CN105267240A - 间充质干细胞来源的外泌体的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及间充质干细胞来源的外泌体的用途,具体为:间充质干细胞来源的外泌体(exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的应用。所述的眼科疾病包括葡萄膜炎、视网膜脱离、视网膜变性、各种原因导致的视网膜损伤和炎症。实验证明,exosome具有神经营养以及免疫抑制作用,能减轻各种原因导致的视网膜损伤、减轻炎症反应,从而改善视网膜功能,为临床治疗眼科疾病开辟新途径。
Description
技术领域
本发明属于药物研发,细胞生物学、分子生物学领域。涉及间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)中活性成分外泌体(exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的应用。
背景技术
目前已知间充质干细胞(MSC)在治疗各种组织损伤以及免疫性疾病中发挥作用。我们也证明,MSC在包括视网膜缺血再灌注、糖尿病视网膜病变、葡萄膜视网膜炎、视网膜变性以及视网膜损伤等多种眼科疾病模型中具有治疗作用。MSC可以从数种成人组织(包括骨髓、脂肪组织、脐带血)分离,并离体扩充。然而,由于MSC细胞产品保存和运输困难,存在移植存活率低及长期临床应用可能存在致瘤隐患等不足使得其临床应用受到限制,因此,寻找一种操作简单、安全有效的基于MSC的非细胞疗法显得十分重要。
外泌体(exosome)是一种提取自细胞培养基上清的膜性囊泡,含有其来源细胞的胞膜和胞质蛋白成分,因此它较易与邻近细胞的胞膜发生融合,进而将一个细胞的胞膜及胞质蛋白传递给另一个细胞,在不同细胞间进行信息传递。此外,许多细胞包括MSC分泌的外泌体还包含着能够在细胞间进行转移的RNA(mRNA及microRNAs),通过在细胞间水平转移方式激活靶细胞产生一些列生物学效应。因此,外泌体在细胞微环境中具有十分重要的作用。
Bruno等研究发现MSC可分泌一种直径80nm-1μm大小的非可溶性微泡,它对急性肾损伤具有修复作用。这些从MSC上清中分离出来的微泡在体外能够促进肾小管上皮细胞的增殖及抗凋亡,将其标记后注射到急性肾损伤动物模型体内,可发现微泡在6h内即在肾损伤部位发生了聚集。2010年,新加坡学者发现MSC细胞分泌的exosome可以减少心脏再灌注损伤。MSC分泌的exosome直径约50-100nm,经免疫共沉淀后发现,exosome表达CD81、CD9、Alix等蛋白。他们将exosome注入小鼠心肌缺血/再灌注模型,发现可以减少梗塞面积。因此,MSC来源的exosome具有保护心脏的功能。脐带血来源的MSC分泌的exosome也用于缓解肝纤维化。研究表明,脐带血MSC-exosome可减少肝脏表面的纤维化,使之恢复较软的质地,缓解肝脏炎症。在CCL4诱导的肝纤维化模型中,可减少1、3型胶原沉积。这些研究表明,MSC可通过旁分泌外泌体在细胞间进行信息传递进而通过某种机制对受损组织进行修复,这一旁分泌机制为基于MSC的非细胞治疗奠定了重要基础。
本发明的目的是提供一种间充质干细胞来源的外泌体(exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的新用途,为临床治疗眼科疾病开辟新途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种间充质干细胞来源的外泌体(exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的应用。
本发明采用的技术方案为:
本发明提供了一种间充质干细胞来源的外泌体(exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的应用。
所述的间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞、人胎盘来源的间充质干细胞或人脂肪来源的间充质干细胞。优选地,所述的间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞或人胎盘来源的间充质干细胞。更优选地,所述的间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞。
