤沢薬品工業(株) 製、製品番号FLA−11) にPODを 合させた。
ヒトIFN−α  抗ヒトIFN−αモノクロナール抗
体(藤沢薬品工業 (株)製、製品番号FLA −03)のFab’にPO Dを合させた。
b)基質溶液 0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液(pH5,0>に0−
フェニレンジアミン2塩酸塩(2,5m g/ m l
 )および過酸化水素(0,018%)を溶解した溶液
(以下「発色液」という)を使用した。
2)試験方法 a)保存方法 実施例1〜4で作成したマイクロプレ ートのウェルをシールした後、室温および10℃の恒温
室に放置した。
b)免疫活性測定法 マイクロプレートのウェルに、5%牛血清、0.1%B
SAおよび0.05%ツイン−20を含有するリン酸緩
衝化生理食塩水に酵素標識抗体を溶解した溶液を所定量
加え、ついで所定濃度の抗原溶液を所定量等時間間隔で
加えた。 室温で所定時間放置した後、反応液を等時間
間隔で吸引除去した。0.1%BSAおよび0.05%
ツイン−20を含有するリン酸緩衝化生理食塩水(pH
7,2)をウェルに満たし、吸引除去する洗浄操作を3
回行なった。
発色液200μlをウェルに加え室温で30分間放置し
た後、1M硫酸(100μl)で酵素反応を停止させ、
490nmの吸光度をミニリーダーMR590(ダイナ
チック社製)で測定した。
上記操作中、使用した酵素標識抗体溶 液量等は次の通りである。
酵素標識  抗原溶液量 抗原抗体 抗原  抗体溶液量 (μl)  反応時間(μm)(
抗原溶液  (hr) ブタインZoo     20     2スリン  
    278um1) AFP   200     20     1100
nm1l 100nα 100    100     3(10
0Iu/m1) 3)試験結果 固定化抗体の抗体活性は次式を用いて算出した。
被検プレートの吸光度 抗体活性(%)=            xto。
作成直後のプレートの 吸光度 尚、保護剤を含まない緩衝液2を用いて、実施例1〜4
と同様にして作成したプレートを対照とした。
実施例1〜4の固定化抗体について、室温および10″
Cにおける安定性の試験結果を第1表および第2表に示
した。
第   2   表 プレート保存 保護剤     抗体活性(X)条件 
溶液      保存日数(月)濃度(X)11.5 
 2  3  6実施例110℃ 対照 73.6  
  56.3のプレート  (乾燥>   0.5  
        85.2        89.4 
 85.22.0     88.9    86.7
 88.1実施例410℃ 0.25 95.5   
 91.8 86.4のプレート  (乾燥) 麩 上記の試験結果から明らかなように、この発明にかかる
固定化抗体は、通常、抗体活性が著しく低下する乾燥状
態に保存しても、抗体活性を損うことなく長期間安定に
保存でき、また低温のみならず室温においても安定に保
存できる利点を有する。
したがって、この発明にかかる固定化抗体を使用した生
体微量成分の免疫化学的測定キットは、保存、輸送、取
扱い等が簡便であるというすぐれた効果を奏する。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 免疫化学的測定に用いる抗体を固相担体に結合させ不溶
    化した固定化担体において、該固定化抗体をショ糖もし
    くはマンニトールまたはそれらの混合物を保護剤として
    含有する水溶液で処理した後、乾燥してなることを特徴
    とする安定化された固定化抗体。
JP3113885A 1985-02-18 1985-02-18 安定化された固定化抗体 Pending JPS61189454A (ja)

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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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