JPH11246593A - 蛋白質および同類品の保護 - Google Patents
蛋白質および同類品の保護Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 乾燥中の変質に対して活性蛋白質を保護する
方法を提供すること。 【解決手段】 乾燥中の変質に対して活性蛋白質を保護
する方法であって、活性蛋白質を含有する水を含んだ系
をトレハローズ(trehalose )の存在のもとで氷点を超
える温度で乾燥し、使用時に水を加え実質的に元の状態
に戻すことを特徴とする保護方法。
方法を提供すること。 【解決手段】 乾燥中の変質に対して活性蛋白質を保護
する方法であって、活性蛋白質を含有する水を含んだ系
をトレハローズ(trehalose )の存在のもとで氷点を超
える温度で乾燥し、使用時に水を加え実質的に元の状態
に戻すことを特徴とする保護方法。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は蛋白質の乾燥時の変
質(denaturing)を保護することに関する。
質(denaturing)を保護することに関する。
【0002】
【従来の技術】高分子化合物、とくに蛋白質およびポリ
ペプチド含有化合物(polypeptide−con
taining compounds)は、普通一般に
第3次構造(tertiary structure)
として知られている複雑な3次元折り畳み立体配座(t
hree−dementional folded c
onformations)の形状をもった自然に発生
した水和状態で存在する。しばしば化合物は、酵素(e
nzyme)、抗体(antibody)、抗原(an
tigen)、調味料(flavourant)、蛍光
体(fluorescent)、ゲル化剤(gelli
ng agent)等、いずれであろうとその活性度
は、第3次構造に極めてよく依存し、たとえ化合物の化
学実験式が変わらないとしても、構造が邪魔されると極
度に減少するかまた排除されさえもする。これは蛋白質
などが貯蔵等用に乾燥状態におかれる時には、非常に大
事な問題である。
ペプチド含有化合物(polypeptide−con
taining compounds)は、普通一般に
第3次構造(tertiary structure)
として知られている複雑な3次元折り畳み立体配座(t
hree−dementional folded c
onformations)の形状をもった自然に発生
した水和状態で存在する。しばしば化合物は、酵素(e
nzyme)、抗体(antibody)、抗原(an
tigen)、調味料(flavourant)、蛍光
体(fluorescent)、ゲル化剤(gelli
ng agent)等、いずれであろうとその活性度
は、第3次構造に極めてよく依存し、たとえ化合物の化
学実験式が変わらないとしても、構造が邪魔されると極
度に減少するかまた排除されさえもする。これは蛋白質
などが貯蔵等用に乾燥状態におかれる時には、非常に大
事な問題である。
【0003】この問題に打勝つため、色々の解決策が提
案されてきた。乾燥免疫試験(dry immunoa
ssay)キット用酵素は脂肪体(liposome
s)中に保護されてきた。ワクチンは容易に凍結乾燥状
態で保存することは出来なかった、そこでかさばったア
ンプルに保存された。免疫試験技術において使用される
フィコビリン蛋白質(phycobiliprotei
ns)のような蛍光蛋白質はもし乾燥すれば蛍光能力を
失い、そこで乾燥キットでは使用できない。さらにもう
ーつの見本は樹脂基材に結合しまた乾燥されているモノ
クロナール(monoclonal)抗体の抗原結合能
力の喪失である。
案されてきた。乾燥免疫試験(dry immunoa
ssay)キット用酵素は脂肪体(liposome
s)中に保護されてきた。ワクチンは容易に凍結乾燥状
態で保存することは出来なかった、そこでかさばったア
ンプルに保存された。免疫試験技術において使用される
フィコビリン蛋白質(phycobiliprotei
ns)のような蛍光蛋白質はもし乾燥すれば蛍光能力を
失い、そこで乾燥キットでは使用できない。さらにもう
ーつの見本は樹脂基材に結合しまた乾燥されているモノ
クロナール(monoclonal)抗体の抗原結合能
力の喪失である。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】そこでこの様な物質を
乾燥時の脱活性化からまもる方法が切望されている。我
々は今や、トレハローズの存在下で化合物を乾燥するこ
とによって、この目的を達成することが出来ることがわ
かった。
乾燥時の脱活性化からまもる方法が切望されている。我
々は今や、トレハローズの存在下で化合物を乾燥するこ
とによって、この目的を達成することが出来ることがわ
かった。
【0005】トレハローズ(trehalose)、α
−D−グルコピラノシル(glucopyranosy
l)−α−D−グルコーピラノシド(glucopra
noside)、は予て細胞保護と関連している必然的
に現れる非還元ジサッカリド(non−reducin
g disaccharide)である。植物および動
物両方ともある種の有機物は、大気の乾燥した条件のな
かで体内の水分を極めて低い水準にと乾燥作用に耐える
ことが出来ることが知られている。これらの有機物は、
塩水シュリンプ包嚢(Artemia salin
a)、ふつか草(Selaginella lepid
ophylla)およびパンイースト(Sacchar
omyces cerevisiae)をふくんでい
る。一般的特徴として、それ等はいずれも細胞中に大量
のトレハローズを持っている。
−D−グルコピラノシル(glucopyranosy
l)−α−D−グルコーピラノシド(glucopra
noside)、は予て細胞保護と関連している必然的
に現れる非還元ジサッカリド(non−reducin
g disaccharide)である。植物および動
物両方ともある種の有機物は、大気の乾燥した条件のな
かで体内の水分を極めて低い水準にと乾燥作用に耐える
ことが出来ることが知られている。これらの有機物は、
塩水シュリンプ包嚢(Artemia salin
a)、ふつか草(Selaginella lepid
ophylla)およびパンイースト(Sacchar
omyces cerevisiae)をふくんでい
る。一般的特徴として、それ等はいずれも細胞中に大量
のトレハローズを持っている。
【0006】作用の本質は、凍結および脱水の間、細胞
膜の安定化へのトレハローズをふくむ各種の水和炭化物
(carbohydrates)の効果にある。この働
きはトレハローズが他の水和炭化物にくらべて、細胞状
の有機物を結合水の喪失という有害な結果から保護する
のに非常にすぐれていることを示している。
膜の安定化へのトレハローズをふくむ各種の水和炭化物
(carbohydrates)の効果にある。この働
きはトレハローズが他の水和炭化物にくらべて、細胞状
の有機物を結合水の喪失という有害な結果から保護する
のに非常にすぐれていることを示している。
【0007】(Crowe J.H.,Crowe
L.M.and MouradianR. (198
3)Cryobiology 20,346,356;
Crowe J.H.,Crowe L.M.and
Chapman D.(1984)Archives
Biochem.Biophysics 232,40
0−497;およびCrowe L.M.,Moura
dian R.,Crowe J.H.,Jackso
n S.A and Womersley C.(19
84) Biochimia & Biophysic
a Acta769,141〜150.) トレハローズは細胞にどんな風に保護効果を及ぼすかに
関して一致した意見はないが、一つの仮説は、トレハロ
ーズが生きている有機体の膜成分の結合水の代替とな
り、結合(構造)水の喪失による変質を妨げることであ
る。効果が生きている細胞においてだけでなく、驚くべ
きことには、精製された分離された状態の高分子自身に
も示されることを我々は今や見出だした。
L.M.and MouradianR. (198
3)Cryobiology 20,346,356;
Crowe J.H.,Crowe L.M.and
Chapman D.(1984)Archives
Biochem.Biophysics 232,40
0−497;およびCrowe L.M.,Moura
dian R.,Crowe J.H.,Jackso
n S.A and Womersley C.(19
84) Biochimia & Biophysic
a Acta769,141〜150.) トレハローズは細胞にどんな風に保護効果を及ぼすかに
関して一致した意見はないが、一つの仮説は、トレハロ
ーズが生きている有機体の膜成分の結合水の代替とな
り、結合(構造)水の喪失による変質を妨げることであ
る。効果が生きている細胞においてだけでなく、驚くべ
きことには、精製された分離された状態の高分子自身に
も示されることを我々は今や見出だした。
【0008】EP140489A(和光純薬工業)は砂
糖の溶液中に、時には牛血清アルブミン(bovine
serum albumin)のような蛋白質と一緒
に、浸せきすることによって周囲の温度での乾燥に対し
て安定化されたキャリヤー例えば硝子ビーズの上の免疫
活性物質例えば抗体を開示している。かなりの多くの砂
糖が使用されると述べられている(リボーズ(ribo
se)、グルコーズ(glucose)、フラクトーズ
(fructose)、マンノーズ(mannos
e)、ガラクトーズ(galactose)、マルトー
ズ(maltose)、ラクトーズ(lactos
e)、サッカローズ(sucrose)、オリゴサッカ
リド(oligosaccharide)、およびポリ
サッカリド(polysaccharide));好ま
