JP2011507871A - トレハロースを含む安定化第ｉｘ因子製剤 - Google Patents

Abstract

第ＩＸ因子のカルシウム結合特性の９０％超を保持する、第ＩＸ因子の凍結調製物を調製する方法を開示する。トレハロースと共に調合した第ＩＸ因子は、２５℃／６０％の相対湿度（ＲＨ）、及び４０℃／７５％ＲＨにて１２週間保管後に、トレハロースを含めずに調合した第ＩＸ因子よりも優れた安定性プロファイルを示す。このデータは、トレハロースを該製剤に含めると、第ＩＸ因子の凍結乾燥産物を温度変化に暴露させるか、又は更に長期間室温で保管することが可能になることを示唆している。試験製剤は、１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．８）、３％のマンニトール、６６ｍＭの塩化ナトリウム、０．００７５％のポリソルベート８０を含み、かつ、１％のトレハロースを含むものと、トレハロースを含まないものであった。４０℃／７５％ＲＨ、又は２５℃／６０％ＲＨで１２週間にわたって保管したところ、トレハロースを含む製剤は、２〜８℃で保管した産物に匹敵していたが、トレハロースを含まない製剤は有意な凝集を起こし、活性を失うことが明らかになった。これらの２つの製剤は、−２０℃及び２〜８℃での２６週間のリアルタイム保管では、同様の安定性を示した。

Description

（関連出願）
本出願は、２００７年１２月２１日に提出した米国仮出願第６１／０１６，２３０号に基づく優先権を主張するものであり、該仮出願は、参照により本明細書に取り込まれる。

（共同研究契約の当事者）
本成果は、インスピレーション・バイオファーマシューティカルズ社とアイコス社との間の研究契約の結果、生まれたものである。

本発明の実施形態は、凍結乾燥及び保管中におけるタンパクの構造と活性の安定化、特に第ＩＸ因子のような血液凝固因子の安定化に関する。

（関連技術の説明）
第ＩＸ因子は、凝固経路に関与する一本鎖糖タンパクである。第ＩＸ因子は、Ｃａ²⁺の結合を担うＧｌａドメインに加えて、アミノ末端シグナルペプチドとプレプロリーダー配列（双方とも循環血液中への分泌前に切断される）を含む複雑な構造の分子である。このタンパクにカルシウムが結合して、このタンパクのコンフォメーション変化（凝固活性に必須である）を誘発することによって、カルシウム結合は第ＩＸ因子の機能において重要な役割を果たす。カルシウムの結合の結果、それまで埋もれていた疎水性結合部分が露出し、この結合部分が、効率的な凝固のためにリン脂質への結合を促す。活性タンパクを産生するためには、第ＩＸ因子のカルシウム結合特性の維持が欠かせない。一本鎖の第ＩＸ因子は、活性化ペプチドが切断されると、鎖間のジスルフィド結合によってつながっている二本鎖の糖タンパクである活性化酵素、第ＩＸａ因子になる。加えて、この分子は複数のＮ及びＯ結合型糖鎖結合部位を含む。第ＩＸ因子の欠損は血友病Ｂを引き起こすが、現在、血友病Ｂには、第ＩＸ因子の組換え型であるベネフィックス（登録商標）、及びヒト血漿由来のモノニン（Mononine）（登録商標）を含め、いくつかの治療法がある。

モノニン（Mononine）（登録商標）製剤は、ヒスチジン、マンニトール、塩化ナトリウム、及びポリソルベート８０からなる。これらの大部分は、凍結中に共晶転移（結晶化事象）を示すことで知られている賦形剤である。しかし、モノニン（Mononine）（登録商標）製剤は凍結保護剤又は安定化剤を含まず、緩衝剤、充填剤、等張化剤、及び界面活性剤のみを含む。その結果、凍結、凍結乾燥、及び続いて行われる保管の間、このタンパクは比較的、氷、水、及び空気への暴露による変性作用から物理的に保護されない。本発明で取り組んだ技術的課題は、凍結、凍結乾燥、及び保管中における安定性が向上した改良型第ＩＸ因子製剤である。

本発明者は、凍結、凍結乾燥、及び保管中に第ＩＸ因子組成物にトレハロースを含めると、第ＩＸ因子のカルシウム結合能が安定化し、精製タンパクの生物活性が維持されることを発見した。

本発明の実施形態は、第ＩＸ因子とトレハロースとを含む凍結乾燥組成物に関する。トレハロースは、凍結乾燥、及び２５℃における６カ月間の保管時に第ＩＸ因子のカルシウム結合特性の９０％超を保持するのに十分な量で存在するのが好ましい。