所述的眼科疾病包括葡萄膜炎、视网膜脱离、视网膜变性、各种原因导致的视网膜损伤和炎症。
本发明提及的间充质干细胞来源的外泌体,具有如下特征:直径约为50-100nm,具有脂质膜,内包裹蛋白质和mRNA、microRNA等遗传物质。(2)经蛋白分析含有CD9、CD81、Alix等蛋白分子,以及与间充质干细胞标记物一致的蛋白分子CD44、CD29。
本发明提及的间充质干细胞来源的外泌体(exosome),由包括如下步骤的方法制备得到:
(1)间充质干细胞的分离培养:
根据间充质干细胞来源不同,采用不同的分离培养方式:
①人脐带间充质干细胞的分离培养:取无菌新生儿新鲜脐带,经磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗后,剪成直径约1-2mm的组织块;经2型胶原酶和胰酶消化依次后,将上清液离心,取细胞沉淀放入培养瓶,使用含10%胎牛血清DMEM/F12培养基,5%CO2、37℃饱和湿度培养;去除非贴壁细胞,在贴壁细胞80%融合后0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养;
②人胎盘间充质干细胞的分离培养:剪取胎盘绒毛膜面1-2cm厚的组织,剪成1-2mm的碎块,用磷酸盐缓冲液漂洗至无色,用DispaseII型酶和4型胶原酶37℃水浴消化1小时,振荡后静置,液体自然分为三层,吸取中间层悬液于离心管中,加入磷酸盐缓冲液混匀后离心,弃上清,取细胞沉淀放入培养瓶,使用含10%胎牛血清DMEM培养基,5%CO2、37℃饱和湿度培养;去除非贴壁细胞,在贴壁细胞80%融合后0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养;
③人脂肪间充质干细胞的分离培养:无菌吸取脂肪抽提液,用磷酸盐缓冲液冲洗数次。去除吸脂手术中所用药物及血细胞,用1型胶原酶37℃消化1小时,间或搅拌;离心后弃去上层脂肪,混匀,用200目筛网过滤,将所获得的细胞悬液离心,细胞沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤,用10%胎牛血清的α-MEM培养液悬浮,转移至培养瓶中,5%CO2、37℃饱和湿度培养;在贴壁细胞80%融合后0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养;
(2)间充质干细胞条件培养基的收集:取3-5代的间充质干细胞无血清培养48h;收集培养上清液;0.22μm无菌膜过滤得到间充质干细胞条件培养基;
(3)exosome分离纯化包括:收集过滤的间充质干细胞条件培养基4℃,1000g离心10min,收集上清;收集的上清液4℃,2000g离心20min,收集上清;收集的上清液4℃,10000g离心30min,收集上清;收集的上清液,110000g离心70min,弃上清,使用磷酸盐缓冲液重悬沉淀;再次110000g离心70min,弃上清,少量磷酸盐缓冲液重悬沉淀,0.22μm滤膜过滤除菌,得到间充质干细胞来源exosome。
将人脐带间充质干细胞来源的exosome用于治疗眼科疾病模型的效果评价:(1)视觉电生理检查;(2)临床观察及评分;(3)视网膜病理切片观察;(4)流式细胞术检测。
所述的眼科疾病模型包括:小鼠视网膜损伤模型、大鼠实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎模型、小鼠视网膜脱离模型。可模拟的眼科疾病包括:葡萄膜炎、视网膜脱离、视网膜变性以及其他各种原因导致的视网膜损伤和炎症。
利用人脐带间充质干细胞来源的exosome作为药物局部注射小鼠视网膜损伤模型、大鼠实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎模型、小鼠视网膜脱离模型,实验证明,exosome具有神经营养以及免疫抑制作用,能减轻各种原因导致的视网膜损伤、减轻炎症反应,从而改善视网膜功能,为临床治疗眼科疾病开辟新途径。
本发明所具有的有益效果:
本发明提供了间充质干细胞来源的外泌体(exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的应用。exosome具有神经营养以及免疫抑制作用,能减轻各种原因导致的视网膜损伤、减轻炎症反应,从而改善视网膜功能,为临床治疗眼科疾病开辟新途径。