しくはラクトーズ、サッカローズまたはデキシトリン
(dextrine)溶液。しかしながら、トレハロー
ズについては言及されていない。
糖の溶液中に、時には牛血清アルブミン(bovine
serum albumin)のような蛋白質と一緒
に、浸せきすることによって周囲の温度での乾燥に対し
て安定化されたキャリヤー例えば硝子ビーズの上の免疫
活性物質例えば抗体を開示している。かなりの多くの砂
糖が使用されると述べられている(リボーズ(ribo
se)、グルコーズ(glucose)、フラクトーズ
(fructose)、マンノーズ(mannos
e)、ガラクトーズ(galactose)、マルトー
ズ(maltose)、ラクトーズ(lactos
e)、サッカローズ(sucrose)、オリゴサッカ
リド(oligosaccharide)、およびポリ
サッカリド(polysaccharide));好ま
しくはラクトーズ、サッカローズまたはデキシトリン
(dextrine)溶液。しかしながら、トレハロー
ズについては言及されていない。
【0009】特許公開GB 2009198(A)(B
ehringwerk AG)は髄膜球菌(menin
gococcal)によって出来たポリサッカリドおよ
びトレハローズの凍結真空乾燥(lyophilisa
tion)を開示している;英国特許公開GB 212
6588A (旭化成KKK)は非イオン界面活性剤ま
たはトレハローズ(または他の砂糖)のどちらかを含む
ことによって凍結真空乾燥および凍結に対する腫よう壊
死ファクター(tumor necrosisfact
or)の安定化を開示している;また公表された日本特
許出願J 58074696A (Iatron La
boratories)はトレハローズの存在下におけ
るATPの凍結乾燥(凍結真空乾燥)を開示している。
ehringwerk AG)は髄膜球菌(menin
gococcal)によって出来たポリサッカリドおよ
びトレハローズの凍結真空乾燥(lyophilisa
tion)を開示している;英国特許公開GB 212
6588A (旭化成KKK)は非イオン界面活性剤ま
たはトレハローズ(または他の砂糖)のどちらかを含む
ことによって凍結真空乾燥および凍結に対する腫よう壊
死ファクター(tumor necrosisfact
or)の安定化を開示している;また公表された日本特
許出願J 58074696A (Iatron La
boratories)はトレハローズの存在下におけ
るATPの凍結乾燥(凍結真空乾燥)を開示している。
【0010】これら三つの刊行物はトレハローズが冷凍
乾燥されている間、敏感な材料を安定化するであろう事
を開示していることが記録されよう。冷凍乾燥(冷凍真
空乾燥)は一つの技術として、ある敏感な材料を加工出
来る只一つの方法であるとして案出された。周囲または
上昇温度における及び大気または減圧下の通常の乾燥
は、極めて多くのこのような物質の、敏感な蛋白質等が
周囲温度で乾燥出来ないおよび乾燥してはいけないとい
う生物学上の分野における言説外(Without s
aying)で行われた物がいつもそうであったよう
に、不可逆的な劣化を引起こした。冷凍乾燥では、水は
固体材料から高真空で取去られる。この方法で蛋白質の
液膜変性、熱不安定等の問題が回避された。トレハロー
ズは周囲温度37〜40℃で乾燥間完全な保護をあたえ
るだけでなく、蛍光性や光伝導性のような分子内電子的
プロセスも乾燥状態でおこさせるということは、以前に
は実現されていなかった。
乾燥されている間、敏感な材料を安定化するであろう事
を開示していることが記録されよう。冷凍乾燥(冷凍真
空乾燥)は一つの技術として、ある敏感な材料を加工出
来る只一つの方法であるとして案出された。周囲または
上昇温度における及び大気または減圧下の通常の乾燥
は、極めて多くのこのような物質の、敏感な蛋白質等が
周囲温度で乾燥出来ないおよび乾燥してはいけないとい
う生物学上の分野における言説外(Without s
aying)で行われた物がいつもそうであったよう
に、不可逆的な劣化を引起こした。冷凍乾燥では、水は
固体材料から高真空で取去られる。この方法で蛋白質の
液膜変性、熱不安定等の問題が回避された。トレハロー
ズは周囲温度37〜40℃で乾燥間完全な保護をあたえ
るだけでなく、蛍光性や光伝導性のような分子内電子的
プロセスも乾燥状態でおこさせるということは、以前に
は実現されていなかった。
【0011】
【課題を解決するための手段】本発明により、我々は蛋
白質または同類品を含有する水からなるシステムをトレ
ハローズの存在下で乾燥させることにより、乾燥時に蛋
白質および他の高分子を変性から保護する方法を与える
ものである。トレハローズは便利なように水からなるシ
ステムに溶解されている、またいかなる有効量にもする
ことが出来る。一般にトレハローズを重量で0.05〜
20%の濃度が好ましい、とくに重量で約0.1〜10
%,例えば約2.5%。
白質または同類品を含有する水からなるシステムをトレ
ハローズの存在下で乾燥させることにより、乾燥時に蛋
白質および他の高分子を変性から保護する方法を与える
ものである。トレハローズは便利なように水からなるシ
ステムに溶解されている、またいかなる有効量にもする
ことが出来る。一般にトレハローズを重量で0.05〜
20%の濃度が好ましい、とくに重量で約0.1〜10
%,例えば約2.5%。
【0012】本乾燥工程は、適当な面、例えば硝子ない
しプラスチック板、または皿、プラスチック又はニトロ
セルローズのフィルム、または紙のような多孔性の支持
体の上にある蛋白質とトレハローズを含む水からなるシ
ステムを単なる空気乾燥することによって成し遂げられ
る。乾燥は好ましくは大気圧で行われる。
しプラスチック板、または皿、プラスチック又はニトロ
セルローズのフィルム、または紙のような多孔性の支持
体の上にある蛋白質とトレハローズを含む水からなるシ
ステムを単なる空気乾燥することによって成し遂げられ
る。乾燥は好ましくは大気圧で行われる。
【0013】乾燥されている製品におけるトレハローズ
の存在は、問題が起こるのは明らかに希な場合(例えば
トレハローズ劣化酵素の保護)であるが、高分子物質の
物理化学的ないし生物学上の性質に何等影響を及ぼす事
がない。他の酵素、抗体、抗原および蛍光性マーカーの
場合には、なんら問題は起こらないし、化合物はあたか
も水和状態に保管されてきたように活性である。
の存在は、問題が起こるのは明らかに希な場合(例えば
トレハローズ劣化酵素の保護)であるが、高分子物質の
物理化学的ないし生物学上の性質に何等影響を及ぼす事
がない。他の酵素、抗体、抗原および蛍光性マーカーの
場合には、なんら問題は起こらないし、化合物はあたか
も水和状態に保管されてきたように活性である。
【0014】多数の酵素が今や各種試験手順に用いら
れ、ないしは自身各種検査(assays)で試験され
る。本発明によれば、酵素または酵素を含む物質は乾燥
し保管する事ができる、また必要な時には水またはバッ
ファー液を添加することにより再び活性化される。例え
ば、パーオキシダーゼ(peroxidase)(例え
ば、わさび大根(horse radish)から)お
よびアルカリホスファターゼ(alkaline ph
osphatase)(ほ乳動物)はこの方法で保存す
ることが出来る。血清中に見出だされる酵素の複合“カ
スケード(cascade)”、これは抗体−抗原結合
により免疫応答において活性化されている(P.J.L
achman および M.J.Hobert,“Ha
ndbook of Experimental Im
munology”ed.D.M.Weir,Blac
kwell 1978)が、周知のように化学変化を起
こしやすい。血清自身は約70〜75mg/mlの蛋白質を
含み、そのうち約2mg/mlだけが補体(complem
ent)部分を含んでいる。補体含有血清(又はそれか
ら取出された精製補体部分)は乾燥することが出来な
い、極めて低温条件(−70〜196℃)で保管されね
ばならない。凍結乾燥することはできるが、この技術は
活性度をいくらか破壊する。それゆえ、例えば凍結真空
乾燥された補体はリンパ球(Iymphocyte)細
胞毒性検査には使うことが出来ない。最も驚くべきこと
には、我々は、補体活性度が本発明にしたがって室温で
大気中で乾燥することにより完全に保存することが出来
ることを見出だした。乾燥された材料は37℃で数週間
も貯蔵することが出来、また活性度を保ったまま再構成
することが出来る。
れ、ないしは自身各種検査(assays)で試験され
る。本発明によれば、酵素または酵素を含む物質は乾燥
し保管する事ができる、また必要な時には水またはバッ
ファー液を添加することにより再び活性化される。例え
ば、パーオキシダーゼ(peroxidase)(例え
ば、わさび大根(horse radish)から)お
よびアルカリホスファターゼ(alkaline ph
osphatase)(ほ乳動物)はこの方法で保存す
ることが出来る。血清中に見出だされる酵素の複合“カ
スケード(cascade)”、これは抗体−抗原結合
により免疫応答において活性化されている(P.J.L
achman および M.J.Hobert,“Ha
ndbook of Experimental Im
munology”ed.D.M.Weir,Blac
kwell 1978)が、周知のように化学変化を起
こしやすい。血清自身は約70〜75mg/mlの蛋白質を
含み、そのうち約2mg/mlだけが補体(complem
ent)部分を含んでいる。補体含有血清(又はそれか
ら取出された精製補体部分)は乾燥することが出来な
い、極めて低温条件(−70〜196℃)で保管されね
ばならない。凍結乾燥することはできるが、この技術は
活性度をいくらか破壊する。それゆえ、例えば凍結真空
乾燥された補体はリンパ球(Iymphocyte)細
胞毒性検査には使うことが出来ない。最も驚くべきこと
には、我々は、補体活性度が本発明にしたがって室温で
