CN115990261B - 外泌体冻干粉针剂或外泌体液体制剂的保护剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物制剂领域，特别涉及外泌体冻干粉针剂或外泌体液体制剂的保护剂。本发明通过多种制剂辅料的研究，确定了牛奶来源外泌体和细胞来源外泌体液体制剂和冻干粉针制剂，舌下片剂的辅料配方。

Description

外泌体冻干粉针剂或外泌体液体制剂的保护剂
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，特别涉及外泌体冻干粉针剂或外泌体液体制剂的保护剂。
背景技术
外泌体的研究中，外泌体的制剂研究尚少。临床所用的制剂以液体制剂为主。只有少量科研研究中提到外泌体的冻干制剂。对于外泌体的临床应用，制剂开发研究不足。我们通过多种制剂辅料的研究，确定了牛奶来源外泌体和细胞来源外泌体液体制剂和冻干粉针制剂，舌下片剂的辅料配方。
表1
目前，临床研究所用到外泌体多数是-80℃储存的溶液制剂。低温储存的制剂存在运输麻烦，成本高，保存设备要求高等缺点。而且在不添加辅料条件下，低温储存外泌体，会造成外泌体破裂，聚集。
因此，提供开发牛奶外泌体和细胞来源的外泌体冻干和液体制剂，舌下片剂的辅料配方，是基于外泌体的创新药从科研实验室走向临床应用的必要步骤，具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了外泌体冻干粉针剂或外泌体液体制剂的辅料配方。本发明解决了牛奶来源外泌体和细胞来源外泌体分别在冻干和冻存条件下，外泌体破碎和聚集问题，确定了不同来源外泌体的液体制剂、冻干制剂和舌下片剂的最适保存方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了甘露醇、山梨醇、蔗糖、精氨酸或甘氨酸中的一种或多种作为保护剂在制备外泌体冻干粉针剂或外泌体液体制剂中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述外泌体包括牛奶来源外泌体或细胞来源外泌体。
在本发明的一些具体实施方案中，甘露醇的含量为1％～10％、1％～6％或1％～12％；山梨醇的含量为1％～15％、1％～10％或3％～15％；蔗糖的含量为1％～10％、6％～25％或2.5％～35％；精氨酸的含量为0.01M～0.5M；甘氨酸的含量为0.01M～1M。
本发明还提供了用于制备外泌体冻干粉针剂或外泌体液体制剂的保护剂，包括甘露醇、山梨醇、蔗糖、精氨酸或甘氨酸中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述保护中，甘露醇的含量为1％～10％、1％～6％或1％～12％；山梨醇的含量为1％～15％、1％～10％或3％～15％；蔗糖的含量为1％～10％、6％～25％或2.5％～35％；精氨酸的含量为0.01M～0.5M；甘氨酸的含量为0.01M～1M。
在本发明的一些具体实施方案中，所述外泌体冻干粉针剂为牛奶外泌体冻干粉针剂，其特征在于，包括1％～10％甘露醇和1％～15％山梨醇的组合物，或1％～10％蔗糖和1％～15％山梨醇的组合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述外泌体液体制剂为牛奶外泌体液体制剂，包括6％～25％蔗糖，1％～10％山梨醇，0.01M～0.5M精氨酸和0.01M～1M甘氨酸的组合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述外泌体液体制剂为细胞来源外泌体冻干粉针剂，包括1％～6％的甘露醇和3％～15％山梨醇的组合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述外泌体液体制剂为细胞来源外泌体的液体制剂，包括2.5％～35％蔗糖和1％～12％甘露醇的组合物，其中，蔗糖和/或甘露醇可经山梨醇替代。
