CN114946830B

CN114946830B - 一种基于响应面优化的细胞外囊泡的储存液及其制备方法

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Publication number: CN114946830B
Application number: CN202210442823.4A
Authority: CN
Inventors: 杨双双; 陈四玉; 谭毅; 罗焕; 郭慧贞; 赵小惠
Original assignee: Qilu Cell Therapy Technology Co ltd; Yinfeng Biological Group Ltd
Current assignee: Qilu Cell Therapy Technology Co ltd; Yinfeng Biological Group Ltd
Priority date: 2022-04-26
Filing date: 2022-04-26
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2042-04-26
Also published as: CN114946830A

Abstract

本发明属于生物医药领域，提供了一种优化的外泌体储存液，包括pH为7.4的APOP缓冲液、海藻糖浓度为0.055 g/mL、甘露醇浓度为0.05 g/mL、HSA浓度为9.5 g/L。本发明的外泌体储存液不存在与外泌体粒径接近的颗粒物质，能够长期保持外泌体在低温下结构与功能的稳定性。

Description

一种基于响应面优化的细胞外囊泡的储存液及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种细胞外囊泡储存液的开发制备及功能检测。

背景技术

细胞外囊泡是指细胞主动分泌的具有膜结构的微小囊泡的统称，根据大小、生物特性和形成过程不同主要分为外泌体（exosome）、微囊泡（microvesicles）和凋亡小体（apoptotic bodies）三大类。外泌体是一类粒径约为30-150 nm的小细胞外囊泡，具有典型的脂质双分子层结构，存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中。外泌体携带蛋白质、脂类、RNA等多种物质，在细胞间的物质和信息传递中发挥重要作用，近几年外泌体在药物递送、疾病诊断及治疗领域都得到了广泛的关注。外泌体合理保存及稳定性研究是外泌体基础研究和临床应用前的关键环节，只有建立合理的储存流程、最大程度的保证外泌体产品的稳定性和活性，才能确保后续研究及应用的有效性和研究结果可信性。

目前关于外泌体的存储共识是，外泌体可在2-8℃稳定短暂保存；为了维持外泌体的结构完整性及生物活性，须保存在低温条件下，-20℃保存1个月左右，其活性会有显著改变；-80℃也只能保存3-6个月，并且不能反复冻融。外泌体稳定性低、容易失活，存储条件要求高，稳定保存时间短，这些缺点影响了外泌体的运输、存储以及应用。目前外泌体保存液种类通过添加牛血清白蛋白、甘油、二甲基亚砜（DMSO）和磷酸盐缓冲液（PBS）等维持外泌体稳定，已有结果显示牛血清白蛋白存在潜在的致病因子，并可能造成外泌体批间稳定性不一致，甘油和DMSO可能导致外泌体的完全或部分裂解，外泌体中即使存在少量的钙离子也易在PBS或其他含磷酸盐的缓冲液中形成纳米和微米级的磷酸钙聚集体，这可能会干扰基于单粒子检测的外泌体的量化。也有针对外泌体设计的冻干制剂方法，但需要专门的冻干设备、制备繁琐、成分复杂，不利于制剂质量控制，同时有效活性也没有最大化保留。

因此亟需一种成分安全且明确，能保持外泌体结构完整性、生物活性、内容物稳定性的外泌体储存液，建立一套外泌体稳定性评价体系，科学合理的评价储存液及存储条件对外泌体结构与功能稳定性的影响。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供一种基于响应面优化的细胞外囊泡的储存液及其制备方法，该方法基于响应面设计实验和建模，进行模型可靠性验证与检测，可靠性认可后得到最优实验条件。在上述最优实验条件下，制备得到外泌体储存，进行外泌体存储试验，建立一套外泌体稳定性评价体系，科学合理的评价储存液及存储条件对外泌体结构稳定性和功能稳定性的影响，最终得到成分安全且明确的外泌体储存液配方，能长期保持外泌体在低温下结构和功能的完整性和稳定性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种外泌体储存液，包括海藻糖0.055 g/mL、甘露醇0.05 g/mL、重组人血白蛋白（HSA）9.5g/L，pH7.4的缓冲液。

