CN101903030A - 含海藻糖的稳定化因子ix制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了制备因子IX的冻干制备物的方法，这样的制备物保留了超过90％的因子IX的钙结合性质。相对于没有用海藻糖配制的因子IX，用海藻糖配制的因子IX在25℃/60％相对湿度(RH)和40℃/75％RH下储存12周后，显示出优异的稳定性分布。这些数据表明，在制剂中包含海藻糖能够允许因子IX冻干产品的温度偏移或甚至长时间的室温储存。所测试的制剂含有10mM组氨酸pH 6.8、3％甘露醇、66mM氯化钠、0.0075％聚山梨醇酯80、含有和不含有1％海藻糖。在40℃/75％RH或25℃/60％RH下储存超过12周后，含海藻糖的制剂与在2～8℃下储存的产品相当，而发现不含海藻糖的制剂产生了显著的聚集并且丧失活性。这两种制剂证实了在-20℃和2～8℃下实时储存超过26周的类似稳定性。

Description

含海藻糖的稳定化因子IX制剂
相关申请
本发明要求享有于2007年12月21日提交的美国临时申请No.61/016,230的优先权，将其结合于本文中作为参考。
联合研究协议的各方
这项工作是作为Inspiration Biopharmaceuticals，Inc.和ICOSCorp.之间的研究协议的结果而产生的。
技术领域
本发明的实施方式涉及在冻干和储存期间蛋白质结构和活性的稳定化，具体而言，涉及凝血因子如因子IX的稳定化。
背景技术
因子IX是参与凝血途径的单链糖蛋白。因子IX是一种含有氨基末端信号肽和前原(prepro)前导序列(二者在分泌进入循环系统之前断裂)以及负责Ca2+结合的Gla结构域的结构复杂分子(或结构性配分子，structurally complex molecule)。钙结合通过结合至凝血活性所需的蛋白以及诱导其构象变化而在因子IX功能中发挥重要作用。钙结合导致之前埋藏的疏水结合位点暴露，这些结合位点有利于结合至有效凝血的磷脂。为了产生活性蛋白，维持因子IX的钙结合性质是必要的。一旦活化肽被切割，则单链因子IX变成活化的酶因子IXa，一种经由链间二硫键连接的双链糖蛋白。另外，该分子含有多个N和O-连接的糖基化位点。因子IX的缺乏导致B型血友病，对该病目前可利用多种疗法，包括
Figure BPA00001161712200021
一种因子IX的重组形式，和其来源于人体血浆。的制剂由组氨酸、甘露醇、氯化钠和聚山梨醇酯80组成。这些主要是已知在冷冻期间表现出共晶转变(eutectictransition)(结晶行为)的赋形剂。然而，制剂不含防冻剂或稳定剂，仅有缓冲剂、疏松剂(或蓬松剂，bulking agent)、等张剂和表面活性剂。因此，在冷冻、冻干和随后的储存期间，该蛋白相对地未进行物理保护且由于暴露于冰、水和空气而产生变性效应。这里解决的技术问题是一种改良的因子IX制剂，其中改善了冷冻、冻干和储存期间的稳定性。本发明的发明人已经发现，在冷冻、冻干和储存期间，在因子IX组合物中包含海藻糖稳定了因子IX的钙结合能力并维持了这种纯化蛋白的生物活性。
发明内容
本发明的实施方式涉及包含因子IX和海藻糖的冻干组合物。优选地，海藻糖以在冻干和25℃下储存6个月期间足以保留超过90％的因子IX的钙结合性质的量存在。
优选地，海藻糖按体积计以0.5～3％的量存在。且更优选地，海藻糖按体积计以1～2％的量存在。
在一些优选实施方式中，该组合物包含作为缓冲剂的组氨酸。在一些优选实施方式中，该组合物包含甘露醇。在一些优选实施方式中，该组合物包含氯化钠。在一些优选实施方式中，该组合物包含聚山梨醇酯80。
在一个最优选的实施方式中，组合物包含因子IX和海藻糖，并另外地包含浓度为5～20mM的组氨酸、按体积计浓度为2～5％的甘露醇、浓度为50～80mM的氯化钠、和按体积计浓度为0.001～0.005％的聚山梨醇酯80。
本发明的实施方式涉及制备因子IX的稳定干燥组合物的方法，该方法通过混合含有因子IX和海藻糖的溶液以获得一种防冻溶液并冷冻干燥该防冻溶液而获得因子IX的稳定干燥组合物。优选地，因子IX的干燥组合物在25℃下储存6个月后保留超过90％的钙结合活性。
优选地，海藻糖按体积计以0.5～3％的量存在。而更优选地，海藻糖按体积计以1～2％的量存在。
在一些优选实施方式中，所述溶液包含作为缓冲剂的组氨酸。在一些优选实施方式中，所述溶液包含甘露醇。在一些优选实施方式中，所述溶液包含氯化钠。在一些优选实施方式中，所述溶液包含聚山梨醇酯80。