大気中で乾燥することにより完全に保存することが出来
ることを見出だした。乾燥された材料は37℃で数週間
も貯蔵することが出来、また活性度を保ったまま再構成
することが出来る。
【0015】血清試料中の必要とされるトレハローズの
量は普通は蛋白質の含有量に比例する。例えば、50重
量%の血清水溶液は少なくとも0.22Mのトレハロー
ズ(即ち約75g/l)を必要とし一方25%溶液では
少なくとも0.15Mのトレハローズ(即ち約51g/
l)を補体保護用に必要とする。他の血清成分例えば血
清抗体は必要量はかなり少ない。一般に、それゆえ、ト
レハローズの蛋白質(または他の高分子)に対する重量
比は少なくとも1.4:1で、好ましくは少なくとも
2:1で、さらに好ましくは3:1が適当であり、例え
ば10:1までである。
量は普通は蛋白質の含有量に比例する。例えば、50重
量%の血清水溶液は少なくとも0.22Mのトレハロー
ズ(即ち約75g/l)を必要とし一方25%溶液では
少なくとも0.15Mのトレハローズ(即ち約51g/
l)を補体保護用に必要とする。他の血清成分例えば血
清抗体は必要量はかなり少ない。一般に、それゆえ、ト
レハローズの蛋白質(または他の高分子)に対する重量
比は少なくとも1.4:1で、好ましくは少なくとも
2:1で、さらに好ましくは3:1が適当であり、例え
ば10:1までである。
【0016】血清と血清補体、抗体、および抗原の保存
は、本発明に従えば多くのタイプのワクチンをトレハロ
ーズの存在のもとに乾燥することにより保存がまた可能
であることを意味している。抗血清(antiser
a)は色々の毒性条件を処埋するに用いられる、また殺
された微生物をふくむ免疫ワクチンが広く用いられてい
る。両方のタイプのワクチンとも低温で水和条件でまた
は深い冷凍条件での貯蔵を必要とする。乾燥ワクチンは
今や本発明の技術により可能になった。
は、本発明に従えば多くのタイプのワクチンをトレハロ
ーズの存在のもとに乾燥することにより保存がまた可能
であることを意味している。抗血清(antiser
a)は色々の毒性条件を処埋するに用いられる、また殺
された微生物をふくむ免疫ワクチンが広く用いられてい
る。両方のタイプのワクチンとも低温で水和条件でまた
は深い冷凍条件での貯蔵を必要とする。乾燥ワクチンは
今や本発明の技術により可能になった。
【0017】貯蔵と保存についてのもう一つ問題がアガ
ローズゲルの分野で生じた。多くの生化学技術でアガロ
ーズゲルは基質として、例えば、電気泳動(elect
rophoresis)、オケテルロニー拡散(ouc
hterlony diffusion)、免疫電気泳
動(immuno−electrophoresis)
などに用いられる。1〜3%のゲルは広くこれらの技術
で分離媒質として用いられている。現在、固体アガロー
ズをバッファー中で溶解するまで加熱することにより各
実験用に研究室で新鮮にしなければならない、次に溶融
したアガローズを型に流し込みアガローズをゲルに冷却
する。予備成型されたゲルは加湿した容器の中で比較的
短期間貯蔵することだけが出来る。もし乾燥されるとゲ
ルはゲル構造の不可逆的な崩壊をうけて水またはバッフ
ァー中での簡単な再水和により再構成する事は出来な
い。
ローズゲルの分野で生じた。多くの生化学技術でアガロ
ーズゲルは基質として、例えば、電気泳動(elect
rophoresis)、オケテルロニー拡散(ouc
hterlony diffusion)、免疫電気泳
動(immuno−electrophoresis)
などに用いられる。1〜3%のゲルは広くこれらの技術
で分離媒質として用いられている。現在、固体アガロー
ズをバッファー中で溶解するまで加熱することにより各
実験用に研究室で新鮮にしなければならない、次に溶融
したアガローズを型に流し込みアガローズをゲルに冷却
する。予備成型されたゲルは加湿した容器の中で比較的
短期間貯蔵することだけが出来る。もし乾燥されるとゲ
ルはゲル構造の不可逆的な崩壊をうけて水またはバッフ
ァー中での簡単な再水和により再構成する事は出来な
い。
【0018】本発明によれば2〜20%のトレハローズ
を含有する2および3%アカローズゲルは乾燥し、引続
いて再水和することができる。我々は、トレハローズな
しに乾燥されたゲルと再水和特性を比較したところ本発
明の乾燥されたゲルは初期の深さと水分量を持ったゲル
を与えるよう完全に再水和されることを見出だした。こ
れは乾燥されたアガローズゲル板は何等特別な容器を必
要とせずに漠然と保管することが出来、また使用する時
に簡単に再水和することが出来る。
を含有する2および3%アカローズゲルは乾燥し、引続
いて再水和することができる。我々は、トレハローズな
しに乾燥されたゲルと再水和特性を比較したところ本発
明の乾燥されたゲルは初期の深さと水分量を持ったゲル
を与えるよう完全に再水和されることを見出だした。こ
れは乾燥されたアガローズゲル板は何等特別な容器を必
要とせずに漠然と保管することが出来、また使用する時
に簡単に再水和することが出来る。
【0019】本発明によれば、大気温度で固定された全
赤血球(fixed wholered blood
cells)を乾燥することによって保存することが又
可能であり、特に例えば赤血球凝縮検査(haemag
glutinationassay)として知られた極
端に鋭敏な免疫検査で使用されるような抗体、および抗
原のような結びついている化学的に変化しやすい分子に
固定された全赤血球を乾燥保存することが可能である。
ここで、抗原にせよ抗体にせよどちらも化学的に赤血球
(erythrocytes)の表面膜に結合してお
り、又適当な配位子(ligand)は目にみえる集合
パターンに赤血球が一緒に固めるような能力により検出
されることが出来る。抗原が赤血球に結合している場合
には、抗体の効力は抗体を希釈段階にて滴定し赤血球の
もはや凝集反応/集合をおこさない点を観察することに
よって評価することが出来る。抗体がレッドセルに結合
している場合には、未知の溶液例えば血液中の正確な抗
原の量は上述のように滴定終点を検出することにより決
定される。このために、抗原はレッドセル上で抗体によ
りみられることの出来る分子について一つ以上の抗原の
用地を占領せねばならない。
赤血球(fixed wholered blood
cells)を乾燥することによって保存することが又
可能であり、特に例えば赤血球凝縮検査(haemag
glutinationassay)として知られた極
端に鋭敏な免疫検査で使用されるような抗体、および抗
原のような結びついている化学的に変化しやすい分子に
固定された全赤血球を乾燥保存することが可能である。
ここで、抗原にせよ抗体にせよどちらも化学的に赤血球
(erythrocytes)の表面膜に結合してお
り、又適当な配位子(ligand)は目にみえる集合
パターンに赤血球が一緒に固めるような能力により検出
されることが出来る。抗原が赤血球に結合している場合
には、抗体の効力は抗体を希釈段階にて滴定し赤血球の
もはや凝集反応/集合をおこさない点を観察することに
よって評価することが出来る。抗体がレッドセルに結合
している場合には、未知の溶液例えば血液中の正確な抗
原の量は上述のように滴定終点を検出することにより決
定される。このために、抗原はレッドセル上で抗体によ
りみられることの出来る分子について一つ以上の抗原の
用地を占領せねばならない。
【0020】この検査はたくさんの準備を必要とする。
レッドセルは普通新鮮なものが使われ、洗浄を必要と
し、化学的に抗原又は抗体のいずれかと結合され、次に
配位子の滴定稀薄液に加えられる。
レッドセルは普通新鮮なものが使われ、洗浄を必要と
し、化学的に抗原又は抗体のいずれかと結合され、次に
配位子の滴定稀薄液に加えられる。
【0021】我々は抗原および抗体をグルタルアルデヒ
ド(glutaraldehyde)のような組織の固
定液で固定されているレッドセルに抗原と抗体を組合わ
せることが出来、次に組合わされたレッドセルをトレハ
ローズの存在下で乾燥することが出来ることが分った。
再水和の際組合わされ固定されたレッドセルは、レッド
セル凝集検査にて新鮮なレッドセル懸濁液として振舞う
完全な単一細胞懸濁液をつくるように再懸濁することが
出来る。この利用ではトレハローズは二つの機能を提供
する。: 1.固定レッドセル膜に結合された抗体または抗原の機
能を完全に保存する。
ド(glutaraldehyde)のような組織の固
定液で固定されているレッドセルに抗原と抗体を組合わ
せることが出来、次に組合わされたレッドセルをトレハ
ローズの存在下で乾燥することが出来ることが分った。
再水和の際組合わされ固定されたレッドセルは、レッド
セル凝集検査にて新鮮なレッドセル懸濁液として振舞う
完全な単一細胞懸濁液をつくるように再懸濁することが
出来る。この利用ではトレハローズは二つの機能を提供
する。: 1.固定レッドセル膜に結合された抗体または抗原の機
能を完全に保存する。
【0022】2.単一細胞懸濁液となるように完全にバ
ッファー中で再懸濁するように固定されたレッドセル自
身を完全に保存する。固定レッドセルはトレハローズな
しに乾燥されると不可逆の自然凝集反応がおこり、使用
することは出来ない。
ッファー中で再懸濁するように固定されたレッドセル自
身を完全に保存する。固定レッドセルはトレハローズな
しに乾燥されると不可逆の自然凝集反応がおこり、使用
することは出来ない。
【0023】かくて本赤血球凝集検査キットは、測定さ
れるべき抗原ないし抗体が単にバッファー中の乾燥レッ
ドセルに加えられる時にごく普通のやり方で行われる乾
燥状態で組立てられる。
れるべき抗原ないし抗体が単にバッファー中の乾燥レッ
ドセルに加えられる時にごく普通のやり方で行われる乾
燥状態で組立てられる。
【0024】R型フィコエリトソン(plycoery
thrin)は海洋のロードファイト(rhodeph
yte)、ローディメニア(rhodymenia)か
ら容易に精製されるフィコビリ蛋白質(phycobi
