KR102058961B1 - 엑소좀의 동결건조 방법 - Google Patents

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김광일
조병성
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Abstract

본 발명은 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 이용하여 엑소좀을 동결건조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 동결건조된 엑소좀은 얼음결정을 형성하지 않으면서 다공성의 스폰지 형상을 유지하는 양호한 성상을 나타낸다. 또한, 본 발명에 따라 동결건조된 엑소좀 또는 이를 포함하는 조성물은 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물로의 응용이 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 동결건조된 엑소좀은 희석제와 간단하게 혼합한 용액으로 사용할 수 있다.

Description

엑소좀의 동결건조 방법 {Method for freeze-drying exosomes}
본 발명은 엑소좀의 동결건조 방법, 엑소좀의 동결건조 보호제, 및 엑소좀의 동결건조를 위한 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 동결건조된 엑소좀 또는 동결건조된 엑소좀과 희석제를 포함하는 조성물 및 이의 응용에 관한 것이다.
동결건조는 수분을 함유하는 시료를 동결하고 감압 하에 두어 시료 중의 수분을 승화시켜 제거하는 건조법으로서, 식물이나 동물의 세포, 조직, 또는 식품 등의 물을 포함하는 물질을 장기간 보존하기 위해 사용되고 있다.
그러나 물을 포함하는 물질을 동결하면 동결 중에 물 분자끼리 얼음 결정(빙정)을 형성하여, 물을 포함하는 물질 중에서 용질이나 혼입물의 매질이 불균일하게 확산되는 동결 농축이 발생한다. 세포 내의 동결 농축을 방지하기 위해, 동결 보호제인 디메틸설폭시드(DMSO), 글리세롤, 아세트아미드, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등을 첨가하는 방법이 사용되고 있다. 동결 보호제는 유리전이온도를 높여 동결 과정에서 얼음 결정에 기인하는 조직 와해를 방지하며 조직의 안정성을 높인다.
그러나 진핵세포의 경우 동결 보호제를 사용하여도 동결건조 시 세포막 등의 세포 구조의 손상 없이 세포를 안정하게 보존하기 어렵고, 이에 따라 세포 내 유효 성분의 기능을 유지할 수 없게 되는 문제점이 있다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 엑소좀을 실온에서 보관할 경우 생체활성 인자들의 활성이 저하되는 안정성의 문제가 발생한다. 또한, 엑소좀을 단순 냉장 보관할 경우에도 보관 시간 및 방법 등에 따라 전체적인 엑소좀의 물성 및 안정성에 변화가 생기고, 엑소좀에 포함된 생체활성 인자들의 활성도 저하될 수 있다.
그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 방법 및 안정적인 제형과 관련한 응용기술의 개발은 미진한 상황이다. 따라서, 엑소좀과 이에 포함된 생체활성 인자들을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 방법과 제형의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 엑소좀의 동결건조 방법 및 이를 위한 동결건조 보호제에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 특정의 당류 및 아미노산과 함께 엑소좀을 특정 조건 하에서 동결건조하면 얼음결정을 형성하지 않으면서 다공성의 스폰지 형상을 유지하는 성상이 우수한 동결건조 제품을 수득할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
대한민국 등록특허공보 제10-1457749호 (2014.11.03) 미국공개특허공보 US 2017/0360842 Al호 (2017.12.21)
본 발명의 목적은 엑소좀의 동결건조 방법, 엑소좀의 동결건조 보호제, 및 엑소좀의 동결건조를 위한 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 동결건조된 엑소좀 또는 동결건조된 엑소좀과 희석제를 포함하는 조성물 및 이의 응용을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 이용하여 엑소좀을 동결건조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
본 명세서에서 용어, "생물학적 용액"은 생물기원의 액체 용액으로서 엑소좀이 분산, 현탁, 침전, 부유 또는 혼합되어 있는 용액을 의미하고, 예를 들어 세포 배양액, 세포 배양 상청액, 줄기세포 배양액, 줄기세포 배양 상청액, 전혈, 혈청, 제대혈, 혈장, 복수액, 뇌 및 뇌척수액, 태반 추출액 및 골수 흡입물 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 다양한 동물, 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물 기원의 용액을 배제하는 것이 아님은 물론이다. "생물학적 용액"은 엑소좀을 방출 및/또는 분비시키는 조건 하에서 배양 또는 인큐베이션될 수 있고, 냉동 및 해동될 수도 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 다양한 동물, 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등의 세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다.
