CN107519207A

CN107519207A - 一种免疫抑制细胞制剂及其制备方法和应用

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Publication number: CN107519207A
Application number: CN201710773824.6A
Authority: CN
Inventors: 马颖; 郑皓钧
Original assignee: Guangdong Value Technology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Value Technology Co Ltd
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2017-12-29

Abstract

本申请属于生物医药技术领域，具体涉及一种免疫抑制细胞制剂及其制备方法和应用。本申请提供了一种免疫抑制细胞制剂，包括：Treg细胞、脐带间充质干细胞外泌体、脐血单个核细胞、脐血浆和医学上可接受的溶剂，以及所述免疫抑制细胞制剂在制备预防和治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。本申请还提供了所述免疫抑制细胞制剂的制备方法。本申请的有益效果在于Treg细胞和脐带间充质干细胞外泌体先发挥抑制机体免疫亢进、平衡机体免疫系统功能，脐血单个核细胞再发挥免疫调控作用，改善血液环境，从根本上解决免疫系统紊乱的问题。

Description

一种免疫抑制细胞制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种免疫抑制细胞制剂及其制备方法和应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一种弥漫性、全身性自身免疫病。在环境因素、雌激素水平等各种因素相互作用下，导致T 淋巴细胞减少、T抑制细胞功能降低、B细胞过度增生，产生大量的自身抗体，并与体内相应的自身抗原结合形成相应的免疫复合物，沉积在皮肤、关节、小血管、肾小球等部位。在补体的参与下，引起急慢性炎症及组织坏死(如狼疮肾炎)，或抗体直接与组织细胞抗原作用，引起细胞破坏(如红细胞、淋巴细胞及血小板壁的特异性抗原与相应的自身抗体结合，分别引起溶血性贫血、淋巴细胞减少症和血小板减少症)。SLE可累及机体多个系统，包括关节、肌肉、肾脏、神经系统、血液系统、心脏和消化系统等，给患者多个组织脏器带来病理损害。

SLE的治疗强调早期诊断和早期治疗，以避免或延缓组织的病理损害。现有治疗药物主要包括非甾体抗炎药、抗疟药、糖皮质激素和免疫抑制剂，其中非甾体抗炎药、抗疟药和糖皮质激素主要用于症状轻微，无明显内脏损害的患者症状改善治疗，以阻止或减少免疫细胞对内脏的损伤；免疫抑制剂如环磷酰胺、硫唑嘌呤等是治疗SLE的有效药物之一，能有效的诱导疾病缓解，阻止和逆转病变发展，改善远期预后，其缺陷主要在于长期使用，会使机体免疫功能受到抑制，不能从根本上治疗机体免疫系统紊乱和病情反复。

Treg是一类调节性T细胞，对机体免疫起着抑制作用，能抑制对自身或外源抗原有害的的免疫反应。Treg细胞对于多种免疫失调疾病均具有治疗效果，在移植抗宿主反应和自身免疫疾病等动物模型中取得了显著效果，外周血来源的Treg细胞已经在欧洲多中心联合开展临床试验，但由于Treg细胞数量较少、扩增培养周期长，因此限制了其临床应用。近期研究显示脐带血来源的 Treg细胞与外周血来源的Treg细胞一样具有免疫抑制作用，研究文献(马小倩等，2016年)提供了体外扩增脐血来源Treg细胞的分离纯化和扩增培养方法，使用该方法获得的Treg细胞数量和效力均能满足临床需求，为临床应用提供了可能。本发明即提供了一种含Treg细胞的免疫抑制制剂，及其在制备预防和治疗自身免疫性疾病系统性红斑狼疮药物中的应用。