附图说明
图1扫描电镜下观察exosome,可见exosome直径约为50~100nm,有完整的脂质膜,小体中心呈低电子密度成分,圆形或椭圆形的膜性囊泡结构(实施例1)。
图2HPLC-MS/MS检测exosome相关蛋白:3批样本中分别含有197、180、279种蛋白,其中三样本共同含有96种蛋白,包括CD9、CD81、Alix、CD44、CD29(实施例1)。
图3实施例2中治疗组与损伤对照组小鼠激光损伤后第1、3、7、14、21、40和60天ERG明暗适应a波与b波振幅。其中,A图:暗适应a波振幅(各时间点p值均<0.05)B图:暗适应b波振幅(各时间点p值均<0.05)C图:明适应a波振幅(第14、21和60天,p值<0.05)D图:明适应b波振幅(除第3天外,p值均<0.05)。
图4实施例2中激光损伤后第1、3、7、14天损伤对照组(A、B、C、D)与治疗组(E、F、G、H)视网膜组织学切片HE染色×20。第1天可见视网膜全层隆起,损伤部位组织增厚,结构紊乱。第3天可见外核层出现缺损区域,大量炎症细胞浸润。第7天可见内核层及色素上皮层细胞向外核层迁移。第14天可见激光斑形态趋于稳定。各个时间点,组织完整性治疗组均优于损伤对照组。
图5实施例2中激光斑参数测量结果的统计结果:激光斑直径(A)及外核层完全缺损区直径(B)治疗组与损伤对照组第3、7和14天均有统计学差异(p<0.05)。
图6实施例2中激光损伤后第1、3、7和14天治疗组和损伤对照组TUNEL染色结果×20。4个时间点治疗组凋亡细胞少于损伤对照组。
图7实施例2中激光斑周围凋亡细胞数统计结果:激光损伤后第1、3、7和14天治疗组与损伤对照组凋亡细胞数差异有统计学意义(p值均<0.05)。
图8实施例3中不同时间点exosome治疗组与对照组炎症反应临床评分比较结果。
图9实施例3中视网膜石蜡切片HE染色:其中A、对照组第15天,表现为炎性细胞浸润,光感受器层严重受损,各层均有不同程度的变性、不规整。B、治疗组第15天,视网膜不规整程度较轻。C、对照组第21天,炎性细胞减少,可见光感受器层破坏灶。D、治疗组第21天,网膜受损轻微,接近于正常。
图10实施例3中造模后第15及21天组织病理学评分,从图10可以看出,治疗组显著低于模型对照组。
图11实施例3中免疫组织化学染色法检测视网膜CD68的表达:A、对照组第15天,CD68大量阳性表达可见巨噬细胞侵润破坏视网膜全层。B、治疗组第15天,CD68在外核层少量阳性表达,视网膜结构损伤较轻。C、对照组第21天,CD68在光感受器层有少量阳性表达。D、治疗组第21天,CD68阳性表达较少,视网膜较完整。
图12实施例3中免疫组织化学染色法检测视网膜iNOS的表达:A、对照组第15天,可见视网膜各层尤其内核层iNOS高度表达。B、治疗组第15天,iNOS表达较少。C、对照组第21天,在光感受器层仍可见阳性表达,但较第15天颜色较浅。D、治疗组第21天,iNOS微量表达,网膜接近于正常。
图13实施例3中流式细胞仪检测对照组与exosome治疗组眼部CD4+T细胞亚群比例:CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞、IL-17+CD4+T细胞和Foxp3+CD4+T细胞在眼部细胞中的比例。治疗组CD4+T细胞浸润减少、IFN-γ+CD4+T细胞、IL-17+CD4+T细胞和Foxp3+CD4+T细胞比例减少。
图14实施例3中在免疫后第12天、第15天和第21天对各组大鼠进行视网膜视觉电生理检测,暗适应3.0a波与b波治疗组振幅明显高于对照组,差异有统计学意义(a波t=3.938、2.726、3.201,P<0.05,b波t=8.942、8.161、9.086,P<0.05)。明适应3.0a波在第15天和21天治疗组与对照组差异有统计学意义(t=5.426、2.463,P<0.05),明适应3.0b波在第15天治疗组与对照组差异有统计学意义(t=4.466,P<0.05)
图15实施例4中治疗组与损伤对照组小鼠视网膜脱离后第1、3、7、14和28天ERG暗适应a波与b波振幅。A图:暗适应0.01a波振幅(各时间点p值均<0.05)B图:暗适应0.01b波振幅(除第28天,其余各时间点p值均<0.05)C图:暗适应3.0a波振幅(除第3天,其余各时间点p值<0.05)D图:暗适应3.0b波振幅(各时间点p值均<0.05)。
