CN107893050A - 一种细胞外囊泡及其制备方法和用途 - Google Patents

一种细胞外囊泡及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞外囊泡及其制备方法和用途。其来自于吸脂产生的脂肪组织液和吸出的脂肪组织，包括微泡和外泌体。微泡和外泌体可特异性地递送物质至靶细胞或靶组织，从而改善了疾病的治疗和诊断，其在辅助脂肪组织等移植、在促进伤口、创面愈合、皮肤组织细胞等再生方面具有重要的治疗作用。

Description

一种细胞外囊泡及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种细胞外囊泡及其制备方法和用途。
背景技术
肌体的正常生理过程或病理过程是通过细胞与细胞之间的相互联系而发生。肌体组织细胞间的信号传递是通过细胞与细胞的直接接触或者旁分泌而进行。细胞外囊泡(extracellular vesicles,简称Evs)是近20年来发现的一种新的细胞间信号传递介质，这种囊泡是细胞在静息、缺氧和各种应急状态下释放出来的特异性的亚细胞结构群，肌体大部分细胞都具有释放EVS的功能。在细胞条件培养基和生物体的血液、关节液、脑脊液等多种体液中也可以分离出大量的EVS。
细胞外囊泡主要由微泡(microvesicles，MV)和外泌体(exosomes，EXO) 组成。微泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为 100nm-1000nm；细胞微泡(MV)是多种细胞释放在微环境中的质膜囊泡。外泌体(EXO)是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程形成并可分泌的直径为40-100nm的亚细胞双层膜囊泡。
细胞外囊泡内含有与正常细胞内相同的一些亚细胞器(如线粒体)和细胞内容物(RNA、microRNA、lncRNA、DNA、蛋白质及脂质等)，细胞微泡和外泌体不仅可以保护这些生物活性物质在细胞外环境中不被降解和稀释，也可以促进这些物质通过组织液或血液的远距离输送，同时微泡和外泌体膜上特异性的表面配体允许它与受体细胞高效率结合。细胞外囊泡在细胞间传递信息的生物活性和功能及其与各种疾病的发生机制和治疗具有重要的作用。外泌体和微泡保存在-80度即可。
脂肪抽吸和颗粒脂肪移植手术从上世纪80年代广泛兴起，越来越广受欢迎。将肥胖部位的脂肪吸除，然后将吸出的脂肪颗粒移植到需要美容整形的部位，起到体型雕塑、美容抗衰老的作用。在吸脂手术过程中，首先要在抽脂的部位注射麻醉肿胀液，使该部位的脂肪组织肿胀变硬、血管收缩，除了麻醉作用外，有利于脂肪抽吸和减少出血。在吸脂的过程中，除了吸出脂肪组织，还会吸出大量组织液包括注射进的麻醉肿胀液。无论是通过肿胀麻醉造成的局部脂肪组织的压力增高、缺血低氧，还是吸脂操作造成的脂肪组织的损伤，都会导致局部组织细胞释放细胞外囊泡到细胞外。吸出的颗粒脂肪组织可根据临床需要用于脂肪移植，吸出的脂肪组织液里可以分离提取干/祖细胞成分用于细胞辅助的脂肪移植，还可以分离提取血管基质碎片，用于移植。剩下的组织液全部废弃了。在这些废弃的组织液里，其实有大量的细胞外囊泡也被同时废弃。
发明内容
本发明人首次发现,吸脂手术产生的脂肪组织液中含有微泡和外泌体。通过过滤和超速离心从脂肪组织液中分离出微泡和外泌体。但迄今为止尚未见报道从吸脂手术产生的脂肪组织液和/或脂肪组织培养物中分离制备细胞外囊泡(微泡、外泌体)，并使用这些微泡、外泌体来辅助脂肪移植促进移植的脂肪组织的成活。此外，也可用于促进其他组织细胞的再生、促进伤口或创面的愈合、促进组织细胞的年轻化。
一种细胞外囊泡，其来自于吸脂产生的脂肪组织液和吸出的脂肪组织，包括微泡和外泌体。
所述脂肪组织液包含吸脂手术开始前注入到脂肪组织内的肿胀麻醉液和吸脂手术器械损伤和负压损伤所致的脂肪组织漏出液和血管漏出的血液；还包含在吸出的脂肪组织液内加的肝素；所述肿胀麻醉液为生理盐水、肾上腺素、利多卡因或碳酸氢钠。
所述脂肪组织是在肿胀麻醉液的肾上腺素缩血管作用和肿胀液的物理挤压作用后导致的缺血低氧情况下通过负压抽吸到无菌容器里的颗粒脂肪组织。
上述细胞外囊泡的制备方法，包括：向脂肪组织液、脂肪组织细胞、或经 SV40转入的永生化的脂肪组织细胞、或脂肪样干细胞经重编程转化成iPS细胞、或直接重编程转化成定向干细胞中，添加药物以获得含有所述药物的细胞悬浮液；并且从所述细胞悬浮液中分离负载药物的脱落的微泡和外泌体。
上述细胞外囊泡的制备方法，包括：向细胞或转化细胞中添加药物以获得含有所述药物的细胞悬浮液；并且从所述细胞悬浮液中分离微泡。
上述细胞外囊泡的制备方法，包括：从脂肪组织液、细胞或转化的细胞培养物中分离脱落的微泡和外泌体；并且将分离的微泡和外泌体悬浮液与药物一起培养。
所述分离的方法选自密度梯度、超速离心、过滤、透析、自由流电泳中的一种或一种以上。
上述细胞外囊泡的制备方法，包括：从微泡或者脱落的微泡悬浮液中分离负载药物的微泡或脱落的微泡。
一种药物组合物，包括负载用于治疗或诊断疾病药物的来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体。
所述治疗或诊断疾病的药物选自由抗炎剂、抗氧化剂、抗老化剂、促进细胞血管生长剂、抗肿瘤剂、肽类、蛋白质、核酸中的一种或一种以上。
本文所使用的术语“脂肪组织细胞”是指构成脂肪组织的细胞，主要包括脂肪细胞、脂肪干细胞样细胞、内皮祖细胞、血管平滑肌细胞/周细胞以及其他部分的血液来源细胞，包括粒细胞、单核细胞、淋巴细胞及造血干细胞等。如本文所使用的术语“来自脂肪组织细胞液的微泡和外外泌体”是包括体内阶段脂肪组织中的细胞在受到肿胀麻醉液的压力挤压、血管收缩、吸脂机械损伤、负压时细胞分泌的微泡和外泌体与脂肪组织细胞在体外阶段受到缺血缺氧性损伤分泌的微泡和外泌体，如同脂肪组织中的细胞在缺血低氧环境预处理后分泌的微泡和外泌体。本文所使用的术语“来自脂肪组织培养液的微泡和外泌体”是指吸出到体外的脂肪组织剪碎放入DMEM培养基(不含生长因子、血清等物质) 中在细胞培养箱中过夜，从该培养液中获取的微泡和外泌体。如本文所使用的术语“来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体”指的是亚细胞大小的囊泡，其内部和外部环境仅通过脂质双层膜分开，且其具有质膜脂质、质膜蛋白、核酸和蛋白等细胞组分。