トレハロースは０．５〜３体積％の量で存在するのが好ましい。トレハロースは１〜２体積％の量で存在するのが更に好ましい。

いくつかの好ましい実施形態では、前記組成物は緩衝剤としてヒスチジンを含む。いくつかの好ましい実施形態では、前記組成物はマンニトールを含む。いくつかの好ましい実施形態では、前記組成物は塩化ナトリウムを含む。いくつかの好ましい実施形態では、前記組成物はポリソルベート８０を含む。

最も好ましい実施形態では、前記組成物は第ＩＸ因子とトレハロースとを含み、更に、濃度５〜２０ｍＭのヒスチジンと、濃度２〜５体積％のマンニトールと、濃度５０〜８０ｍＭの塩化ナトリウムと、濃度０．００１〜０．００５体積％のポリソルベート８０とを含む。

本発明の実施形態は、第ＩＸ因子とトレハロースとを含む溶液を混合して凍結保護溶液を得て、その凍結保護溶液をフリーズドライして第ＩＸ因子の安定的な乾燥組成物を得ることによって、第ＩＸ因子の安定的な乾燥組成物を調製する方法に関する。第ＩＸ因子の乾燥組成物は、６カ月間２５℃で保管したときに９０％超のカルシウム結合活性を保っているのが好ましい。

トレハロースは０．５〜３体積％の量で存在するのが好ましい。トレハロースは１〜２体積％の量で存在するのが更に好ましい。

いくつかの実施形態では、前記溶液は緩衝剤としてヒスチジンを含む。いくつかの好ましい実施形態では、前記溶液はマンニトールを含む。いくつかの好ましい実施形態では、前記溶液は塩化ナトリウムを含む。いくつかの好ましい実施形態では、前記溶液はポリソルベート８０を含む。

最も好ましい実施形態では、前記溶液は第ＩＸ因子とトレハロースとを含み、更に、濃度５〜２０ｍＭのヒスチジンと、濃度２〜５体積％のマンニトールと、濃度５０〜８０ｍＭの塩化ナトリウムと、濃度０．００１〜０．００５体積％のポリソルベート８０とを含む。

前記フリーズドライ工程は、１回のアニール段階を含むのが好ましい。

本発明の実施形態は、下記のステップの１つ以上を含む方法によって、第ＩＸ因子とトレハロースとを含む医薬製剤を凍結乾燥する方法に関する。
（ａ）第ＩＸ因子とトレハロースとを含む医薬製剤を−４０℃以下の温度で凍結するステップ
（ｂ）前記医薬製剤を約−２０℃〜−３５℃の温度でアニールするステップ
（ｃ）前記医薬製剤の温度を−４０℃以下まで低下させるステップ
（ｄ）第１の乾燥段階で、５℃〜２０℃にて減圧下で前記医薬製剤を乾燥するステップ
（ｅ）第２の乾燥段階で、４５℃〜５５℃にて減圧下で前記医薬製剤を乾燥するステップ

前記医薬製剤は、濃度５〜２０ｍＭのヒスチジンと、濃度２〜５体積％のマンニトールと、濃度５０〜８０ｍＭの塩化ナトリウムと、濃度０．００１〜０．００５体積％のポリソルベート８０も含むのが好ましい。

本発明の更なる態様、特徴、及び利点は、後掲の発明を実施するための形態から明らかになるであろう。

本発明の上記及びその他の特徴について、好ましい実施形態の図面を参照しながら説明していくが、好ましい実施形態は、本発明を例示するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。

