CN110559254A - 一种外泌体组合物、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种外泌体组合物、其制备方法、以及在护肤或生发类皮肤美容产品中的应用，所述外泌体组合物包括外泌体和药学上可接受的载体，外泌体为单层细胞外泌体、细胞球外泌体、或二者的组合。本发明能够有效将外泌体输送至皮肤真皮层，并保持其生物活性，更有效地调节皮肤和毛囊分泌生长因子和基质的能力，最大程度地实现改善肌肤和毛囊问题，达到更为持久的效果，并且最大程度地减少了皮肤组织的损伤，更为安全。

Description

一种外泌体组合物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及医疗美容领域，具体涉及一种外泌体组合物、其制备方法及应用。

背景技术

外泌体是细胞主动分泌的囊泡，含有与细胞来源相关的微小RNA以及蛋白等物质，可进入受体细胞内，参与细胞间的信息交流以及需要重要的生理和病理过程，具有与其来源细胞相似的功能。外泌体直径为100纳米左右，且为磷脂双分子层结构，极易与表皮细胞融合，进而通过微小RNA等生物活性物质调节细胞的活性。

为了收集足够的外泌体，需要进行细胞扩大培养。但是，随着细胞传代次数的增加，会出现细胞衰老和生长缓慢的状态，细胞分泌的外泌体也随之发生变化，例如其中的蛋白质和微小RNA成分，导致其生物活性大大降低。

如何培养及获取高活性的外泌体，并利用其特殊的生物活性进而转化为安全、有效的产品，成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明创造性地提出一种外泌体组合物、其制备方法、以及在护肤或生发类皮肤美容产品中的应用，并经大量实验数据证实了该方法和产品效果的可靠性。下文将对本发明内容进行详细描述。

根据本发明的一方面，提供一种外泌体组合物，其包括外泌体和药学上可接受的载体。其中，所述外泌体为单层细胞外泌体、细胞球外泌体、或二者的组合。所述单层细胞外泌体或细胞球外泌体来自成纤维细胞，毛囊乳突细胞，脂肪干细胞，胚胎干细胞，造血干细胞，脐带血干细胞，以及皮肤、脂肪、骨髓来源的间充质干细胞中的一者或多者。

在一些实施方式中，单层细胞外泌体通过以下方式获得：将成纤维细胞、毛囊乳突细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞、或者皮肤、脂肪、骨髓来源的间充质干细胞进行低代数细胞的贴壁扩大培养，至细胞融合率达90％以上后，收集单层细胞外泌体。

在一些实施方式中，细胞球外泌体通过以下方式获得：将经多次传代后呈现衰老表型的成纤维细胞、毛囊乳突细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞、或者皮肤、脂肪、骨髓来源的间充质干细胞传代至超低吸附培养瓶中，培养成细胞球，收集细胞球外泌体。

在一些实施方式中，通过以下方法收集单层细胞外泌体或细胞球外泌体：将单层细胞或细胞球置于无血清的培养基中培养，收集上清液并除去细胞及其他杂质，得到单层细胞外泌体或细胞球外泌体。

在一些实施方式中，所述单层细胞外泌体或细胞球外泌体中均表达外泌体标志蛋白CD63，CD81和CD9。

根据本发明的另一方面，还提供一种外泌体的制备方法，包括以下步骤：

将成纤维细胞、毛囊乳突细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞、或者皮肤、脂肪、骨髓来源的间充质干细胞进行低代数细胞的贴壁扩大培养，至细胞融合率达90％以上后，通过以下方法收集单层细胞外泌体：将细胞置于无血清的培养基中培养，收集上清液并除去细胞及其他杂质，得到单层细胞外泌体。

根据本发明的另一方面，还提供一种外泌体的制备方法，包括以下步骤：

将经多次传代后呈现衰老表型的成纤维细胞、毛囊乳突细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞、或者皮肤、脂肪、骨髓来源的间充质干细胞传代至超低吸附培养瓶中，培养成细胞球，通过以下方法收集细胞球外泌体：将细胞球置于无血清的培养基中培养，收集上清液并除去细胞及其他杂质，得到细胞球外泌体。

根据本发明的另一方面，还提供一种外泌体在制备用于护肤或生发的皮肤美容产品中的用途。在一些实施方式中，所述外泌体在所述皮肤美容产品中的浓度为1-1000μg/ml。