liprotain)である。575nmで最高の発光を
もつ赤−オレンヂ色の蛍光をきらきらと発する。その輝
かしい蛍光および高い発光量は分子中のフィコウロビリ
ン(phycourobilin)とフィコエリトロビ
リン発色団(phycoerythrobilin c
hromphore)の空間的分布と形状によるもので
ある。この蛍光蛋白質はフルオレスセィンより1モル当
り20倍明るいので、また抗体ないし蛍光性抗体または
DNA/RNA交配(hybridisation)検
査に使用されるアビディン(avidin)/ストレプ
トアビディン(streptaviden)のようなプ
ローブに容易に結合されるので多くの蛍光性検査に選択
される。
thrin)は海洋のロードファイト(rhodeph
yte)、ローディメニア(rhodymenia)か
ら容易に精製されるフィコビリ蛋白質(phycobi
liprotain)である。575nmで最高の発光を
もつ赤−オレンヂ色の蛍光をきらきらと発する。その輝
かしい蛍光および高い発光量は分子中のフィコウロビリ
ン(phycourobilin)とフィコエリトロビ
リン発色団(phycoerythrobilin c
hromphore)の空間的分布と形状によるもので
ある。この蛍光蛋白質はフルオレスセィンより1モル当
り20倍明るいので、また抗体ないし蛍光性抗体または
DNA/RNA交配(hybridisation)検
査に使用されるアビディン(avidin)/ストレプ
トアビディン(streptaviden)のようなプ
ローブに容易に結合されるので多くの蛍光性検査に選択
される。
【0025】この試薬の使用に対する重大な欠点は蛍光
性が水溶液において衰えに敏感であることである。これ
は蛍光の半減期を非常に短くする。これは蛍光用剌激波
長をもって光輝いている時にフィコエリトリン分子が水
溶液中でフリーラジカルができることによって破壊する
ことによるものである。分子を乾燥することはフリーラ
ジカルの発生を阻止しそれゆえ蛍光の衰えを妨げるが、
蛍光特性が依存しているこの巨大蛋白質(240Kd)の
3次元構造が乾燥時崩壊するので蛍光性の90%以上を
破壊する。
性が水溶液において衰えに敏感であることである。これ
は蛍光の半減期を非常に短くする。これは蛍光用剌激波
長をもって光輝いている時にフィコエリトリン分子が水
溶液中でフリーラジカルができることによって破壊する
ことによるものである。分子を乾燥することはフリーラ
ジカルの発生を阻止しそれゆえ蛍光の衰えを妨げるが、
蛍光特性が依存しているこの巨大蛋白質(240Kd)の
3次元構造が乾燥時崩壊するので蛍光性の90%以上を
破壊する。
【0026】我々はこの分子がトレハローズの存在下で
蛍光特性の損失無しに完全に乾燥されることが分った。
これはこの蛋白質が蛍光強度を弱めることなく又完全に
保持したまま高い強度の刺激光に長時間ないし繰返して
暴露する必要のある検査に今や用いられる事を意味して
いる。光の弱まりはトレハローズを洗い流し、水溶液中
の分子を照射することにより再建される。
蛍光特性の損失無しに完全に乾燥されることが分った。
これはこの蛋白質が蛍光強度を弱めることなく又完全に
保持したまま高い強度の刺激光に長時間ないし繰返して
暴露する必要のある検査に今や用いられる事を意味して
いる。光の弱まりはトレハローズを洗い流し、水溶液中
の分子を照射することにより再建される。
【0027】蛋白質構造と機能を保持に対する主な要求
は抗体、抗原、および酵素の水準の臨床測定用の血液サ
ンプルにおいてである。現在これらのサンプルは常に4
℃で短期間、−20℃またはそれ以下で完全冷凍では長
期間貯蔵される。乾燥することは出来ない。
は抗体、抗原、および酵素の水準の臨床測定用の血液サ
ンプルにおいてである。現在これらのサンプルは常に4
℃で短期間、−20℃またはそれ以下で完全冷凍では長
期間貯蔵される。乾燥することは出来ない。
【0028】魅力ある代わりの方法は血液成分の構造と
機能がトレハローズ存在下で乾燥することにより保護す
る、乾燥形式で、血清または血液サンプルを貯蔵するこ
とであろう。これを達成する簡単なまた優雅な方法は、
サンプル貯蔵媒質として、その上に血液または血清サン
プルを使用したり、またその上で再乾燥させたりする多
孔質の予めトレハローズを含漫した基質を用いることで
ある。乾燥はどんな身近の大気温度、例えば熱帯地方で
も行う事ができる。トレハローズの基質中の含有は乾燥
基質の重量の5〜25%、例えば7.5〜20%が好ま
しい。基質は何らかの適当な不活性材料、例えばセルロ
ーズまたはガラス紙、多孔質プラスチックフィルム、布
等を含んでいる。使用の容易さからセルローズろ紙が好
ましい。吸収された蛋白質の回復の容易さから基質は便
宜的に薄いシート又は織物である。 我々は理論づけよ
うとは思わないが、乾燥状態で蛋白質の構造と機能を保
存するトレハローズの独特の特性はトレハローズ分子が
その水酸基に水素結合することによる。このようにして
トレハローズは、乾燥による高分子構造の崩壊がないよ
うに構造的な(結合)水分子の代わりになる。トレハロ
一ズは高分子の構造的完全さを保持しながら乾燥骨格と
して作用する。
機能がトレハローズ存在下で乾燥することにより保護す
る、乾燥形式で、血清または血液サンプルを貯蔵するこ
とであろう。これを達成する簡単なまた優雅な方法は、
サンプル貯蔵媒質として、その上に血液または血清サン
プルを使用したり、またその上で再乾燥させたりする多
孔質の予めトレハローズを含漫した基質を用いることで
ある。乾燥はどんな身近の大気温度、例えば熱帯地方で
も行う事ができる。トレハローズの基質中の含有は乾燥
基質の重量の5〜25%、例えば7.5〜20%が好ま
しい。基質は何らかの適当な不活性材料、例えばセルロ
ーズまたはガラス紙、多孔質プラスチックフィルム、布
等を含んでいる。使用の容易さからセルローズろ紙が好
ましい。吸収された蛋白質の回復の容易さから基質は便
宜的に薄いシート又は織物である。 我々は理論づけよ
うとは思わないが、乾燥状態で蛋白質の構造と機能を保
存するトレハローズの独特の特性はトレハローズ分子が
その水酸基に水素結合することによる。このようにして
トレハローズは、乾燥による高分子構造の崩壊がないよ
うに構造的な(結合)水分子の代わりになる。トレハロ
一ズは高分子の構造的完全さを保持しながら乾燥骨格と
して作用する。
【0029】多くの高分子機能は高分子の動きやすさを
必要とする、例えば抗体は静電的および疎水的相互作用
により起こる結合の為に抗原へ極めて近くに物埋的に移
勧せねばならない。基質に結び付いている酵素について
も同じである。小さな分子運動も又他の高分子機能とし
て必要とされる。このようにしてヘモグロビンは可逆的
な酸素と二酸化炭素の結合の間、あるアミノ酸の回転と
移動をうける。この分子移動は乾燥状態では全く観察さ
れない。かくて我々はオキシおよびカーボキシの形で乾
燥ヘモグロビン(haemoglobin)を得、これ
らの分子はトレハローズの存在の下で乾燥されるとその
スペクトル特性(spectral properti
es)を保持する。
必要とする、例えば抗体は静電的および疎水的相互作用
により起こる結合の為に抗原へ極めて近くに物埋的に移
勧せねばならない。基質に結び付いている酵素について
も同じである。小さな分子運動も又他の高分子機能とし
て必要とされる。このようにしてヘモグロビンは可逆的
な酸素と二酸化炭素の結合の間、あるアミノ酸の回転と
移動をうける。この分子移動は乾燥状態では全く観察さ
れない。かくて我々はオキシおよびカーボキシの形で乾
燥ヘモグロビン(haemoglobin)を得、これ
らの分子はトレハローズの存在の下で乾燥されるとその
スペクトル特性(spectral properti
es)を保持する。
【0030】トレハローズ中で乾燥されたカーボオキシ
ヘモグロビンを100%酸素にさらすとオキシの形への
転換は起こらない、これに反して水溶液中では数分間の
うちに発生する。対称的に、R型フィコエリトリンの蛍
光は原子レベル以下の“動き”だけを含んでいる。低い
波長例えば(488nm)における光エネルギーの吸収は
発色団におけるエレクトロンをより高いエネルギー軌道
に移動せしめる。より長い波長での蛍光性はこれらエレ
クトロンがより低いエネルキ一軌道にジヤンプバックす
る時に起こるホトン(photons)の発光によるも
のである。トレハローズによる乾燥状態におけるR型フ
ィコエリトリンの蛍光性の保存は、高分子の電子特性が
完全にこの技術によって保たれることを示している。こ
の方法はそれゆえ新たな電子的応用における生物学上
(および合成)高分子の応用に大変興味のもてるもので
ある。例としては、プロトンおよびエレクトロンのポン
ピング(pumping)を含んでいる(光にさらされ
た時に、バクテリオロードプシン(bacterior
hodopsin)およびロードプシン(rhodop
sin)により仲介されるように)。蛋白質を乾燥し、
それらの三次元形状や機能を保持する能力は、生物学的
分子をもちいて太陽エネルギーを水素ないし電流に直接
転換することを含む分子エレクトロニクスの可能性を提
供した。この生物学的分子は本来、分子サイズスケール
で高い効率とセンサーと電子回路(コンピューターを含
む)の構成をもっている。
ヘモグロビンを100%酸素にさらすとオキシの形への
転換は起こらない、これに反して水溶液中では数分間の
うちに発生する。対称的に、R型フィコエリトリンの蛍
光は原子レベル以下の“動き”だけを含んでいる。低い
波長例えば(488nm)における光エネルギーの吸収は
発色団におけるエレクトロンをより高いエネルギー軌道
に移動せしめる。より長い波長での蛍光性はこれらエレ
クトロンがより低いエネルキ一軌道にジヤンプバックす
る時に起こるホトン(photons)の発光によるも
のである。トレハローズによる乾燥状態におけるR型フ
ィコエリトリンの蛍光性の保存は、高分子の電子特性が
完全にこの技術によって保たれることを示している。こ