发明内容

为了解决现有技术中系统性红斑狼疮治疗药物药效不足、副作用多这一技术问题，本发明实施例提供一种预防和治疗系统性红斑狼疮的免疫抑制细胞制剂及其制备方法。

本发明的具体技术方案如下：

一种免疫抑制细胞制剂，包括：Treg细胞、脐带间充质干细胞外泌体、脐血单个核细胞、脐血浆和医学上可接受的溶剂；

所述Treg细胞的浓度为1×10⁶～5×10⁶个/mL；

所述外泌体的浓度为每毫升细胞制剂中含有5×10⁷～1×10⁸个脐带间充质干细胞中所提取出来的外泌体总量；

所述脐血单个核细胞的浓度为1×10⁶～5×10⁶个/mL；

所述脐血浆的浓度为体积比5％。

优选地，所述Treg细胞为来源于脐带血的Treg细胞。

优选地，所述脐带间充质干细胞外泌体由脐带间充质干细胞经传代培养 2～5代后提取得到。

优选地，所述医学上可接受的溶剂包括生理盐水或5％葡萄糖注射溶液。

优选的，所述免疫抑制细胞制剂的制备方法为：将所述脐血浆和所述溶剂混合，加入Treg细胞、脐血单个核细胞和脐带间充质干细胞外泌体，混匀后置于4℃环境中保存。

本发明还提供了上述免疫抑制细胞制剂在制备预防或治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。

本发明的技术方案的有益效果在于：

(1)本发明使用脐带血Treg细胞在会输后可立即发挥免疫抑制的功能，脐带干细胞外泌体能协同改善血液环境，强化Treg细胞的功能，血细胞类型会随着Treg细胞的回输而发生变化，各类型细胞因子的含量随之改变，从而起到级联调控的作用，抑制机体免疫亢进，起到立竿见影的效果。

(2)依赖于Treg细胞和脐带干细胞外泌体的免疫调控作用，能够进一步改善患者血液环境，从而更有利于脐血单个核细胞的分化，通过初期的免疫抑制和后期的免疫调控，从而持续性的改善自身免疫性疾病的免疫环境，从根本上解决机体免疫系统紊乱的问题；

(3)本发明开创性的采用了干细胞外泌体和脐血浆代替人血白蛋白，该方法能够保证细胞活率。

具体实施方式

为了解决现有技术中系统性红斑狼疮治疗药物药效不足、副作用多这一技术问题，本发明实施例提供了一种应用于预防或治疗系统性红斑狼疮的免疫抑制细胞制剂及其制备方法。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.脐带间充质干细胞外泌体的制备

(1)脐带干细胞原代培养

步骤1：取脐带，于超净台中进行无菌清洗，剥离脐带羊膜和动静脉，取出沃顿胶，用手术剪进行剪碎；

步骤2：用完全培养基(DMEM+10％FBS)重悬后接种至15cm平皿中，转移至37℃条件下，含5％CO₂的培养箱中培养；

步骤3：于5天后补液，直至细胞爬出，弃去组织块，补充新的完全培养基继续培养，待细胞形成较大的克隆，即可传代；

(2)脐带干细胞的传代培养及鉴定

步骤4：取可传代的原代细胞，弃掉皿内原培养液，加入10mL PBS缓冲液轻轻冲洗细胞生长面，弃去洗液，；

步骤5：加入2mL 0.25％胰蛋白酶，左右摇晃平皿使胰酶均匀覆盖于皿底，显微镜下观察可见细胞间隙增大，胞质回缩，当长梭形细胞变圆变亮时，立即加入10倍体积的完全培养基终止消化，用移液枪反复吹打贴壁细胞，直至细胞全部脱落成单细胞悬液，将悬液转移至离心管中，1500rpm离心5min，弃上清；

步骤6：用完全培养基重悬细胞，按1×10⁵cells/皿进行传代培养，重复传代培养；

步骤7：取P2代细胞1×10⁵cells，用于流式检测脐带干细胞的纯度，检测指标为细胞CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD19、CD11b及HLA-DR 表达。

(3)外泌体的分离

步骤8：收集P2～P5代的脐带血干细胞，按照Invitrogen外泌体提取试剂盒 (购自Thermo Fisher Scientific公司)说明书提取脐带干细胞外泌体，将提取的外泌体用500μL预冷的PBS缓冲液重悬，即得到所述的脐带间充质干细胞外泌体；

步骤9：调整外泌体的浓度为每毫升细胞制剂中含有5×10⁷～1×10⁸个脐带间充质干细胞中所提取出来的外泌体总量，将外泌体置于-20℃保存。

脐带间充质干细胞的表面抗原检测结果如表1所示，结果显示本实施例分离培养得到的脐带间充质干细胞高表达CD73、CD90、CD105，表达率分别为 99.9％、99.9％、97.2％；低表达CD11b、CD19、CD34、HLA-DR和CD45,表达率分别为0.4％、0.1％、0.2％、0.1％、0.0％。符合间充质干细胞的表面抗原特征，说明了脐带间充质干细胞并没有出现分化的现象，仍维持着干细胞的特点。