优选地，所述缓冲液为APOP缓冲液，包括5mM KCl、1mM MgCl₂、136mM NaCl。

本发明具有以下优点：

本发明所述的外泌体储存液中，不含动物源成分、不含与外泌体粒径接近的颗粒物质，安全性及一致性得到极大的保证。其中海藻糖的添加对外泌体具有较好的保护作用，在低温条件下海藻糖能在外泌体表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活；甘露醇是一种白色结晶性粉末，具有低温保护，从而利于维持外泌体在低温条件下的结构完整和生物活性；重组人血白蛋白的添加，增加了外泌体储存液体系中蛋白质浓度，防止蛋白酶对外泌体膜蛋白的水解；APOP缓冲液与外泌体自然状态下的pH值、渗透压一致，具有维持外泌体渗透压、控制酸碱平衡的作用，同时避免磷酸盐缓冲溶液易与样本中Ca²⁺离子、Mg²⁺离子等缔合生成沉淀，进一步保护外泌体结构的完整性以及内含物的稳定性。

本发明所述的外泌体存储稳定性评价中，包括结构稳定性检测，电镜进行外泌体形态检测、纳米颗粒跟踪分析（简称NTA）进行检测颗粒浓度检测；以及功能稳定性检测，以脐静脉内皮细胞细胞为研究对象，在细胞水平对外泌体被细胞摄取、促进细胞增殖和迁移等功能进行检测，是一套包括结构稳定性与功能稳定性，建立了完整且有效的外泌体存储稳定性评价体系。

附图说明

图1是响应面模型中预测值与实际试验值的对应关系图；

图2是响应面模型中绘出pH与海藻糖的三维响应面图；

图3是响应面模型中绘出pH与甘露醇的三维响应面图；

图4是响应面模型中绘出pH与HSA的三维响应面图；

图5是响应面模型中绘出海藻糖与甘露醇的三维响应面图；

图6是响应面模型中绘出海藻糖与HSA的三维响应面图；

图7是响应面模型中绘出甘露醇与HSA的三维响应面图；

图8是存储于不同外泌体储存液中外泌体电镜图；

图9是存储于不同外泌体储存液中外泌体Western blot检测图；

图10是存储于不同外泌体储存液中外泌体被细胞摄取结果图；

图11是存储于不同外泌体储存液中外泌体促进细胞增殖结果图；

图12是存储于不同外泌体储存液中外泌体促进细胞迁移结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 脐带间充质干细胞外泌体的分离与纯化

APOP缓冲液的配置：配置1M KCl母液，称取KCl 7.455 g，加入注射用水定容到100mL；配制1M MgCl₂母液，称取MgCl₂9.521g，加入注射用水定容到100 mL；配制1M NaCl母液，称取NaCl5.844 g，加入注射用水定容到100 mL，上述溶液0.22 μm滤膜过滤除菌备用。APOP 缓冲液配置：取0.5 mL1M KCl母液、0.1 mL 1M MgCl₂母液、13.6 mL 1M NaCl母液，加入注射用水定容到100mL，调pH7.4，于超高速离心管中120000 g离心4 h，去除APOP缓冲液中存在的与外泌体粒径接近的颗粒物质，收集上清液即为APOP缓冲液，用于后续实验中外泌体沉淀的重悬、稀释以及储存液的配置。

从细胞库中选取P3-P6的脐带间充质干细胞复苏，随后接种于细胞工厂中，置于温度为37℃、5%的CO₂培养箱内，无血清培养基中常规培养；定期观察细胞生长状态、进行微生物检测，细胞融合率达到80-90％左右，收集细胞培养上清夜，用于外泌体制备。上述上清液经0.22 μm孔径的滤膜过滤，随后进行浓缩。收集浓缩液4℃、3500 g离心30 min，以去除死细胞和体积较大的细胞碎片。随后转移上清液至超速离心管中，继续4℃、100000 g的离心力条件下离心70 min，初次提取外泌体；无菌APOP缓冲液溶解沉淀，4℃、100000 g的离心力条件下再次离心70 min，离心后弃上清，所得沉淀即为外泌体。