본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 상기 생물학적 용액은 줄기세포 배양액일 수 있다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
그러나 본 발명의 동결건조 대상이 되는 엑소좀은 전술한 바와 같은 엑소좀에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 줄기세포 유래 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 동결건조 보호제는 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함한다. 상기 동결건조 보호제는 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 수용액 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 동결건조 보호제에 있어서, 상기 수용액 내의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 농도는 각각 대략 5~15 mg/mL의 범위 내, 바람직하게는 대략 9 mg/mL일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 동결건조를 위한 조성물은 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제와, 엑소좀을 포함한다. 상기 동결건조 보호제는 아스코르브산 및 레티놀을 포함하는 수용액에 첨가될 수 있다. 상기 수용액은 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 또는 탈이온수일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 동결건조를 위한 조성물에 있어서, 상기 수용액 내의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 농도는 각각 대략 5~15 mg/mL의 범위 내, 바람직하게는 대략 9 mg/mL일 수 있다. 또한, 예를 들어 상기 수용액 내의 아스코르브산 및 레티놀의 농도는 각각 대략 0.5 mg/mL일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 동결건조 방법은, (a) 엑소좀을 준비하는 단계와, (b) 상기 준비된 엑소좀을 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제로 처리하는 단계와, (c) 상기 동결건조 보호제로 처리된 엑소좀을 동결건조시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 동결건조 방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 동결건조 보호제와, 상기 엑소좀을 혼합하는 것을 특징으로 한다. 상기 동결건조 보호제는 아스코르브산 및 레티놀을 포함하는 수용액에 첨가될 수 있다. 상기 수용액은 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 또는 탈이온수일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 동결건조 방법에 있어서, 상기 수용액 내의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 농도는 각각 대략 5~15 mg/mL의 범위 내, 바람직하게는 대략 9 mg/mL일 수 있다. 또한, 예를 들어 상기 수용액 내의 아스코르브산 및 레티놀의 농도는 각각 대략 0.5 mg/mL일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 동결건조 방법에 있어서, 상기 (c) 단계는, 대기압 상태에서 -50℃에서 10 시간 내지 15 시간 동안 동결, 진공 상태에서 -50℃에서 50 시간 내지 60 시간 동안 1차 건조, 진공 상태에서 -20℃에서 1 시간 내지 3시간 동안 2차 건조한 후, 진공 상태에서 10℃에서 30분 내지 2 시간 동안 3차 건조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 엑소좀과, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 유효성분으로 포함하는 엑소좀의 동결건조제제를 제공한다. 예를 들어, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 중량비는 1:1:1이다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 동결건조제제는 아스코르브산 및 레티놀을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어, 메티오닌, 만니톨, 트레할로오스, 아스코르브산 및 레티놀의 중량비는 9:9:9:0.5:0.5이다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 동결건조제제는 희석제에 의해 혼합된 용액으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 희석제는 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 또는 탈이온수일 수 있다. 또한, 상기 희석제는 히알루론산 또는 히알루론산염(예를 들어, 히알루론산 나트륨)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 동결건조제제 또는 이를 포함하는 조성물은 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 피부 외용제일 수 있다. 예를 들어, 엑소좀의 동결건조제제 또는 이를 포함하는 조성물은 주사제로 제조될 수 있다.
본 발명은 전술한 바와 같이 동결건조된 엑소좀과 희석제를 포함하는 엑소좀의 현탁액을 제공한다. 희석제로는 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 탈이온수, 히알루론산 또는 이들의 조합 등을 사용할 수 있고, 하기에 예시된 것을 포함하여 당업계에서 희석제로 알려진 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 동결건조된 엑소좀 또는 이를 포함하는 조성물은 약학 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 동결건조된 엑소좀 또는 이를 포함하는 조성물이 약학 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 과립제, 엘릭시르제(elixirs), 에어로졸 등의 경구투여용 제제, 외용제, 좌제, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 림프 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 동결건조된 엑소좀 또는 이를 포함하는 조성물을 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 응용하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예의 동결건조된 엑소좀 또는 이를 포함하는 조성물이 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 동결건조된 엑소좀 또는 이를 포함하는 조성물 이외에, 그 작용(예를 들어, 항염, 보습 효과 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 항염제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 동결건조된 엑소좀 또는 이를 포함하는 조성물은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제가 화장료 조성물로 제조되는 경우, 예를 들어, 항염, 보습 등의 목적으로 사용될 수 있으며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명에 따라 동결건조된 엑소좀은 얼음결정을 형성하지 않으면서 다공성의 스폰지 형상을 유지하는 양호한 성상을 나타낸다.