图16实施例4中网脱损伤后第1、3、7、14、28天损伤对照组(A、C、E、G、I)与治疗组(B、D、F、H、J)视网膜组织学切片HE染色×20。第1天可见网膜全层组织无明显变化,RPE层显著脱离。第3天可见网脱处外核层水肿明显,少量炎症细胞浸润。第7天可见外核层细胞水肿减轻,但内核层细胞数量及层数明显变少。第14天可见RPE重新贴附于神经上皮层,炎症反应几乎消失,组织形态趋于稳定。第28天可见对照组外核层内核层细胞排列紊乱,治疗组各层细胞排列较为整齐,轻度水肿。各个时间点,组织完整性治疗组均优于损伤对照组。
图17实施例4中免疫组织化学染色GFAP:A,对照组第7天,GFAP阳性表达于视网膜各层,视网膜各层水肿程度较严重。B,治疗组第7天,GFAP阳性表达较对照组显著减少,各层视网膜结构破坏。C,对照组第14天,GFAP少量阳性表达于外核层,内核层。D,治疗组第14天,GFAP仅极少量表达于内核层,各层细胞结构稳定。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:
人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcell,hucMSC)来源的外泌体(exosome)的分离纯化和鉴定
1.人脐带间充质干细胞来源的外泌体的分离纯化方法,包括如下步骤:
(1)人脐带间充质干细胞的分离培养:取无菌新生儿新鲜脐带,经磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗后,剪成直径约1-2mm的组织块;经2型胶原酶和胰酶消化依次后,将上清液离心,取细胞沉淀放入培养瓶,使用含10%胎牛血清DMEM/F12培养基,5%CO2、37℃饱和湿度培养;去除非贴壁细胞,在贴壁细胞80%融合后0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养;
(2)间充质干细胞条件培养基的收集:取3-5代的间充质干细胞无血清培养48h;收集培养上清液;0.22μm无菌膜过滤得到间充质干细胞条件培养基;
(3)exosome分离纯化包括:收集过滤的间充质干细胞条件培养基4℃,1000g离心10min,收集上清;收集的上清液4℃,2000g离心20min,收集上清;收集的上清液4℃,10000g离心30min,收集上清;收集的上清液,110000g离心70min,弃上清,使用磷酸盐缓冲液重悬沉淀;再次110000g离心70min,弃上清,少量磷酸盐缓冲液重悬沉淀,0.22μm滤膜过滤除菌,得到人脐带间充质干细胞来源的外泌体(hucMSC-exosome)。
2.hucMSC-exosome的鉴定
(1)扫描电镜观察exosome的一般形态:取悬置均匀的exosome溶液,样品经脱水、干燥、粘样、导电处理,在扫描电镜下观察微粒形态,并拍摄电镜照片,随机选取20个exosome,根据标尺记录其直径。扫描电镜下观察,可见exosome直径约为50~100nm,有完整的脂质膜,小体中心呈低电子密度成分,圆形或椭圆形的膜性囊泡结构(图1)。
(2)HPLC-MS/MS检测exosome相关蛋白:取3批样本,采用高效液相色谱和质谱联用分析exosome中含有的蛋白。经过对3批样本的分析,各样本中分别含有197、180、279种蛋白,其中三样本共同含有96种蛋白,包括CD9、CD81、Alix等hucMSC-exosome特征性蛋白分子,以及与人脐带来源间充质干细胞标记物一致的蛋白分子CD44、CD29(图2)。
实施例2:hucMSC-exosome对小鼠视网膜损伤模型的疗效观察
(1)模型建立:6~8周龄SPF级健康雌性C57BL/6小鼠(体重15~18g)经检查确认屈光间质清、眼底无异常后纳入实验。饲养方法遵照视觉与眼科学研究协会关于眼科和视觉研究饲养和使用动物标准。随机将小鼠分为正常组、治疗组和损伤对照组。正常组小鼠不做任何处理。治疗组与损伤对照组小鼠以500mg/kg剂量腹腔注射5%水合氯醛麻醉,右眼用复方托吡卡胺散瞳后,采用多波长氪离子激光机NOVUSOMNI(美国Coherent公司)进行激光光凝,激光参数如下:波长647nm,输出功率100mW,曝光时间100ms。每只小鼠右眼造成20个激光斑,每个激光斑距视盘两个视盘直径以上,相互之间距离至少一个激光斑直径,且避开眼底大血管。