の方法はそれゆえ新たな電子的応用における生物学上
(および合成)高分子の応用に大変興味のもてるもので
ある。例としては、プロトンおよびエレクトロンのポン
ピング(pumping)を含んでいる(光にさらされ
た時に、バクテリオロードプシン(bacterior
hodopsin)およびロードプシン(rhodop
sin)により仲介されるように)。蛋白質を乾燥し、
それらの三次元形状や機能を保持する能力は、生物学的
分子をもちいて太陽エネルギーを水素ないし電流に直接
転換することを含む分子エレクトロニクスの可能性を提
供した。この生物学的分子は本来、分子サイズスケール
で高い効率とセンサーと電子回路(コンピューターを含
む)の構成をもっている。
【0031】
【発明の実施の形態】次の実施例は発明を詳細に説明す
るものである。
るものである。
【0032】実施例 1 フィコビリ蛋白質、R−フィコエリトリンは海洋のロー
ドフィトから精製される。輝かしい赤色の蛍光蛋白質
は、10%w/vのトレハローズ添加または無添加の燐
酸塩バッファー中に置かれたニトロセルローズ膜または
ガラスファイバーフィルター紙上に吸取られ、室温で乾
燥される。トレハローズのない場合には赤色蛋白質は紫
色に変化し、青色光で照らされた時にオレンヂ/赤の蛍
光を発する能力を失った。10%のトレハローズがある
場合には蛋白質はその色を保持し、完全に乾いた時でさ
えも、溶液中の蛋白質と同じように輝かしく蛍光を発し
た。
ドフィトから精製される。輝かしい赤色の蛍光蛋白質
は、10%w/vのトレハローズ添加または無添加の燐
酸塩バッファー中に置かれたニトロセルローズ膜または
ガラスファイバーフィルター紙上に吸取られ、室温で乾
燥される。トレハローズのない場合には赤色蛋白質は紫
色に変化し、青色光で照らされた時にオレンヂ/赤の蛍
光を発する能力を失った。10%のトレハローズがある
場合には蛋白質はその色を保持し、完全に乾いた時でさ
えも、溶液中の蛋白質と同じように輝かしく蛍光を発し
た。
【0033】我々は同じくリンパ球の表面に結合された
抗体と組合わされたフィコエリトリンの蛍光性をトレハ
ローズの存在下で乾燥することにより完全に保持した。
抗体と組合わされたフィコエリトリンの蛍光性をトレハ
ローズの存在下で乾燥することにより完全に保持した。
【0034】実施例 2 我々は同じく乾燥された時に抗体の抗原結合容量を保持
するトレハローズに対する能力を研究した。これは、1
級移植抗原(class I transplatat
ion antigens)用の非常に敏感な二位置酵
素リンク免疫検査(two site Enzyme
Linked Immunoassay)(ELISA)
への応用によって最も良く説明される。
するトレハローズに対する能力を研究した。これは、1
級移植抗原(class I transplatat
ion antigens)用の非常に敏感な二位置酵
素リンク免疫検査(two site Enzyme
Linked Immunoassay)(ELISA)
への応用によって最も良く説明される。
【0035】この検査ではモノクロナール抗原YR5/
310が、96個のウェル(well)を持ったミクロ
滴定プレート(micro titre plate)
(Nuc 免疫板)にあるポリスチレン表面に一晩培養
して結び付けられた。次にトレハローズのないプレート
の24個のウェルを乾燥し、10%添加トレハローズの
24個のウェルを乾燥、残り48個のウェルは燐酸塩バ
ッファーで湿した。乾燥は37℃で一晩行われた。
310が、96個のウェル(well)を持ったミクロ
滴定プレート(micro titre plate)
(Nuc 免疫板)にあるポリスチレン表面に一晩培養
して結び付けられた。次にトレハローズのないプレート
の24個のウェルを乾燥し、10%添加トレハローズの
24個のウェルを乾燥、残り48個のウェルは燐酸塩バ
ッファーで湿した。乾燥は37℃で一晩行われた。
【0036】次に関連した1級分子をふくんでいる血清
を加え室温で5時間培養した。プレートを洗浄し、次に
ビオチン(biotin)をラベルされた第二の抗体、
YR5/12を1時間加えた。そのプレートを再び洗浄
し、基体3,3´,5,5´−テトラメチル ベンヂヂ
ン(tetramethylbenzidine)と2
0分間培養した。反応生成物は自動ELISAプレート
リーダーで測定された。結果(第一図)はトレハローズ
なしに結合抗体を乾燥することは結合活性度の90%よ
り以上の損失をひきおこす、一方トレハローズを加えて
乾燥するとELISAの結果では非乾燥抗体によるもの
と同じであるように完全に抗体活性度を保持している。
を加え室温で5時間培養した。プレートを洗浄し、次に
ビオチン(biotin)をラベルされた第二の抗体、
YR5/12を1時間加えた。そのプレートを再び洗浄
し、基体3,3´,5,5´−テトラメチル ベンヂヂ
ン(tetramethylbenzidine)と2
0分間培養した。反応生成物は自動ELISAプレート
リーダーで測定された。結果(第一図)はトレハローズ
なしに結合抗体を乾燥することは結合活性度の90%よ
り以上の損失をひきおこす、一方トレハローズを加えて
乾燥するとELISAの結果では非乾燥抗体によるもの
と同じであるように完全に抗体活性度を保持している。
【0037】実施例 3 ドライプレート血液タイピング検査 4個のウェルを持つ組織培養皿(Nunclon 3/
132 マルチ皿4,Nunc Denmark)が用
いられた。他の安い代替品、例えば薄いPVCシートか
ら作られた“ブリスターパック(blisterpac
k)”が用いられる。
132 マルチ皿4,Nunc Denmark)が用
いられた。他の安い代替品、例えば薄いPVCシートか
ら作られた“ブリスターパック(blisterpac
k)”が用いられる。
【0038】また標準のミクロ滴定プレート、94,4
8,ないし24個のウェルも用いられる。
8,ないし24個のウェルも用いられる。
【0039】製造 3個のウェルは抗体を含み、1個は(ウェル4)A血液
グループ物質にモノクロナール マウス IgM 抗体
の50μlのみを含む(64 i.u.perml−B
lood Group Reference Labo
ratory,Radcliffe Infirmar
y,Oxford.) ウェル2はB血液グループ物質に対しモノクロナールマ
ウスIgM抗体を50μl含む(64 i.u.per
ml一出所上に同じ)。
グループ物質にモノクロナール マウス IgM 抗体
の50μlのみを含む(64 i.u.perml−B
lood Group Reference Labo
ratory,Radcliffe Infirmar
y,Oxford.) ウェル2はB血液グループ物質に対しモノクロナールマ
ウスIgM抗体を50μl含む(64 i.u.per
ml一出所上に同じ)。
【0040】ウェル3はRh D抗原に対しモノクロナ
ール ヒト IgM抗体を50μl(1mg/ml,我々の
研究所製品)。
ール ヒト IgM抗体を50μl(1mg/ml,我々の
研究所製品)。
【0041】全てのウェルが5単位のヘパリン(hep
arin)および0.01%のナトリウム アジド(s
odium azide)を加えた蒸溜水の0.1〜1
0%w/vトレハローズ溶液を50μl含む。プレート
は暖かい部屋の中で37℃で一晩乾燥される。その後室
温で無期限に貯蔵出来る。
arin)および0.01%のナトリウム アジド(s
odium azide)を加えた蒸溜水の0.1〜1
0%w/vトレハローズ溶液を50μl含む。プレート
は暖かい部屋の中で37℃で一晩乾燥される。その後室
温で無期限に貯蔵出来る。
【0042】利用 各々のウェルに水(蒸溜水または水道水)を2滴(約1
00μl)加え2〜5秒揺動プレートで広げる。全血液
の1滴を加え、血液とウェルの中身が混合するように、
静かに揺らす。5分間それぞれ数秒静かに揺する。
00μl)加え2〜5秒揺動プレートで広げる。全血液
の1滴を加え、血液とウェルの中身が混合するように、
静かに揺らす。5分間それぞれ数秒静かに揺する。
【0043】結果 A,BまたはRh抗原に対しで陽性であるレッドセルを
含んでいる血液は特定のウェルの中で30秒以内に明白
な、粗大な肉眼で見える凝集模様を与えるであろう。
O,Rh−ve血液はどのウェルにも血液凝集を起こさ
ない。
含んでいる血液は特定のウェルの中で30秒以内に明白
な、粗大な肉眼で見える凝集模様を与えるであろう。
O,Rh−ve血液はどのウェルにも血液凝集を起こさ
ない。
【0044】利益 1.プレートは無期限に室温で安定である。活性度の損
失なしに37℃で2ヶ月貯蔵された。
失なしに37℃で2ヶ月貯蔵された。
【0045】2.検査は非常に便利で速い。何等の装置
も必要としない。全ての血液が用いられる。レッドセル
は分離したり洗ったりする必要がない。指を刺すことは
ABOおよびRh検査用に十分な血液を与える。
も必要としない。全ての血液が用いられる。レッドセル
は分離したり洗ったりする必要がない。指を刺すことは
ABOおよびRh検査用に十分な血液を与える。
【0046】3.トレハローズは100%抗体活性度を
保持する。滴定血液凝集検査において5%の最終濃度で
すべて用いられた5つの糖の検査結果は次の通りであ
る。
保持する。滴定血液凝集検査において5%の最終濃度で
すべて用いられた5つの糖の検査結果は次の通りであ
る。
【0047】
【表1】 追加の滴定が保存用の最適のトレハローズ濃度があるか
どうか確立するため行われた。検査された抗体はマウス
モノクロナール IgM アンチA抗体、マウス モ
ノクロナール IgM アンチB抗体および上述の検査
で用いられたヒトモノクロナール IgM アンチRh
抗体であった。これらは適当な出発濃度に下記のように
希釈された:マウスアンチAは1:10,マウスアンチ
Bは1:10,ヒトアンチRhは最終濃度20μg/ml
に。これらは最終容積50μlとなるデュルベコ(Du
