CN102698266A

CN102698266A - Cd200在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN102698266A
Application number: CN2012101503051A
Authority: CN
Inventors: 张烜; 赵丽丹; 李扬
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2012-05-15
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及CD200或CD200融合蛋白在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用。当体外给予足量的外源性CD200分子时能够纠正系统性红斑狼疮患者调节T细胞的发育缺陷和减少Th17的发育分化并抑制DC的迁移趋化功能，表明CD200分子具有潜在的治疗价值。而制备高亲和力的CD200重组蛋白是本领域的常规技术，应用简单，可通过体内对调节T细胞和Th17细胞及DC细胞的调节而多环节发挥治疗作用，可制备成系统性红斑狼疮的新型治疗药物。

Description

CD200在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及CD200或CD200融合蛋白在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一种可累及多个脏器组织的自身免疫性疾病，免疫调节缺陷特别是免疫耐受丧失、自身抗体产生、免疫复合物沉积、细胞因子失衡和炎症应答失控为其主要的免疫病理机制。而吞噬功能障碍使得凋亡细胞不能及时被清理以致大量自身抗原释放诱发自身免疫被认为是疾病启动的重要环节，但内在机制不清。此外,CD4⁺CD25^highFoxP3⁺调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs),作为维持T细胞稳态和免疫耐受的关键性调节组分，在SLE患者中存在数量和/或质量上的缺陷，参与了SLE疾病的发生发展。

CD200是隶属免疫球蛋白超家族的I型跨膜糖蛋白，可表达于多种细胞，包括B细胞、活化T细胞、树突细胞(dendritic cells，DCs)以及神经元细胞。CD200分子由胞外段、跨膜段和胞内段三个结构域组成，其胞内结构域缺乏信号基序。CD200受体包括CD200R1-4,其中CD200R1亲和力最高。CD200受体主要分布于髓系来源的细胞如DCs、巨噬细胞，也表达于活化T细胞。已知CD200/CD200R1信号通路具有免疫调节作用，可抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒、下调巨噬细胞功能等。Hoek等发现CD200缺乏的小鼠中枢神经系统的巨噬细胞/髓系细胞的内源性活化增加，对实验性变应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)和胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)的易感性增加。给予CD200R-Ig 阻断CD200-CD200R的相互作用可增加小鼠对CIA的易感性。Broderick等也报道阻断CD200可导致小鼠早发实验性自身免疫性视网膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis，EAU)。Rosenblum等人在研究CD200敲除小鼠中紫外线介导半抗原耐受的实验中发现，皮肤细胞表达的CD200在先天性自身免疫性脱发中发挥重要作用。尽管诸多证据显示CD200/CD200R1在实验性自身免疫性疾病中具有重要作用，这一信号通路在人类的自身免疫性疾病如SLE中的作用仍不明确。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供CD200或CD200融合蛋白在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用。

其中，CD200可单独或与其他片段融合成融合蛋白进行应用，所述的融合蛋白可优选为CD200Fab、CD200Fc、CD200-毒素、CD200-细胞因子，更优选为CD200Fc融合蛋白。

进一步地，本发明还提供一种纠正SLE患者中诱导生成CD4⁺CD25^highFoxP3⁺Treg细胞缺陷的方法，其为施用有效量的CD200或CD200融合蛋白。

其中，所述的诱导生成CD4⁺CD25^highFoxP3⁺Treg细胞缺陷为TGF-β信号转导分子诱导生成CD4⁺CD25^highFoxP3⁺Treg细胞缺陷。