図１は、４０℃／７５％ＲＨにおける第ＩＸ因子の安定性を示している。「■」は、１０ｍＭのヒスチジン、３％のマンニトール、６６ｍＭのＮａＣｌ、０．００７５％のポリソルベート８０（ｐＨ６．８）中の０．４ｍｇ／ｍｌの第ＩＸ因子タンパク（Ｒ１）を表している。「●」は、１０ｍＭのヒスチジン、３％のマンニトール、６６ｍＭのＮａＣｌ、０．００７５％のポリソルベート８０（ｐＨ６．８）中の０．４ｍｇ／ｍｌの第ＩＸ因子タンパクに１％のトレハロースを添加したもの（Ｒ２）を表している。 図２は、１２週間保管後の第ＩＸ因子組成物のＳＥ−ＨＰＬＣ溶出プロファイルを示している。図２Ａは、１０ｍＭのヒスチジン、３％のマンニトール、６６ｍＭのＮａＣｌ、及び０．００７５％のポリソルベート８０（ｐＨ６．８）中の０．４ｍｇ／ｍｌの第ＩＸ因子タンパク（Ｒ１）を示している。図２Ｂは、１０ｍＭのヒスチジン、３％のマンニトール、６６ｍＭのＮａＣｌ、０．００７５％のポリソルベート８０（ｐＨ６．８）中の０．４ｍｇ／ｍｌの第ＩＸ因子タンパクに１％のトレハロースを添加したもの（Ｒ２）を示している。 図３は、１２週間保管後の第ＩＸ因子のＳＥ−ＨＰＬＣ（カルシウム）溶出プロファイルを示している。図３Ａは、１０ｍＭのヒスチジン、３％のマンニトール、６６ｍＭのＮａＣｌ、及び０．００７５％のポリソルベート８０（ｐＨ６．８）中の０．４ｍｇ／ｍｌの第ＩＸ因子タンパク（Ｒ１）を示している。図３Ｂは、１０ｍＭのヒスチジン、３％のマンニトール、６６ｍＭのＮａＣｌ、０．００７５％のポリソルベート８０（ｐＨ６．８）中の０．４ｍｇ／ｍｌの第ＩＸ因子タンパクに１％のトレハロースを添加したもの（Ｒ２）を示している。 図４は、４０℃／７５％ＲＨにおける第ＩＸ因子のカルシウム結合の安定性を示している。「■」は、１０ｍＭのヒスチジン、３％のマンニトール、６６ｍＭのＮａＣｌ、０．００７５％のポリソルベート８０（ｐＨ６．８）中の０．４ｍｇ／ｍｌの第ＩＸ因子タンパク（Ｒ１）を表している。「●」は、１０ｍＭのヒスチジン、３％のマンニトール、６６ｍＭのＮａＣｌ、０．００７５％のポリソルベート８０（ｐＨ６．８）中の０．４ｍｇ／ｍｌの第ＩＸ因子タンパクに１％のトレハロースを添加したもの（Ｒ２）を表している。 図５は、１２週間保管後の第ＩＸ因子製剤の非還元条件下（Ａ）及び還元条件下（Ｂ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。パネルＡのレーン１はブランク、レーン２はマーカー、レーン３は第ＩＸ因子の標準試料（モノニン（Mononine）（登録商標））、レーン４は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ１、凍結乾燥、−２０℃、レーン５は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ２、凍結乾燥、−２０℃、レーン６は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ１、凍結乾燥、２〜８℃、レーン７は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ２、凍結乾燥、２〜８℃、レーン８は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ１、凍結乾燥、２５℃、レーン９は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ２、凍結乾燥、２５℃、レーン１０は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ１、凍結乾燥、４０℃、レーン１１は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ２、凍結乾燥、４０℃、レーン１２はマーカーである。パネルＢでは、レーン１及び２はマーカー、レーン３は第ＩＸ因子の標準試料（モノニン（Mononine）（登録商標））、レーン４は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ１、凍結乾燥、−２０℃、レーン５は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ２、凍結乾燥、−２０℃、レーン６は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ１、凍結乾燥、２〜８℃、レーン７は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ２、凍結乾燥、２〜８℃、レーン８は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ１、凍結乾燥、２５℃、レーン９は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ２、凍結乾燥、２５℃、レーン１０は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ１、凍結乾燥、４０℃、レーン１１は０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｒ２、凍結乾燥、４０℃、レーン１２はマーカーである。 図６は、１２週間保存後の第ＩＸ因子組成物の陰イオン交換ＨＰＬＣ溶出プロファイルを示している。図６Ａは、１０ｍＭのヒスチジン、３％のマンニトール、６６ｍＭのＮａＣｌ、０．００７５％のポリソルベート８０（ｐＨ６．８）中の０．４ｍｇ／ｍｌの第ＩＸ因子タンパク（Ｒ１）を示している。図６Ｂは、１０ｍＭのヒスチジン、３％のマンニトール、６６ｍＭのＮａＣｌ、０．００７５％のポリソルベート８０（ｐＨ６．８）中の０．４ｍｇ／ｍｌの第ＩＸ因子タンパクに１％のトレハロースを添加したもの（Ｒ２）を示している。

記載されている実施形態は本発明の好ましい実施形態を表しているが、当業者であれば、本発明の趣旨から逸脱することなく、その修正形態を考え付くと理解されるべきである。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ定められるものとする。