在一些实施方式中，所述皮肤美容产品为乳剂、霜剂、注射剂、或冻干粉。在一些实施方式中，所述皮肤美容产品为用于无针注射的注射剂。

在一些实施方式中，所述皮肤美容产品的施用给皮肤带来以下中的一种或多种改变：

使人皮肤成纤维细胞中I型原胶原蛋白的表达量提高至1.5-3倍；

使人毛囊真皮乳头细胞的生长迁移速度提高至2-3倍；或

所述皮肤美容产品通过无针注射到皮肤后深入皮肤真皮层并均匀分布。

附图说明

图1为性能表征4间充质干细胞或细胞球外泌体作用于人皮肤成纤维细胞后，成纤维细胞分泌的I型前胶原蛋白的含量。数据为平均值±标准误差，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图2为性能表征8毛囊干细胞或细胞球来源的外泌体作用于人毛囊真皮乳头细胞后，细胞的生长迁移速度。数据为平均值±标准误差，*P<0.05，****P<0.0001。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明。应当指出，这些代表性的实施例仅用于对本发明技术方案的解释与说明，本发明并非受限于这些具体的实施例。根据本发明的实质性内容，对所述实施例进行的任意组合、改变、修饰，均属于本发明要求保护的范围。

为了使本发明更加易于理解，本发明说明书中会阐述一些本发明所用术语的定义。

本发明所述外泌体可以采集自受试者的自体细胞或异体细胞。所述自体或异体细胞取自人体皮肤组织、毛囊、脂肪以及骨髓等，优选毛囊干细胞、脂肪来源干细胞和间充质干细胞。所述的“受试者”可以指动物、人类或者接受给药的细胞、组织。

为了避免随着细胞传代次数增加而出现的细胞衰老、生长缓慢及外泌体成分改变，本发明采用低代单层细胞培养和高代三维细胞球培养技术进行细胞的扩大培养。在三维细胞球培养中，细胞在超低吸附培养瓶中自聚集为细胞球，以三维细胞球状态培养一段时间后，可以增加细胞的活性，减少衰老表型，恢复细胞活性和分泌有效因子的能力。在一些实施方式在，毛囊乳突细胞在三维培养后可以有效提高细胞的功效和移植率。

在一些实施方式中，在多次传代培养后，将细胞传至超低吸附培养瓶中，进行三维细胞球培养。细胞球培养一段时间后，可重新传代至普通培养瓶中进行单层培养，也可直接收集条件培养基。

在一些实施方式中，取供体人耳后的皮肤，可分离出自体成纤维细胞；取头枕处少量毛囊组织，可分离出自体毛囊乳突细胞；取脂肪组织，可分离出自体脂肪干细胞；取骨髓或血液等，可分离出间充质干细胞。将细胞扩大培养，低代细胞可直接进行外泌体的收集；高代细胞传至超低吸附的培养瓶中得到细胞球，再进行外泌体的收集。所述的细胞取自自体或健康人体，可扩大生产，安全有效，且外泌体无排异现象。

在一些实施方式中，将细胞进行低代数细胞的贴壁扩大培养，至细胞融合率达90％以上后，通过条件培养基收集单层细胞外泌体。在一些实施方式中，将经多次传代后呈现衰老表型的细胞传代至超低吸附培养瓶中，培养成细胞球，通过条件培养基收集细胞球外泌体。

在一些实施方式中，所述条件培养基为使用不含血清配置的培养基。

在一些实施方式中，所述单层细胞(又称为二维细胞)外泌体或细胞球(又称为三维细胞球)外泌体的来源为细胞或细胞球的条件培养基。其制备过程如下：将单层细胞或细胞球换成无血清配制的培养基继续培养3-5天，收集上清。离心除去细胞以及碎片后，进一步离心浓缩，收集得到外泌体，磷酸盐缓冲液重悬，分装于-80℃保存。

在一些实施方式中，所述单层细胞外泌体或细胞球外泌体中均表达外泌体标志蛋白CD63，CD81和CD9。

基于上述方法获得的低代单层细胞和高代三维细胞球分泌的外泌体，本发明配合生物相容性载体，将其制备成多种形式的外泌体产品。在一些实施方式中，所述外泌体产品为皮肤美容产品。在一些实施方式中，所述皮肤美容产品可用于皮肤的凹陷或皱纹处，用于改善皮肤状态。在一些实施方式中，所述皮肤美容产品可用于头皮处，用于促进生发。

在一些实施方式中，所述外泌体在所述皮肤美容产品中的浓度为1-1000μg/ml。

在一些实施方式中，所述皮肤美容产品为用于局部注射、水光微针注射或无针注射的注射剂。微针注射和无针注射均可以直接输送外泌体至真皮层，从而大大提高外泌体的皮肤利用率和吸收率。根据本发明，无针注射方式可以有效将外泌体输送至皮肤真皮层，并保持其生物活性，相较注射器注射以及水光微针注射，能够更有效地调节皮肤和毛囊分泌生长因子和基质的能力，最大程度地实现改善肌肤和毛囊问题，达到更为持久的效果，并且无针注射最大程度地减少了皮肤组织的损伤，更为安全。