本发明还提供了所述保护剂在制备外泌体冻干粉针剂或外泌体液体制剂中的应用。
本发明还提供了外泌体冻干粉针剂或外泌体液体制剂，包括外泌体和所述的保护剂。
本发明通过多种制剂辅料的研究，确定了牛奶来源外泌体和细胞来源外泌体液体制剂和冻干粉针制剂，舌下片剂的辅料配方(所选用的崩解剂：微晶纤维素，交联羧甲基纤维素钠，交联聚乙烯吡咯烷酮，羧甲基淀粉钠，低取代羟丙基纤维素，淀粉，吐温，十二烷基硫酸钠中的仍一种或两种以上的混合物；所选用的填充剂：微晶纤维素，微晶纤维素-甘露醇，微晶纤维素-微粉硅胶，乳糖，淀粉，改性淀粉，甘露醇，山梨醇，木糖醇，赤藓糖，海藻糖，预胶化淀粉，糖粉，葡萄糖，糊精，硫酸钙中的任一种或两种以上的混合物；所选用矫味剂：甜菊甙，糖粉，甘草甜素，阿司帕坦，三氯蔗糖，甜蜜素，索马甜，糖精等一种或两种以上的混合物；所选用的粘合剂：纯化水，淀粉浆，羟丙基甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，卡波姆，糊精，明胶浆，阿拉伯胶浆，海藻酸钠和糖浆中的一种或两种以上的混合物；所用润滑剂：硬脂酸，硬脂酸镁，硬脂酸钙，微粉硅胶，滑石粉，氢化植物油，聚乙二醇4000，聚乙二醇6000，十二烷基硫酸钠，十二万级硫酸镁，富马酸硬质酸钠中的任一种或两种以上的混合物)。为外泌体的临床应用提供了制剂工艺。
1)对于牛奶外泌体冻干粉针剂，最优配方是1％-10％甘露醇与1％-15％山梨醇组合，其中甘露醇可用蔗糖替代；
2)对于牛奶外泌体液体制剂，最优配方是6％-25％蔗糖，1％-10％山梨醇，0.01M-0.5M精氨酸，0.01M-1M甘氨酸，对牛奶外泌体均有明显的保护效果；
3)对于细胞来源外泌体冻干粉针剂，最优配方是1％-6％的甘露醇，3％-15％山梨醇具有保护效果；
4)对于细胞来源外泌体的液体制剂，最优配方2.5％-35％蔗糖与1％-12％甘露醇，对样品保存效果最好，其中，蔗糖，甘露醇可用山梨醇替代。
5)对于舌下片，最优配方每1000片外泌体舌下片中，主药的含量为105-1013颗粒数，交联羧甲基纤维素钠的含量为1-50g(可用交联聚乙烯吡咯烷酮，微晶纤维素替代)，淀粉的含量为20-400g(可用木糖醇，乳糖，甘露醇替代)；阿司帕坦0-50g(可用糖粉替代)，纯水5-100g(可用淀粉浆替代)，滑石粉1g-10g(可用硬脂酸镁替代)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示冻存盒慢冻结果；其中，图1(A)是样品颗粒数；图1(B)示纯度；
图2示液氮速冻结果；其中，图2(A)是样品颗粒数；图2(B)示纯度；
图3示不同浓度蔗糖和山梨醇对牛奶外泌体冻存的保存效果；其中，图3(A)示纯度；图3(B)示样品颗粒数；
图4示不同辅料组合，对牛奶外泌体冻存的保护效果；其中，图4(A)示纯度；图4(B)示样品颗粒数；
图5示-80℃冻存条件下，不同冻存保护剂对细胞来源外泌体的保护效果；其中，图5(A)示纯度；图5(B)示样品颗粒数；