本発明の実施形態は、トレハロースの存在下で第ＩＸ因子を凍結乾燥する方法と、トレハロースを含む第ＩＸ因子製剤とに関する。凍結乾燥プロセス中に結晶化しない凍結保護剤であるトレハロースを添加した場合と添加しなかった場合の第ＩＸ因子製剤を評価した。トレハロースは、低温まで凍結するとガラス転移を起こす濃縮物として存続する。したがってタンパクは、トレハロースの存在下で保持され、混合したアモルファス状態で保たれ、凍結及びフリーズドライによって安定化する。トレハロースは安定性を向上させると共に、保管されている第ＩＸ因子タンパクの凝集を防いだ。トレハロースを前記製剤に含めたところ、第ＩＸ因子活性に必要なカルシウム誘発性のコンフォメーション変化の保持度が有意に向上したことも驚くべきことに明らかになった。カルシウム結合能の見かけ上の喪失は、効力の喪失と相関していた。このカルシウム結合能と効力の喪失は、トレハロースを含む製剤では大きく抑えられた。

好ましい実施形態では、第ＩＸ因子組成物中にトレハロースを含めることによって、凍結、凍結乾燥、及び保管中に第ＩＸ因子のカルシウム結合能の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、更に好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも９０％が保持される。トレハロースは、凍結、凍結乾燥、及び２５℃で少なくとも３カ月、より好ましくは２５℃で少なくとも６カ月、更に好ましくは２５℃で少なくとも１年間保管中に第ＩＸ因子のカルシウム結合特性の９０％超を保持するのに十分な量で存在するのが好ましい。

製剤成分
好ましい実施形態では、本発明の第ＩＸ因子組成物は緩衝剤、充填剤、等張化剤、界面活性剤、及び凍結保護剤／安定化剤を含む。いくつかの実施形態では、その他の賦形剤も含めてよい。これらの組成物は、凍結乾燥調製物中の第ＩＸ因子、更には液体状態の第ＩＸ因子の安定性を最大化する。

好ましい実施形態では、緩衝剤が前記組成物中に含まれている。そのｐＨは、凍結乾燥及び保管中に好ましくは６〜８の範囲、より好ましくはｐＨ約６．８に保たなければならない。緩衝剤は、ヒスチジン、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（トリス）、１，３−ビス−［トリス−（ヒドロキシ−メチル）メチルアミノ］−プロパン（ビス−トリスプロパン）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及びＮ−２−アセトアミド−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）を含め、緩衝剤として働く力を有するいずれかの生理学的に許容可能な化学物質、又は化学物質の組み合わせであってもよい。典型的には、緩衝剤は５〜２０ｍＭの濃度で含める。最も好ましい実施形態では、緩衝剤は濃度約１０ｍＭのヒスチジンである。

充填剤は、医薬調製物を凍結乾燥後、医薬調製物の「ケーク」、すなわち残渣固形塊に構造をもたらす化学物質であり、医薬調製物を崩壊から守る。本発明の製剤で用いられる充填剤は、マンニトール、グリシン、及びアラニンを含むがこれらに限定されない群から選択する。マンニトール、グリシン、又はアラニンは、１〜１０％、好ましくは２〜５％、より好ましくは約３％の量で存在する。

本発明の製剤には、塩化ナトリウムを３０〜１００ｍＭ、好ましくは５０〜８０ｍＭ、最も好ましくは約６６ｍＭの量で含める。

好ましい実施形態では、第ＩＸ因子組成物は界面活性剤を好ましくは０．１％以下の量で、より好ましくは０．００１〜０．００５％の量で含む。界面活性剤は例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、プルロニックポリオル、及びＢＲＩＪ３５（ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル）を含むがこれらに限定されない群から選択できる。いくつかのグレードのプルロニックポリオル（プルロニックという商品名で販売されている。ＢＡＳＦワイアンドット社製）が入手可能である。様々な分子量（１,０００〜１６,０００超）と様々な物理化学的特性を持つこれらのポリオルは、界面活性剤として用いられてきている。分子量５,０００のプルロニックＦ−３８と分子量９,０００のプルロニックＦ−６８はいずれも、（重量比で）疎水性ポリオキシエチレン基を８０パーセント、疎水性ポリオキシプロピレン基を２０パーセント含む。好ましい実施形態では、ポリソルベート８０を約０．００７５％の濃度で含む。

本発明の製剤では、安定化剤を用いるのが好ましい。安定化剤は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、及びアルギニンを含むがこれらに限定されない群から選択する。これらの安定化剤は本発明の製剤中に、０．５〜３％、好ましくは１〜２％、より好ましくは約１％の量で存在する。非常に好ましい実施形態では、本組成物中にトレハロースを１％の濃度で含める。