lbecco)の燐酸塩バッファー塩水(phosph
ate buffered saline)(PBS)
中で96個のウェルのあるミクロ滴定板を横断して1:
3滴定された。各々の水平8個のウェルの列に50μl
のトレハローズが10%w/vから0.1%w/vの範
囲の濃度で加えられた。ウェルはつぎに37℃で一晩乾
燥された。翌日ウェルは等張性を回復するのに十分なバ
ッファーをふくむ100μlの蒸溜水で再水和された。
次に50μlの部分がv底のミクロ滴定プレートに移さ
れ、適当な血液グループ抗原を運ぶ1%の洗浄されたヒ
トレッドセルを25μl添加され混合された。レッドセ
ル凝集反応滴定が室温で2〜3時間後に読取られた。結
果はヒト抗体については活性度の最高保存は100%で
乾燥段階でトレハローズの最終濃度2.5%で起こった
ことを示している。5%最終トレハローズ濃度で滴定に
僅かな減少があった。アンチA抗体では1%以上のどん
なトレハローズ濃度でも最高活性度を保存し、アンチB
抗体では0.5%以上のどんな濃度でも最高活性度を保
存した。
どうか確立するため行われた。検査された抗体はマウス
モノクロナール IgM アンチA抗体、マウス モ
ノクロナール IgM アンチB抗体および上述の検査
で用いられたヒトモノクロナール IgM アンチRh
抗体であった。これらは適当な出発濃度に下記のように
希釈された:マウスアンチAは1:10,マウスアンチ
Bは1:10,ヒトアンチRhは最終濃度20μg/ml
に。これらは最終容積50μlとなるデュルベコ(Du
lbecco)の燐酸塩バッファー塩水(phosph
ate buffered saline)(PBS)
中で96個のウェルのあるミクロ滴定板を横断して1:
3滴定された。各々の水平8個のウェルの列に50μl
のトレハローズが10%w/vから0.1%w/vの範
囲の濃度で加えられた。ウェルはつぎに37℃で一晩乾
燥された。翌日ウェルは等張性を回復するのに十分なバ
ッファーをふくむ100μlの蒸溜水で再水和された。
次に50μlの部分がv底のミクロ滴定プレートに移さ
れ、適当な血液グループ抗原を運ぶ1%の洗浄されたヒ
トレッドセルを25μl添加され混合された。レッドセ
ル凝集反応滴定が室温で2〜3時間後に読取られた。結
果はヒト抗体については活性度の最高保存は100%で
乾燥段階でトレハローズの最終濃度2.5%で起こった
ことを示している。5%最終トレハローズ濃度で滴定に
僅かな減少があった。アンチA抗体では1%以上のどん
なトレハローズ濃度でも最高活性度を保存し、アンチB
抗体では0.5%以上のどんな濃度でも最高活性度を保
存した。
【0048】ノート 多くの他の抗体、IgMまたはIgG級のモノクロナー
ルおよび血清抗体ともにトレハローズとのこの方法で保
存された。活性度の保存率は常に100%またはそれに
近かった。抗体は疎水性で電荷相互作用により滴定プレ
ートのウェルのプラスチック表面に結付けられる事もで
きるし、同様な力でニトロセルローズやナイロン膜に結
付けられることも出来るし又は溶液中でフリーであるこ
とも出来る。抗体が溶液中でフリーである場合には、そ
の機能は十分に保たれる、即ち抗血液グループ物質抗体
(agglutinating anti blood
group substance antibodie
s)を凝集することは乾燥しているレッドセルの激しい
凝集を引起こし、溶液中での多価結合と再水和への能力
を保持していることを示している。
ルおよび血清抗体ともにトレハローズとのこの方法で保
存された。活性度の保存率は常に100%またはそれに
近かった。抗体は疎水性で電荷相互作用により滴定プレ
ートのウェルのプラスチック表面に結付けられる事もで
きるし、同様な力でニトロセルローズやナイロン膜に結
付けられることも出来るし又は溶液中でフリーであるこ
とも出来る。抗体が溶液中でフリーである場合には、そ
の機能は十分に保たれる、即ち抗血液グループ物質抗体
(agglutinating anti blood
group substance antibodie
s)を凝集することは乾燥しているレッドセルの激しい
凝集を引起こし、溶液中での多価結合と再水和への能力
を保持していることを示している。
【0049】実施例 4 全ての血清における抗体活性度をトレハローズの存在下
で乾燥することによる保護 ラットIgG免疫グロブリン(immunoglobu
lin)(K237)へヒツジ抗血清は96ウェルの平
底ミクロ滴定プレートで1:3段階で滴定された(50
μlPBS中25μl血清)。D.W中5%w/vトレ
ハローズ50μlが次に加えられ、プレートを温室で3
7℃で48時間乾燥した。
で乾燥することによる保護 ラットIgG免疫グロブリン(immunoglobu
lin)(K237)へヒツジ抗血清は96ウェルの平
底ミクロ滴定プレートで1:3段階で滴定された(50
μlPBS中25μl血清)。D.W中5%w/vトレ
ハローズ50μlが次に加えられ、プレートを温室で3
7℃で48時間乾燥した。
【0050】ウェルは100μlの蒸溜水で再構成され
る。各々のウェルの内容の内50μlがv底ミクロ滴定
プレートヘ移され、DAラットレッドセル(DA ra
terythrocytes)は塩水で3回洗われ、D
Aレッドセル上へのAaクラス1移植抗原として特殊で
あるモノクロナール抗体R3/13HLKの表面にうか
ぶ組織培養でもって室温で2時間の培養により敏感にさ
れる。レッドセルはつぎに塩水で3回洗われPBS+1
%BSA中に1%v/vで再懸濁された。敏感にしたラ
ットレッドセルがくわえられる。同時に新しいK237
血清が陽性非乾燥例と同じように滴定される。
る。各々のウェルの内容の内50μlがv底ミクロ滴定
プレートヘ移され、DAラットレッドセル(DA ra
terythrocytes)は塩水で3回洗われ、D
Aレッドセル上へのAaクラス1移植抗原として特殊で
あるモノクロナール抗体R3/13HLKの表面にうか
ぶ組織培養でもって室温で2時間の培養により敏感にさ
れる。レッドセルはつぎに塩水で3回洗われPBS+1
%BSA中に1%v/vで再懸濁された。敏感にしたラ
ットレッドセルがくわえられる。同時に新しいK237
血清が陽性非乾燥例と同じように滴定される。
【0051】ラット抗体R3/13により敏感にさせら
れたレッドセルの直接的でない凝集を引起こす乾燥され
たまた新しい血清への能力は次のようである。
れたレッドセルの直接的でない凝集を引起こす乾燥され
たまた新しい血清への能力は次のようである。
【0052】結果
【表2】 結諭 トレハローズは全血清の抗体活性度を100%保存す
る。トレハローズのない乾燥は活性度を99%以上破壊
する。
る。トレハローズのない乾燥は活性度を99%以上破壊
する。
【0053】実施例 5 多数の異なった基質がトレハローズ支持体として検査さ
れた。そこには純粋なセルローズ紙(ワットマン(wh
atman)No.1ろ紙)、ガラスファイバー紙(ワ
ットマンGF/AおよびGF/C紙)、ポリウレタンス
ポンヂフォーム及び多孔質ポリエチレンシートがある。
これらの基質は10%から1%までの色々の濃度で蒸溜
水に溶解したトレハローズに浸し、37℃で乾燥した。
乾燥した紙のトレハローズの含有量は溶液中の約2倍で
あった。それゆえ10%溶液は重量でトレハローズ20
%を含む乾燥紙を、また5%溶液は10%重量のトレハ
ローズを含む紙を与えた。色々の血清が紙に適用され3
7℃で乾燥された。37℃で一定期間貯蔵後、蒸溜水ま
たは普通の塩水で洗われる;普通は同じ血清の新しい非
乾燥サンプルとその効力が直接比較されるように元の血
清サンプルの2〜4倍量で用いられる。
れた。そこには純粋なセルローズ紙(ワットマン(wh
atman)No.1ろ紙)、ガラスファイバー紙(ワ
ットマンGF/AおよびGF/C紙)、ポリウレタンス
ポンヂフォーム及び多孔質ポリエチレンシートがある。
これらの基質は10%から1%までの色々の濃度で蒸溜
水に溶解したトレハローズに浸し、37℃で乾燥した。
乾燥した紙のトレハローズの含有量は溶液中の約2倍で
あった。それゆえ10%溶液は重量でトレハローズ20
%を含む乾燥紙を、また5%溶液は10%重量のトレハ
ローズを含む紙を与えた。色々の血清が紙に適用され3
7℃で乾燥された。37℃で一定期間貯蔵後、蒸溜水ま
たは普通の塩水で洗われる;普通は同じ血清の新しい非
乾燥サンプルとその効力が直接比較されるように元の血
清サンプルの2〜4倍量で用いられる。
【0054】K237、ラットIgGに対してヒツジ抗
血清(sheep antiserum)、は10%ト
レハローズ含浸セルローズ紙、ガラスファイバー紙およ
び多孔質ポリエチレンシート上で乾燥され37℃で7日
間貯蔵される。
血清(sheep antiserum)、は10%ト
レハローズ含浸セルローズ紙、ガラスファイバー紙およ
び多孔質ポリエチレンシート上で乾燥され37℃で7日
間貯蔵される。
【0055】紙またはシートは通常の塩水の4倍量で洗
われ、レッドセル膜の上にしぼられたクラス1抗原に対
してモノクロナール抗体(JN2/85)で覆われたD
Aストレィンラットレッドセルを凝集する能力について
間接レッドセル凝集検査で滴定された。結果はセルロー
ズ紙でまた多孔質ポリエチレンシート上で100%の活
性度が保たれ、ガラスファイバー紙では50%であっ
た。
われ、レッドセル膜の上にしぼられたクラス1抗原に対
してモノクロナール抗体(JN2/85)で覆われたD
Aストレィンラットレッドセルを凝集する能力について
間接レッドセル凝集検査で滴定された。結果はセルロー
ズ紙でまた多孔質ポリエチレンシート上で100%の活
性度が保たれ、ガラスファイバー紙では50%であっ
た。
【0056】
【表3】 同じ血清がワットマンNo.1セルローズ紙上で各種砂
糖のある場合とない場合とを乾燥することにより試験さ
れた。
糖のある場合とない場合とを乾燥することにより試験さ
れた。
【0057】
【表4】 滴定が1:1280から1:640に低下したのは少な
