CN110403959B

CN110403959B - 间充质干细胞外泌体制剂及其应用

Info

Publication number: CN110403959B
Application number: CN201910867109.8A
Authority: CN
Inventors: 杨瑞莉
Original assignee: Peking University School of Stomatology
Current assignee: Peking University School of Stomatology
Priority date: 2019-09-12
Filing date: 2019-09-12
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2039-09-12
Also published as: CN110403959A

Abstract

本发明提供了一种间充质干细胞外泌体制剂，其中，所述间充质干细胞外泌体制剂包括间充质干细胞来源的外泌体和药学上可接受的载体。本发明还提供了间充质干细胞外泌体或间充质干细胞外泌体制剂在制备用于治疗或预防骨质疏松症或者增加骨密度的药物、保健品或营养补充剂中的应用。

Description

间充质干细胞外泌体制剂及其应用

技术领域

本发明总体涉及生物医药领域，具体地涉及一种间充质干细胞外泌体制剂及其用途。

背景技术

骨质疏松症是由多种原因引起的一种全身性骨骼疾病，其以骨强度降低和骨折危险性增加为特征。随着人类寿命的不断延长，老龄化问题也日趋严峻，骨质疏松症及其引起的骨折风险严重威胁着中老年人的健康，日益成为全球关注的焦点问题。我国对骨质疏松症进行抽样流行病学研究的结果表明：在40岁以上人群中，骨质疏松症及低骨量的患病率女性分别为19.9％和32.4％，而男性分别为11.5％和45.8％。60岁以上人群的骨质疏松症及低骨量患病率：女性分别为28.6％和13.8％，男性分别为15％和12.7％。这些数据显示骨质疏松症在中老年人群的高发生率，因此预防和治疗骨质疏松症对于维持中老年人群的健康显得尤为重要。

我国目前是世界人口大国，亦是老年人口绝对数量最多的国家，只有及早采取且制定合理防治骨质疏松症的措施和方法，才能在全国范围内有效地防治骨质疏松症。目前，骨质疏松症的预防方法主要有加强运动和营养，其在一定程度上可以预防骨质疏松症的发生发展。骨质疏松症的治疗方法主要包括雌激素代替疗法、降钙素、选择性雌激素受体调节剂以及二磷酸盐疗法，这些药物可以阻止骨吸收但对骨形成的作用特别小。具体地，用于治疗和阻止骨质疏松症发展的药物可分为两大类，第一类为抑制骨吸收药，包括钙剂、维生素D及活性维生素D、降钙素、二磷酸盐、雌激素以及异黄酮等；第二类为促进骨形成药，包括氟化物、合成类固醇、甲状旁腺激素以及异黄酮等。其中激素治疗及二磷酸盐的治疗容易引起易发感染及骨坏死等多种并发症。因此，寻找一种新的、高效且不具有或具有极少不良副作用的治疗和预防骨质疏松症的药物迫在眉睫。

外泌体是多种细胞在正常及病理状态下均可分泌到细胞外的包含复杂RNA和蛋白质的小膜泡。研究发现，外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。另外，已有研究发现外泌体具有多种功能，例如其可参与到机体的免疫应答、细胞迁移、抗原提呈、细胞分化、肿瘤侵袭等生物过程中。

发明内容

本发明提供了一种间充质干细胞外泌体制剂及其应用，从而为骨质疏松症的防治提供一种新的途径。

一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防骨质疏松症的间充质干细胞外泌体制剂，其包括间充质干细胞来源的外泌体和药学上可接受的载体。

进一步地，所述外泌体制剂还包含乙酰水杨酸。

进一步地，所述外泌体和所述乙酰水杨酸的质量比为1:1至3:1。

进一步地，相对于所述外泌体制剂的总体积，所述外泌体制剂中的外泌体含量为500μg/ml至2500μg/ml，优选750μg/ml至1500μg/ml，最优选1000μg/ml。

进一步地，所述制剂包含100μg至500μg、优选150μg至300μg、最优选200μg的外泌体。

进一步地，所述外泌体的直径为40nm至250nm、优选地40nm至200nm。

进一步地，所述间充质干细胞选自骨髓间充质干细胞、口腔干细胞、脂肪来源的间充质细胞、人脐带血来源的间充质干细胞和人胚胎来源的间充质干细胞中的一种或多种。

进一步地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。

进一步地，所述骨质疏松症为原发性骨质疏松症或继发性骨质疏松症。

进一步地，所述外泌体制剂用于增加骨密度。

进一步地，所述外泌体制剂为注射剂、胶囊剂、片剂、粉末剂、软膏剂或喷雾剂等的形式。

进一步地，所述药学上可接受的载体包括磷酸盐缓冲液和/或生理盐水。

另一方面，本发明提供间充质干细胞外泌体制剂在制备用于治疗或预防骨质疏松症的药物、保健品或营养补充剂中的应用。

又一方面，本发明提供间充质干细胞外泌体制剂在制备用于增加骨密度的药物、保健品或营养补充剂中的应用。

本发明的有益效果包括：本发明的间充质干细胞外泌体制剂制备简单、材料来源广泛、且相较于微米级的细胞，外泌体囊泡的提取方法更为简单灵活且容易保存。通过施用间充质干细胞外泌体，显著地提高了骨密度，从而实现预防和治疗骨质疏松症的目的。另外，本发明的外泌体制剂不具有副作用或副作用小、且不会引起患者不适反应，因此能够有效地长期用于预防或治疗骨质疏松症。