可使用以下说明的非限制性的方法之一构建本发明的脱落的微泡和外泌体。(1)将吸脂产生的脂肪组织液，通过差速离心以得到脱落的微泡和外泌体。 (2)将吸脂产生的基质血管细胞碎片中的细胞成分进行分离，然后进行细胞培养，通过差速离心细胞培养物的上清液以得到脱落的微泡和外泌体。(3)从吸取的脂肪组织中分离脂肪干细胞进行细胞培养，通过差速离心细胞培养物的上清液以得到脱落的微泡和外泌体。(4)将脂肪干细胞通过重编程形成iPS细胞或直接重编程直接形成定向干细胞后进行细胞培养，通过差速离心细胞培养物的上清液以得到脱落的微泡和外泌体。(5)用药物处理吸取的脂肪组织液、脂肪组织细胞、培养的脂肪组织细胞或转化的脂肪干细胞，并过滤及差速离心组织液或细胞培养的上清液以得到脱落的微泡和外泌体。药物不赋予特别限制。可使用选自下组方法处理含有脂肪组织细胞的脂肪组织液和/或脂肪组织细胞的培养物上清液和/或脂肪干细胞培养上清液和/或脂肪干细胞转化的培养物上清液以构建本发明的人工微泡和外泌体，构建方法不限于此。在本发明的一个实施方式中，来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体还进一步包含来自脂肪组织细胞膜的组分以外的膜内组分。来自脂肪组织细胞膜以外的组分还包含靶向分子、膜融合靶细胞所必需的融合剂、聚乙二醇。此外，可使用各种方法，包括细胞膜的化学改性，添加来自细胞膜以外的组分。
例如，来自细胞的微泡的膜组分可用巯基(-SH)或胺基(-NH2)化学改性或通过化学方法将聚乙二醇结合至膜。根据本发明的来自细胞的微泡和外泌体的制备方法还进一步包括膜组分的化学改性。根据本发明的一个实施方式，药物组合物还进一步包含提高疾病治疗活性的药物。在这方面，所述药物可负载于微泡和外泌体。本发明中使用的药物含抑制Th17(辅助性T细胞17)免疫应答的药物、抑制白介素6(IL-6)的产生或活性的药物、提高或抑制血管内皮生长因子(VEGF)的产生或活性的药物、抑制细胞老化的β1-TGFR(β1- 转化生长因子受体阻滞剂)信号传导的药物、负载这种药物的纳米颗粒治疗剂及细胞治疗剂等。抑制Th17免疫应答的药物可以是阿司匹林，抑制β1-TGF 形成或活性药物可起到中断β1-TGF受体介导的信号传导的作用。负载药物的纳米颗粒可以是脂质体，诸如D0XIL。纳米颗粒治疗剂是大小为10nm至1μm的颗粒，且其例子包括，但不限于，脂质体、树枝状大分子、聚合物及微泡和外泌体。除了活性成分之外，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体，例如，生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体或其组合。如果需要，所述药物组合物还进一步包含典型的添加剂，诸如抗氧化剂、缓冲液等。此外，借助稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂和/或润滑剂，所述药物组合物可配制成注射剂，诸如水溶液、悬浮液、乳剂等、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。此外，可根据本领域众所周知的方法或Remington’Spharmaceutical Science(MackPublishingCompany，Easton PA)中公开的方法，所述药物组合物可配制成合适的剂型。不赋予药物组合物的制剂特殊限制。优选地，所述药物组合物可配制成注射剂或可吸入形式。不赋予本发明药物组合物的施用特殊限制。所述药物组合物可口服或胃肠外施用，诸如静脉内、皮下、腹腔内，经由吸入或局部地施用。在本发明药物组合物中活性成分的量可依据各种因素变化，所述因素包括患者体重、年龄、性别和健康情况、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、疾病严重程度等。术语“日剂量”是指本发明的治疗上有效成分的量，当施用于需要的受试者时其足够缓解病情。本发明药物组合物中活性成分的合适剂量取决于负载化合物的种类、疾病严重程度及需要治疗的受试者的情况，并可由本领域技术人员确定。本发明药物组合物的总有效量可以单剂量施用于患者，或通过分级的治疗方案施用，其中在更长时间内施用多剂量。根据另一方面，本发明涉及一种疾病的治疗方法，其包括需要受试者施用来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体。如本文所使用的术语“受试者”指的是需要治疗目的疾病 (如损伤、炎症性疾病、组织细胞老化、缺血性疾病、肿瘤等)。如本文所使用的术语“疾病”指的是一组不同疾病，其特征在于由于机械性、化学性、物理性、生物性等因素、缺血性、免疫性、老化等因素造成的组织细胞的损伤。根据本发明待处理的靶标可选自下组疾病中，但不限于此，该组由以下损伤疾病组成：皮肤外伤、肌肉韧带拉伤、皮肤切割伤、烧伤创面、糖尿病创面、放射性溃疡、周围神经损伤、心脑缺血性损伤、肝损伤，“炎症”包括由体液在组织中异常积累造成的水肿、由于血管扩张引起的充血、由热源及血管舒张增加的热量，及花生四烯酸代谢物导致的疼痛的综合症或症状。根据时间，炎症可分类为急性炎症、亚急性炎症和慢性炎症。根据病理生理条件，炎症可分为传染性炎症性疾病、过敏性炎症性疾病、自身免疫性炎症性疾病、毒性炎症性疾病、代谢性炎症性疾病和创伤性炎症性疾病。本发明方法中使用的脂肪组织细胞的微泡和外泌体如上所述，可使用负载增强治疗活性的药物的微泡和外泌体，微泡和外泌体可与增强治疗活性的药物，负载这种药物的纳米颗粒治疗剂以及细胞治疗剂组合施用于受试者。所述纳米颗粒治疗剂是大小为10nm至1μm的颗粒，且包括，但不限于，脂质体、树枝状大分子、聚合物和微泡、外泌体。如本文所使用的术语“负载”指的是，但不限于，在来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体的表面显示目的物质或将物质封装进微泡内的过程。此外，根据另一方面，本发明提供了一种用于疾病防治的来自脂肪组织细胞的微泡的制备方法。在本发明的制备方法中，来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体包括由细胞自发释放的脱落的微泡和外泌体，所述用于治疗的脱落的微泡和外泌体的制备方法包括以下步骤：将药物加至脂肪组织细胞或转化细胞的悬浮液中以得到含有药物的细胞悬浮液；并将负载药物的脱落的微泡和外泌体从细胞悬浮液中分离。所述用于治疗的脱落的微泡和外泌体的制备方法包括以下步骤：将脱落的微泡从脂肪组织细胞或转化细胞的培养物中分离；并培养带有药物的已分离的微泡和外泌体的悬浮液。该方法还进一步包括分离负载用于治疗的药物的脱落的微泡和外泌体。