图6示冻干条件下，不同辅料组合对外泌体的保存效果；其中，图6(A)示纯度；图6(B)示样品颗粒数；
图7示冻干条件下，针对3％甘露醇+5％山梨醇条件进一步优化后对外泌体的保存效果；其中，图7(A)示纯度；图7(B)示样品颗粒数；图7(C)示冻样品留存图；
图8示冻干条件下，冻干保护剂的组合对细胞来源外泌体的保护效果；其中，图8(A)示纯度；图8(B)示样品颗粒数；
图9示牛奶外泌体液体制剂现有保存技术(PBS)与本发明技术(5％山梨醇)，纯度与颗粒数对比图；
图10示牛奶外泌体冻干粉针剂制剂现有保存技术(PBS)与本发明技术(6％甘露醇)，纯度与颗粒数对比图；
图11示细胞外泌体液体剂制剂现有保存技术(PBS)与本发明技术(6％甘露醇)，纯度与颗粒数对比图；
图12示细胞外泌体冻干粉针剂制剂现有保存技术(PBS)与本发明技术(6％甘露醇)，纯度与颗粒数对比图；
图13示药代动力学曲线图。
具体实施方式
本发明公开了外泌体冻干粉针剂或外泌体液体制剂的保护剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
临床研究所用到外泌体多数是-80℃储存的溶液制剂。低温储存的制剂存在运输麻烦，成本高，保存设备要求高等缺点。而且在不添加赋形剂条件下，低温储存外泌体，会造成外泌体破裂，聚集。本发明解决了牛奶来源外泌体和细胞来源外泌体分别在冻干和冻存条件下，外泌体破碎和聚集问题，确定了不同来源外泌体的液体制剂和冻干制剂，舌下片剂的最适保存方法。
本发明提供的外泌体冻干粉针剂或外泌体液体制剂的保护剂所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1冻存方法对外泌体的影响
原理：外泌体是具有和细胞膜结构类似的脂质双分子层结构。细胞常用的冻存方式是梯度降温。但是外泌体源于细胞分泌，细胞分泌蛋白通常采用液氮速冻的方法进行冻存。外泌体在冻存过程时，会出现聚集，破裂。蔗糖，精氨酸，甘氨酸，尿素是常用的赋形剂，有助于药物分散剂，DMSO是细胞常用的冻存液，能防止细胞破裂。
操作步骤：
1)牛奶外泌体的制备：3M硫酸铵沉淀牛奶，室温进行沉淀，静置1.5h，沉淀后的牛奶样品6000rpm，离心20min，接着将上清依次用0.8μm，0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。初纯的样品采用TFF初滤，再用core700进行精纯，获得牛奶外泌体
2)用PBS分别配制4M、2M、1M尿素，50％、25％、12.5％蔗糖，1M、0.5M、0.25M甘氨酸，0.2M、0.1M、0.05M精氨酸储液。20％、2％DMSO。按下述表格加入外泌体和各试剂，各2份(A组和B组)
表2
3)样品混合均匀后，A组用细胞冻存盒-80℃冻存，B组用液氮速冻后，放入-80℃保存2天
4)冻存的样品从-80℃取出，25℃水浴快速溶解
5)12000g离心10min，将上清转移至新的1.5mL离心管中
6)纳米流式NanoFCM检测样品颗粒数和纯度
实验结果：
1)冻存盒慢冻，结果如图1所示：
表3
表4
2)液氮速冻，结果如图2所示：
表5
表6
实验结论：
1)对于冻存盒慢冻方法保存的样品，所有辅料均不能很好的保持外泌体结构完整性和分散性，所有样品的颗粒数下降了一个数量级，纯度下降了至少50％。综合分析，0.25M甘氨酸的保存最好，效率是45.1％
2)对于液氮速冻方法保存的样品，所有辅料的抗聚集效果均不佳，所有样品的颗粒数均下降一个数量级。25％精氨酸能较好的保持外泌体的结构完整性，保存效率是82.8％。