再进一步地，本发明还提供一种治疗系统性红斑狼疮的药物，其为含有治疗有效量的CD200或CD200融合蛋白。

所述的融合蛋白可优选为CD200Fab、CD200Fc、CD200-毒素、CD200-细胞因子，更优选为CD200Fc融合蛋白。

进一步地，本发明还提供激动型抗CD200R1抗体在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用。

更进一步地，本发明还提供一种治疗系统性红斑狼疮的药物，其含有治疗有效量的激动型抗CD200R1抗体。

本领域技术人员应当理解，所述的药物中还可含有常规的辅料，并将药物制备成本领域常规的剂型，如片剂、注射剂等。

本发明表明，SLE患者中CD200⁺细胞和血清CD200水平显著增高，而CD200R1 mRNA和蛋白水平均显著下降，以CD4⁺T细胞和DCs尤为显著。SLE患者中，CD200Fc可减少Th17细胞比例并纠正CD4⁺CD25^highFoxP3⁺Treg的诱导缺陷。而拮抗性抗CD200R1抗体可促进抗CD3/抗CD28刺激的CD4⁺T细胞增殖。此外，还发现SLE患者早期凋亡细胞的CD200表达上调并可抑制DCs对其结合和吞噬的能力。

当体外给予足量的外源性CD200分子时能够纠正系统性红斑狼疮患者调节T细胞的发育缺陷和减少Th17的发育分化并抑制DC的迁移趋化功能，而已有较多证据证实调节T细胞缺陷和Th17细胞增多及DC的功能异常参与SLE的发病机制，表明CD200分子可能具有潜在的治疗价值。而制备高亲和力的CD200重组蛋白是本领域的常规技术，应用简单，可通过体内对调节T细胞和Th17细胞及DC细胞的调节而多环节发挥治疗作用，可制备成系统性红斑狼疮的新型治疗药物。拮抗性抗CD200R1抗体能够促进淋巴细胞增殖，表明激动型抗CD200R1能发挥抑制淋巴细胞增殖的作用，而CD200发挥的免疫调节作用需通过受体实现。体外实验中给予足量的CD200分子是通过结合并激动CD200R特别是CD200R1实现的，因此，表明激动型抗CD200R1发挥抑制淋巴细胞增殖及多环节免疫调节作用，从而抑制系统性红斑狼疮患者体内过度亢进的免疫状态而发挥治疗作用。

附图说明

图1所示为SLE患者和健康对照CD200和CD200R1的表达。其中，A,SLE患者PBMC中的CD200表达上调。直方图显示PBMC中CD200⁺细胞，灰色部分为同型对照;B,SLE患者(n=53)和健康对照(n=24)的PBMC及CD4⁺T细胞、CD14⁺单核细胞(CD14⁺Mo)、CD11c^-CD123^highpDC(pDC)和CD11c⁺CD123^-mDC(mDC)等各亚群中CD200⁺细胞比例；C,SLE患者中，CD3⁺CD200⁺细胞比例与血清C3水平负相关；D，SLE患者PBMC中CD200R1的表达下调。直方图显示PBMC中的CD200R1⁺细胞,灰色部分为同型对照；E，SLE患者(n=53)和健康对照(n=24)的PBMC及CD4⁺T细胞、CD14⁺单核细胞(CD14⁺Mo)、CD11c^-CD123^high pDC(pDC)和CD11c⁺CD123^-mDC(mDC)等各亚群中CD200R1⁺细胞比例；F，SLE患者PBMC中CD200mRNA和CD200R1mRNA表达均显著低于健康对照；G，SLE患者中血清CD200水平与血清C3水平负相关(r=-0.45,p=0.014)。

图2所示为浆样树突细胞pDC(CD11c^-CD123^high)(Gate2)和髓样树突细胞mDC(CD11c⁺CD123^-)(Gate3)中CD200表达的流式图。

图3所示为纯真T细胞(naive T)(CD4+CD45RA⁺)和记忆T细胞(CD4⁺CD45RO⁺)中CD200R1表达的流式图。

图4所示为PBMC中DOK2(左图)和p-DOK2(右图)表达的免疫印迹分析。CD200Fc可诱导DOK2(右图泳道2)磷酸化，这一作用可通过与拮抗性抗CD200R1抗体的预孵育而阻断(右图泳道3)。

图5所示为CD200Fc和拮抗性抗CD200R1抗体对于抗CD3/抗CD28刺激的CD4⁺T细胞增殖的影响。其中，A,SLE和健康对照中，CD200Fc对于抗CD3/抗CD28刺激的CD4⁺T细胞增殖无显著影响。B,SLE患者中，拮抗性抗CD200R1抗体可促进抗CD3/抗CD28刺激下的CD4⁺T细胞增殖，并呈量效关系。健康对照中无此发现。流式散点图为代表图，共进行了5例SLE和5例健康对照的实验。