表1

抗原类型

CD73

CD90

CD105

CD11b

CD19

CD34

CD45

HLA-DR

表达率

99.9％

97.2％

0.4％

0.1％

0.2％

0.0％

0.1％

2.脐血单个核细胞的制备

(1)在超净台中，脐血2000r/min离心10min，用巴氏吸管把上层血浆移至新的50mL离心管中，置于4℃环境中备用；

(2)按照脐带血和生理盐水1:1的比例加入生理盐水，再按照脐带血稀释液和淋巴细胞分离液(购自广州斯佳生物技术有限公司)1:2的比例将脐带血稀释液缓慢加入淋巴细胞分离液中，2000r/min离心25min，然后吸取中间的白膜层，即得到脐血单个核细胞粗提液；

(3)将脐血单个核细胞粗提液用生理盐水洗涤，1500r/min离心10min，依次洗涤3次，得到所述脐血单个核细胞，将脐血单个核细胞置于4℃环境中保存。

3.Treg细胞的制备

取按照上述方法制得的脐血单个核细胞，按照马小倩等在“体外扩增后脐血来源Treg细胞的有效性及安全性研究”中报道的方法制备Treg细胞。

参考文献：马小倩,李桑,王维.体外扩增后脐血来源Treg细胞的有效性及安全性研究.《生命科学研究》[J].2016,20(4):333-339.

4.本发明所述的免疫抑制细胞制剂的制备

(1)往生理盐水中添加脐血浆，使其终浓度为5％，配制5％脐血浆的生理盐水体积为100mL；

(2)往含有5％脐血浆的生理盐水中添加体积为100uL通过上述方法制备的脐带间充质干细胞外泌体；

(3)往含有脐血浆和外泌体的生理盐水中，添加1×10⁸～5×10⁸个脐血单个核细胞，和1×10⁸～5×10⁸个Treg细胞，充分混匀后即得到所述免疫抑制细胞制剂，将该细胞制剂置于4℃环境中保存。

实施例2

1.本发明所述的3种不同浓度的免疫抑制细胞制剂

根据实施例1所述的免疫抑制细胞制剂的制备方法，按照表2所述的各个组分的浓度，制备3种不同浓度的免疫抑制细胞制剂，分别对应细胞制剂1、细胞制剂2和细胞制剂3。

表2

2.SLE模型鼠和正常小鼠

SLE模型鼠为EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因小鼠，42只，雌性，体重30～40g；正常小鼠6只，体重30～40g，购自中山大学医学部实验动物研究中心。

3.动物分组及给药

正常小鼠用于作为空白组，SLE模型鼠随机平均分为7组，每组6只，分别为模型组，对照组1(给予血必净注射液)，对照组2(给予糖皮质激素)，对照组3(给予免疫抑制剂硫唑嘌呤)，实验组1(给予本发明细胞制剂1)，实验组2 (给予本发明细胞制剂2)，实验组3(给予本发明细胞制剂3)，并按照表3所示给药方式给予药物治疗。

表3

分组	药品	给药
			空白组	生理盐水	每天1次，连续尾静脉注射14天
模型组	生理盐水	每天1次，连续尾静脉注射14天
			对照组1	回注血必净注射液	每天1次，连续尾静脉注射14天
对照组2	糖皮质激素	每天1次，连续尾静脉注射14天
			对照组3	免疫抑制剂硫唑嘌呤	每天1次，连续尾静脉注射14天
实验组1	细胞制剂1	每5天1次，连续尾静脉注射15天
			实验组2	细胞制剂2	每5天1次，连续尾静脉注射15天
实验组3	细胞制剂3	每5天1次，连续尾静脉注射15天

4.检测指标

(1)给药结束后，小鼠摘眼取血，1500rpm室温离心15min，取血清2500rpm 再离心15min，分别用试剂盒检测血液中的肌酐、尿素氮、INF-α的水平。

正常小鼠和SLE模型鼠血清中的肌酐、尿素氮和INF-α变化如表4所示，模型组的肌酐、尿素氮、INF-α与空白组比较，具有极显著差异，p<0.001，说明造模成功。

对照组1～3的肌酐、尿素氮和INF-α的含量比空白组的要高，且具有统计学意义p>0.05。与模型组相比，三检测指标的含量低，但没有统计学意义，p>0.05，说明对照组1～3在一定程度上缓解病情，但效果不明显。