在一个最优选的实施方式中，所述溶液包含因子IX和海藻糖并另外地包含浓度为5～20mM的组氨酸、按体积计浓度为2～5％的甘露醇、浓度为50～80mM的氯化钠、和按体积计浓度为0.001～0.005％的聚山梨醇酯80。
优选地，冷冻干燥操作包括一个退火步骤。
本发明的实施方式涉及通过包括以下步骤中的一个或多个的方法冻干包含因子IX和海藻糖的药物制剂的方法：
(a)在-40℃或更低的温度下冷冻包含因子IX和海藻糖的药物制剂；
(b)在约-20℃和-35℃之间退火该药物制剂；
(c)将该药物制剂的温度降低至-40℃或更低；
(d)在5℃～20℃于减压下在第一干燥步骤中干燥该药物制剂；和
(e)在45℃～55℃于减压下在第二干燥步骤中干燥该药物制剂。
优选地，该药物制剂还包含浓度为5～20mM的组氨酸、按体积计浓度为2～5％的甘露醇、浓度为50～80mM的氯化钠、和按体积计浓度为0.001～0.005％的聚山梨醇酯80。
根据以下对优选实施方式的详细描述，本发明的其他方面、特征和优点将会显而易见。
附图说明
现在将参照优选实施方式的附图，描述本发明的这些和其他特征，这些优选实施方式用于举例说明本发明而非限制本发明。
图1示出了因子IX在40℃/75％RH下的稳定性。“■”表示在10mM组氨酸、3％甘露醇、66mM NaCl、0.0075％聚山梨醇酯80(pH6.8)中的0.4mg/mL因子IX蛋白(R1)。“·”表示在10mM组氨酸、3％甘露醇、66mM NaCl、0.0075％聚山梨醇酯80(pH 6.8)中并具有1％海藻糖的0.4mg/mL因子IX蛋白(R2)。
图2示出了在储存12周之后因子IX组合物的SE-HPLC洗脱曲线图。图2A示出了在10mM组氨酸、3％甘露醇、66mM NaCl和0.0075％聚山梨醇酯80(pH 6.8)中的0.4mg/mL因子IX蛋白(R1)。图2B示出了在10mM组氨酸、3％甘露醇、66mM NaCl、0.0075％聚山梨醇酯80(pH 6.8)中并具有1％海藻糖的0.4mg/mL因子IX蛋白(R2)。
图3示出了在储存12周之后因子IX的SE-HPLC(钙)洗脱曲线图。图3A示出了在10mM组氨酸、3％甘露醇、66mM NaCl和0.0075％聚山梨醇酯80(pH 6.8)中的0.4mg/mL因子IX蛋白(R1)。图3B示出了在10mM组氨酸、3％甘露醇、66mM NaCl、0.0075％聚山梨醇酯80(pH 6.8)中并具有1％海藻糖的0.4mg/mL因子IX蛋白(R2)。
图4示出了在40℃/75％RH下因子IX钙结合稳定性。“■”表示在10mM组氨酸、3％甘露醇、66mM NaCl、0.0075％聚山梨醇酯80(pH 6.8)中的0.4mg/mL因子IX蛋白(R1)。“·”表示在10mM组氨酸、3％甘露醇、66mM NaCl、0.0075％聚山梨醇酯80(pH 6.8)中并具有1％海藻糖的0.4mg/mL因子IX蛋白(R2)。
图5示出了在非还原(A)和还原(B)条件下储存12周之后，因子IX制剂的SDS-PAGE分析。图A：泳道1，空白；泳道2，标记物；泳道3，因子IX参考标准(
Figure BPA00001161712200051
)；泳道4，0.4mg/ml，R1，冻干(lyo)-20℃；泳道5，0.4mg/ml，R2，冻干-20℃；泳道6，0.4mg/ml，Rl，冻干2～8℃；泳道7，0.4mg/ml，R2，冻干2～8℃；泳道8，0.4mg/ml，Rl，冻干25℃；泳道9，0.4mg/mL，R2，冻干25℃；泳道10，0.4mg/mL，Rl，冻干40℃；泳道11，0.4mg/ml，R2，冻干40℃；泳道12，标记物。图B：泳道1和2，标记物；泳道3，因子IX参考标准()；泳道4，0.4mg/ml，R1，冻干-20℃；泳道5，0.4mg/ml，R2，冻干-20℃；泳道6，0.4mg/mL，Rl，冻干2～8℃；泳道7，0.4mg/mL，R2，冻干2～8℃；泳道8，0.4mg/mL，Rl，冻干25℃；泳道9，0.4mg/mL，R2，冻干25℃；泳道10，0.4mg/ml，Rl，冻干40℃；泳道11，0.4mg/ml，R2，冻干40℃；泳道12，标记物。
