CN113018245A - 一种牛胎盘细胞外泌体冻干粉及其制备方法 - Google Patents
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本发明涉及护肤品技术领域，尤其涉及一种牛胎盘细胞外泌体冻干粉及其制备方法。本发明以甘露醇、海藻糖、甘氨酸、甘油、吐温、白蛋白和水组成的赋形剂结合本发明制备工艺，制备的牛胎盘细胞外泌体冻干粉具有良好的稳定性和生物学活性，在常温下的能够保存较长时间。实验表明，常温25℃保存6个月后牛胎盘细胞外泌体仍然保持良好的完整性和生物学活性，适用于牛胎盘细胞外泌体的长期保存、运输和应用。
Description
技术领域
本发明涉及护肤品技术领域，尤其涉及一种牛胎盘细胞外泌体冻干粉及其制备方法。
背景技术
动物胎盘其内含有多种生物活性物质如蛋白质、氨基酸、免疫调节肽、矿物元素、维生素及多种功能因子等，这些活性物质具有调节机体免疫、抗应激、抗氧化等功效,他们使用也有较长的时间和范围，例如牛、羊等动物胎盘制品已收录至《化妆品已使用原料目录》，有水解胎盘(牛)提取物(HYDROLYZED PLACENTAL PROTEIN)，动物胎盘蛋白(PLACENTALPROTEIN)等多种。
胎盘中富含各种类型的干细胞，其分泌的外泌体(exosome)，一种直径在30-150纳米的囊泡，包含有多种类型的核酸和蛋白，可以起到信号传导，免疫调节，营养物质传递的功能，近年来成为美容及科研领域的热点，国内外已应用到化妆品、医疗器械、医学美容、医药等多个领域。越来越多的研究表明，干细胞外泌体能够参与细胞结构的维持运动信息交流以及组织修复与再生，具有较好的抗光老化、抗氧化、抗皱、美白肌肤、伤口愈合、细胞修复等功效。外泌体的这些作用使得其在治疗心肌梗死，皮肤创伤等组织损伤中存在良好的应用前景，并且已经有较多深入的研究。
冻干粉是采用真空冷冻干燥法将物料除去水分后的粉末状固体。真空冷冻干燥法广泛应用于药物生产，主要工艺是在低温度下使物料完全冻结，活性物质与保护剂形成稳定的固体骨架，然后在高真空、温条件下使固态的冰晶直接升华，采用冷凝的方法捕捉升华的水汽，致使物质脱水干燥。冻干粉质地疏松多孔，定量准确，无污染，可避免活性物因高热而分解变质；加注射用水后能迅速恢复原来的特性；同时高真空的环境下活性物不易氧化，有利于产品长期贮存，是药物针剂常用剂型。
在化妆品行业，很多具有生物活性的植物来源或生物工程来源物质在化妆品体系中稳定性差，易降解变质，而真空冷冻干燥技术的广泛发展和普及很好的解决了这个问题，冻干粉类化妆品也应运而生。因为其高度的稳定性和运输、储存、使用的便捷性，随着真空冷冻干燥技术的普及和成本的降低，冻干粉现在已成为化妆品常用形式，通过添加不同活性物质起到不同的护肤功效。
基于动物胎盘的生物活性，多种动物胎盘提取物收录在中国化妆品原料目录和CFDA已使用化妆品原料名称目录。胎盘中分布有大量的间充质干细胞，具有很高的生长及分泌活性。大量临床前试验证明了干细胞分泌的外泌体的安全性，国际上外泌体主要应用于创新治疗皮肤损伤和化妆品，已有含有外泌体的面膜及外用凝胶药物上市。
外泌体转化应用，关键在于生产安全合格的规模化外泌体及其稳定保存。目前针对外泌体设计的冻干方法，虽能一定程度上保存外泌体的活性，但试剂的成份复杂，制备较繁琐，外泌体活性并不稳定，并不利于外泌体产品质量的控制。因此，亟需一种成分简单、能在常温下长期保存外泌体且不影响其活性的冻存保护试剂及方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种牛胎盘细胞外泌体冻干粉及其制备方法，该冻干粉具有良好的稳定性和生物学活性，在常温下的能够保存较长时间。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种牛胎盘细胞外泌体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