또한, 본 발명에 따라 동결건조된 엑소좀 또는 이를 포함하는 조성물은 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물로의 응용이 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 동결건조된 엑소좀은 희석제와 간단하게 혼합한 용액으로 사용할 수 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 1A"는 NTA(nanoparticle tracking analysis)에 의해 얻어진 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1B"는 TEM(transmitted electron microscopy)으로 촬영된 입자 이미지 사진이다. "도 1C"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 포지티브 마커에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 네거티브 마커에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD9, CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 동결건조된 엑소좀의 양호한 성상을 나타내는 사진이다.
도 3a 내지 도 3g는 동결건조 보호제 성분의 조합을 다르게 하고 동결건조를 수행한 후, 동결건조 보호제 성분 조합별로 동결건조 엑소좀의 성상을 촬영한 사진이다.
도 4 내지 도 7은 멀티플렉스 패널을 이용한 염증성 사이토카인 분석 결과를 도시한 그래프로서, RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래 엑소좀(줄기세포 배양액으로부터 분리·정제된 엑소좀)을 농도별(mL 당 입자수 기준)로 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 IL-β, IL-6, IL-27 및 IFN-β의 생성량이 엑소좀의 농도의존적으로 감소하는 것을 나타낸다.
도 8 내지 도 11은 멀티플렉스 패널을 이용한 염증성 사이토카인 분석 결과를 도시한 그래프로서, RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 실시예 4-1에서 준비된 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제를 배양배지와 혼합하여 희석한 수용액을 농도별(mL 당 입자수 기준)로 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 IL-β, IL-6, IL-27 및 IFN-β의 생성량이 동결건조제제의 농도의존적으로 현저하게 감소하는 것을 나타낸다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 ㎛ 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff;MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 NTA, TEM 분석 결과는 도 1A 및 도 1B에 도시하였다.
도 1C는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 포지티브 마커에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD63, CD9, CD81, Alix 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD63, 항-CD9, 항-CD81, 항-Alix 및 항-TSG101을 사용하였다.
도 1D는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 네거티브 마커에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과이다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-GM130 및 항-칼넥신(Calnexin)을 사용하였다. GM130 및 칼넥신(Calnexin)은 엑소좀의 특성 분석 시 엑소좀에 존재하지 않아야 하는 네거티브 마커이다. 도 1D에 도시된 바와 같이 GM130 및 칼넥신(Calnexin)은 지방줄기세포의 파쇄물에서는 존재하는 것으로 확인되었지만, 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에서는 존재하지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 도 1C 및 도 1D의 결과를 종합할 때, 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 포지티브 마커 및 네거티브 마커 특성분석을 만족하는 엑소좀임을 알 수 있다.
도 1E는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD9, CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD81에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD81 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD9 (PE-Mouse anti-human CD9)(BD에서 구입), PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
한편, 본 발명의 동결건조 방법에 사용되는 엑소좀은 전술한 바와 같은 실시예들의 엑소좀에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 상기 실시예들에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명의 동결건조 방법에 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
실시예 4: 엑소좀의 동결건조
실시예 4-1: 동결건조 조건
엑소좀의 동결건조를 위해 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 준비하였다. 아스코르브산 및 레티놀을 각각 0.5 mg/mL로 함유하고 있는 1mL의 수용액[(주)바이오에프디엔씨(대한민국 전남 화순군 소재)에서 외주 제작]에 상기 동결건조 보호제를 첨가한 수용액을 준비하였다. 본 실시예에서는 동결건조 보호제를 아스코르브산 및 레티놀을 함유하고 있는 용액에 첨가하였으나, 주사용수, 정제수, 생리적 식염수, 또는 탈이온수에 동결건조 보호제를 첨가하여 수용액을 준비할 수도 있다. 상기 수용액 내의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 농도는 각각 9 mg/mL가 되도록 하였다.
동결건조 보호제가 함유된 수용액에 실시예 2에서 준비된 엑소좀(5×108 입자/mL)을 혼합한 후 동결건조 장비(제조사: VIRTIS, ITME No.: 34424)를 이용하여 하기 표 1의 조건으로 동결건조를 수행하였다. 동결건조는 하기 표 1의 조건 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 순서로 진행하였다.