图6示出了因子IX组合物在储存12周之后的阴离子交换HPLC洗脱曲线图。图6A示出了在10mM组氨酸、3％甘露醇、66mM NaCl和0.0075％聚山梨醇酯80(pH 6.8)中的0.4mg/mL因子IX蛋白(R1)。图6B示出了在10mM组氨酸、3％甘露醇、66mMNaCI、0.0075％聚山梨醇酯80(pH 6.8)中并具有1％海藻糖的0.4mg/mL因子IX蛋白(R2)。
具体实施方式
尽管所描述的实施方式代表了本发明的优选实施方式，但是应该理解，对于本领域技术人员而言可以进行变形而不会偏离本发明的精神。因此本发明的范围将仅仅由所附权利要求进行确定。
本发明的实施方式涉及在海藻糖存在下冻干因子IX的方法以及含海藻糖的因子IX制剂。在添加和没有添加海藻糖的情况下对因子IX制剂进行评价，其中海藻糖是一种在冻干工艺期间不会结晶的防冻剂。随着冷冻至较低温度，海藻糖保持为一种经历玻璃转化的浓缩物。因此，在海藻糖存在下，蛋白得以保存，通过冷冻和冻干而保持混合无定形状态并被稳定化。海藻糖改善了储存的因子IX蛋白的稳定性并防止了聚集。还令人惊奇地发现，在制剂中包含海藻糖显著地改善对于因子IX活性所需的钙诱导构象变化的保持。钙结合能力的明显损失与效能损失相关。这种钙结合能力和效能的损失在包含海藻糖的制剂中被大大地延迟。
在优选的实施方式中，在冷冻、冻干和储存期间通过在因子IX组合物中包含海藻糖，因子IX的至少50％，更优选至少70％，还更优选至少80％，还更优选至少90％的钙结合能力得以保持。优选地，海藻糖以在冷冻、冻干和在25℃下储存至少3个月，更优选在25℃下储存至少6个月并且还更优选在25℃下储存至少1年期间，足以保持超过90％的因子IX钙结合性质的量存在。
制剂组分
在优选实施方式中，本发明的因子IX组合物包含缓冲剂、疏松剂、等张剂、表面活性剂和防冻剂/稳定剂。在一些实施方式中，也可以包含其他赋形剂。这些组合物最大化了因子IX在冻干制备物(或制剂，preparations)中以及其液体状态的稳定性。
在优选的实施方式中，组合物中包含缓冲剂。在冻干和储存期间，pH应该优选维持在6～8的范围，并且更优选pH为约6.8。缓冲剂可以是具有作为缓冲剂的能力的任何生理上可接受的化学物质(chemical entity)或化学物质的组合，包括组氨酸、三-(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS)、1，3-二-[三-(羟基-甲基)甲氨基]-丙烷(BIS-Tris丙烷)、哌嗪-N，N’-二-(2-乙磺酸)(PIPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、N-2-羟乙基-哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)和N-2-乙酰胺-2-氨基乙磺酸(ACES)。典型地，所包含的缓冲剂浓度为5～20mM。在一个最优选的实施方式中，缓冲剂是浓度为约10mM的组氨酸。
疏松剂是在经过冻干之后对药物制备物的“饼(或块，cake)”或残存固体物质提供结构并保护它以防止坍塌的那些化学物质。在本发明制剂中所使用的疏松剂选自包括但不限于甘露醇、甘氨酸和丙胺酸的组。甘露醇、甘氨酸或丙氨酸以1～10％，优选2～5％，且更优选约3％的量存在。
在本发明制剂中所包含的氯化钠的量为30～100mM，优选50～80mM，并且最优选约66mM。
在优选的实施方式中，因子IX组合物包含表面活性剂，优选含量为0.1％或更低，并且更优选含量为0.001～0.005％。表面活性剂例如可以选自，包括但不限于聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、复合多元醇加聚物(或聚氧丙烯和聚氧乙烯的加聚物，pluronicpolyols)和BRIJ35(聚氧乙烯23月桂基醚)的组。可以获得几种级别的复合多元醇加聚物(以商标名PLURONIC进行销售，由BASFWyandotte Corporation生产)。这些不同分子量(从1,000至超过16,000)和物理化学性质的多元醇都已经被用作表面活性剂。分子量为5,000的PLURONIC F-38和分子量为9,000的PLURONICF-68，都包含(按重量计)80％的亲水聚氧乙烯基团和20％的疏水聚氧丙烯基团。在优选的实施方式中，所包含的聚山梨醇酯80的浓度为约0.0075％。
优选地，在本发明的制剂中使用稳定剂。稳定剂选自，包括但不限于蔗糖、海藻糖、棉子糖和精氨酸的组。这些试剂在本发明的制剂中存在的量为0.5％～3％，优选1％～2％，更优选约1％。在高度优选的实施方式中，在组合物中所包含的海藻糖浓度为1％。