好ましい実施形態では、本発明の組成物で用いられる第ＩＸ因子は、高純度のヒト血漿由来第ＩＸ因子であるか、より好ましくは、組換え技術によって作られた第ＩＸ因子であるか、のいずれかであってよい。組換え第ＩＸ因子は、第ＩＸ因子分子をコードするＤＮＡ配列を有するベクターでトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって製造することができる。このようなトランスフェクションＣＨＯ細胞を作製する方法はとりわけ、Toole, Jr.の米国特許第４,７５７,００６号に記載されているが、当業界では代替的な方法も知られている（例えば、上記と同様にToole, Jr.の米国特許第４,８６８,１１２号、及び国際公開第Ａ−９１／０９１２２号を参照のこと)。

本願に記載されている第ＩＸ因子組成物は、示されている濃度で凍結乾燥及び再構成することができるが、これらの調製物は、更に希釈した状態でも再構成できることを当業者は理解するであろう。例えば、凍結乾燥及び／又は一般には２ｍｌの溶液中で再構成される本発明による調製物は、５ｍｌのような更に大きい体積の希釈剤中で再構成させることもできる。これは、第ＩＸ因子調製物を患者に直接注入するときに特に適している。このケースでは、第ＩＸ因子が活性を失う可能性が低いからであり、この活性の喪失は、第ＩＸ因子溶液が薄いほど急速に起こり得る。

ヒト第ＩＸ因子をコードするｃＤＮＡでトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣細胞中で、組換え第ＩＸ因子を調製した。宿主細胞タンパク及びＤＮＡを含む培地成分から所望の産物を分離するための陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーを含むプロセスを用いて、馴化培地から第ＩＸ因子を精製した。

当業界において既知の手段によって凍結乾燥を行った。凍結乾燥に関する情報は、Carpenter, J. F. and Chang, B. S., Lyophilization of Protein Pharmaceuticals, Biotechnology and Biopharmaceutical Manufacturing, Processing and Preservation, K. E. Avis and V. L. Wu, eds. (Buffalo Grove, Ill.: Interpharm Press, Inc.), pp. 199-264 (1996)に見出すことができる。本発明の文脈においては、「フリーズドライ」及び「凍結乾燥」という用語は、アニール段階及び乾燥段階を含め、試料を濃縮する段階の全てを包含するために同義的に用いられる。好ましい実施形態では、凍結乾燥は１〜３回のアニール段階を含む。好ましい実施形態では、凍結乾燥は１回のアニール段階と共に行う。「アニール」という用語は、凍結乾燥を経る医薬調製物の凍結乾燥プロセスにおいて、調整物をフリーズドライする前に、調整物の温度を低温から高温に上昇させてから、ある期間経過後に再び冷却する段階を示す。乾燥段階は減圧下で、典型的には５０〜３００マイクロバールの範囲で行う。

代表的なプロトコールを下記の表１に示す。

一段階式第ＩＸ因子凝固アッセイによって活性を割り出した。一段階式アッセイは当業界において既知である。本発明で用いたアッセイは、第ＩＸ因子活性の基準としてUniversal Coagulation Reference Plasma（ＵＣＲＰ）を、較正基準と未知の試料との希釈用に第ＩＸ因子欠損血漿を利用するものである。このアッセイは、血漿を活性化剤及び塩化カルシウムと混合して凝固カスケードを開始させ、フィブリン塊の形成をマイクロプレートリーダーでの吸光度によって測定する。このアッセイで測定される凝固時間は、ａＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）、すなわち、吸光度が所定の閾値を超えるのに要する時間である。第ＩＸ因子活性の正確な判定は、同時にアッセイされる、未知の試料の信号と第ＩＸ因子の標準試料（ＵＣＲＰ）とを比較することによって実現される。示されている全てのデータは、各温度、各タイムポイントにつき１本のバイアルから得たものであることに留意されたい。

実施例１
トレハロースを含む安定化製剤中の第ＩＸ因子では、２５℃及び４０℃での保管中における安定性が向上する。

下記の表２に示されている２つの候補製剤のそれぞれにおいて、第ＩＸ因子を凍結乾燥した。いずれの製剤も、１０ｍＭのヒスチジン、３％のマンニトール、６６ｍＭのＮａＣｌ、０．００７５％のポリソルベート８０（ｐＨ６．８）を含んでいた。一方の製剤（Ｒ２）は、トレハロース（１％）を更に含んでいた。これらの製剤を２６週間にわたって、−２０℃及び２〜８℃のリアルタイムの保管条件、並びに、２５℃／６０％ＲＨ及び４０℃／７５％ＲＨの条件で評価した。サイズ排除（ＳＥ）−ＨＰＬＣ、イオン交換（ＩＥ）−ＨＰＬＣ、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、タンパク濃度、濁度、ｐＨ、外観（ケーク及び再構成液）残留湿気、及び活性を含む一連の解析方法による調査全体を通じて、０．４ｍｇ／ｍＬの第ＩＸ因子を評価した。製剤の構成は、１０ｍＬのガラスバイアルにおいて５ｍＬであった。