根据本发明的用于治疗的脱落的微泡和外泌体的制备方法可进一步包括使用选自由抗生素处理、紫外线照射、Y射线照射和过滤组成的组中的方法灭菌脱落的微泡和外泌体。本发明的制备方法还进一步包括分离亚细胞大小的负载药物的微泡和外泌体。可使用选自下组的方法进行分离步骤，该组由密度梯度、超速离心、过滤、透析和自由流电泳等的方法组成。根据还一方面，本发明涉及一种包含负载治疗药物的来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体的药物组合物。根据还一方面，本发明涉及一种包含负载治疗药物的来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体的药物组合物，所述细胞被转化以靶向细胞。此外，本发明的又一方面涉及一种递送治疗药物至目的组织或目的细胞的方法，其包括使用负载药物的来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体，所述细胞被转化以靶向细胞或组织。根据又一方面，本发明涉及一种治疗的方法，其包括使用负载药物的来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体，所述细胞被转化以靶向细胞或组织。此外，根据还一方面，本发明涉及一种用于递送治疗的物质的组合物，其包含负载治疗物质的来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体。不赋予负载于来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体的物质以特定限制。例如，所述物质可以是治疗中使用的一种物质，或有细胞或转化细胞自身表达的蛋白质。如果需要，所述负载物质可以不来自细胞，而是外源物质。也就是说，治疗物质可以是至少一种来自脂肪组织细胞的物质或从细胞外导入的物质。此外，可使用，但不限于，物理、化学和/或生物方法将物质负载于微泡表面和外泌体。本发明的来自细胞的微泡和外泌体可以如下的各种方式负载各种治疗物质。首先，可由已负载目的治疗物质的脂肪组织细胞制备微泡和外泌体。例如，当在含有目的治疗物质的培养基中培养细胞时，细胞中可含有所述物质。可替换地，可通过电穿孔将物质导入细胞。
脱落的微泡和外泌体可在其构建或形成后负载目的物质。例如，可通过电穿孔使物质进入已制备的脱落的微泡和外泌体或人工微泡和外泌体中以完成负载。然而，本领域技术人员应该理解的是将目的物质负载于微泡和外泌体的方法不限制于上述方法。本发明中使用的治疗物质是抗炎剂、血管生成剂、老化抑制剂、抗肿瘤剂、肽类、蛋白质、核酸、小珠、微粒或纳米颗粒等，但本发明不限于此。核酸的实例包括DNA、RNA、核酸适体、LNA(锁核酸)、PNA(肽核酸)及吗啉寡聚核苷酸，但不限于此。纳米颗粒说明性、非限制性的实例包括氧化铁、金、碳纳米管和磁珠，但不限于此。治疗物质可以是荧光团，但不限于此。例如，荧光团可以使荧光蛋白或量子点(Qdot)。治疗物质可以是一种或多种治疗药物。本发明的微泡和外泌体可被引导至特定细胞或组织。特定组织可包括，但不限于，损伤组织、炎症组织、老化组织、缺血组织、肿瘤等。根据还一方面，本发明涉及一种递送治疗疾病的药物、负载所述药物的纳米颗粒治疗剂及细胞治疗剂的方法，其包括使用负载治疗药物的来自细胞的微泡和外泌体。根据另一方面，本发明涉及一种递送治疗的物质、负载治疗疾病的物质的纳米颗粒治疗剂及细胞治疗剂的方法，其包括使用负载治疗物质的来自细胞的微泡和外泌体，所述微泡和外泌体来自被转化以靶向目的细胞或组织的脂肪组织细胞。所述纳米颗粒治疗剂是大小为1nm至1μm的颗粒，且包括，但不限于，脂质体、树枝状分子、聚合物和微泡。借助本发明的微泡和外泌体，可递送治疗疾病的物质、负载治疗疾病的物质的纳米颗粒治疗剂及细胞治疗剂。两种或多种不同治疗物质可被递送至特定细胞或组织。例如，负载两种或多种不同治疗物质的微泡和外泌体可用于递送所述物质至特定细胞或组织。两种或多种不同微泡和外泌体可用于递送治疗物质，所述微泡和外泌体选自下组，该组由负载一种治疗物质的微泡和外泌体、负载两种或多种不同治疗物质的微泡和外泌体及其组合组成。例如，两种或多种不同微泡和外泌体可同时施用。可通过顺序地施用两种或多种不同微泡和外泌体，将两种或多种不同治疗物质递送至特定细胞或组织，所述微泡和外泌体选自下组，该组由负载一种治疗物质的微泡和外泌体、负载两种或多种不同治疗物质的微泡和外泌体及其组合组成。可顺序地施用负载一种或多种治疗物质的微泡和外泌体，负载一种或多种治疗物质的纳米颗粒治疗剂或细胞治疗剂。此外，根据另一方面，本发明涉及一种治疗疾病的方法，其包括将负载治疗疾病的药物的来自细胞的微泡和外泌体递送至靶细胞或组织。根据另一方面，本发明涉及一种治疗药物的递送系统，其包含负载治疗药物的来自细胞的微泡和外泌体。根据另一方面，本发明涉及一种用于诊断疾病的试剂盒，其包含负载诊断物质的来自细胞的微泡和外泌体。所述诊断物质可选自由引物、探针、反义核酸和抗体所组成的组。使用来自细胞的微泡和外泌体递送物质在本发明中，可采用来自靶向特定组织的细胞的微泡和外泌体或来自表达靶向蛋白的转化细胞的微泡和外泌体。此外，微泡和外泌体可来自表达融合剂的转化细胞。已知血细胞，就是说单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和血小板、髓源性抑制细胞及其在骨髓、血液和脂肪组织中发现的干细胞，被引导至靶组织。所以，来自免疫细胞、炎症细胞或干细胞膜的微泡和外泌体被引入靶向组织。此外，来自被转化的以表达与特定细胞或组织表达的底物选择性结合的蛋白质的细胞的微泡和外泌体可被引导至特定细胞或组织。在本发明中，负载治疗物质后，由这种细胞构建的微泡和外泌体可用于递送所述物质至靶细胞、组织或血液。存在参与引导免疫细胞、炎症细胞和干细胞至特定组织中的各种质膜蛋白。例如，包括整合素，诸如LFA-1(白细胞功能相关抗原-1)和Mac-1(巨噬细胞-1抗原)的细胞黏附分子存在于单核细胞表面。这些细胞黏附分子可与其他细胞黏附分子结合，诸如血管细胞上的ICAM-1(细胞间粘附分子-1)和VCAM-1(血管细胞黏附分子-1)。LFA-1和ICAM-1之间的相互作用允许单核细胞通过血管内皮细胞以使单核细胞被引导至炎症组织或靶组织。当被转化以表达来自细胞的微泡和外泌体的表面上特异于靶组织的质膜蛋白时，所述微泡和外泌体可被引导至特定组织。此外，如果细胞被转化以表达一种融合蛋白，在所述融合蛋白中识别靶组织中大量发现的抗原的抗体与细胞的跨膜蛋白相融合，来自细胞的微泡和外泌体可被引导至靶向组织。来自细胞的微泡和外泌体保留着与来源细胞几乎相同的膜组分，以使其朝着细胞靶向的特定组织或细胞。如果需要，在构建微泡和外泌体过程中，可使用核酸酶以从微泡中去除对于递送治疗物质或诊断物质不必要的核酸。来自细胞的微泡和外泌体可容易地负载各种需递送的治疗物质或诊断物质。所以，微泡和外泌体可以单独或组合用于治疗或诊断或同时治疗和诊断(治疗诊断、药物诊断)。在这方面，当需要递送的物质被封装时其存在于微泡和外泌体内，当所述物质至少部分包埋或嵌入其中(如同跨膜蛋白) 或存在于微泡和外泌体表面时，其存在于脂质双分子层内。