附图说明

图1示出骨髓间充质干细胞的生长形态光镜图；

图2示出骨髓间充质干细胞外泌体的透射电镜图，其示出微囊泡样结构；

图3示出Western blot鉴定骨髓间充质干细胞外泌体的表面标志物的结果；

图4示出利用NaNoSight LM10显微镜系统鉴定的外泌体直径大小的分布；

图5A-5C示出不同浓度的外泌体处理对骨质疏松症治疗的效果图；和

图6A-6C示出外泌体和乙酰水杨酸组合处理对骨质疏松症治疗的效果图。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步阐述本发明。应理解，本发明的技术方案不限于以下所列举的具体实施方式，还包括各种具体实施方式的组合。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：骨髓间充质干细胞外泌体的制备

1、骨髓间充质干细胞的分离和培养

1)取6-8周龄小鼠股骨和胫骨，将表面附着的肌肉及筋膜等清除干净，并且用PBS冲洗；

2)将股骨和胫骨两端断开，用10ml注射器抽取含2％热灭活胎牛血清的PBS从干骺端反复冲洗骨髓腔，然后100μm细胞筛过滤，获得骨髓细胞；

3)将所得骨髓细胞离心(1500r/min)5min，然后用培养液重悬离心后所得的骨髓细胞，再将其接种于直径100mm的培养皿中，并置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，24小时后更换培养液；

4)当细胞达到70-80％融合时进行传代培养，用于间充质干细胞鉴定或后续的外泌体分离，其中骨髓间充质干细胞细胞生长状态如图1所示。

其中，所述培养液包括：含20％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、55μM巯基乙醇、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的α-MEM。

2、骨髓间充质干细胞的鉴定

(1)骨髓间充质干细胞表面标记分子的测定

利用荧光标记的抗体CD105、CD90、SCA1、CD34和CD45对上述获得的骨髓间充质干细胞进行染色30min，在用2％PFA固定后，利用流式细胞仪(BD Accuri C6)检测干细胞表面标记分子表达，其中骨髓间充质干细胞高表达CD105(93.39％)、CD90(72.44％)和SCA1(44.57％)，但几乎不表达造血干细胞表面标记分子CD34(0.05％)和CD45(0.01％)。

(2)细胞增殖的测定

将上述间充质干细接种于4孔细胞玻片(Nunc，1×10⁴/孔)上，在含5％CO₂、温度为37℃的培养箱中培养12小时。通过溴脱氧尿苷方法检测细胞增殖率。

在细胞培养物中加入溴脱氧尿苷(10μM)，继续培养12小时。移除培养液，PBS冲洗三次细胞培养物，然后以70％乙醇固定30分钟。移除固定液，蒸馏水冲洗两次，每次2分钟。加入变性液(1.5M HCl，100μl)孵育30分钟，移除变性液。PBS冲洗三次，每次2分钟。加入封闭液(5％BSA溶液，100μl)孵育10分钟。移除封闭液，加入生物素耦联的小鼠抗溴脱氧尿苷抗体孵育60分钟。移除抗体，PBS冲洗三次，每次2分钟。加入链霉亲和素耦联的过氧化酶孵育10分钟。移除过氧化物酶，加入DAB显色剂(100μl)显示阳性染色，苏木素(100μl)复染细胞核，显示间充质干细胞快速增殖。

(3)成骨分化检测

在成骨培养液(含1.8mM磷酸二氢钾，10nM地塞米松)中诱导间充质干细胞进行成骨分化。经过28天的成骨诱导，用茜素红对钙结节进行染色，用免疫印迹分析成骨标记物碱性磷酸酶(ALP和RUNX2)的表达。

(4)成脂分化检测

在成脂培养液(含0.5mM异丁甲基黄嘌呤、60μM吲哚米辛、0.50μM氢化可的松和100μg/ml胰岛素)中诱导间充质干细胞进行成脂分化。经过14天的成脂诱导，用油红O对脂滴进行染色，用半定量PCR分析成脂标记物LPL和PPAR的表达。

3、外泌体的分离和鉴定

(1)外泌体的分离

A.将骨髓间充质干细胞在无外泌体的培养基中扩增3天，收集培养基；

B.将收集到的细胞培养基在15℃以2000rpm离心30min去除培养基中的细胞碎片；

C.弃去沉淀，收集上清液；

D.对上清液进行系列超速离心以获得外泌体，具体地：1)300g离心10分钟，收集上清液；2)2,000g离心10分钟，收集上清液；3)10,000g离心10分钟，收集上清液；4)100,000g离心70分钟，收集沉淀；5)将沉淀用PBS重悬，100,000g离心70分钟，收集的沉淀部分即为分离的外泌体。