在优选的实施方式中，在本发明组合物中所使用的因子IX是高度纯化的人血浆来源的因子IX或更优选地可以是重组生产的因子IX。重组因子IX能够通过用带有编码因子IX分子的DNA序列的载体转染的中华仓鼠卵巢(CHO)细胞进行生产。用于产生这样的转染CHO细胞的方法，尤其描述于Toole，Jr.的美国专利No.4,757,006中，尽管可替代的方法在本领域内也是已知的(参见，例如，也是Toole，，Jr.的美国专利No.4,868,112、及PCT国际申请WO-A-91/09122)。
尽管本申请中描述的因子IX组合物能够在所指定浓度下进行冻干和重构，但是本领域内的技术人员应该理解到，这些制备物(或制剂，preparations)也能够以更加稀释的形式进行重构。例如，被冻干和/或一般在2mL溶液中重构的根据本发明的制备物也能够在更大稀释体积，如5mL中进行重构。这在因子IX制备物将向患者立即注射时是尤其适合的，因为在这种情况下因子IX更不易于失活，这种失活在因子IX更稀的溶液中更快速地发生。
实施例
重组因子IX在用编码人体因子IX的cDNA转染的中华仓鼠卵巢细胞中进行制备。因子IX采用包括阴离子和阳离子交换色谱的工艺从条件培养基(conditioned media)中进行纯化，以从包含宿主细胞蛋白和DNA的培养基组分中分离所期望的产物。
通过本领域内已知的方法实施冻干。有关冻干的信息可以在Carpenter，J.F.and Chang，B.S.，Lyophilization of ProteinPharmaceuticals，Biotechnology and BiopharmaceuticalManufacturing，Processing and Preservation，K.E.Avis and V.L.Wu，eds.(Buffalo Grove，111.：Interpharm Press，Inc.)，pp.199-264(1996)中找到。在本发明上下文中，术语“冷冻干燥”和“冻干”可以互换使用，以包括用于样品浓缩的所有步骤，包括退火和干燥步骤。在优选的实施方式中，冻干包括1～3个退火步骤。在优选的实施方式中，冻干利用一个退火步骤进行。术语“退火”是指在经受冻干的药物制备物的冻干工艺中，在制备物冷冻干燥之前的步骤，其中制备物的温度从较低温度向较高温度升高，然后在一定时间后再次冷却。干燥步骤在减压下进行，典型地是在50～300微巴下进行。
示例性方案在下表1中举例说明。
表1
 步骤#   步骤   货架温度(℃)   N2渗液   时间(分钟)   压力(微巴)
 1   载入   室温   环境
 2   冷冻   -50   100   环境
 3   冷冻   -50   120   环境
 4   冷冻   -23   60   环境
 5   冷冻   -23   120   环境
  6   冷冻   -50   60   环境
  7   冷冻   -50   120   环境
  8   初次干燥   -50   X   60   150
  9   初次干燥   -43   X   100   150
  10   初次干燥   10   X   120   150
  11   初次干燥   10   X   1440   150
  13   二次干燥   50   X   435   150
  14   二次干燥   50   X   240   150
  15   预充气   25   X   150
  16   塞住   25   X   0.15   150
  17   储存   4   X   ＜72h   ＜106
  18   充气   4   X   环境
采用因子IX一步凝血测定来确定活性。一步测定在本领域内是已知的。本文中所用的测定利用作为因子IX活性标准的通用凝血定标血浆(UCRP)和用于稀释校准标准和未知样品的因子IX-缺乏血浆。该测定涉及将血浆与活化剂和氯化钙混合以启动凝血级联，其中通过在微板阅读器上的吸光度而检测纤维蛋白凝块的形成。在该测定中检测的凝血时间是aPTT(激活部分促凝血酶原激酶时间)，吸光度越过预定阈值所需的时间。因子IX活性的精确确定通过比较未知物与同时测定的因子IX参照标准(UCRP)的信号而实现。注意，提供的所有数据都来自每个温度每个时间点的1个小瓶(vial)。