くとも50%の抗体活性度が失われたことを意味する。
サッカローズとラフィノ一ズ紙および未処埋紙の間には
重要な差はない。
くとも50%の抗体活性度が失われたことを意味する。
サッカローズとラフィノ一ズ紙および未処埋紙の間には
重要な差はない。
【0058】実施例 6 紙または膜上のフィコエリトリンの乾燥 R型フィコエリトリン5mg/mlは37℃でガラスファイ
バーろ紙(ワットマンGF/C)、セルローズろ紙(ワ
ットマンNo.1)又はニトロセルローズ膜(シュライ
ヒアー&シュール0.45μ孔径)の上で5%トレハロ
ーズ溶液のある場合とない場合と乾燥した。トレハロー
ズのない場合には乾燥したR型フィコエリトリンのスポ
ットは色が紫がかった赤に変わりその蛍光強度の90%
より以上を失った。トレハローズを添加した場合には色
と蛍光性の両方とも保ち続けている。トレハローズ含有
サンプルは蛍光性をうしなう事なく10か月間暗所に貯
蔵された。
バーろ紙(ワットマンGF/C)、セルローズろ紙(ワ
ットマンNo.1)又はニトロセルローズ膜(シュライ
ヒアー&シュール0.45μ孔径)の上で5%トレハロ
ーズ溶液のある場合とない場合と乾燥した。トレハロー
ズのない場合には乾燥したR型フィコエリトリンのスポ
ットは色が紫がかった赤に変わりその蛍光強度の90%
より以上を失った。トレハローズを添加した場合には色
と蛍光性の両方とも保ち続けている。トレハローズ含有
サンプルは蛍光性をうしなう事なく10か月間暗所に貯
蔵された。
【0059】実施例 7 ニトロセルローズ膜上でDNAを吟味するための新規試
験における膜一乾燥のフィコエリトリンの使用 フィコエリトリンの蛍光性は衰えることなしに膜上で乾
燥状態で励起されるので、非常に強い完全な蛍光信号が
この分子から写真のエマルジョン上に記録される。
験における膜一乾燥のフィコエリトリンの使用 フィコエリトリンの蛍光性は衰えることなしに膜上で乾
燥状態で励起されるので、非常に強い完全な蛍光信号が
この分子から写真のエマルジョン上に記録される。
【0060】この方法の敏感さの一例として、DNAの
100picogramから0.1pgへの10回連続の希釈はス
ロット−ブロット装置(slot−blot appa
ratus)を用いてニトロセルローズ上に乾燥され
た。このDNAは光ビオチンを用いているビオチンと分
類されていた。これらの膜は、R型フィコエリトリン
(QB−AR4セロテック社)に、1mg/ml溶液に室温
で1時間インキュベーション後、300mlのブロッキン
グバッファー(1%BSAin PBS)中に一晩中過
剰洗浄を続けることで、等価に結合されているストレプ
トアビデインで検査された。つづいて膜は蒸溜水10%
トレハローズ溶液で洗浄され室温で乾燥される。膜は次
に修正したポロライドVDUカメラで1時間露出を用い
て写真を写され、一方490nmの干渉フィルター(イー
リングベック(ealing beck))を通したキ
セノン光源からの強烈な青色光で照らされた。カメラレ
ンズはオレンヂ−赤蛍光だけが記録されるように560
nm切離しのロングパス干渉フィルターで覆われた。レッ
テルを張られたDNAのしみは容易に10pgDNAより
以上の感度で検出され、バックグランドは無視出来た。
ニトロセルローズの同じ乾燥膜はこのシステムで3日の
期間に亙って20回以上蛍光信号が衰えることなしに写
真が写された。対照的に湿った状態でまたトレハローズ
がない場合に照らされると、蛍光信号は30秒内に衰え
る。トレハローズなしに乾燥すると蛍光信号は失われる
ことになる。
100picogramから0.1pgへの10回連続の希釈はス
ロット−ブロット装置(slot−blot appa
ratus)を用いてニトロセルローズ上に乾燥され
た。このDNAは光ビオチンを用いているビオチンと分
類されていた。これらの膜は、R型フィコエリトリン
(QB−AR4セロテック社)に、1mg/ml溶液に室温
で1時間インキュベーション後、300mlのブロッキン
グバッファー(1%BSAin PBS)中に一晩中過
剰洗浄を続けることで、等価に結合されているストレプ
トアビデインで検査された。つづいて膜は蒸溜水10%
トレハローズ溶液で洗浄され室温で乾燥される。膜は次
に修正したポロライドVDUカメラで1時間露出を用い
て写真を写され、一方490nmの干渉フィルター(イー
リングベック(ealing beck))を通したキ
セノン光源からの強烈な青色光で照らされた。カメラレ
ンズはオレンヂ−赤蛍光だけが記録されるように560
nm切離しのロングパス干渉フィルターで覆われた。レッ
テルを張られたDNAのしみは容易に10pgDNAより
以上の感度で検出され、バックグランドは無視出来た。
ニトロセルローズの同じ乾燥膜はこのシステムで3日の
期間に亙って20回以上蛍光信号が衰えることなしに写
真が写された。対照的に湿った状態でまたトレハローズ
がない場合に照らされると、蛍光信号は30秒内に衰え
る。トレハローズなしに乾燥すると蛍光信号は失われる
ことになる。
【0061】実施例 8 ラットリンパ球の蛍光顕微鏡使用法(fluoresc
ence microscopy) R−フィコエリトリンを用いる蛍光顕微鏡使用法、フッ
化クロムは以前水性マウンタント(mountant
s)における蛍光性の衰えの為に非常に効率が悪かっ
た。これは調整品を乾燥することにより、またガル(G
urr)のフルオロマウント(fluoromoun
t)のような非極性マウンタントに乗せることにより避
けることができる、しかしながら乾燥はR−フィコエリ
トリンの蛍光性の90%以上を破壊する。これは最終バ
ッファーにトレハローズを加えて乾燥することにより避
けられる。これは有機の非水マウンタンに乗せられる又
蛍光信号の損失無しに長期間繰返して試験出来るラベル
された細胞ないし組織の蛍光強度の全てを事実上保存す
る。
ence microscopy) R−フィコエリトリンを用いる蛍光顕微鏡使用法、フッ
化クロムは以前水性マウンタント(mountant
s)における蛍光性の衰えの為に非常に効率が悪かっ
た。これは調整品を乾燥することにより、またガル(G
urr)のフルオロマウント(fluoromoun
t)のような非極性マウンタントに乗せることにより避
けることができる、しかしながら乾燥はR−フィコエリ
トリンの蛍光性の90%以上を破壊する。これは最終バ
ッファーにトレハローズを加えて乾燥することにより避
けられる。これは有機の非水マウンタンに乗せられる又
蛍光信号の損失無しに長期間繰返して試験出来るラベル
された細胞ないし組織の蛍光強度の全てを事実上保存す
る。
【0062】アンチCD4モノクロナール抗体W3/2
5はビオチン(biotin)−リンカー(like
r)ーアーム(arm)N−ヒドロキシサクシニィミド
エステル(hydroxysuccinimide e
ster)と結合され、ラットリンパ球のTヘルパー部
分集合としてラベルするよう飽和された量で用いられ
た。これらラベルされた細胞は次にストレプトアビディ
ン−R−フィコエリトリン結合品を用いて第二の着色過
程で検出された。最終洗浄後細胞は4分割されーつはこ
れらの試薬と正確なレッテルを示すようFACSで試験
された。二つの他の分割品はスピンダウンされトレハロ
ーズ10%添加のまたは入っていない血清に再懸濁され
た。標本が作られ、乾燥され、次にフルオロマウントに
乗せられた。四番目の分割品はPBSに湿ったまま備え
付けられた。全ての三つの調整品はプレーム光学のツア
ィス光学顕微鏡で試験された。
5はビオチン(biotin)−リンカー(like
r)ーアーム(arm)N−ヒドロキシサクシニィミド
エステル(hydroxysuccinimide e
ster)と結合され、ラットリンパ球のTヘルパー部
分集合としてラベルするよう飽和された量で用いられ
た。これらラベルされた細胞は次にストレプトアビディ
ン−R−フィコエリトリン結合品を用いて第二の着色過
程で検出された。最終洗浄後細胞は4分割されーつはこ
れらの試薬と正確なレッテルを示すようFACSで試験
された。二つの他の分割品はスピンダウンされトレハロ
ーズ10%添加のまたは入っていない血清に再懸濁され
た。標本が作られ、乾燥され、次にフルオロマウントに
乗せられた。四番目の分割品はPBSに湿ったまま備え
付けられた。全ての三つの調整品はプレーム光学のツア
ィス光学顕微鏡で試験された。
【0063】湿ったマウントは約20〜30秒以内に最
も明るい細胞だけが僅かに見分けることが出来るほど急
激に衰えた約75%輝度の蛍光細胞を示した。トレハロ
ーズをふくまない乾燥マウントは辛うじてバックグラン
ドの上に見ることのできる極めて弱い蛍光細胞のみを示
した。
も明るい細胞だけが僅かに見分けることが出来るほど急
激に衰えた約75%輝度の蛍光細胞を示した。トレハロ
ーズをふくまない乾燥マウントは辛うじてバックグラン
ドの上に見ることのできる極めて弱い蛍光細胞のみを示
した。
【0064】トレハローズ添加の乾燥調整品は衰えるこ
とのない75%輝度の蛍光細胞を示した。この調整品数
週間繰返し試験したが、何等検出しうるその細胞の衰え
は見られなかった。
とのない75%輝度の蛍光細胞を示した。この調整品数
週間繰返し試験したが、何等検出しうるその細胞の衰え
は見られなかった。
【0065】このようにトレハローズは完全に乾燥され
た時でも蛋白質のいくつかの広くことなれる又非常に変
化しやすい特性を完全に保持する。これらの特性(蛍光
性と抗原結合)は完全に分子の手のついていない第三の
構造の保持によるものである。 この現象は蛋白質の機
能と構造が乾燥状態で完全に保たれていることを意味す
る。かくして科学的ないし医学的関心の蛋白質は凍結ま
たは凍結乾燥に対する必要条件なしに保存される。免疫
一検査用キットは水分損失を阻止するため密閉するとか
脂肪体一形成とかの必要性なしに調製され貯蔵される。
化学ルミネッサンス、電気伝導および窒素固定とか光合
成のようなあるいは複合した特性のような新しい又あり