在本发明中，可由脂肪组织中所有种类的细胞构建微泡和外泌体，例如，可以通过转化以定向到靶标(诸如特定细胞或组织)的细胞。用于递送物质至特定组织，微泡和外泌体可以由定向特定组织的细胞构建。此外，当由其中定向特定组织的蛋白质被上调和/或参与非特异性导向的蛋白质被下调的细胞构建微泡和外泌体时，微泡可有效地用于递送治疗物质或诊断物质至靶组织。可使用本领域已知的典型方法完成细胞的转化，例如，通过刺激细胞或将外源基因导入细胞以改性，例如，上调或下调目的蛋白的表达。特定刺激可诱导目的蛋白表达的变化。导入外源基因可能诱导或抑制目的蛋白的表达。在这方面，使用电穿孔、显微注射、超声介导或本领域已知的其他方法将质粒DNA、RNA导入细胞。细胞被转化以表达能够在其表面单独或作为融合蛋白结合靶细胞组织的蛋白或抗体后，可由细胞构建微泡和外泌体。此外，可由表达治疗物质和/ 或诊断物质的细胞或被转化以表达治疗物质和/或诊断物质的细胞或被转化以表达治疗物质和/或诊断物质的细胞制备微泡和外泌体。此外，可由表达上述物质的组合的细胞或被转化以表达上述物质的组合的细胞制备微泡和外泌体。为了抑制特定蛋白的表达，可使用反义RNA、LNA、PNA等。当由特定两种靶向的细胞构建微泡和外泌体时，细胞可以这种方式转化，其中抑制一种或多种特定蛋白的表达以降低细胞至两种靶标之一的引导。所以，增强了递送用于来自转化细胞的微泡和外泌体的物质的特异性。本发明中使用的物质可包括，但不限于，细胞或转化细胞表达的物质或细胞不表达的外源物质。本发明中使用的治疗物质或诊断物质可负载于微泡和外泌体或根据需求和目的与微泡和外泌体组合施用。
治疗物质或诊断物质其本身或作为与纳米颗粒治疗剂或细胞治疗剂的复合物或与微泡和外泌体组合施用。所述纳米颗粒治疗剂是大小为10nm至1μm的颗粒，且其实例包括，但不限于，脂质体、树枝状大分子、聚合物和微泡及外泌体。作为负载于本发明的微泡和外泌体或纳米颗粒或细胞治疗剂的治疗物质或诊断物质，可无限制的使用各种来自有细胞核的哺乳动物细胞的物质，其包括蛋白质或肽类、核酸、脂质和代谢产物。本发明中使用的负载的蛋白质或肽类的实例包括，但不限于，生长因子，诸如VEGF，EGF等，细胞因子，诸如IL-1、 IFN-Y、IL-10等，抗体，受体和荧光蛋白。所述蛋白质或肽类可在细胞内表达或显露在质膜上。此外，其全部或活性位点可单独表达或作为融合蛋白表达。已知由于具有较高的局部浓度，蛋白质或肽类显露在微泡和外泌体上时蛋白质或肽类的活性高于其在细胞内单独存在时的活性。负载于微泡和外泌体的蛋白质或肽类可用作配体已触发信号传导或用作拮抗剂抑制各种配体的功能。根据本发明的负载于微泡和外泌体或纳米颗粒或细胞治疗剂的核酸实例包括DNA、 miRNA、siRNA、反义RNA和正义RNA，但不限于此。这些核酸可用于引发正义效应、反义效应、RNA干扰或抑制蛋白质功能。作为可负载于微泡和外泌体或纳米颗粒或细胞治疗剂的外源治疗物质或诊断物质，可无限制地使用抗炎剂、血管生成剂、抗肿瘤剂、肽类、蛋白质、核酸、小珠、微粒和纳米颗粒等。本发明的可负载于微泡和外泌体或纳米颗粒或细胞治疗剂的抗炎剂选自下组，该组由地塞米松、吲哚美辛、布洛芬、氯倍他索丙酸脂、醋酸双氟拉松、卤倍他索丙酸脂、安西奈德、醋酸氟轻松、双氯芬酸及吡罗昔康组成，但不限于此。根据本发明负载于微泡或纳米颗粒或细胞治疗剂的治疗物质或诊断物质可包括蛋白质或肽类。例如，可使用核糖核酸酶A，生长因子，诸如VEGF、EGF，细胞因子，诸如IL-U、IFN-Y和IL-10、抗体疗法、脱氧核糖核酸酶，及各种抑制炎症反应的蛋白质或肽类，但不限于此。
根据本发明可负载于微泡和外泌体或纳米颗粒或细胞治疗剂的核酸中典型的为DNA、miRNA、siRNA、反义RNA、正义RNA和核酸适体。此外，核酸类似物，诸如LNA、PNA和吗啉寡聚核苷酸可负载于微泡或纳米颗粒或细胞治疗剂，但不限于此。这些核酸可用于引发正义效应、反义效应、RNA干扰或抑制蛋白质功能。在本发明中，可将负载编码荧光蛋白的核酸或负载各种荧光的微泡和外泌体用于诊断。当设计为靶向特定细胞或组织的微泡和外泌体负载携带编码荧光蛋白的基因的质粒DNA并导入体内时，从荧光蛋白发射的荧光信号使得能识别靶细胞或组织的存在。此外，荧光量子点或其他各种荧光剂可负载于微泡和外泌体并用于检测体内特定的靶细胞和靶组织的位置。就是说，靶细胞或靶组织产生的荧光可用于诊断。另外，因为其诱导细胞凋亡，所以荧光发射的量子点可用于治疗疾病。除了荧光剂，可负载于微泡和外泌体的治疗物质或诊断物质还可举例为微粒或纳米粒子。实例包括氧化铁颗粒、金颗粒和碳纳米管，但不限此。磁珠可用作治疗物质或诊断物质并负载于微泡和外泌体。磁性粒子诸如氧化铁可用作MRI的图像对比剂。此外，也可使用与纳米颗粒结合的核酸或蛋白质。还可使用诊断性的放射性物质。
通过本发明的微泡可递送两种或多种不同物质。例如，同时负载两种或多种不同物质的微泡和外泌体可用于递送所述物质。可替换地，将组合使用单独或组合地负载不同物质的微泡和外泌体，以递送两种或多种不同物质。为了递送三种不同物质，例如，第一、第二和第三微泡和外泌体可分别负载三种不同物质。另一方面，同时负载两种不同物质的第四微泡和外泌体及负载另一种不同物质的第五微泡和外泌体可用于递送三种不同物质。第一、第二和第三微泡和外泌体可同时或顺序地使用。同样地，第四和第五微泡和外泌体可同时或顺序地使用。存在多种从其他分子或其他细胞组分中分离微泡和外泌体的方法，所述方法的例子包括密度梯度、超速离心、过滤、透析和自由流电泳，但不限于此。用于区分具有不同密度的材料的最流行的方法之一为密度梯度方法，可应用于分离本发明的微泡和外泌体，因为其密度与游离分子的密度不同。在密度梯度方法中，使用的介质可选自，但不限于聚蔗糖、聚乙二醇、甘油、蔗糖及OptiPrep。负载或未负载治疗物质或诊断物质的微泡和外泌体可利用其密度差异相互分离。密度梯度方法可与离心或电泳组合使用。微泡和外泌体还可通过凝胶过滤或超滤作用分离。可采用透析替代过滤去除小分子。另外，自由流电泳可用于分离本发明的微泡和外泌体。在本发明中，可构建其中部分膜组分改性的微泡和外泌体。例如，当由融合蛋白和细胞的混合物构建微泡和外泌体时，所述融合蛋白可至少部分地暴露于微泡和外泌体上。用聚乙二醇涂层微泡和外泌体可将微泡和外泌体转化为隐性微泡和外泌体。加入环糊精至微泡和外泌体可降低微泡和外泌体的非特异性靶向。当将同时显示亲水性和疏水性的环糊精附着于微泡和外泌体表面时，可用作阻断脂质之间的非特异性结合。微泡和外泌体可被化学改性。