(2)治疗方法及分组:损伤后,治疗组与损伤对照组小鼠右眼分别玻璃体腔内注射5μl(0.5mg/ml)hucMSC-exosome及5μlPBS。
(3)评价方法:在激光损伤后第0、2、6、13、20、39和59天,取治疗组和损伤对照组小鼠各6只放于暗室中过夜,分别于第二天,对其分别进行ERG检测。①暗适应ERG:在暗室中微弱暗红光下,5%水合氯醛腹腔注射麻醉,右眼用复方托吡卡胺滴眼液散瞳,0.4%盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉,1%羧甲基纤维素钠滴眼液保护角膜。将小鼠俯卧放置于实验台上,银丝环形正电极置于右眼前接触角膜,针状负电极置于两眼之间的枕后皮下,针状接地电极置于小鼠尾部皮下。光刺激器提供闪光,参数如下:白光,闪光时间2.92ms,闪光强度3.0cd*s/m2,闪光间隔10s,重复测量5次。②明适应ERG:在背景光强度30cd/m2下进行明适应5分钟。光刺激器提供闪光,参数与暗适应ERG相同。测量a波、b波振幅。
在造模后的第1、3、7和14天,随机选取正常组小鼠1只,治疗组和损伤对照组小鼠各10只,断颈法处死并摘取右侧眼球,10%福尔马林固定,常规脱水,石蜡包埋。应用组织切片机经视乳头矢状径连续切3μm厚切片进行常规苏木精-伊红(HE)染色。光镜下观察组织结构并拍照,测量治疗组和损伤对照组小鼠视网膜激光斑直径及外核层缺损直径。
未经HE染色的石蜡切片经热修复、脱水及破膜处理,PBS洗2遍后干燥样本周围区域,根据原位细胞凋亡检测试剂盒说明书的步骤进行凋亡细胞染色,孵育、清洗、干燥后,DAPI复染并封片。立即在荧光显微镜下观察并进行凋亡细胞计数。
(4)治疗组与损伤对照组小鼠ERG暗适应和明适应a波、b波振幅见图3。暗适应a波振幅在7个时间点两组间均有统计学差异(t1=6.865,t2=5.963,t3=2.413,t4=3.794,t5=2.999,t6=2.475,t7=4.786,p值均<0.05);暗适应b波振幅在7个时间点均有统计学差异(t1=3.233,t2=4.019,t3=11.361,t4=6.390,t5=3.612,t6=2.782,t7=2.421,p值均<0.05);明适应a波振幅两组间在损伤后第14、21和60天有统计学差异(t1=5.711,t2=2.327,t3=2.786,p<0.05),第1、3、7和40天两组间a波振幅差异无统计学意义(t1=1.422,p1=0.181;t2=0.472,p2=0.646;t3=1.772,p3=0.103;t4=2.007,p4=0.069);明适应b波振幅两组间差异除第3天(t1=1.753,p1=0.107)外均有统计学意义(t1=3.005,t2=5.238,t3=4.742,t4=5.407,t5=4.029,t6=3.365,p值均<0.05)。
激光损伤后第1天,光学显微镜下观察视网膜病理切片,可见视网膜全层组织隆起,色素上皮层细胞排列紊乱,神经上皮层轻度水肿,组织紊乱程度损伤对照组为重(图4A、4E)。第3天可见外核层损伤处变薄,由于细胞核消失,出现外核层组织缺损区,也可见炎症区域内炎症细胞浸润(图4B、4F)。第7天可见外核层缺损区域直径变大,色素上皮层及内核层细胞向外核层迁移填补缺损区,治疗组细胞迁移数量少于损伤对照组(图4C、4G)。第14天可见外核层缺损区几乎被内核层与色素上皮层细胞填补,炎症反应几乎消失,组织形态趋于稳定(图4D、4H)。激光斑直径治疗组与损伤对照组第1天无统计学差异(t1=1.913,p=0.071),第3、7和14天均有统计学差异(t2=4.697,t3=10.331,t4=5.379,p值均<0.05)(图5A);外核层完全缺损区直径治疗组与损伤对照组相比,第3、7和14天均有统计学差异(t1=4.176,t2=7.841,t3=6.440,p值均<0.05)(图5B)。
激光损伤后第1、3、7和14天,均可见外核层细胞凋亡(图6),凋亡细胞数量治疗组明显少于损伤对照组,差异具有统计学意义(t1=9.687,t2=7.530,t3=2.094,t4=3.973,p值均<0.05)(图7)。
实施例3:hucMSC-exosome对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎模型的疗效观察