在一些实施方式中，所述皮肤美容产品为乳剂、霜剂、或冻干粉。在一些实施方式中，所述产品的形式为化妆水、乳液、面霜、精华和面膜等，可配合注射剂持续外用，从而大大延长注射后效果的持续时间。

本发明提供的外泌体组合物和皮肤美容产品中还包含药学上可接受的载体。能够掺入所述组合物或产品中的药学上可接受的载体包括药学上可接受的乳液成分、面霜成分、注射液或冻干保护剂。在一些实施方式中，所述载体为高浓度血小板血浆、角蛋白或透明质酸中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述的药学上可接受的载体包括辅料或冻干保护剂。辅料包括矿油、硬脂酸、棕榈酸、甘油硬脂酸酯、牛油果树果脂、肉豆蔻醇肉豆蔻酸酯、氢化聚癸烯、氢化聚异丁烯、三甲基硅烷氧基硅酸酯、聚二甲基硅氧烷、山嵛醇、辛酸/癸酸甘油三酯甘油、泛醇等适用于面霜的成分；也可为丁二醇、双丙甘醇、山梨糖醇、甘油、透明质酸钠、海藻糖、神经酰胺、氨基酸、山梨糖醇、甜菜碱、聚乙二醇-6等适于制作面膜的成分；还可以为透明质酸钠、壳聚糖、胶原蛋白或者生理盐水等制备成注射剂型；还可以为冻干保护剂，如海藻糖，甘露醇，葡聚糖，聚乙二醇，氨基酸等可直接用于皮肤的物质。

在一些实施方式中，所述皮肤美容产品的施用给皮肤带来以下中的一种或多种改变：

使人皮肤成纤维细胞中I型原胶原蛋白的表达量提高至1.5-3倍；

使人毛囊真皮乳头细胞的生长迁移速度提高至2-3倍；或

所述皮肤美容产品通过无针注射到皮肤后深入皮肤真皮层并均匀分布。

实施例1间充质干细胞的单层培养和细胞球培养

a.采样：取约100mL脂肪组织进行消化离心后，利用流式细胞术分选得到间充质干细胞(表达CD105，CD44；不表达CD45，CD34)。

b.低代数细胞的贴壁扩大培养和冻存。

c.细胞球的培养：细胞传至十代后，生长逐渐缓慢，将细胞传代至超低吸附培养瓶中培养成细胞球。

d.细胞球的扩增：培养一周后的干细胞球，可再次贴壁后扩大培养，或直接将培养基换成无血清培养基，进行外泌体的收集。

性能表征1：细胞形态

取实施例1制备的二维细胞和三维细胞球，显微镜下观察并记录其形态。结果显示，间充质干细胞呈梭状，形成细胞球后，结构致密，直径一般约为100-200微米。

性能表征2：外泌体的粒径分析

利用透射电子显微镜(TEM)观察外泌体的形貌和大小分布。电镜图显示外泌体为100纳米左右球形。

性能表征3：外泌体的鉴定

利用Western blot鉴定外泌体的特征蛋白。结果显示，外泌体表达CD63，CD81和CD9。

性能表征4：促进成纤维细胞分泌I型原胶原蛋白

将皮肤成纤维细胞铺在12孔板中，分别加入无血清培养基(对照组，1毫升)、单层细胞外泌体(5微克/毫升，1毫升)和细胞球外泌体(5微克/毫升，1毫升)培养24小时，用ELISA试剂盒测定每组细胞分泌的I型原胶原蛋白的含量。

如图1所示，三组细胞中I型原胶原蛋白的表达量平均值分别为对照组11912pg/ml，单层细胞外泌体组19450pg/ml，细胞球外泌体组23232pg/ml。上述结果显示，相对于对照组，单层细胞外泌体的施加使得皮肤成纤维细胞中I型原胶原蛋白的表达量提高至对照组的约1.63倍，细胞球外泌体的施加使得皮肤成纤维细胞中I型原胶原蛋白的表达量提高至对照组的约1.95倍。