将牛胎盘细胞外泌体与赋形剂混合，得混合液：
将混合液预冻，制冷，抽真空，解析干燥；
所述赋形剂由甘露醇、海藻糖、甘氨酸、甘油、吐温、白蛋白和水组成。
一些实施方案中，所述牛胎盘细胞外泌体与赋形剂的体积比为1：1。
一些实施方案中，所述赋形剂由以下质量百分比的组分组成：
2.0％-10.0％甘露醇、0.1％-1.0％海藻糖、0.05％-1.0％甘氨酸、1.0％-5.0％甘油、0.01％-0.05％吐温、0.1％-0.5％白蛋白，其余为水。
一些具体实施例中，所述赋形剂由以下质量百分比的组分组成：
3.0％甘露醇、0.4％海藻糖、0.3％甘氨酸、2.0％甘油、0.02％吐温、0.2％白蛋白，其余为水。
一些具体实施例中，所述赋形剂由以下质量百分比的组分组成：
10.0％甘露醇、0.1％海藻糖、0.05％甘氨酸、5.0％甘油、0.01％吐温、0.1％白蛋白，其余为水。
一些具体实施例中，所述赋形剂由以下质量百分比的组分组成：
5.0％甘露醇、0.4％海藻糖、0.06％甘氨酸、4.0％甘油、0.02％吐温、0.2％白蛋白，其余为水。
一些实施方案中，预冻为：将混合液的温度降温至-40℃，保持190min。
一些实施方案中，制冷为将预冻后的混合液制冷，1min由-40℃降温至-50℃。
一些实施方案中，解析干燥包括一次解析干燥和二次解析干燥。
进一步地，一次解析干燥为：70min由-50℃升温至-15℃，保持5小时；60min由-15℃升温-10℃，保持5小时；60min由-10℃升温-5℃，保持5小时；60min由-5℃升温0℃，保持220min。
二次解析干燥为：40min由0℃升温至30℃，保持500min，控制真空度为0.19bar；30℃保持120min，控制真空度为0.0002bar。
经过二次解析干燥，尽可能去除残留水分。
本发明中，以上预冻、一次解析干燥和二次解析干燥均在冻干机中进行。在二次解析干燥结束后，启动冻干机的油压系统，进行压塞，压完塞之后，观察是否有跳塞的状况发生，如无异常，则破冻干箱体中的真空。
一些实施方案中，所述牛胎盘细胞外泌体由以下方法制备得到：
取牛胎盘匀浆，-80℃冷冻反复冻融2-3次；
匀浆液常温解冻后进行第一超声处理，过滤，滤液-80℃冷冻保存；
滤液常温解冻，离心，上清液进行第二超声处理，0.22um微孔滤膜过滤，获得牛胎盘细胞外泌体。
一些实施方案中，所述牛胎盘细胞外泌体由外泌体与PBS溶液组成。一些具体实施例中，牛胎盘细胞外泌体由以下方法制备得到：
取牛胎盘预处理后匀浆，-80℃冷冻反复冻融2-3次；
匀浆液常温解冻后进行第一超声处理30min，加PBS缓冲液充分搅拌后用滤网过滤，滤液-80℃冷冻保存；
滤液常温解冻，10000rpm高速离心30min，上清液进行第二超声处理30min，0.22um微孔滤膜过滤，获得牛胎盘细胞外泌体。
一些实施方案中所述匀浆为：用PBS缓冲液冲洗牛胎盘，切成小块，置于匀浆机中匀浆。
一些实施方案中，在匀浆之前还包括对牛胎盘进行预处理的步骤；其中，预处理具体为：将胎盘除去羊膜和脐带，反复冲洗至除净血液，控干水分。
一个具体实施例中，本发明对牛胎盘细胞外泌体冻干粉的功能进行了测试，形态鉴定结果显示，牛胎盘细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体大小均匀，外泌体结构成圆饼状，中间折光低，周围折光高。免疫印迹法检测到CD63和TSG101蛋白的表达。通过CCK8检测发现，外泌体具有明显促细胞增殖作用。以上结果表明，本发明牛胎盘细胞外泌体冻干粉制备方法适用于牛胎盘细胞外泌体的冻存，制得的牛胎盘细胞外泌体冻干粉能够保持良好的稳定性和生物学活性。
基于以上结果，本发明还提供了由以上制备方法制得的牛胎盘细胞外泌体冻干粉。
本发明还提供了所述的牛胎盘细胞外泌体冻干粉在制备抗衰老或修复的化妆品中的应用。