(1)模型建立:6~8周龄雌性Lewis大鼠,30μg光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)R16多肽片段溶于磷酸盐缓冲液(PBS)与等体积含有2.5mg/ml结核杆菌H37Ra的完全弗氏佐剂(CFA)等体积混合,三通阀充分乳化。每只大鼠取0.2ml进行单后足皮下注射建立EAU模型。
(2)治疗方法及分组:Lewis大鼠EAU造模后随机分为exosome治疗组和模型对照组各6只。exosome治疗组从疾病初发期开始每日球旁sub-tenon囊注射50μl含有30μghucMSC-exosome的PBS,连续注射7天,相应模型对照组注射等体积的PBS作为对照。
(3)临床观察及评分:各组大鼠于免疫后第6天开始每日在裂隙灯显微镜下观察双眼炎症表现,参照Caspi临床分级进行评分。评分标准具体如下:0分:无炎症,眼底红光反射正常;0.5分:虹膜血管轻度扩张、充血;1分:虹膜血管中度充血,瞳孔缩小;2分:前房轻度混浊,眼底红光反射减弱;3分:前房中度混浊,瞳孔仍可见,眼底红光反射暗淡;4分:前房重度混浊,瞳孔膜闭,眼底红光反射消失,眼球前突。
视网膜组织病理学观察:Lewis大鼠免疫后第15天及第21天,处死后固定眼球进行视网膜组织病理学HE染色,光学显微镜下观察大鼠葡萄膜及视网膜组织结构,参照Caspi病理学分级进行评价。
视网膜免疫组织化学染色法检测视网膜CD68和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达:Lewis大鼠免疫后第15天及第21天,处死后固定眼球HE染色切片,用免疫组织化学染色法对巨噬细胞表面标志物CD68和主要由巨噬细胞分泌的iNOS染色,光学显微镜下观察大鼠葡萄膜及视网膜组织结构。
视网膜视觉电生理检测:在免疫后第12天、第15天和第21天对各组大鼠进行视网膜视觉电生理检测。
流式细胞仪测定Th1、Th17和Treg细胞:免疫后第15天处死大鼠,取大鼠眼部和引流淋巴结单个核细胞,用流式细胞仪检测Treg细胞、Th1细胞和Th17细胞。
(4)临床评分显示,第12-16天,exosome治疗组大鼠眼部临床评分明显低于对照组,差异有统计学意义。(t=3.849、5.121、5.715、6.859、5.830,P<0.05)。(图8)
视网膜组织病理学改变与临床表现变化一致,exosome治疗后视网膜炎细胞浸润和组织结构破坏明显减轻(图9),各时间点(15天及21天)组织病理学评分均显著低于模型对照组,差异有统计学意义(图10)。(t=4.544、6.708,P<0.05)。
免疫组织化学染色显示,造模后第15,21天,大鼠眼视网膜CD68和iNOS阳性表达量均显著低于相应模型对照组(图11,图12)。
流式细胞仪检测结果显示,在炎性状态下,眼部CD4+T细胞浸润增多,与对照组相比,exosome治疗组可以减少CD4+T细胞在眼部细胞的比例,差异有统计学意义(t=2.442,P<0.05),IFN-γ+CD4+T细胞、IL-17+CD4+T细胞和Foxp3+CD4+T细胞下调(t=5.559、4.846、4.276,P<0.05)(图13)。
在免疫后第12天、第15天和第21天对各组大鼠进行视网膜视觉电生理检测,检测指标暗适应以及明适应3.0的a波和b波,治疗组振幅均明显高于对照组(图14)。
实施例4:hucMSC-exosome对小鼠视网膜脱离模型的疗效观察
(1)模型建立:6~8周龄SPF级健康雌性C57BL/6小鼠(体重15~18g)经检查确认屈光间质清、眼底无异常后纳入实验。饲养方法遵照视觉与眼科学研究协会关于眼科和视觉研究饲养和使用动物标准。
(2)治疗方法及分组:随机将小鼠分为正常组、治疗组和损伤对照组。正常组小鼠不做任何处理。治疗组与损伤对照组小鼠以500mg/kg剂量腹腔注射5%水合氯醛麻醉,右眼用复方托吡卡胺散瞳后,采用视网膜下注射玻璃酸钠造成人为视网膜脱离。规定网脱位置位于颞侧或颞上方,网脱面积约30%-40%,舍去不符合以上标准及有损伤出血的动物模型。损伤后,治疗组与损伤对照组小鼠右眼分别玻璃体腔内注射5μl(0.5mg/ml)hucMSC-exosome及5μlPBS。