(2)外泌体的鉴定

通过透射电镜(FEI Tecnai Spirit 120kv)观察所分离的骨髓间充质干细胞，发现细胞内存在大量的微囊泡样的外泌体(见图2)。

用常规方法提取外泌体蛋白，通过Western blot检测外泌体中表面标志物CD9和CD81的表达(见图3)。

外泌体直径的测定：

1)由培养基分离得到的细胞外囊泡重悬于PBS中；

2)经不同比例的稀释，利用NanoSight LM10显微镜系统，记录细胞外囊泡的形态，并进行直径大小的测量。如图4所示，骨髓间充质干细胞分离得到的外泌体囊泡的尺寸集中在40-250nm范围内，特别地在200nm附近。

实施例2：骨髓间充质干细胞外泌体对骨质疏松症的作用

(1)小鼠模型：取6-8周龄的雌性小鼠C3H小鼠，体重20g左右，作为实验小鼠。通过卵巢去势法，构建小鼠骨质疏松症状模型。同时建立假手术(Sham)组作为对照，该组仅去除少许卵巢周围脂肪。实验小鼠均从北京维通利华购买。

(2)分组试验：建立小鼠骨质疏松症模型4周后，将小鼠随机分为四组：OVX组(仅0.9％NaCl处理)、Exo-100μg组(骨髓间充质干细胞外泌体100μg溶于200μl 0.9％NaCl中)、Exo-200μg组(骨髓间充质干细胞外泌200μg溶于200μl0.9％NaCl中)和Exo-500μg组(骨髓间充质干细胞外泌体500μg溶于200μl0.9％NaCl中)，每组6只小鼠。通过尾静脉分别向三组小鼠注射100μg、200μg和500μg骨髓间充质干细胞外泌体(200μl)进行治疗，OVX组用同样的方法仅注射200μl 0.9％NaCl溶液，注射四周后，观察结果。

结果表明：如图5A-5C所示，骨髓间充质干细胞外泌体治疗小鼠的骨密度(BMD)和骨体积分数(BV/TV)相较于OVX组均呈现增加趋势。其中Exo-200μg治疗组对小鼠骨密度和骨体积分数的提高效果显著优于Exo-100μg和Exo-500μg治疗组(P<0.05)。这表明施200μg外泌体的治疗效果要显著地优于施用100μg和500μg外泌体的治疗效果。

实施例3：骨髓间充质干细胞外泌体和乙酰水杨酸组合对骨质疏松症的作用

在实施例2的结果基础上，进一步探讨了外泌体与乙酰水杨酸联合治疗对骨质疏松症的影响。

根据实施例2中的操作步骤，对小鼠注射骨髓间充质干细胞和乙酰水杨酸(acetosalicylic acid，ASA)以进行联合治疗。其中，具体治疗分组如下：OVX组(仅200μl的0.9％NaCl处理)、ASA组(仅200μl的浓度为200μg/ml的ASA)、Exo组(200μl的浓度为1000μg/ml的骨髓间充质干细胞外泌体)和ASA+Exo组(200ul的1000μg/ml骨髓间充质干细胞外泌体+浓度为200μg/ml的ASA)，每组6只小鼠。通过尾静脉分别对小鼠进行如上处理，注射四周后，观察结果。结果表明，外泌体和乙酰水杨酸联合治疗组的骨密度图像以及骨密度和骨体积分数与假手术组(无骨质疏松症)几乎相同，且显著地优于OVX组、单纯地外泌体组或者单纯地乙酰水杨酸组治疗的效果。这充分说明外泌体和乙酰水杨酸组合对于骨质疏松症的治疗呈现出明显的协同作用，其显著提高外泌体对骨质疏松症治疗的效果(如图6A-6C所示)。

以上所述仅仅是本发明的优选实施方式。应当指出的是，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，本领域技术人员可对本发明的细节进行各种修改、变更或替换。这些修改、变更或替换也应理解为包括在本发明要求保护的范围之内。

Claims

1.一种用于治疗骨质疏松症的间充质干细胞外泌体制剂，由骨髓间充质干细胞来源的外泌体、药学上可接受的载体和乙酰水杨酸组成；

所述外泌体和所述乙酰水杨酸的质量比为1:1至3:1。

2.根据权利要求1所述的制剂，其中，相对于所述外泌体制剂的总体积，所述外泌体制剂中的外泌体含量为500μg/ml至2500μg/ml。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的制剂，其中，所述制剂包含100μg至500μg的外泌体。

4.根据权利要求1所述的制剂，其中，所述外泌体的直径为40nm至250nm。

5.根据权利要求1所述的制剂，其中，所述骨质疏松症为原发性骨质疏松症或继发性骨质疏松症。

6.根据权利要求1所述的制剂，其中，所述外泌体制剂为注射剂、胶囊剂、片剂、粉末剂、软膏剂或喷雾剂的形式。

7.根据权利要求1所述的制剂，其中，所述药学上可接受的载体包括磷酸盐缓冲液和/或生理盐水。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的制剂在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的应用。