实施例1
在含有海藻糖的稳定化制剂中的因子IX在25℃和40℃下储存期 间表现出增高的稳定性。
因子IX在如下表2中所示的两个候选制剂的每一个中进行冻干。这两个制剂都包含10mM组氨酸、3％甘露醇、66mM NaCl、0.0075％聚山梨醇酯80，pH 6.8。制剂之一(R2)另外还含有海藻糖(1％)。制剂在26周内在-20℃和2～8℃的实时储存条件以及25℃/60％RH和40℃/75％RH的条件下进行评价。在0.4mg/mL的因子IX在整个研究中通过包括体积排阻(SE)-HPLC、离子交换(IE)-HPLC、反相(RP)-HPLC、SDS-PAGE的系列分析方法，评价蛋白浓度、浊度、pH、可视外观(饼和重构液体)、残留水分和活性。制剂配制(formulation configuration)是在10mL玻璃小瓶中填充5mL。
在每个时间点获得的测定结果通过将每一储存条件的检测值除以配制产品在-20℃下储存获得的检测值而进行归一化，通过定义，这取作表示100％。采用这种方法是为了在研究的时间期内尽量最小化研究实验室测定的变化性。
表2
稳定性评价时间点
Figure BPA00001161712200111
表3
Figure BPA00001161712200112
如表3所示结果表明的，海藻糖(1％)的加入显著改善了冻干因子IX在40℃/75RH储存期间的稳定性。海藻糖制剂的特定活性，即重构药物产品中的因子IX活性单位/mg蛋白，在40℃/75％RH下储存12周期间下降至～15％，而用海藻糖配制的因子IX的特定活性仅仅轻微下降。
如图1中所示，在12周时间期内的特定活性衰减速率分析表明，海藻糖将在40℃/75％RH下的衰减速率降低几乎20倍(-0.0096wk-1对-0.187wk-1)。
海藻糖对在室温条件(一般25℃/60％)下储存的冻干因子IX的稳定性的保护效应也是显著的。海藻糖的表观效应是将特定活性衰减速率降低～5倍，从0.0196wk-1至0.0039wk-1(表3)。用海藻糖配制的因子IX的衰减表观速率表明，该冻干产品在室温下储存长达26周(6个月)也将是稳定的。检测和计算的特定活性值提供了海藻糖配制的因子IX可以在26周保持～90％的活性的支持(表3)。
实施例2
如体积排阻HPLC(SE-HPLC)所表明的，含有海藻糖的因子IX 制剂在冻干产品储存期间表现出更少的聚集。
高分子量聚集体的形成，如通过体积排阻色谱HPLC(SE-HPLC)所检测的，降低了因子IX制备物的表观纯度和特定活性。向R1制剂缓冲液中加入海藻糖(1％)看起来显著防止在冻干产品储存期间因子IX的聚集。在12周储存之后，R1和R2配制产品的SE-HPLC洗脱曲线如图2所示。
因子IX的体积排阻利用Tosoh G3000SWxl柱(7.8mm×30cm，5μm，
Figure BPA00001161712200131
)在Agilent 1100系列HPLC上实施。等度法(isocraticmethod)采用50mM Tris、200mM NaCl pH 7.5作为流动相。
实施例3
在钙存在下，体积排阻HPLC表明用海藻糖储存的因子IX保持进 行钙诱导构象变化的能力。
通过结合至对于凝血活性所需的蛋白并诱导其构象变化，钙离子在因子IX功能中起重要作用。钙诱导的构象变化，其减小溶液中蛋白的流体动力学体积，能够通过诸如SE-HPLC的方法作为表观分子量的减小而进行检测。
如在因子IX活性直接检测时所观察到的(表3)，向制剂缓冲液中加入海藻糖(1％)，在保留因子IX的功能方面(在这种情况下，就是结合钙并进行钙诱导构象变化的能力)，显著地改进了储存期间冻干因子IX的稳定性。在钙存在下，对于存在(R2)和不存在(R1)海藻糖的因子IX组合物，在12周储存之后，SE-HPLC洗脱曲线如图3所示。虽然在R1配制的药物产品(无海藻糖)中的功能因子IX的百分数在40℃/75％RH下储存12周期间下降至～31％，但是在R2配制的药物产品(+海藻糖)中的功能因子IX百分数仅稍微低于在低温(-20℃，2～8℃)下储存的因子IX。
如图4所示，在12周的时间内的功能(钙诱导的构象变化)衰减速率的分析表明，海藻糖将在40℃/75％RH下的衰减速率降低～19倍(-0.0046wk-1对-0.0853wk-1)，这非常类似于效能的衰减速率降低的～20倍(图1)。
实施例4
用海藻糖配制的因子IX表现出被高分子量污染物更少的污染