各保管条件における測定値を、−２０℃で保管した調合産物（定義上、１００％を示すものとして定めた）に関して得られた測定値で除すことによって、各タイムポイントで得られたアッセイ結果を正規化した。このアプローチは、調査期間中に研究所でのアッセイのばらつきを最小限に抑えるために採用した。

表３に示されている結果によって示されているように、トレハロース（１％）を添加したところ、４０℃／７５％ＲＨでの保管中における凍結乾燥第ＩＸ因子の安定性が劇的に向上した。トレハロースを含まない製剤の比活性、すなわち再構成薬品中のタンパクの第ＩＸ因子活性ユニット／ｍｇは、４０℃／７５％ＲＨで１２週間保管中に約１５％に低下したが、トレハロースと共に調合した第ＩＸ因子の比活性は、わずかしか低下しなかった。

図１に示されているように、１２週間の期間にわたる比活性の減衰速度の解析によって、トレハロースが４０℃／７５％ＲＨにおいて減衰速度をほぼ２０倍（−０．００９６ｗｋ^-1対−０．１８７ｗｋ^-1）低下させることが示唆されている。

室温条件下（名目的には２５℃／６０％）で保管した凍結乾燥第ＩＸ因子の安定性に対するトレハロースの保護作用も注目に値する。トレハロースの見かけ上の作用は、比活性の減衰速度を０．０１９６ｗｋ^-1から０．００３９ｗｋ^-1まで約５倍低下させることである（表３）。トレハロースと共に調合された第ＩＸ因子の見かけ上の減衰速度によって、凍結乾燥産物が、室温で最大２６週間（６カ月間）保管したときに安定していることが示されている。比活性の測定値、計算値のいずれも、トレハロースを調合した第ＩＸ因子が２６週間目に約９０％の活性を保つことができることの裏付けを与えている（表３）。

実施例２
サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ―ＨＰＬＣ）によって示されているように、トレハロースを含む第ＩＸ因子製剤の方が、凍結乾燥産物の保管中における凝集度が低い。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって検出される高分子量の凝集体の形成は、第ＩＸ因子調製物の見かけ上の純度と比活性を低下させる。トレハロース（１％）をＲ１製剤の緩衝液に添加すると、凍結乾燥産物の保管中における第ＩＸ因子の凝集が実質的に回避されるようである。Ｒ１及びＲ２調合産物の１２週間保管後のＳＥ−ＨＰＬＣ溶出プロファイルが図２に示されている。

第ＩＸ因子のサイズ排除は、Agilent 1100 series HPLCにおいてTosoh G3000SWxlカラム（７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５μｍ、２５０Å）を用いて行った。この定組成法では、移動相として５０ｍＭのトリス、２００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を用いた。

実施例３
カルシウム存在下におけるサイズ排除ＨＰＬＣによって、トレハロースと共に保管した第ＩＸ因子が、カルシウム誘発性のコンフォメーション変化を起こす力を維持することが示されている。

カルシウムイオンは、第ＩＸ因子タンパクに結合して、このタンパクのコンフォメーション変化（凝固活性に必須である）を誘発することによって、第ＩＸ因子の機能において重要な役割を果たす。溶液中のタンパクの流体力学的体積を減少させるカルシウム誘発性のコンフォメーション変化は、ＳＥ−ＨＰＬＣのような方法によって、見かけ上の分子量の低下として検出することができる。

第ＩＸ因子活性を直接測定したときに観察されたように（表３）、トレハロース（１％）を製剤緩衝液に添加すると、第ＩＸ因子の機能、このケースでは、カルシウムと結合してカルシウム誘発性のコンフォメーション変化を起こす力を保持するという点で、保管中における凍結乾燥第ＩＸ因子の安定性が劇的に向上する。トレハロース存在下（Ｒ２）及びトレハロース非存在下（Ｒ１）の第ＩＸ因子組成物の１２週間保管後の、カルシウム存在下におけるＳＥ−ＨＰＬＣ溶出プロファイルが図３に示されている。調合薬品Ｒ１（トレハロースを含まない）中における機能的な第ＩＸ因子のパーセンテージは、４０℃／７５％ＲＨでの１２週間の保管中に約３１％まで低下したが、調合薬品Ｒ２（トレハロースを含む）中における機能的な第ＩＸ因子のパーセンテージは、低温（−２０℃、２〜８℃）で保管した第ＩＸ因子よりもわずかに低いだけであった。