本发明以甘露醇、海藻糖、甘氨酸、甘油、吐温、白蛋白和水组成的赋形剂结合本发明制备工艺，制备的牛胎盘细胞外泌体冻干粉具有良好的稳定性和生物学活性，在常温下的能够保存较长时间，与现有的冻干方法具有明显的优势。实验表明，常温25℃保存6个月后牛胎盘细胞外泌体仍然保持良好的完整性和生物学活性，适用于牛胎盘细胞外泌体的长期保存和应用。
附图说明
图1示本发明外泌体冻干粉的制备工艺流程图；
图2示实施例2外泌体的冷冻干燥曲线图；
图3示实施例6中牛胎盘细胞外泌体的电镜图；
图4示实施例8中外泌体的Westernblot检测结果；
图5示实施例9中外泌体促细胞增殖活性的检测结果；
图6示实施例10中外泌体促细胞增殖活性的检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种牛胎盘细胞外泌体冻干粉及其制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1牛胎盘细胞外泌体提取物制备
(1)胎盘预处理：将新鲜胎盘除去羊膜和脐带，反复冲洗至除净血液，控干水分后直接使用或-80℃冷冻保存。
(2)胎盘组织匀浆：新鲜或解冻至室温的胎盘组织先用PBS缓冲液冲洗2次，处理为小块后放入组织匀浆机进行匀浆，匀浆完毕后，匀浆液应为均匀糊状。
(3)组织冻融及滤液收集：将匀浆后的糊状组织放入-80℃冰箱冷冻反复冻融2-3次。
(4)超声处理：常温化冻后将匀浆液进行超声处理30分钟，加PBS缓冲液充分搅拌后用滤网过滤，-80℃冰箱冷冻保存。
(5)滤液冻融及二次超声处理：滤液常温解冻后高速离心(10000rpm)30分钟，收集上清，超声处理30分钟。
(6)无菌过滤及胎盘提取物制备：将上述获得的滤液在洁净区中用0.22um微孔滤膜过滤，得到牛胎盘外泌体提取物原液(Exo-00)。
实施例2牛胎盘细胞外泌体冻干粉的制备
按照实施例1的方法获得牛胎盘细胞外泌体提取物，常温解冻，与赋形剂(3.0％甘露醇、0.4％海藻糖、0.3％甘氨酸、2.0％甘油、0.02％吐温、0.2％白蛋白，其余为水)按照1:1的体积比例混合，得混合液，将混合液在无菌环境中使用东富龙的冻干机按照表1的程序进行冷冻干燥(包括预冻，制冷，抽真空，一次升华、解析干燥)，冻干过程最高温度不得超过40℃，制得牛胎盘细胞外泌体冻干粉(Exo-01)。
制备工艺流程参照图1，具体步骤如下：
(1)灌装：将制备配料好的牛胎盘细胞外泌体混合液倒入灌装机的料桶中，开动灌装机前要对灌装的重量进行校准并做好记录，在灌装的过程中作好灌装过程中的监控记录，并且依次填写好监控过程的记录。
(2)预冻+抽真空：将灌装好以后的产品放置于冻干机的板层上，关闭好冻干机箱门；检查水压、电流、气压之后符合冻干机启动的条件，启动冻干机，在前箱将产品预冻到-40℃以下，控制真空0.19mbar；
(3)一次升华：产品预冻到-40℃之后，保温190min，然后关闭油温制冷，转向后箱制冷，将后箱的冷凝盘管制冷至-50℃，然打开中隔阀，开启真空泵以及真空控制程序，依次进行升温和保温，将冻干粉中的水份进行蒸发到冷凝盘管中进行捕水冷凝。
(4)二次升华解析干燥：一次干燥进行完毕之后，关闭冻干机的真空调节程序，进行二次解析干燥，将冻干粉中的残留水份继续抽干，此时冻干粉的瓶温不能超过32℃，保持工艺时间6h。
(5)压塞：二次解析干燥完成之后，启动冻干机的油压系统，进行压塞，压完塞之后，观察是否有跳塞的状况发生，如无异常，则破冻干箱体中的真空。
表1
实施例3牛胎盘细胞外泌体冻干粉的制备
按照实施例1的方法获得牛胎盘细胞外泌体提取物，常温解冻，与赋形剂(2.0％甘露醇、1.0％海藻糖、1.0％甘氨酸、1.0％甘油、0.05％吐温、0.5％白蛋白，其余为水)按照1:1的体积比例混合获得均匀的混合液，然后在无菌环境中使用冻干机按照表1的程序进行冷冻干燥制得牛胎盘细胞外泌体冻干粉(Exo-02)。
实施例4牛胎盘细胞外泌体冻干粉的制备