实施例2 外泌体冻存液成分筛选及配置

确定pH、海藻糖浓度、甘露醇浓度、HSA浓度作为影响外泌体稳定性的四个关键因素。根据响应面二阶设计方法，采用Design-expert12.0建立4因素4水平的Box-Benhnken模型进行优化试验，试验设计及实验结果见表1。根据实验结果，利用Design-Expert软件绘制外泌体保留率预测值与实际试验值的对应关系图（图1），数据点分布靠近在一条直线上，说明了模型拟合度好，其中细胞外囊泡保留率（Y）定义为存储后与存储前颗粒总数的比值。根据Box-Benhnken实验设计结果及上述回归方程绘出三维响应面图(图2、图3、图4、图5、图6、图7)。从表2可以看出，模型的F=8.26、P=0.0004<0.05，说明本实验所采取的二次模型是具有显著性的，对试验结果进行多元回归分析，得到各因素对外泌体保留率（Y）的二次多项回归模式方程：Y=75.6+ 1.38A+ 3.19B+ 1.53C+ 2.11D- 0.5525AB+ 2.41AC+ 0.0625AD+0.1125BC+ 2.00BD+ 0.3250CD- 4.72A²- 6.69B²- 5.13C²- 4.08D²，用Design-expert12.0软件选择逐步回归方法对二次多项式回归方程做进一步优化，最佳工艺条件为：pH为7.46、海藻糖浓度为0.055 g/mL、甘露醇浓度为0.05 g/mL、HSA浓度为9.527 g/L，预测外泌体保留率为76.27%。考虑到实际操作的局限性和应用性，将工艺条件修正为：pH为7.4、海藻糖浓度为0.055g/mL、甘露醇浓度为0.05g/mL、HSA浓度为9.5 g/L。

表1 外泌体储存液工艺条件响应面法试验设计及结果

表2 外泌体储存液工艺条件响应面回归方程的方差分析

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实施例3 外泌体储存液的配置

按照以下三种方法配置外泌体储存液，并对外泌体进行存储试验：

（1）本发明外泌体储存液配制：APOP 缓冲液的配置及缓冲液中颗粒去除方法同上，APOP 缓冲液（含5 mM KCl、1 mM MgCl₂、136 mM NaCl、pH7.4），按照上文中优化并修正的外泌体储存液的配方，用APOP缓冲液配置外泌体储存液，其中海藻糖浓度为0.055 g/mL、甘露醇浓度为0.05 g/mL、HSA浓度为9.5g/L、pH 7.4，0.22 μm滤膜过滤后，120000 g离心4h，去除上述存在储存液中与外泌体粒径接近的颗粒物质避免对后续检测结果的干扰，收集上清液制备得到本发明中外泌体储存液，命名为方法1储存液。

（2）按照以下公开的实施例中外泌体保存液的配方配置方法2储存液及方法3储存液，用于与方法1储存液效果比较：

按照CN111226902A公开的实施例1中外泌体保存液的配方，配制含1 g/L牛血清白蛋白、30 g/L海藻糖、50％（v/v）甘油、5％（v/v）二甲基亚砜和0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2的外泌体保存液；0.22 μm滤膜过滤后，滤液置于90℃加热20 min，形成胶体溶液，冷却；将制得的胶体溶液与外泌体进行1:1稀释，命名为方法2储存液。

按照CN112514892A公开的实施例1中外泌体保存液的配方，配制94.3重量份含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液，2.5重量份的葡萄糖，1重量份的CDLipid浓缩液，2重量份的人血清白蛋白（HSA）溶液，0.2重量份的聚乙烯醇；其中，所述含NaCl的Tris-HCL缓冲溶液中，Tris-HCl的摩尔浓度为25 mM，NaCl的摩尔浓度为137 mM，KCl的摩尔浓度为2.5 mM；所述含NaCl的Tris-HCl，缓冲溶液的pH值为7.4，混合，制得外泌体冻存保护液，命名为方法3储存液。

实施例4外泌体储存后的性能检测

1. NTA实验进行外泌体颗粒浓度检测

分别取上述三种外泌体储存液，对经过超离纯化的外泌体沉淀进行重悬，进行纳米颗粒跟踪分析（简称NTA）检测颗粒浓度，并稀释为1×10¹¹particles/mL，分别分装为1mL存储于-80℃条件下。在第0天、第1个月、第2个月、第4个月、第6个月取存储于上述3种外泌体储存液中的外泌体样本进行NTA检测，计算外泌体保留率，结果如表3所示，在方法1储存液中保存的外泌体在-80℃条件下存放6个月，外泌体的保留率高达78%。

表3 不同时间保存外泌体NTA检测

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2. 电镜实验进行外泌体形态检测

在第6个月取-80℃存储于上述3种外泌体储存液中的外泌体样本进行电镜实验（简称TEM），观察存储于三种外泌体储存液中外泌体的形态。由三组外泌体样本的电镜图（图8）所示，A为方法1储存液中外泌体电镜图，B为方法2储存液中外泌体电镜图，C为方法3储存液中外泌体电镜图，可以观察到在方法1储存液中保存的外泌体样本具有外泌体典型双层囊膜超微结构，为茶托型（也有描述为一侧凹陷的半球形），形态更好。