동결건조 조건
총 시간 (min) 4320
조건 시간 (min) 온도 (℃) 압력 (mmHg)
1 700 -50 760
2 60 -50 760
3 999 -50 0
4 999 -50 0
5 999 -50 0
6 370 -50 0
7 120 -20 0
8 73 10 0
메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 처리하여 엑소좀을 동결건조 후 성상을 확인한 결과, 색은 유백색이며 다공성의 스폰지 형상을 유지하는 양호한 성상을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 2). 즉, 본 발명의 엑소좀의 동결건조 방법에서는 감압 하에서의 건조 시간을 길게 하고 동결건조 보호제를 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합으로 구성함으로써 우수한 성상을 나타내는 동결건조 제품을 수득할 수 있었다.
실시예 4-2: 동결건조 보호제 성분에 따른 동결건조 엑소좀의 성상 비교
한편, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스 (이하, 동결건조 보호제 성분이라 함) 중 적어도 1종을 포함하는 다양한 동결건조 보호제를 사용하여 엑소좀을 동결건조한 경우의 엑소좀의 성상을 비교하였다. 상기 실시예 4-1에 기재된 방법에 따라 동결건조 보호제 성분 단독, 2가지 성분의 조합, 또는 3가지 성분 조합을 첨가한 7가지 종류의 수용액을 준비하였다. 상기 수용액 내에서 각 동결건조 보호제 성분의 농도는 9 mg/mL가 되도록 하였다. 상기 실시예 4-1의 동결건조 조건 및 방법에 따라, 동결건조 보호제 성분의 각 조합이 함유된 수용액에 실시예 2에서 준비된 엑소좀(5×108 입자)을 혼합한 후 동결건조를 수행하였다.
동결건조된 엑소좀 제품들에 대한 외형 성상을 촬영하고 평가하였다(도 3a 내지 도 3g). 동결건조된 엑소좀 제품의 케익 모양의 좋고 나쁨에 따라 가장 좋은 것은 5점으로 하고 가장 나쁜 것은 1점으로 하여 외형 성상을 상대 평가하였다. 동결건조 보호제 성분 조합별로 동결건조 엑소좀 제품의 성상을 평가한 결과는 하기 표 2와 같다.
동결건조 보호제 성분별 동결건조 엑소좀 제품의 성상 비교
동결건조 보호제 성분 조성 만니톨 트레할로오스 메티오닌 메티오닌+
트레할로오스		 메티오닌+
만니톨		 트레할로오스+
만니톨		 메티오닌+만니톨+트레할로오스(본 발명)
평가점수 1 1 4 3 4 2 5
도면 도 3a 도 3b 도 3c 도 3d 도 3e 도 3f 도 3g
도 3a 내지 도 3g 및 상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합으로 구성된 동결건조 보호제를 사용하여 엑소좀을 동결건조한 경우가 제품 외형 성상이 가장 양호하였고, 상기 3가지 성분 중 1가지 또는 2가지 성분이 빠진 조합으로 동결건조한 엑소좀은 제품 외형 성상이 본 발명의 경우 보다 불량함을 알 수 있었다.
실시예 5: 염증성 사이토카인 생성 감소 효과 확인
마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 실시예 2의 줄기세포 유래 엑소좀과 실시예 4-1의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제의 염증성 사이토카인 생성 감소 효과를 다음과 같이 확인하였다.
RAW 264.7 세포를 10% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium; ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 현탁시킨 후 96웰 플레이트에 2.5×104 세포/웰의 밀도로 접종하였고, 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래 엑소좀(줄기세포 배양액으로부터 분리·정제된 엑소좀)을 농도별(mL 당 입자수 기준)로 처리한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 또한, 전술한 줄기세포 유래 엑소좀 처리 방식과 동일한 방식으로, RAW 264.7 세포에 대해 실시예 4-1의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제(5×109 입자/vial)를 배양배지와 혼합하여 희석한 수용액을 농도별(mL 당 입자수 기준)로 처리한 후, 처리된 RAW 264.7 세포를 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 한편, 양성대조군 물질로는 덱사메타손을 사용하였다(도 4 내지 도 11에 DEX로 표기됨).
그리고 나서, 100 ng/mL의 LPS(Sigma에서 구입)를 처리하였고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하여 RAW 264.7 세포의 활성화를 유도하였다.