図４に示されているように、１２週間の期間にわたる機能（カルシウム誘発性のコンフォメーション変化）の減衰速度の解析によって、トレハロースが４０℃／７５％ＲＨで減衰速度を約１９倍（−０．００４６ｗｋ^-1対−０．０８５３ｗｋ^-1）低下させることが示唆されており、これは、効力の減衰速度が約２０倍低下した（図１）のとよく似ている。

実施例４
トレハロースと共に調合した第ＩＸ因子は、高分子量の混入物質によるコンタミが少ない。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、様々な条件下で１２週間保管後の凍結乾燥第ＩＸ因子の純度を直接視覚的に比較した。図５のパネルＡに示されているように、全ての試料において、微量の高分子量混入物質が存在するようであるが、その量は、高い温度で保管されていた第ＩＸ因子ほど漸進的に大きくなっている。これは、非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーン８及び１０で最もよく見られる（レーン８には、２５℃／６０％ＲＨで保管した調合第ＩＸ因子Ｒ１（トレハロースを含まない）、レーン１０には、４０℃／７５％ＲＨで保管した調合第ＩＸ因子Ｒ１から取った試料が示されている）。調合第ＩＸ因子Ｒ２（トレハロースを含む）から取った対応する試料（レーン９及び１１に示されている）は、２〜８℃又は−２０℃で保管した調合第ＩＸ因子Ｒ１又はＲ２のいずれかの試料（レーン４〜７）と比べて、高分子量混入物質量の増加の兆候をほとんど示していない。

本調査で使用した第ＩＸ因子の調製物中では、低級化形状の第ＩＸ因子が検出可能であったが、その量は、いずれの実験条件下でも保管時間と共には増えなかったようであった。第ＩＸ−ガンマ因子（第ＩＸγ因子）は、第ＩＸ因子の面取りされた低分子量形状であり、Ａｒｇ３１８〜Ｓｅｒ３１９のペプチド結合又はその近辺で元のタンパクがタンパク分解によって切断されて、この分子のカルボキシ末端領域から１０ｋＤａのペプチドが解放されるときに形成される。第ＩＸ因子製剤中に存在する第ＩＸγ因子は、非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（パネルＡ）で、見かけ上の分子量約４５ｋＤａで移動する小さいバンドとして見ることができる。図５のパネルＡに示されているゲルの目視検査によって、本調査の期間にわたって保管中において、第ＩＸ因子の第ＩＸγ因子への有意なタンパク分解が起こらなかったことが示唆されている。

実施例５
イオン交換クロマトグラフィーによって、トレハロースが第ＩＸ因子組成物を安定化させたことが示されている。

イオン交換クロマトグラフィーは、電荷及び／又は電荷分布の異なるタンパクのアイソフォームを部分的に分離する潜在力を有する。GE Healthcare Tricorn MonoQ 5/50GLカラム（５×５０ｍｍ、１０μｍ）を用いて第ＩＸ因子の陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。この二元勾配法では、移動相Ａとして５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）を、移動相Ｂとして５０ｍＭのトリス、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を用いた。

本調査で行ったような陰イオン交換クロマトグラフィーによって、調合第ＩＸ因子Ｒ１（トレハロースなし）は、４０℃／７５％ＲＨでは保管時間にわたって広くなっている単一の左右対称なピークとして溶出されたが、調合第ＩＸ因子Ｒ２（トレハロースを含む）の溶出は、この点については、実質的に不変のようであった。これらの結果は図６に示されている。

結論
２〜８℃において少なくとも２年間、高純度の凍結乾燥第ＩＸ因子を安定化させることで知られる製剤にトレハロース（１％）を添加することによって、タンパクの構造と機能を維持するという点で更に優れた製剤が得られる。トレハロースを含まない第ＩＸ因子組成物（Ｒ１）は、室温（２５℃／６０％ＲＨ）において約１カ月間安定したようであった。トレハロース存在下（Ｒ２）では、第ＩＸ因子薬品は、約６カ月間安定していた（≧９０％に維持された活性に基づく）。

ヒスチジン、マンニトール、塩化ナトリウム、及びポリソルベート８０を含む凍結乾燥製剤中に、トレハロースを含む第ＩＸ因子とトレハロースを含まない第ＩＸ因子を調合すると、おそらく乾燥された二糖のアモルファス特性によって生じる凍結保護効果が原因で、トレハロースを含む製剤の方が、２５℃及び４０℃で保管中に優れた安定性プロファイルを示す。