按照实施例1的方法获得牛胎盘细胞外泌体提取物，常温解冻，与赋形剂(10.0％甘露醇、0.1％海藻糖、0.05％甘氨酸、5.0％甘油、0.01％吐温、0.1％白蛋白，其余为水)按照1:1的体积比例混合获得均匀的混合液，然后在无菌环境中使用冻干机按照表1的程序进行冷冻干燥制得牛胎盘细胞外泌体冻干粉(Exo-03)。
实施例5牛胎盘细胞外泌体冻干粉的制备
按照实施例1的方法获得牛胎盘细胞外泌体提取物，常温解冻，与赋形剂(5.0％甘露醇、0.4％海藻糖、0.06％甘氨酸、4.0％甘油、0.02％吐温、0.2％白蛋白，其余为水)按照1:1的体积比例混合获得均匀的混合液，然后在无菌环境中使用冻干机按照表1的程序进行冷冻干燥制得牛胎盘细胞外泌体冻干粉(Exo-04)。
实施例6牛胎盘细胞外泌体的形态鉴定
将实施例2制得的牛胎盘细胞外泌体冻干粉重悬于500～1000uLPBS中，取10μL滴加于透射电镜铜网上沉淀1min，用滤纸吸去浮液，吸取醋酸双氧铀10μL滴加于透射电镜铜网上沉淀1min，用滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟后上机观察，结果见图3。
结果可见，本发明牛胎盘细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体直径在100nm左右；外泌体结构成圆饼状，中间折光低，周围折光高，结构完整，符合外泌体的经典结构。
实施例7外泌体浓度粒径NTA检测
使用纳米颗粒跟踪分析仪分析外泌体粒径大小与浓度，将实施例2～5获得的外泌体冻干粉使用1mL经0.22μm过滤的PBS溶解外泌体，密封置于冰上；选择一次性干净的样品池，对光使用无尘纸擦拭，确保光路上无颗粒附着外管壁，缓慢注入外泌体溶液避免气泡，可适度倾斜样品池，使用盖子将样品池封住；将样品池放入仪器，按照标准操作规程操作仪器检测，并保存数据，分析获得外泌体的粒径范围与浓度，结果见表2。
结果可知，本发明冻干粉复溶后获得的外泌体粒径较均匀(30-150nm)，粒子数较多。
表2
| 外泌体名称 | 平均粒径(nm) | 浓度(Particles/mL) |
| Exo-00 | 85.28 | 2.02E+10 |
| Exo-01 | 88.56 | 1.94E+10 |
| Exo-02 | 84.54 | 1.82E+10 |
| Exo-03 | 85.92 | 1.74E+10 |
| Exo-04 | 87.28 | 1.62E+10 |
实施例8外泌体的Western blot检测
将实施例2-5制备的冻干粉复溶后加入蛋白裂解液，冰上放置5～15min，期间震荡3-4次，每次30s。然后于4℃条件下，12,000rpm的转速离心5min，取上清转移置新的离心管中，进行Westernblot检测CD63、TSG101蛋白的表达情况，结果见图4。
结果显示，本发明实施例2-5制备的冻干粉复溶后的外泌体可检测CD63和TSG101蛋白的表达。
实施例9外泌体促细胞增殖实验
将实施例2制备的冻干粉复溶后利用CCK8法检测外泌体的活性，按照浓度梯度(0、25、50、100ug/ml)加入皮肤成纤维细胞培养基中，control为不添加外泌体冻干粉的对照，24小时后，加入CCK8试剂孵育2小时，然后使用酶标仪检测获得OD450计算细胞活力，结果见图5。
结果显示，外泌体具有明显的浓度依赖的促细胞增殖作用。
实施例10不同外泌体冻干粉工艺比较
分别将制备获得的胎盘外泌体使用不同的赋形剂和冻干工艺进行外泌体冻干粉制备，实验设置对照组：control(不添加外泌体冻干粉的对照)、对比例1～3，和实验组：实施例1～2。
对比例1：液体保存实施例1的牛胎盘外泌体(Exo-05)；
对比例2：按照申请号为201910553008.3的专利“一种外泌体冻干粉及其制备方法与应用”中实施例1的方法制备冻干粉(Exo-06)。