实施SDS-PAGE以获得在各种条件下在12周储存之后，冻干因子IX的纯度的直观比较。如图5中图A所示，在所有样品中看起来存在痕量的高分子量污染物，但是这个量对于已在高温下储存的因子IX是逐渐升高的。这在非还原SDS-PAGE凝胶的泳道8和10中最易于观察到，其中示出了分别保持在25℃/60％RH和40℃/75％RH下的来自R1配制的因子IX的样品(无海藻糖)。在泳道9和11示出的来自R2(+海藻糖)配制的因子IX相对应的样品，当相比于储存在2～8℃或-20℃下的R1或R2配制的因子IX(泳道4～7)时，表现出几乎没有高分子量污染物的量增多的迹象。
尽管在用于本研究中的因子IX制备物中可检测到因子IX的降解形式，但是含量看起来在任何试验条件下并未随着储存时间增加。因子IX-γ(因子IXγ)是一种因子IX的截短的低分子量形式，其是在完整蛋白在Arg318-Ser319肽键或在Arg318-Ser319肽键附近被蛋白水解切割以从该分子的羧基端区释放10kDa肽时形成的。在因子IX制剂中存在的因子IXγ，能够在非还原的SDS-PAGE凝胶(图A)中作为表观分子量为约45kDa迁移的次要带观察到。在图5的图A中所示的凝胶的视觉检查表明，在本研究的时间期内的储存期间并未发生因子IX显著蛋白水解成因子IXγ。
实施例5
离子交换色谱表明，海藻糖使因子IX组合物稳定
离子交换色谱具有部分地分离电荷和/或电荷分布不同的蛋白亚型的潜力。因子IX的阴离子交换色谱采用GE Healthcare TricornMonoQ 5/50GL柱(5×50mm，10μm)实施。二元梯度方法利用50mM Tris pH 7.5作为流动相A，以及50mM Tris、1 M NaCI pH 7.5作为流动相B。
如在本研究中实施的，阴离子交换色谱产生作为单个对称峰(其在40℃/75％RH下的储存时间内被加宽)的R1配制因子IX(无海藻糖)的洗脱液，而R2配制的因子IX(+海藻糖)的洗脱液看起来在这个方面基本上无变化。这些结果如图6所示。
结论
通过向制剂中加入海藻糖(1％)，已知可使高度纯化的冻干因子IX在2～8℃下稳定至少2年，在保持蛋白的结构和功能方面，获得一种甚至更好的制剂。无海藻糖的因子IX组合物(R1)看起来在室温(25℃/60％RH)下能够稳定约1个月。在海藻糖存在下(R2)，因子IX药物产品能够稳定约6个月(基于≥90％的保留活性)。
当因子IX在含有组氨酸、甘露醇、氯化钠和聚山梨醇酯80的冻干制剂中用和不用海藻糖配制时，具有海藻糖的制剂在25℃和40℃储存期间呈现优异的稳定性分布，这可能是由于通过所干燥的二糖的无定形性能产生的防冻益处。
具有海藻糖的因子IX制剂呈现出的稳定性数据相当于因子IX在冷藏温度下储存的稳定性数据。这些数据支持在含有海藻糖的制剂中的因子IX药物产品在室温下几周和可能甚至更长时间的温度偏移(或温度偏差，temperature excursion)的可能性。
在无海藻糖的制剂中因子IX在40℃/75％RH的储存导致：
-如通过SE-HPLC鉴定的，高分子量物种(物质)增加。
-如通过一步凝血测定确定的，在12周内活性呈降低趋势。
-IE-HPLC色谱曲线显著加宽。
在无海藻糖制剂中的因子IX在25℃/60％RH下的储存还导致如上所述的降解，尽管到较小的程度。
对于重构产品的饼形态、浓度、浊度，或RP-HPLC，制剂之间没有观察到显著差异。
在冷藏和冷冻温度下因子IX的26周稳定性对于两种制剂是相当的。
相比于没有海藻糖的制剂，残余水分水平和重构倍数(reconstitution times)对于含有海藻糖的制剂来说每一个都稍微偏高。
对于本领域技术人员而言，应该理解到，能够作出许多和各种变形而不会偏离本发明的精神。因此，应该清楚地理解到，本发明的各种形式仅仅是举例说明性的而不用于限制本发明的范围。

Claims (19)

1.一种冻干组合物，包含因子IX和海藻糖，其中，所述海藻糖以在冻干和在25℃下储存6个月期间足以保留超过90％的因子IX的钙结合性质的量存在。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，海藻糖以按体积计为0.5～3％的量存在。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，海藻糖以按体积计为1～2％的量存在。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，进一步包含作为缓冲剂的组氨酸。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，进一步包含甘露醇。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，进一步包含氯化钠。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，进一步包含聚山梨醇酯80。