3)综合对比冻存盒慢冻和液氮速冻的方法，虽然各条件下，最佳的保存辅料不一样，但是，从外泌体结构完整性的保存效率上看，液氮速冻的方法更适合外泌体的保存。
实施例2-80℃冻存条件下，牛奶来源外泌体最优保存方法
原理：外泌体是具有和细胞膜结构类似的脂质双分子层结构。不同来源的外泌体，最适储存条件不同。不同的辅料成分，不同浓度，对样品的保护效果不同。
实验步骤
1)牛奶外泌体的制备：3M硫酸铵沉淀牛奶，室温进行沉淀，静置1.5h，沉淀后的牛奶样品6000rpm，离心20min，接着将上清依次用0.8μm，0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。初纯的样品采用TFF初滤，再用core700进行精纯，获得牛奶外泌体
2)用PBS配制50％，25％，12.5％蔗糖储液，40％，20％，10％山梨醇储液，0.4M精氨酸，2M甘氨酸
3)按下述表格配制溶液
表7
表8
4)样品混合均匀后，用液氮速冻后，放入-80℃保存2天
5)冻存的样品从-80℃取出，25℃水浴快速溶解
6)12000g离心10min，将上清转移至新的1.5mL离心管中
7)纳米流式NanoFCM检测样品颗粒数和纯度
实验结果：
1)不同浓度蔗糖和山梨醇对牛奶外泌体冻存的保存效果，如图3所示：
表9样品纯度
表10样品颗粒数
2)不同辅料组合，对牛奶外泌体冻存的保护效果，如图4所示：
表11样品纯度
表12样品颗粒数
实验结论：
1)相对于其他浓度的蔗糖，25％蔗糖对牛奶外泌体的保护效果最好
2)相对于其他浓度的山梨醇，5％山梨醇对牛奶外泌体的保护效果最好
3)25％蔗糖，5％山梨醇，0.1M精氨酸，0.25M甘氨酸，单独添加时，对牛奶外泌体均有明显的保护效果。但将这些辅料进行混合时，对样品的保护效果，从颗粒数和纯度上看，并没有优于单独使用这些辅料。
实施例3-80℃冻存条件下，细胞来源外泌体最优保存方法
原理：外泌体是具有和细胞膜结构类似的脂质双分子层结构。不同来源的外泌体，最适储存条件不同。
实验步骤：
1)细胞来源外泌体：细胞上清依次用0.2μm的滤膜进行过滤。初纯的样品采用TFF初滤，再用core700进行精纯，获得细胞外泌体。
2)用PBS配制50％蔗糖，40％山梨醇，15％甘露醇，按下述表格配制溶液。
表13
3)样品混合均匀后，用液氮速冻后，放入-80℃保存2天；
4)冻存的样品从-80℃取出，25℃水浴快速溶解；
5)12000g离心10min，将上清转移至新的1.5mL离心管中；
6)纳米流式NanoFCM检测样品颗粒数和纯度。
实验结果，如图5所示：
表14纯度
甘露醇 Fresh PBS 25％蔗糖 5％山梨醇
0 84.73％ 68.98％ 0％ 0％
3％ 0％ 0％ 36.45％
6％ 77.21％ 0％ 30.38％
表15颗粒数
甘露醇 Fresh PBS×109 25％蔗糖×109 5％山梨醇×109
0 1.56 0.978 0.438 0.0571
3％ 0.257 0.0663 0.529
6％ 0.645 0.706 0.525
实验结论：从结果上看，在冻存条件下，6％的甘露醇，外泌体纯度最高，颗粒数也较好的保存，因此6％的甘露醇对细胞来源外泌体的保护效果最好。
实施例4冻干条件下，牛奶来源外泌体最优保存方法
原理：外泌体是具有和细胞膜结构类似的脂质双分子层结构。不同来源的外泌体，最适储存条件不同。
实验步骤：