对比例3：按照申请号为201410705636.6的专利“一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法”中实施例2的方法制备冻干粉(Exo-07)。
实验组：实施例2的冻干粉(Exo-01)和实施例3(Exo-02)的冻干粉。
保存条件：常温25℃
将对比例1～3和实施例2～3制备的外泌体冻干粉(Exo-01、Exo-02)分别置于25℃保存6个月后复溶，进行外泌体鉴定(NTA纳米粒径，表3)，并使用皮肤成纤维细胞增殖模型检测其生物学活性(CCK8，图6)。其中，编号为Exo-01、Exo-02的外泌体冻干粉复溶后进行重新编号，分别为Exo-08、Exo-09。
结果显示，本发明实施例2～3的冻干粉复溶后(Exo-08、Exo-09)能够保持外泌体的完整性和生物学活性，效果明显优于对比例1～3。
表3
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种牛胎盘细胞外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将牛胎盘细胞外泌体与赋形剂混合，得混合液：
将混合液预冻，制冷，抽真空，解析干燥；
所述赋形剂由甘露醇、海藻糖、甘氨酸、甘油、吐温、白蛋白和水组成。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述赋形剂由以下质量百分比的组分组成：
2.0％-10.0％甘露醇、0.1％-1.0％海藻糖、0.05％-1.0％甘氨酸、1.0％-5.0％甘油、0.01％-0.05％吐温、0.1％-0.5％白蛋白，其余为水。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述牛胎盘细胞外泌体与赋形剂的体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述预冻为将混合液的温度降温至-40℃，保持190min；所述制冷为将预冻后的混合液制冷，1min由-40℃降温至-50℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述解析干燥包括一次解析干燥和二次解析干燥。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述一次解析干燥为：70min由-50℃升温至-15℃，保持5小时；60min由-15℃升温-10℃，保持5小时；60min由-10℃升温-5℃，保持5小时；60min由-5℃升温0℃，保持220min；
所述二次解析干燥为：40min由0℃升温至30℃，保持500min，控制真空度为0.19bar；30℃保持120min，控制真空度为0.0002bar。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述牛胎盘细胞外泌体由以下方法制备得到：
取健康牛胎盘组织匀浆，-80℃冷冻后反复冻融2-3次；
匀浆液常温解冻后进行第一超声处理，过滤，滤液-80℃冷冻保存；
滤液常温解冻，离心，上清液进行第二超声处理，0.22um微孔滤膜过滤，获得牛胎盘细胞外泌体。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述匀浆为：用PBS缓冲液冲洗牛胎盘，切成小块，置于匀浆机中匀浆；在所述匀浆之前还包括对牛胎盘进行预处理的步骤；所述预处理为：将胎盘除去羊膜和脐带，反复冲洗至除净血液，控干水分。
9.权利要求1～8任一项所述制备方法制得的牛胎盘细胞外泌体冻干粉。
10.如权利要求1～8中任一项所述制备方法制得的牛胎盘细胞外泌体冻干粉或权利要求9所述的牛胎盘细胞外泌体冻干粉在制备抗衰老或修复的化妆品中的应用。
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