实验组1～3的肌酐、尿素氮和INF-α的含量与空白组的相比，没有统计学意义p<0.05。与模型组相比，肌酐、尿素氮的含量低，具有统计学意义p<0.05， INF-α没有统计学意义，说明实验组1～3在一定程度上缓解病情，且效果明显。

表4

分组	肌酐(μmol/L)	尿素氮(mmol/L)	INF-α(pg/mL)
				空白组	23.56±1.95^##	5.68±0.84^##	52.158±28.46^##
模型组	36.91±2.04^**	13.97±2.64^**	120.623±22.09^**
				对照组1	29.25±3.18^*	10.04±3.37^*	80.652±51.76
对照组2	30.38±2.56^*	9.15±2.45^*	86.745±48.39
				对照组3	28.13±3.75^*	9.08±1.81^*	79.886±40.62
实验组1	24.27±1.14^#	6.69±2.86^#	56.439±31.83
				实验组2	23.08±2.39^#	5.85±1.42^#	52.657±35.79
实验组3	23.96±1.57^#	5.73±2.83^#	53.314±38.12

*表示与对空白照组相比，具有显著性差异，P<0.05.

**表示与空白对照组相比，具有极显著性差异，P<0.001.

#表示与模型组相比，具有显著性差异，P<0.05.

##表示与模型组相比，具有极显著性差异，P<0.001.

(2)给药结束后，小鼠摘眼取血，1500rpm室温离心15min，取血清2500rpm 再离心15min，取血清，进行红细胞裂解，检测血液中的树突状细胞(Dendritic Cells,DC)数量和各型淋巴细胞的水平。

正常小鼠和SLE模型鼠血清中外周血中树突状细胞的相对计数和各型淋巴细胞的水平如表5所示，模型组的CD3⁺CD4⁺和CD19⁺与空白组比较，没有统计学意义，p>0.05；对照组1～3和实验组1～3与空白组比较，没有统计学意义，p>0.05；对照组1～3和实验组1～3与模型组比较，没有统计学意义，p>0.05；说明CD3⁺CD4⁺和CD19⁺不能作为评估病情愈合的检测指标。

模型组的DC相对计数和Th细胞/Ts细胞与空白组比较，具有极显著性差异，p<0.001；说明两者可作为检测指标进行病情评估。

对照组1～3的DC相对计数和Th细胞/Ts细胞与空白组相比，含量要低，均具有统计学意义p<0.05。与模型组相比，对照组1～3的DC相对计数要低，具有极显著差异，p<0.001；对照组1～3的Th细胞/Ts细胞具有统计学意义p<0.05。说明对照组1～3能一定程度缓解病情。

实验组1～3的DC相对计数和Th细胞/Ts细胞与空白组相比，没有统计学意义p>0.05。与模型组相比，实验组1～3的DC相对计数和Th细胞/Ts细胞，具有极显著差异，p<0.001；说明实验组1～3起到很好的治疗作用。

表5

*表示与对空白照组相比，具有显著性差异，P<0.05.

**表示与空白对照组相比，具有极显著性差异，P<0.01.

#表示与模型组相比，具有显著性差异，P<0.05.

##表示与模型组相比，具有极显著性差异，P<0.01。

Claims

1.一种免疫抑制细胞制剂，包括：Treg细胞、脐带间充质干细胞外泌体、脐血单个核细胞、脐血浆和医学上可接受的溶剂；

所述Treg细胞的浓度为1×10⁶～5×10⁶个/mL；

所述脐血单个核细胞的浓度为1×10⁶～5×10⁶个/mL；

所述脐血浆的浓度为体积比5％。

2.根据权利要求1所述的免疫抑制细胞制剂，其特征在于，所述Treg细胞为来源于脐带血的Treg细胞。

3.根据权利要求1所述的免疫抑制细胞制剂，其特征在于，所述脐带间充质干细胞外泌体由脐带间充质干细胞进传代培养2～5代后提取得到。

4.根据权利要求1所述的免疫抑制细胞制剂，其特征在于，所述医学上可接受的溶剂包括生理盐水或5％葡萄糖注射溶液。

5.根据权利要求1所述的免疫抑制细胞制剂，其特征在于，其制备方法为：将所述脐血浆和所述溶剂混合，加入Treg细胞、脐血单个核细胞和脐带间充质干细胞外泌体，混匀后置于4℃环境中保存。

6.权利要求1至5任意一项所述的免疫抑制细胞制剂在制备预防或治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。