例如，从膜蛋白或跨膜蛋白至少部分地暴露于外面的细胞构建微泡和外泌体后，各种分子可在蛋白质的暴露区域或与半胱氨酸残基的巯基化学结合。此外，还可通过各种分子与膜蛋白内的胺基结合使微泡和外泌体的膜组分改性。根据另一方面，本发明提供了一种治疗疾病的方法，其包括向需要的受试者施用来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体的组分。本发明中使用的脂肪组织细胞可以是脂肪样干细胞、内皮祖细胞、血管平滑肌细胞/周细胞等，也可以是脂肪组织中来自血液的单核巨噬细胞系或淋巴细胞、造血干细胞等。但不限于此。微泡和外泌体的组分的实例包括蛋白质、核酸和脂质，但不限于此。作为来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体的组分之一存在的蛋白质，包括水溶性蛋白、脂溶性蛋白或膜蛋白，但不限于此。核酸可包括DNA和RNA，但不限于此。蛋白质可与至少一种物质结合，所述物质选自下组，但不限于，该组有细胞黏附分子、抗体、靶向蛋白、细胞膜融合蛋白及其融合蛋白所组成。根据另一方面，本发明涉及在治疗中与蛋白质重组的纳米颗粒治疗剂的用途，所述蛋白质是来自细胞的微泡和外泌体的组分。根据还一方面，本发明涉及在治疗中负载核酸的纳米颗粒治疗剂的用途，所述核酸是来自细胞的微泡和外泌体的组分。根据还一方面，本发明涉及在治疗中与脂质重组的纳米颗粒治疗剂的用途，所述脂质是来自细胞的微泡和外泌体的组分。根据又一方面，本发明涉及在治疗中负载或重组两种或多种来自细胞的微泡和外泌体的组分的纳米颗粒治疗剂的用途。所述纳米颗粒治疗剂是大小为10nm至1μm的颗粒，且其实例包括，但不限于，脂质体、树枝状大分子、聚合物和微泡及外泌体、在本发明的一个实施方式中，一种新物质可进一步用作来自细胞的微泡组分。这种新物质可包括环糊精和聚乙二醇。此外，可使用各种方法(包括化学改性)将这种新物质作为组分。纳米颗粒治疗剂还进一步包含增强治疗活性的药物。例如增强活性的药物可包括抑制Th17免疫应答的药物、抑制白介素6的产生或活性的药物、抑制beta-TGF受体介导的信号传导等。所述纳米颗粒治疗剂或细胞治疗剂是大小为10nm至1μm的颗粒，且其实例包括，但不限于，脂质体、树枝状大分子、聚合物和微泡及外泌体。将两种或多种不同组分同时施用，所述组分选自由微泡和外泌体的一种组分、微泡和外泌体的两种或多种不同组分及其组合所组成的组。将两种或多种不同组分顺序地施用，所述组分选自由微泡或外泌体的一种组分、微泡或外泌体的两种或多种不同组分及其组合所组成的组。
本发明的有益效果：根据本发明的来自吸脂产生的脂肪组织液和/或脂肪组织细胞的微泡和外泌体,可用于治疗组织细胞的损伤、炎症、老化、肿瘤等，促进移植组织的存活，促进组织细胞的再生、伤口和创面的愈合，减小异体组织移植的免疫反应等。一旦它们负载靶分子，来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体，无论脂肪组织细胞是否被转化，可靶向受损的细胞或组织。此外，当诸如抗损伤剂、抗炎剂、抗老化剂、抗肿瘤剂等药物负载于微泡和外泌体或封装于其中时，微泡可准确地递送药物并最大限度地提高药物的治疗效果，同时，不靶向非靶细胞，也不会引起副作用。此外，本发明的来自脂肪组织液和/或脂肪组织细胞的微泡和外泌体具有同时被用于治疗或诊断疾病的优势。特别地，来自转化到靶向目的组织或细胞的脂肪组织细胞的微泡，或显示分子靶向目的组织或目的细胞的或负载诸如荧光剂的外部可检测物质物质的来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体，可同时应用于疾病的诊断与治疗。另外，当本发明的来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体负载与治疗诊断疾病相关的物质时，其可用于治疗和诊断有关疾病。微泡和外泌体可特异性地递送物质至靶细胞或靶组织，从而改善了疾病的治疗和诊断。
本发明的来自脂肪组织细胞的微泡的另一个优势是脂肪间充质干细胞可在体外大量扩增或还可转变成iPS细胞而产生大量的微泡和外泌体，这些微泡和外泌体可以长期深低温保存而不失活性，也可将脂肪间充质干细胞或由其转化成的iPS细胞深低温保存，待需要时将其复苏以产生微泡和外泌体。此外，只要由细胞表达，任何靶分子、治疗物质或诊断物质可不经纯化负载于来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体上或负载于该微泡和外泌体中。负载物质可有效地发挥其固有功能。此外，根据本发明的负载治疗物质和/或诊断物质的来自脂肪组织细胞的微泡及其制备方法，可用于体外和体内治疗、诊断或实验。
附图说明
图1为提取的外泌体图。
图2为外泌体Western-blot鉴定结果。
图3为外泌体Western-blot鉴定检测条带图像分析图。
图4为外泌体电镜图。
图5为微泡Western-blot鉴定结果。
图6为微泡Western-blot鉴定检测条带图像分析图。
图7为移植外泌体后的小鼠体积变化图。
图8为移植外泌体后的小鼠体重变化图。
图9为移植外泌体后的小鼠免疫荧光检测图。
图10细胞外囊泡Western-blot鉴定检测条带图像分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1从吸脂术产生的脂肪组织液中提取细胞外囊泡----外泌体(EXO)
取材：取吸脂手术时，离心后弃置的脂肪组织液，可在-20℃保存。
提取外泌体：-20℃储存的脂肪组织液4℃过夜解冻。4℃6000g离心6min，弃去上层脂肪组织和底层沉淀，取中层水相液体。4℃12000g离心12min，弃去底层沉淀取上清液。0.44微米滤网过滤。4℃100000g高速离心1h，弃去上清液，加PBS冲洗。4℃100000g高速离心1h，弃去上清液，可见有半透明胶冻状沉淀(图1)，为外泌体。一般每250ml脂肪组织液离心得到外泌体可溶于 200μl的PBS溶液。充分吹打混合后可用于下一步的治疗处理。也可于-80度条件下储存，或直接冻于液氮中长期保存。
Western-blot鉴定：
一、溶液配制：
1.0mol/L Tris·HCl
1.74mg/ml(10mmol/L)PMSF
10％SDS
10％过硫酸胺(APS)
过硫酸胺 0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8)
0.5mol/L Tris·HCl(pH6.8)
Tris(MW121.14) 15.14g
超纯水 200ml
溶解后，浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
30％Acr/Bic
还原型5XSDS上样缓冲液