(3)评价方法:在造模后第1、3、7、14、28天,取治疗组和损伤对照组小鼠各6只放于暗室中过夜,分别于第二天,对其分别进行ERG检测。暗适应ERG:在暗室中微弱暗红光下,5%水合氯醛腹腔注射麻醉,右眼用复方托吡卡胺滴眼液散瞳,0.4%盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉,1%羧甲基纤维素钠滴眼液保护角膜。将小鼠俯卧放置于实验台上,银丝环形正电极置于右眼前接触角膜,针状负电极置于两眼之间的枕后皮下,针状接地电极置于小鼠尾部皮下。光刺激器提供闪光,参数如下:白光,闪光时间2.92ms,闪光强度3.0cd*s/m2,闪光间隔10s,重复测量5次。测量a波、b波振幅。
在造模后的第1、3、7、14和28天,随机选取正常组小鼠1只,治疗组和损伤对照组小鼠各10只,断颈法处死并摘取右侧眼球,10%福尔马林固定,常规脱水,石蜡包埋。应用组织切片机经视乳头矢状径连续切3μm厚切片进行常规苏木精-伊红(HE)染色及免疫组化染色。光镜下观察组织结构并拍照。
(4)治疗组与损伤对照组小鼠ERG暗适应a波、b波振幅见图15。暗适应0.01a波振幅在5个时间点两组间均有统计学差异(t1=3.334,t2=3.814,t3=3.961,t4=6.645,t5=8.793,p值均<0.05);暗适应0.01b波振幅两组差异除第28天外,各个时间点均有统计学差异(t1=5.131,t2=8.091,t3=4.335,t4=2.213,p值均<0.05);暗适应3.0a波振幅两组差异除第3天外,各个时间点均有统计学差异(t1=2.898,t2=2.665,t3=3.958,t4=3.876,p<0.05);暗适应3.0b波振幅两组间均有统计学意义(t1=7.953,t2=4.976,t3=6.069,t4=2.639,t5=9.859,p值均<0.05)。
网脱损伤后第1天,光学显微镜下观察视网膜病理切片,可见视网膜全层组织无明显变化,RPE层显著脱离,神经上皮层轻度水肿,组织紊乱程度损伤对照组与治疗组无明显差别(图16A、16B)。第3天可见网脱处外核层水肿明显,也可见炎症区域内少量炎症细胞浸润,损伤对照组较治疗组水肿程度更加明显(图16C、16D)。第7天可见外核层细胞水肿减轻,但内核层细胞数量及层数明显变少,神经节细胞层水肿减轻,外核层及内核层细胞排列对照组较治疗组更加紊乱(图16E、16F)。第14天可见治疗组RPE重新贴附于神经上皮层,炎症反应几乎消失,组织形态趋于稳定(图16G、16H)。第28天可见对照组外核层内核层细胞排列紊乱,治疗组各层细胞排列较为整齐,轻度水肿(图16I、16J)。
免疫组织化学染色显示,造模网脱后第7,14天,治疗组大鼠眼视网膜GFAP阳性表达量均显著低于模型对照组。(图17)
上述利用本发明所述的人脐带间充质干细胞来源的exosome作为药物局部注射小鼠视网膜损伤模型、大鼠实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎模型、小鼠视网膜脱离模型的实验证明,exosome具有神经营养以及免疫抑制作用,能减轻各种原因导致的视网膜损伤、减轻炎症反应,从而改善视网膜功能,为临床治疗眼科疾病开辟新途径。
Claims (5)
1.间充质干细胞来源的外泌体(exosome)在制备治疗眼科疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述的间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞、人胎盘来源的间充质干细胞或人脂肪来源的间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于:所述的间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞或人胎盘来源的间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的用途,其特征在于:所述的间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞。
5.根据权利要求1-4所述的用途。其特征在于:所述的眼科疾病包括葡萄膜炎、视网膜脱离、视网膜变性、各种原因导致的视网膜损伤和炎症。
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