3. Western blot分子标志物检测

在第6个月取-80℃存储于上述3种外泌体储存液中的外泌体样本进行Westernblot实验，检测存储于上述三种外泌体储存液中外泌体样本中外泌体的标志蛋白（包括四跨膜蛋白家族，如CD9、CD63和CD81）表达情况。由三组外泌体样本的Western blot实验结果（图9）可以看出，在方法1储存液中保存的外泌体CD9、CD63和CD81的表达量最高。

4. 外泌体功能稳定性评价

研究表明脐带间充质干细胞外泌体可以被脐静脉内皮细胞（HUVEC）摄取，促进HUVEC细胞增殖和迁移，本发明以HUVEC细胞为研究对象，在细胞水平对分别在-80℃条件存储6个月存储于方法1和方法3两种外泌体储存液中的外泌体的功能与活性进行评估。

4.1 外泌体的细胞摄取实验

外泌体含有多种生长因子、细胞因子，并且几乎所有外泌体内都含有生理活性脂质成分。此外，外泌体还可以通过水平转移mRNA和miRNA至受体细胞，调节受体细胞的生理或病理状态。外泌体与靶细胞之间的识别以及相应的靶细胞对外泌体的摄取是细胞水平上研究外泌体功能的第一步也是必须的一步。分别取1 mL（经NTA检测初始颗粒浓度为1×10¹¹particles/mL）分别存储于方法1和方法3两种外泌体储存液于-80℃条件下存储6个月，对上述外泌体分别进行PKH26标记，用于HUVEC细胞的培养，分析外泌体被HUVEC细胞的摄取情况。

HUVEC细胞的培养：HUVEC细胞在37℃培养24 h待细胞贴壁后，更换含有PKH26荧光标记外泌体的相应培养基。细胞培养6h后，吸弃培养液，细胞用PBS清洗2次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤3次，每次10 min；1%Triton透化处理10 min，增加细胞通透性；然后PBS洗涤3次，每次10 min；加入1 mL 1%BSA，孵育20-30 min，降低染色背景；滴加适宜浓度的FITC-Phalloidin（FITC标记鬼笔环肽），对细胞骨架中的F-actin进行染色避光，室温孵育20 min；PBS洗涤3次，每次5 min；使用DAPI对细胞核进行复染；PBS洗涤3次，每次5 min；选择适合波长，在共聚焦显微镜下观察目的细胞对外泌体的摄取情况。结果如图10所示，A为方法3储存液中外泌体被HUVEC细胞摄取图，B为方法1储存液中外泌体被HUVEC细胞摄取图，可以明显的看出方法1储存液中保存的外泌体可以更好的被HUVEC细胞摄取。

4.2 外泌体对细胞增殖影响实验

细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其连有的炔烃基团在天然化合物中很少见，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中，基于Apollo®荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性，利用本发明以HUVEC细胞为研究对象，利用EdU增值检测的方法，对分别在-80 的条件存储6个月存储于方法1和方法3两种外泌体储存液中的外泌体的促进细胞增殖的活性进行评估。结果如图11所示，可以明显的看出方法1储存液中保存的外泌体可以更明显的促进HUVEC细胞增殖。

4.3 外泌体对细胞迁移影响实验

创伤愈合实验是一种简单、廉价的方法，也是最早发展起来的研究定向细胞在体外迁移的方法之一，该方法模拟了细胞在体内愈合过程中的迁移过程。本发明以HUVEC细胞为研究对象，利用划痕实验，对分别在-80℃条件存储6个月存储于方法1和方法3两种外泌体储存液中的外泌体的促进细胞增殖的活性进行评估。细胞接种与划痕：先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条线。6孔板中铺HUVEC细胞，原则是24h后可以铺满。第二天用200µL枪头比着直尺，与标记线垂直的方向划两条平行线，枪头要垂直，不能倾斜。PBS清洗细胞，将划下的细胞清洗下去。分别加入上述外泌体，37℃培养0h、6h、22h拍照分析。结果如图12所示，可以明显的看出方法1储存液中保存的外泌体可以更明显的促进HUVEC细胞迁移。

综上，相比于现有技术中的外泌体储存液，本发明的储存液对外泌体的结构与功能有很好的保护作用。

Claims

1.一种外泌体储存液，其特征在于，包括海藻糖0.055 g/mL、甘露醇0.05 g/mL、重组人血白蛋白9.5 g/L和pH 7.4的缓冲液；

所述缓冲液为APOP缓冲液，包括5mM KCl、1mM MgCl₂、136mM NaCl。