배양이 끝난 RAW 264.7 세포의 배양 상등액(Culture supernatant)을 수거하였고, 배양 상등액 내의 IL-β, IL-6, IL-27 및 IFN-β의 생성량을 LEGENDplexTM 비드-기반 면역 측정법(bead-based immnnoassay) 마우스 염증 패널(mouse inflammation panel)(Biolegend에서 구입) 및 노보사이트 유세포 분석기(NovoCyte Flow Cytometer)(ACEA에서 구입)를 이용하여 측정하여 항염증 효과를 확인하였다.
또한, 줄기세포 유래 엑소좀과 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제에 의한 세포 생존율 변화 측정과 이를 통한 사이토카인 생성량 보정을 위하여 MTT 어세이를 수행하였다. 배양이 끝난 RAW 264.7 세포의 배양 배지를 0.5 mg/mL 티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)(Sigma에서 구입)를 포함한 DMEM 배지로 교환하였고 1시간 동안 배양하였다. 이후 세포배양 플레이트 바닥에 형성된 포르마잔(formazan)이 흩어지지 않게 상등액을 제거하였고 디메틸 설폭시드(Dimethyl Sulfoxide)(AMRESCO에서 구입)로 용해시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다. 그리고 각각의 사이토카인(IL-β, IL-6, IL-27 및 IFN-β) 생성량을 세포 생존율로 보정하였다.
도 4 내지 도 7에 도시된 바와 같이, 멀티플렉스 패널을 이용한 염증성 사이토카인 분석 결과, RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 줄기세포 유래 엑소좀을 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 IL-β, IL-6, IL-27 및 IFN-β의 생성량이 줄기세포 유래 엑소좀의 농도의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 8 내지 도 11에 도시된 비와 같이, 멀티플렉스 패널을 이용한 염증성 사이토카인 분석 결과, RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제를 처리한 경우에도 LPS에 의해 유도되는 IL-β, IL-6, IL-27 및 IFN-β의 생성량이 동결건조제제의 농도의존적으로 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과로부터, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제는 유효성분으로 함유하고 있는 줄기세포 유래 엑소좀의 항염 효능을 안정하게 유지하고 있으며, 동결건조, 보관 및 유통 과정에서 줄기세포 유래 엑소좀의 물성 변화가 없음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제는 줄기세포 유래 엑소좀을 상업적으로 활용가능하도록 안정화시킬 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (16)

  1. 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합을 포함하는, 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀의 동결건조 보호제.
  2. 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합을 포함하는 동결건조 보호제와,
    이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀을 포함하는, 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀의 동결건조를 위한 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 동결건조 보호제는 아스코르브산 및 레티놀을 포함하는 수용액에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀의 동결건조를 위한 조성물.
  4. (a) 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀을 준비하는 단계와,
    (b) 상기 준비된 엑소좀을, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합을 포함하는 동결건조 보호제로 처리하는 단계와,
    (c) 상기 동결건조 보호제로 처리된 엑소좀을 동결건조시키는 단계를 포함하는, 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀의 동결건조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 상기 동결건조 보호제와, 상기 엑소좀을 혼합하는 것을 특징으로 하는, 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀의 동결건조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 동결건조 보호제는 아스코르브산 및 레티놀을 포함하는 수용액에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀의 동결건조 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (c) 단계는, 대기압 상태에서 -50℃에서 10 시간 내지 15 시간 동안 동결, 진공 상태에서 -50℃에서 50 시간 내지 60 시간 동안 1차 건조, 진공 상태에서 -20℃에서 1 시간 내지 3시간 동안 2차 건조한 후, 진공 상태에서 10℃에서 30분 내지 2 시간 동안 3차 건조하는 것을 특징으로 하는, 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀의 동결건조 방법.
  8. 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀과, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합을 유효성분으로 포함하는, 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀의 동결건조제제.
  9. 제8항에 있어서,
    아스코르브산 및 레티놀을 추가로 함유하는, 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀의 동결건조제제.
  10. 제8항에 있어서,
    희석제에 의해 혼합된 용액으로 사용되는, 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀의 동결건조제제.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 희석제는 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 또는 탈이온수인 것을 특징으로 하는, 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀의 동결건조제제.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 희석제는 히알루론산 또는 히알루론산염을 추가로 포함하는, 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀의 동결건조제제.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀의 동결건조제제 또는 이를 포함하는 조성물을 포함하는, 화장료 조성물.
  16. 삭제
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