トレハロースを含む第ＩＸ因子製剤は、冷蔵温度で保管した第ＩＸ因子の安定性データに匹敵する安定性データを示した。このデータは、トレハロースを含む製剤中の第ＩＸ因子薬品を室温で数週間、潜在的には更に長い期間にわたって、温度変化に暴露できる可能性を裏付けている。

トレハロースを含まない製剤中の第ＩＸ因子を４０℃／７５％ＲＨで保管したところ、以下の現象を招いた。
−高分子量化学種の増大（ＳＥ−ＨＰＬＣによって同定）
−１２週間にわたって活性が低下する傾向（一段階式凝固アッセイによって測定）
−ＩＥ−ＨＰＬＣクロマトグラフプロファイルの有意な拡大

また、トレハロースを含まない製剤中の第ＩＸ因子を２５℃／６０％ＲＨで保管したところ、程度は小さかったものの、上記のように低級化した。

ケーク形態、濃度、再構成産物の濁度、又はＲＰ−ＨＰＬＣに関しては、製剤間で有意な差は観察されなかった。

冷蔵及び冷凍温度における第ＩＸ因子の２６週間での安定性は、双方の製剤において同様であった。

残渣水分レベルと再構成時間はそれぞれ、トレハロースを含む製剤の方が、トレハロースを含まない製剤よりもわずかに高かった。

当業者であれば、本発明の趣旨から逸脱することなく、数多くの様々な修正を行えることを理解するであろう。したがって、本発明の形態は説明のためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定する意図はないことを明確に理解すべきである。

Claims (19)

1. 第ＩＸ因子とトレハロースとを含む凍結乾燥組成物であって、該トレハロースが、凍結乾燥及び６カ月間２５℃での保管中に第ＩＸ因子のカルシウム結合特性の９０％超を保持するのに十分な量で存在する組成物。
2. トレハロースが０．５〜３体積％の量で存在する、請求項１に記載の組成物。
3. トレハロースが１〜２体積％の量で存在する、請求項２に記載の組成物。
4. 緩衝剤としてヒスチジンを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. マンニトールを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
6. 塩化ナトリウムを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
7. ポリソルベート８０を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
8. 濃度５〜２０ｍＭのヒスチジンと、濃度２〜５体積％のマンニトールと、濃度５０〜８０ｍＭの塩化ナトリウムと、濃度０．００１〜０．００５体積％のポリソルベート８０とを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
9. 第ＩＸ因子を含む溶液をトレハロースと混合して、凍結保護溶液を得る工程と、
   該凍結保護溶液をフリーズドライして、第ＩＸ因子の安定的な乾燥組成物を得る工程と、
   を含む、第ＩＸ因子の安定的な乾燥組成物の調製法であって、
   第ＩＸ因子の該乾燥組成物が、６カ月間２５℃で保管したときに９０％超のカルシウム結合活性を保っている方法。
10. トレハロースが０．５〜３体積％の量で存在する、請求項９に記載の方法。
11. トレハロースが１〜２体積％の量で存在する、請求項１０に記載の方法。
12. 前記溶液がヒスチジンを更に含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記溶液がマンニトールを更に含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記溶液が塩化ナトリウムを更に含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記溶液がポリソルベート８０を更に含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記溶液が、濃度５〜２０ｍＭのヒスチジンと、濃度２〜５体積％のマンニトールと、濃度５０〜８０ｍＭの塩化ナトリウムと、濃度０．００１〜０．００５体積％のポリソルベート８０とを更に含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記フリーズドライ工程が１回のアニール段階を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
18. 第ＩＸ因子とトレハロースとを含む医薬製剤を凍結乾燥する方法であって、
    （ａ）第ＩＸ因子とトレハロースとを含む医薬製剤を−４０℃以下の温度で凍結するステップと、
    （ｂ）該医薬製剤を約−２０℃〜−３５℃でアニールするステップと、
    （ｃ）該医薬製剤の温度を−４０℃以下まで低下させるステップと、
    （ｄ）該医薬製剤を第１の乾燥段階において５℃〜２０℃にて減圧下で乾燥するステップと、
    （ｅ）該医薬製剤を第２の乾燥段階において４５℃〜５５℃にて減圧下で乾燥するステップと、
    を含む方法。
19. 前記医薬製剤が、濃度５〜２０ｍＭのヒスチジンと、濃度２〜５体積％のマンニトールと、濃度５０〜８０ｍＭの塩化ナトリウムと、濃度０．００１〜０．００５体積％のポリソルベート８０とを更に含む、請求項１８に記載の方法。

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