8.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，进一步包含浓度为5～20mM的组氨酸、按体积计浓度为2～5％的甘露醇、浓度为50～80mM的氯化钠、和按体积计浓度为0.001～0.005％的聚山梨醇酯80。
9.一种用于制备因子IX的稳定干燥组合物的方法，包括：
混合包含因子IX的溶液与海藻糖以获得防冻溶液；和
冷冻干燥所述防冻溶液以获得因子IX的稳定干燥组合物，
其中，当在25℃下储存6个月时，所述因子IX的干燥组合物保留超过90％的钙结合活性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，海藻糖以按体积计为0.5～3％的量存在。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，海藻糖以按体积计为1～2％的量存在。
12.根据权利要求9～11中任一项所述的方法，其中，所述溶液进一步包含组氨酸。
13.根据权利要求9～11中任一项所述的方法，其中，所述溶液进一步包含甘露醇。
14.根据权利要求9～11中任一项所述的方法，其中，所述溶液进一步包含氯化钠。
15.根据权利要求9～11中任一项所述的方法，其中，所述溶液进一步包含聚山梨醇酯80。
16.根据权利要求9～11中任一项所述的方法，其中，所述溶液进一步包含浓度为5～20mM的组氨酸、按体积计浓度为2～5％的甘露醇、浓度为50～80mM的氯化钠、和按体积计浓度为0.001～0.005％的聚山梨醇酯80。
17.根据权利要求9～11中任一项所述的方法，其中，所述冷冻干燥包括一个退火步骤。
18.一种冻干包含因子IX和海藻糖的药物制剂的方法，包括以下步骤：
(a)在-40℃或更低的温度下冷冻所述包含因子IX和海藻糖的药物制剂；
(b)在约-20～-35℃之间退火所述药物制剂；
(c)将所述药物制剂的温度降低至-40℃或更低；
(d)在5℃～20℃于减压下在第一干燥步骤中干燥所述药物制剂；和
(e)在45℃～55℃于减压下在第二干燥步骤中干燥所述药物制剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述药物制剂进一步包含浓度为5～20mM的组氨酸、按体积计浓度为2～5％的甘露醇、浓度为50～80mM的氯化钠、和按体积计浓度为0.001～0.005％聚山梨醇酯80。
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Owner name: CANGENE CORP.

Free format text: FORMER OWNER: INSPIRATION BIOPHARMACEUTICALS, INC.

Effective date: 20130805

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Effective date of registration: 20130805

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Owner name: CNJ HOLDINGS LIMITED

Free format text: FORMER OWNER: CANGENE CORP.

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Effective date of registration: 20140306

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Applicant after: CNJ HOLDINGS CO., LTD.

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