电泳液缓冲液
转移缓冲液
10X丽春红染液
TBS缓冲液、TBST缓冲液
封闭液:5％,3％
脱脂奶粉/BSA 5g/3g
TBST 100ml
二、实验方法:
2.1蛋白抽提
预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂(cocktail)；用移液器反复吹打，冰上静止20min，使其充分裂解，12000rpm(4度)离心15min。取上清，进行蛋白定量，根据定量结果进行样本制备。
2.2BCA法蛋白定量
按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明操作，测定蛋白浓度。
1、根据样品数量，试剂A：B＝50:1配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA 工作液室温24小时内稳定。
2、完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。
3、将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加至96孔板的标准品孔中，并用标准品稀释液补足20μl。
4、将待测样品滴加至样品孔中，用标准品稀释液补足20μl。
5、各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。
6、测定A570nm，绘制标准曲线图并计算蛋白浓度(蛋白浓度结果见excel 表格)。
2.3蛋白浓度调整
以RIPA调整蛋白浓度，样品终浓度为2ug/ul,加入5×蛋白样品缓冲液， 95度5min。
三、WB实验
3.1根据目的蛋白的分子量，配制10％分离胶，浓缩胶浓度为5％。
3.2待检测蛋白样品上样量：20ug/孔
3.3电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min；分离胶恒压120V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。
3.4湿转法，转膜条件：300mA恒流；0.45um孔径PVDF膜，转膜时间80min。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。
3.5封闭：将膜完全浸没于5％BSA-TBST中，水平摇床孵育1h(RT)。
3.6一抗孵育：5％BSA-TBST稀释一抗，4℃水平摇床孵育过夜。
膜编号 一抗名称 来源 稀释比例 稀释后体积
1 ALIX Rb 1：1000 3ml
2 CD9 Rb 1：2000 3ml
3 CD63 Rb 1：1000 3ml
4 TSG101 Rb 1：1000 3ml
5 GAPDH Rb 1：10000 3ml
3.7次日，洗膜：TBST洗3次，每次10min。
3.8二抗孵育：5％BSA-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1:10000，室温孵育60min。洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。
3.9ECL滴加到膜的蛋白面，反应3min；胶片曝光：10s-5min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2min，定影。
四、实验结果
1：检测条带见图2。
2：数据分析:图片扫描后，并使用软件为:Gel Image ststem ver.4.00 (Tanon,china)对图像进行灰度分析，结果见图3。
电镜鉴定：
1.离心后外泌体胶状物质加2％戊二醛固定1.5小时。
2.PBS冲洗2遍，1％饿酸4℃固定1.5小时。
3.PBS冲洗2遍，依次用50％、70％、90％乙醇4℃各脱水1次，每次10 分钟。
4.室温下100％乙醇脱水3次，每次10分钟。
5.室温下1：1 100％乙醇:环氧丙烷浸泡10分钟。
6.室温下环氧丙烷浸泡10分钟。
7.室温下1：1Epon812:环氧丙烷液体浸透，充分干燥。
8.Epon812包埋。
9.温度梯度聚合40℃2小时、60℃4小时、80℃l0小时。
10.超薄切片机切片。
11.铀染色15分钟，铅染色10分钟。
12.镜下观察(机器型号TEM-1400plus)，见图4。
实施例2：从吸脂术产生的脂肪组织液中提取细胞外囊泡----微泡(MV)
取材：取吸脂手术时，离心后弃置的脂肪组织液，可在-20℃保存。
提取微泡：-20℃储存的脂肪组织液4℃过夜解冻。4℃6000g离心6min，弃去上层脂肪组织和底层沉淀，取中层水相液体。4℃12000g离心12min，弃去底层沉淀取上清液。4℃100000g高速离心1h，弃去上清液，加PBS冲洗。4℃ 100000g高速离心1h，弃去上清液，沉淀为微泡。一般每250ml脂肪组织液离心得到微泡可溶于200μl的PBS溶液。充分吹打混合后可用于下一步的治疗处理。也可直接冻于液氮中长期保存。
Western-blot鉴定：
一、溶液配制：
1.0mol/L Tris·HCl
1.74mg/ml(10mmol/L)PMSF
10％SDS
10％过硫酸胺(APS)
过硫酸胺 0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8)
0.5mol/L Tris·HCl(pH6.8)
Tris(MW121.14) 15.14g
超纯水 200ml
溶解后，浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
30％Acr/Bic
还原型5XSDS上样缓冲液
电泳液缓冲液
转移缓冲液
10X丽春红染液
TBS缓冲液、TBST缓冲液
封闭液:5％,3％
脱脂奶粉/BSA 5g/3g
TBST 100ml
二、实验方法:
2.1蛋白抽提
预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂(cocktail)；用移液器反复吹打，冰上静止20min，使其充分裂解，12000rpm(4度)离心15min。取上清，进行蛋白定量，根据定量结果进行样本制备。
2.2BCA法蛋白定量
按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明操作，测定蛋白浓度。
1、根据样品数量，试剂A：B＝50:1配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA 工作液室温24小时内稳定。