实施例2毛囊干细胞的单层培养和细胞球培养

a.采样：取少许毛囊组织在显微镜下从毛囊中部切开消化后，放入培养皿中，待细胞从毛囊中爬出。利用流式细胞术分选得到毛囊干细胞(表达Lgr5，Lgr6)。

b.低代数细胞的贴壁扩大培养和冻存。

c.细胞球的培养：细胞传至十代后，生长逐渐缓慢，将细胞传代至超低吸附培养瓶中培养成细胞球。

d.细胞球的扩增：培养一周后的毛囊干细胞球，再次贴壁后扩大培养，或将培养基换成无血清培养基，进行外泌体的收集。

性能表征5：细胞形态

取实施例2制备的二维细胞和三维细胞球，显微镜下观察并记录其形态。结果显示，毛囊干细胞形貌舒展，贴壁良好，形成细胞球后，结构致密，直径一般约为100-200微米。

性能表征6：外泌体的粒径分析

利用透射电子显微镜(TEM)观察外泌体的形貌和大小分布。电镜图显示外泌体为80-150纳米的球形，分布均匀。

性能表征7：外泌体的鉴定

利用Western blot鉴定外泌体的特征蛋白。结果显示，外泌体表达CD63，CD81和CD9。

性能表征8：促进毛囊乳突细胞的迁移

将人毛囊真皮乳头细胞铺在12孔板中(每孔十万个细胞)，在细胞贴壁后，用枪头进行划痕，用磷酸盐缓冲液润洗三次，去除划落的细胞，然后将培养基换成无血清培养基(对照组，1毫升)、单层细胞外泌体(5微克/毫升，1毫升)和细胞球外泌体(5微克/毫升，1毫升)。于0、12和24小时分别拍摄划痕愈合程度。

结果如图2所示，12小时细胞划痕平均愈合程度分别为：对照组13％，单层细胞外泌体组29.4％，细胞球外泌体组37.2％；24小时细胞划痕愈合程度分别为：对照组20.4％，单层细胞外泌体组48.2％，细胞球外泌体组57.4％。

上述结果显示，24小时后，相对于对照组，单层细胞外泌体的施加使得毛囊真皮乳头细胞的生长速度提高至对照组的约2.36倍，细胞球外泌体的施加使得毛囊真皮乳头细胞的生长迁移速度提高至对照组的约2.81倍。

实施例3使用无针注射器注射外泌体制剂

由于外泌体为生物活性物质，为最大程度地保证其活性的发挥，本实施例采用无针注射器。将外泌体(100微克/毫升，使用DiR膜荧光探针标记外泌体的膜)溶于2％的透明质酸中混合均匀，置入无针注射器，在猪腹部皮肤进行局部注射，随后取下皮肤组织切片。在荧光显微镜下观察切片，发现染料标记的外泌体可以透过表皮，深入真皮层，主要分布在100-1000微米深度的皮肤。说明本发明提供的外泌体制剂可以通过无针注射方式被直接输送至皮肤真皮层并均匀分布，从而更加有效地发挥生物活性。

以上结合优选实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是，这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释，并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下，可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰，这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种外泌体组合物，其特征在于，包括外泌体和药学上可接受的载体。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述外泌体为单层细胞外泌体、细胞球外泌体、或二者的组合。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述外泌体来自成纤维细胞，毛囊乳突细胞，脂肪干细胞，胚胎干细胞，造血干细胞，脐带血干细胞，以及皮肤、脂肪、骨髓来源的间充质干细胞中的一者或多者。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述外泌体中含有外泌体标志蛋白CD63，CD81和CD9。

5.一种外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将成纤维细胞、毛囊乳突细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞、或者皮肤、脂肪、骨髓来源的间充质干细胞进行低代数细胞的贴壁扩大培养，至细胞融合率达90％以上后，收集单层细胞外泌体。

6.一种外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将经多次传代后呈现衰老表型的皮肤成纤维细胞、毛囊乳突细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞、或者皮肤、脂肪、骨髓来源的间充质干细胞传代至超低吸附培养瓶中，培养成细胞球，收集细胞球外泌体。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，通过以下方法收集单层细胞外泌体或细胞球外泌体：

将单层细胞或细胞球置于无血清的培养基中培养，收集上清液并除去细胞及其他杂质，得到单层细胞外泌体或细胞球外泌体。

8.一种外泌体在制备用于护肤或生发的皮肤美容产品中的用途，其特征在于，所述外泌体在所述皮肤美容产品中的浓度为1-1000μg/ml。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述皮肤美容产品为乳剂、霜剂、注射剂、或冻干粉。

10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述皮肤美容产品的施用给皮肤带来以下中的一种或多种改变：

使人皮肤成纤维细胞中I型原胶原蛋白的表达量提高至1.5-3倍；

使人毛囊真皮乳头细胞的生长速度提高至2-3倍；或

所述皮肤美容产品通过无针注射到皮肤后深入皮肤真皮层并均匀分布。