1)牛奶外泌体的制备：3M硫酸铵沉淀牛奶，室温进行沉淀，静置1.5h，沉淀后的牛奶样品6000rpm，离心20min，接着将上清依次用0.8μm，0.45μm和0.2μm的滤膜进行过滤。初纯的样品采用TFF初滤，再用core700进行精纯，获得牛奶外泌体
2)用PBS配制50％蔗糖，40％山梨醇，15％，10％甘露醇，按下述表格配制溶液
表16
表17
3)样品混合均匀后，用液氮速冻后，放入冻干机中，冻24h；
4)冻干样品用100μL PBS重溶；
5)12000g离心10min，将上清转移至新的1.5mL离心管中；
6)纳米流式NanoFCM检测样品颗粒数和纯度。
实验结果：
1)不同辅料组合对外泌体的保存效果，如图6所示：
表18颗粒数
表19纯度
2)针对3％甘露醇+5％山梨醇条件进一步优化，结果如图7所示：
表20纯度
表21颗粒数×109
实验结论：
1)从结果上看，3％甘露醇与5％山梨醇组合，对外泌体的保存效果更好。
2)在针对3％甘露醇与5％山梨醇组合优化实验中，综合纯度和颗粒数，同时考虑高浓度辅料对冻干样品的影响，辅料越多，冻干剂体积越大，会增加溶解难度。因此，3％山梨醇和2％甘露醇的保存效果较优。
实施例5
1.冻干条件下，细胞来源外泌体最优保存方法
原理：外泌体是具有和细胞膜结构类似的脂质双分子层结构。不同来源的外泌体，最适储存条件不同。
实验步骤：
1)细胞来源外泌体的制备：细胞上清经0.22μm滤膜过滤后，采用TFF初滤，再用core700进行精纯，获得细胞外泌体；
2)用PBS配制50％蔗糖，40％山梨醇，15％，10％甘露醇，按下述表格配制溶液。
表22
3)样品混合均匀后，用液氮速冻后，放入冻干机中，冻24h；
4)冻干样品用100μL PBS重溶；
5)12000g离心10min，将上清转移至新的1.5mL离心管中；
6)纳米流式NanoFCM检测样品颗粒数和纯度。
实验结果如图8所示：
表23细胞来源外泌体冻干制剂颗粒数
甘露醇浓度 新鲜样品×109 PBS×109 25％蔗糖×109 5％蔗糖×109
0 1.56 1.06 1.87 0.637
3％ 0.522 1.48 1.23
6％ 0.815 1.28 1.16
表24细胞来源外泌体冻干制剂纯度
实验结论：25％蔗糖与6％甘露醇组合，对样品保存效果最好。
实施例6
外泌体舌下片的最优辅料配方
制备步骤如下：
第一步：将所述的主药冷冻干燥，过筛80-120目；
第二步：将填充剂，崩解剂，矫味剂，润滑剂烘干，粉碎，过筛80-120目预处理；
第三步：将预处理的外泌体冻干粉，填充剂，矫味剂和崩解剂混合均匀；
第四步：将粘合剂加入混匀的上述无聊中，制成软材，制粒，干燥；
第五步：干颗粒加入润滑剂混匀，再进行压片得到成品。
实施例：将主药外泌体加入赋形剂，冷冻干燥后，与填充剂淀粉，崩解剂羧甲基纤维素钠，润滑剂滑石粉进行烘干，粉碎，过筛混合，制成软材，用20目网筛制粒，并风干至水分≤3％，再加入润滑剂，进行总混，最后压片得到外泌体舌下片。
获得的舌下片进行动物药效评价：
1)主药在制备过程中，采用PKH67进行荧光标记。舌下片的制备同上述步骤一致步骤五
2)将制备好的荧光标记的舌下片给予小鼠，检测血清中的外泌体颗粒数，并进行药代动力学分析，结果如表25、图13所示。
表25药代动力学参数
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对比例