2、完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。
3、将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加至96孔板的标准品孔中，并用标准品稀释液补足20μl。
4、将待测样品滴加至样品孔中，用标准品稀释液补足20μl。
5、各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。
6、测定A570nm，绘制标准曲线图并计算蛋白浓度(蛋白浓度结果见excel 表格)。
2.3蛋白浓度调整
以RIPA调整蛋白浓度，样品终浓度为2ug/ul,加入5×蛋白样品缓冲液，95度5min。
三、WB实验
3.1根据目的蛋白的分子量，配制10％分离胶，浓缩胶浓度为5％。
3.2待检测蛋白样品上样量：20ug/孔
3.3电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min；分离胶恒压120V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。
3.4湿转法，转膜条件：300mA恒流；0.45um孔径PVDF膜，转膜时间80min。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。
3.5封闭：将膜完全浸没于5％BSA-TBST中，水平摇床孵育1h(RT)。
3.6一抗孵育：5％BSA-TBST稀释一抗，4℃水平摇床孵育过夜。
膜编号 一抗名称 来源 稀释比例 稀释后体积
1 ALIX Rb 1：1000 3ml
2 CD9 Rb 1：2000 3ml
3 CD63 Rb 1：1000 3ml
4 TSG101 Rb 1：1000 3ml
5 GAPDH Rb 1：10000 3ml
3.7次日，洗膜：TBST洗3次，每次10min。
3.8二抗孵育：5％BSA-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1:10000，室温孵育60min。洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。
3.9ECL滴加到膜的蛋白面，反应3min；胶片曝光：10s-5min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2min，定影。
四、实验结果
1：检测条带见图5。
2：数据分析:图片扫描后，并使用软件为:Gel Image ststem ver.4.00 (Tanon,china)对图像进行灰度分析，结果见图6。
实施例3：细胞外囊泡----外泌体辅助脂肪组织移植
取材：取吸脂手术时，离心后弃置的脂肪组织液，可在-20℃保存。
提取外泌体及荧光标记：-20℃储存的脂肪组织液4℃过夜解冻。4℃6000g 离心6min，弃去上层脂肪组织和底层沉淀，取中层水相液体。4℃12000g离心 12min，弃去底层沉淀取上清液。0.44微米滤网过滤。4℃100000g高速离心 1h，弃去上清液，取200μl的PBS重悬沉淀。使用PKH67荧光标记，取100μlPBS 重悬液加0.5ml Diluent C混匀，另取4μl PKH 67加0.5ml Diluent C混匀，将上述两种混匀液混合，室温反应4ml，加入1ml 0.5％BSA终止染色。加入PBS 冲洗，4℃100000g高速离心1h，弃去上清液，沉淀为标记后外泌体。溶于200μl的PBS溶液。充分吹打混合后可用于下一步的治疗处理。也可直接冻于液氮中长期保存。
外泌体辅助脂肪组织移植：取临床上吸脂手术获得废弃脂肪组织。实验组每0.5ml脂肪加入100μl荧光标记外泌体PBS溶液混合。对照组加入等量PBS。使用注射器移植混合后脂肪组织于裸鼠背部皮下，每只移植0.5ml，移植前称重。
取材：于移植后第3天、1周、2周、3周和4周取材实验组和对照组小鼠背部脂肪移植物。称量重量和体积。体重及体积变化见图7和图8。取材的脂肪组织制备冰冻切片，用于后续免疫荧光检测。
免疫荧光检测：取上述取材后制备的冰冻切片。PBS洗涤2遍，每次5分钟。滴加10％FBS封闭血清，室温孵育1小时。倾去血清，直接滴加一抗，检测一抗包括CD31。滴加PBS者设为空白对照，只加二抗者设为二抗对照。放入湿盒，4度过夜。次日PBS漂洗3次，每次5分钟。加入荧光标记二抗，室温孵育30分钟。PBS漂洗3次，每次5分钟。操作中注意避光。滴加Mounting Medium with DAPI，封片。激光共聚焦显微镜观察：根据二抗设定荧光通道，DAPI选择405nm通道，Alexa Fluor 488选择488nm通道，CY3选择543nm通道，Alexa Fluor594选择594nm通道。先看空白对照和二抗对照，调整电压，后看样本，拍照保存，见图9。
实施例4：从脂肪组织培养基中提取细胞外囊泡----外泌体(EXO)
取材：取吸脂手术时，离心后弃置的脂肪组织。
提取外泌体：脂肪组织剪碎，每10ml脂肪组织加入40ml DMEM培养基，37℃细胞培养箱过夜。4℃6000g离心6min，弃去上层脂肪组织和底层沉淀，取中层水相液体。4℃12000g离心12min，弃去底层沉淀取上清液。4℃100000g 高速离心1h，弃去上清液，加PBS冲洗。0.44微米滤网过滤。4℃100000g高速离心1h，弃去上清液，沉淀为外泌体。一般每40ml脂肪组织离心得到外泌体可溶于200μl的PBS溶液。充分吹打混合后可用于下一步的治疗处理。也可直接冻于液氮中长期保存。
Western-blot鉴定：
一、溶液配制：
1.0mol/L Tris·HCl
1.74mg/ml(10mmol/L)PMSF
10％SDS
10％过硫酸胺(APS)
1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8)
0.5mol/L Tris·HCl(pH6.8)
Tris(MW121.14) 15.14g
超纯水 200ml
溶解后，浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
30％Acr/Bic
还原型5XSDS上样缓冲液
电泳液缓冲液
转移缓冲液
10X丽春红染液
TBS缓冲液、TBST缓冲液
封闭液:5％,3％
脱脂奶粉/BSA 5g/3g
TBST 100ml
二、实验方法:
2.1蛋白抽提
预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂(cocktail)；用移液器反复吹打，冰上静止20min，使其充分裂解，12000rpm(4度)离心15min。取上清，进行蛋白定量，根据定量结果进行样本制备。