ふれていない蛋白質や他の分子が乾燥状態で保存するこ
とが出来る。
た時でも蛋白質のいくつかの広くことなれる又非常に変
化しやすい特性を完全に保持する。これらの特性(蛍光
性と抗原結合)は完全に分子の手のついていない第三の
構造の保持によるものである。 この現象は蛋白質の機
能と構造が乾燥状態で完全に保たれていることを意味す
る。かくして科学的ないし医学的関心の蛋白質は凍結ま
たは凍結乾燥に対する必要条件なしに保存される。免疫
一検査用キットは水分損失を阻止するため密閉するとか
脂肪体一形成とかの必要性なしに調製され貯蔵される。
化学ルミネッサンス、電気伝導および窒素固定とか光合
成のようなあるいは複合した特性のような新しい又あり
ふれていない蛋白質や他の分子が乾燥状態で保存するこ
とが出来る。
【0066】実施例 9 酵素活性度の保存 子牛の腸(calf intestine)からの、ほ
乳動物酵素アルカリ燐酸塩は燐酸塩バッファー塩水(P
BS)で連続的に薄められ、NUNC免疫プレートのウ
ェルに加えられた。プラスチック表面に酵素を結び付け
るよう一晩以上培養の後、ウェルは洗浄され、液をとる
よう揺り動かされ、37℃で5%トレハローズ蒸溜水溶
液の存在下でまた非存在下で乾燥された。プレートは次
に室温で4週間培養された。この時の最後にウェルは蒸
溜水で再水和され基質が加えられた。陽性コントロール
は酵素の新鮮な希釈からなっていた。一つの酵素の活性
度がp−ニトロフェニルフォスフェート(nitrop
henylphosphate)を還元する標準テスト
により測定されまた405nmにおける光密度を監視し
た。
乳動物酵素アルカリ燐酸塩は燐酸塩バッファー塩水(P
BS)で連続的に薄められ、NUNC免疫プレートのウ
ェルに加えられた。プラスチック表面に酵素を結び付け
るよう一晩以上培養の後、ウェルは洗浄され、液をとる
よう揺り動かされ、37℃で5%トレハローズ蒸溜水溶
液の存在下でまた非存在下で乾燥された。プレートは次
に室温で4週間培養された。この時の最後にウェルは蒸
溜水で再水和され基質が加えられた。陽性コントロール
は酵素の新鮮な希釈からなっていた。一つの酵素の活性
度がp−ニトロフェニルフォスフェート(nitrop
henylphosphate)を還元する標準テスト
により測定されまた405nmにおける光密度を監視し
た。
【0067】活性度の十分な保有は酵素かトレハローズ
とともに乾燥されたときに得られ、トレハローズがなし
に乾燥されたときには90%以上活性度が失われた。同
一の結果がわさび大根からのパーオキシダーゼについて
同一の実験に使われた時に得られた。
とともに乾燥されたときに得られ、トレハローズがなし
に乾燥されたときには90%以上活性度が失われた。同
一の結果がわさび大根からのパーオキシダーゼについて
同一の実験に使われた時に得られた。
【0068】実施例 10 血清補体の保存 モルモット血清(guinia pig serum)
が使用まで−196℃で分割して新鮮かつ凍結されて準
備された。目標細胞として、2週間にいたるまでアルス
バー(Alsever)の溶液に貯蔵した洗浄されたヒ
ツジレッドセルがウシモノクロナールアンチ−ホルスマ
ン抗体(bovin monoclonal anti
−forrsmann antibody)94A1−
AZAと一緒に4℃で1時間培養された、次に補体固定
希釈液(CFD)で洗浄された。
が使用まで−196℃で分割して新鮮かつ凍結されて準
備された。目標細胞として、2週間にいたるまでアルス
バー(Alsever)の溶液に貯蔵した洗浄されたヒ
ツジレッドセルがウシモノクロナールアンチ−ホルスマ
ン抗体(bovin monoclonal anti
−forrsmann antibody)94A1−
AZAと一緒に4℃で1時間培養された、次に補体固定
希釈液(CFD)で洗浄された。
【0069】新たにとかしたモルモット血清はCFDで
希釈され、その際平底ミクロ滴定プレート(NUNC,
デンマーク)が使われ、またトレハローズは各種の濃度
で添加される。プレートは室温で一晩以上乾燥空気を流
して乾燥された。
希釈され、その際平底ミクロ滴定プレート(NUNC,
デンマーク)が使われ、またトレハローズは各種の濃度
で添加される。プレートは室温で一晩以上乾燥空気を流
して乾燥された。
【0070】CH50検査(P.J.Lachmann
及びM.j.Hobart、“Handbook o
f Experimental Immunolog
y”刊行,D.M.Weir,Blackwell 1
978)については、乾燥したまたは新鮮な補体がU底
のミクロ滴定プレートの中で滴定が行われ最終濃度2%
まで添加しSRBCを敏感にした。プレートは次に37
℃1時間培養され、遠心分離された。終点はレッドセル
の50%がその中でボタンとして残っているのがカップ
として測定された。
及びM.j.Hobart、“Handbook o
f Experimental Immunolog
y”刊行,D.M.Weir,Blackwell 1
978)については、乾燥したまたは新鮮な補体がU底
のミクロ滴定プレートの中で滴定が行われ最終濃度2%
まで添加しSRBCを敏感にした。プレートは次に37
℃1時間培養され、遠心分離された。終点はレッドセル
の50%がその中でボタンとして残っているのがカップ
として測定された。
【0071】結果 トレハローズの保護効果は糖の蛋白質に対するモル比に
依存した。補体活性度100%は50%規定の血清中に
トレハローズを0.22Mまたはそれ以上により保た
れ、25%血清では0.15Mと同等以上を必要とし
た。トレハローズの高い濃度(0.5Mまで)はいかな
る濃度の血清おいても抑制しなかった。
依存した。補体活性度100%は50%規定の血清中に
トレハローズを0.22Mまたはそれ以上により保た
れ、25%血清では0.15Mと同等以上を必要とし
た。トレハローズの高い濃度(0.5Mまで)はいかな
る濃度の血清おいても抑制しなかった。
【0072】トレハローズのない場合での牛類(nea
t)血清の乾燥は補体活性度の75%の損失を引起こし
た。トレハローズのない25%血清の乾燥は93%の補
体活性度損失を起こした。これらの損失は完全にトレハ
ローズにより阻止された、乾燥され再構成された補体の
活性度は新鮮な補体のものと全く同じであった。
t)血清の乾燥は補体活性度の75%の損失を引起こし
た。トレハローズのない25%血清の乾燥は93%の補
体活性度損失を起こした。これらの損失は完全にトレハ
ローズにより阻止された、乾燥され再構成された補体の
活性度は新鮮な補体のものと全く同じであった。
【図1】実施例2の結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI A61K 39/00 A61K 37/02 37/48
Claims (1)
- 【請求項1】乾燥中の変質に対して活性蛋白質を保護す
る方法であって、活性蛋白質を含有する水を含んだ系を
トレハローズ(trehalose )の存在のもとで氷点を超え
る温度で乾燥し、使用時に水を加え実質的に元の状態に
戻すことを特徴とする保護方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB858517352A GB8517352D0 (en) | 1985-07-09 | 1985-07-09 | Protection of proteins |
GB8517352 | 1985-07-09 | ||
GB868613066A GB8613066D0 (en) | 1986-05-29 | 1986-05-29 | Protection of proteins &c |
GB8613066 | 1986-05-29 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61503940A Division JPH0779694B2 (ja) | 1985-07-09 | 1986-07-09 | 蛋白質および同類品の保護 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11246593A true JPH11246593A (ja) | 1999-09-14 |
JPH11246593A6 JPH11246593A6 (ja) | 2010-04-08 |
Family
ID=26289504
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61503940A Expired - Lifetime JPH0779694B2 (ja) | 1985-07-09 | 1986-07-09 | 蛋白質および同類品の保護 |
JP10253492A Pending JPH11246593A (ja) | 1985-07-09 | 1998-09-08 | 蛋白質および同類品の保護 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61503940A Expired - Lifetime JPH0779694B2 (ja) | 1985-07-09 | 1986-07-09 | 蛋白質および同類品の保護 |
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Country | Link |
---|---|
US (1) | US4891319A (ja) |
EP (1) | EP0229810B1 (ja) |
JP (2) | JPH0779694B2 (ja) |
AT (1) | ATE68524T1 (ja) |
DE (2) | DE3682047D1 (ja) |
DK (1) | DK170173B1 (ja) |
WO (1) | WO1987000196A1 (ja) |
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