现有临床研究用的外泌体保存及制剂以液体制剂为主，没有冻干剂和舌下片，并且液体制剂在不添加辅料时，直接冻存，会造成外泌体聚集，破裂，影响外泌体的疗效。并且没有牛奶外泌体和细胞来源外泌体的制剂工艺。本发明解决了牛奶外泌体和细胞来源外泌体的液体制剂，冻干粉针剂和舌下片剂的制剂工艺开发，开发了新型的外泌体制剂。
对比数据请审查员审核：
对照组：采用PBS作为冻存剂；
实验组1：采用5％山梨醇作为冻存保护剂；
实验组2：采用6％甘露醇作为冻干赋形剂；
实验方法：
方法一：在500uL新鲜牛奶外泌体样品中，加入500uL 10％山梨醇，对照组500uL样品中加入500uL PBS，液氮速冻后，-80℃保存；样品检测时，4℃溶化样品，12000rpm离心10min，取上清，NanoFCM检测样品浓度，样品用1％Trtion消化后，NanoFCM检测并计算获得样品纯度。
方法二：在500uL新鲜细胞外泌体样品中，加入500uL 12％甘露醇，对照组500uL样品中加入500uL PBS，液氮速冻后，-80℃保存；样品检测时，4℃溶化样品，12000rpm离心10min，取上清，NanoFCM检测样品浓度，样品用1％Trtion消化后，NanoFCM检测并计算获得样品纯度。
方法三：在500uL新鲜牛奶或细胞外泌体样品中，加入500uL 12％甘露醇，对照组500uL样品中加入500uL PBS，液氮速冻后，-80℃保存液氮速冻后，冻干机中冻干；样品检测时，实验组和对照组的样品均用1mL H2O复溶后，12000rpm离心10min，取上清，NanoFCM检测样品浓度，样品用1％Trtion消化后，NanoFCM检测并计算获得样品纯度。
实验结果：
图9示牛奶外泌体液体制剂现有保存技术(PBS)与本发明技术(5％山梨醇)，纯度与颗粒数对比图。样品添加5％山梨醇作为保护剂，样品的纯度和颗粒数明显高于PBS组，说明5％山梨醇能够有效保护样品冻存时的结构完整性和分散性。
图10示牛奶外泌体冻干粉针剂制剂现有保存技术(PBS)与本发明技术(6％甘露醇)，纯度与颗粒数对比图。样品中添加6％甘露醇作为赋形剂，样品的纯度和颗粒数明显高于PBS组，说明6％山梨醇能够有效保护样品冻干时的结构完整性和分散性。
图11示细胞外泌体液体剂制剂现有保存技术(PBS)与本发明技术(6％甘露醇)，纯度与颗粒数对比图。样品添加6％山梨醇作为保护剂，样品的纯度和颗粒数明显高于PBS组，说明6％山梨醇能够有效保护样品冻存时的结构完整性和分散性。
图12示细胞外泌体冻干粉针剂制剂现有保存技术(PBS)与本发明技术(6％甘露醇)，纯度与颗粒数对比图。样品添加6％山梨醇作为保护剂，样品的纯度和颗粒数明显高于PBS组，说明6％山梨醇能够有效保护样品冻存时的结构完整性和分散性。
综上，5％山梨醇对牛奶外泌体液体制剂具有明显的保护效果；6％的甘露醇对牛奶外泌体冻干粉针剂，细胞外泌体的冻干粉针剂或液体制剂具有明显的保护效果，均能保持外泌体的稳定性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.外泌体冻干粉针剂或外泌体液体制剂，其特征在于，包括外泌体和保护剂；
所述外泌体冻干粉针剂为牛奶外泌体冻干粉针剂，所述保护剂为2%的甘露醇和3%的山梨醇的组合物；
或所述外泌体液体制剂为牛奶外泌体液体制剂，所述保护剂为25%的蔗糖，5%的山梨醇，0.1M的精氨酸和0.25M的甘氨酸的组合物；
或所述外泌体冻干粉针剂为细胞来源外泌体冻干粉针剂，所述保护剂为25%的甘露醇和6%的山梨醇的组合物。
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