2.2BCA法蛋白定量
按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明操作，测定蛋白浓度。
1、根据样品数量，试剂A：B＝50:1配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA 工作液室温24小时内稳定。
2、完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。
3、将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加至96孔板的标准品孔中，并用标准品稀释液补足20μl。
4、将待测样品滴加至样品孔中，用标准品稀释液补足20μl。
5、各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。
6、测定A570nm，绘制标准曲线图并计算蛋白浓度(蛋白浓度结果见excel 表格)。
2.3蛋白浓度调整
以RIPA调整蛋白浓度，样品终浓度为2ug/ul,加入5×蛋白样品缓冲液， 95度5min。
三、WB实验
3.1根据目的蛋白的分子量，配制10％分离胶，浓缩胶浓度为5％。
3.2待检测蛋白样品上样量：20ug/孔
3.3电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min；分离胶恒压120V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。
3.4湿转法，转膜条件：300mA恒流；0.45um孔径PVDF膜，转膜时间80min。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。
3.5封闭：将膜完全浸没于5％BSA-TBST中，水平摇床孵育1h(RT)。
3.6一抗孵育：5％BSA-TBST稀释一抗，4℃水平摇床孵育过夜。
膜编号 一抗名称 来源 稀释比例 稀释后体积
1 ALIX Rb 1：1000 3ml
2 CD9 Rb 1：2000 3ml
3 CD63 Rb 1：1000 3ml
4 TSG101 Rb 1：1000 3ml
5 GAPDH Rb 1：10000 3ml
3.7次日，洗膜：TBST洗3次，每次10min。
3.8二抗孵育：5％BSA-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1:10000，室温孵育60min。洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。
3.9ECL滴加到膜的蛋白面，反应3min；胶片曝光：10s-5min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2min，定影。
四、实验结果
检测条带见图10。
除了上述描述的差速离心法分离提取细胞外囊泡外，也可采用聚乙二醇沉淀富集细胞外囊泡的方法：将来自吸脂术产生的脂肪组织液或脂肪组织细胞培养基置于500转下离心五分钟，随后,再将其置于4℃条件中，2000转，离心三十分钟，以去除细胞碎片和大的凋亡小体。在4℃条件下，将经过离心的脂肪组织液或培养基添加到等体积的2倍聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)溶液中,以期获得一个理想的5％–15％的PEG最终浓度。将该样品反向完全混合，并于4℃过夜温育(至少12小时)。然后，在4℃条件下，使用台式离心机，以最大的速度，对上述样品进行离心1小时(埃普多夫,型号5810R，使用S-4- 104摇桶转子；3214转)。去除锥形管中的溶液，并且不时地轻拍锥形管以去除管中多余的PEG。将最终获得的囊泡用5％浓度的PGE进行PEG二次沉淀。最后，将所有的样品重悬于无颗粒的PBS中，并在室温下振动、摇匀30分钟。于-80 度下保存，或保存于液氮罐中。

Claims (10)

1.一种细胞外囊泡，其特征在于，其来自于吸脂产生的脂肪组织液和吸出的脂肪组织，包括微泡和外泌体。
2.根据权利要求1所述细胞外囊泡，其特征在于，所述脂肪组织液包含吸脂手术开始前注入到脂肪组织内的肿胀麻醉液和吸脂手术器械损伤和负压损伤所致的脂肪组织漏出液和血管漏出的血液；还包含在吸出的脂肪组织液内加的肝素；所述肿胀麻醉液为生理盐水、肾上腺素、利多卡因或碳酸氢钠。
3.根据权利要求1所述细胞外囊泡，其特征在于，所述脂肪组织是在肿胀麻醉液的肾上腺素缩血管作用和肿胀液的物理挤压作用后导致的缺血低氧情况下通过负压抽吸到无菌容器里的颗粒脂肪组织。
4.权利要求1所述细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括：向脂肪组织液、脂肪组织细胞、或经SV40转入的永生化的脂肪组织细胞、或脂肪样干细胞经重编程转化成iPS细胞、或直接重编程转化成定向干细胞中，添加药物以获得含有所述药物的细胞悬浮液；并且从所述细胞悬浮液中分离负载药物的脱落的微泡和外泌体。
5.权利要求1所述细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括：向细胞或转化细胞中添加药物以获得含有所述药物的细胞悬浮液；并且从所述细胞悬浮液中分离微泡。
6.权利要求1所述细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括：从脂肪组织液、细胞或转化的细胞培养物中分离脱落的微泡和外泌体；并且将分离的微泡和外泌体悬浮液与药物一起培养。
7.根据权利要求4至6中任一项所述细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述分离的方法选自密度梯度、超速离心、过滤、透析、自由流电泳中的一种或一种以上。
8.权利要求1所述细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括：从微泡或者脱落的微泡悬浮液中分离负载药物的微泡或脱落的微泡。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括负载用于治疗或诊断疾病药物的来自脂肪组织细胞的微泡和外泌体。
10.根据权利要求9所述药物组合物，其特征在于，所述治疗或诊断疾病的药物选自由抗炎剂、抗氧化剂、抗老化剂、促进细胞血管生长剂、抗肿瘤剂、肽类、蛋白质、核酸中的一种或一种以上。
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