图6A,SLE患者(n=30)PBMC中早期自发凋亡地淋巴细胞比例(Annexin V⁺PI^-)显著高于健康对照(n=15)(p=0.027)。B,早期凋亡细胞CD200表达显著高于活细胞CD200(Annexin V^-PI^-)，而同种荧光标记的CD4无此趋势(n=45)(p<0.001)。C,以早期凋亡细胞与活细胞中CD200的阳性率之比定义的CD200相对表达率，SLE患者显著高于健康对照(p=0.037)。

图7所示为CD200Fc抑制DC迁移、结合并吞噬早期凋亡细胞(Annexin V⁺PI^-)。其中，A,不成熟DC(PKH67染色,绿色)与靶细胞(PKH26染色，红色)共孵育，荧光显微镜检，白色箭头:不成熟DC贴近靶细胞；黄色箭头:不成熟DC吞噬靶细胞；左上：靶细胞为CD200^-活细胞；右上：靶细胞为CD200⁺活细胞；左下：靶细胞为CD200^-凋亡细胞；右下：靶细胞为CD200⁺凋亡细胞。B,荧光显微镜计数结合并吞噬了靶细胞的DC的比例。计数10个视野内的所有细胞(平均40-50个细胞/HP，共约计数400-500个细胞)。C,流式细胞仪定量吞噬了靶细胞的DC(PKH26/PKH67双阳性)。D,transwell实验中DC迁移的比例(n=5)。

图8所示为CD200Fc减少SLE患者Th17细胞的分化。SLE患者(n=9)或健康对照(n=6)的PBMC分别与CD200Fc共培养48h,流式细胞仪检测Th17细胞比例。图中所示数据以Th17细胞所占CD4⁺T细胞的比例表示。A图显示一例SLE患者和一例健康对照PBMC分别与CD200Fc和IgG对照孵育后的Th17表达流式代表图；B图显示9例SLE患者PBMC与CD200Fc和IgG对照孵育的Th17分化的统计学分析结果。

图9所示为CD200Fc可纠正SLE患者中TGF-β诱导CD4⁺CD25^-T细胞分化为CD4⁺CD25^highFoxP3⁺Treg细胞的缺陷。分选SLE和健康对照PBMC中的CD4⁺CD25^-T细胞，培养于RPMI 1640完全培养基，给予抗CD3/抗CD28抗体刺激，并加入IL-2和TGF-β联合培养，给予CD200Fc处理7天，数据来源于5个独立的实验。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

FITC、PE、APC或PE-Cy7标记的鼠抗人CD4(RPA-T4)、CD11c(3.9)、CD25(BC96)、CD200R(OX-108)和CD123(6H6)及相应同型对照均购自美国BioLegend公司；CD200(OX104)、IFN-γ(B27)、IL-4(MP4-25)、IL-17(eBio64DEC17)、Foxp3(PCH101)及相应同型对照购自美国eBioscience公司；重组人IL-2、IL-4、TGF-β1和GM-CSF及相应对照购自美国PeproTech公司；重组人CD200-Fc、抗人CD200R1抗体及对照、CD200 Duoset ELISA试剂盒均购自美国R&D公司；CD4⁺CD25⁺调节性T细胞磁珠分选试剂盒(Miltenyi Biotec 130-091-301)购自德国美天旎公司；Cell Trace^TM CFSE细胞增殖试剂盒和凋亡试剂盒(Vybrant Apoptosis Assay Kit﹟2)购自美国Invitrogen公司；PKH26、PKH67、ionomycin和PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)购自美国Sigma-Aldrich公司。

实施例1流式细胞仪检测细胞表面CD200和CD200R1的表达

1)患者与健康对照

选取2009～2011年在北京协和医院风湿科就诊的SLE患者161例(见表1)，诊断均符合由美国风湿学会(American College of Rheumatology，ACR)1987年修订的分类标准。患者均为女性，年龄12～55岁(平均29.0±10.2岁)。另选取性别年龄匹配的健康对照95人。该研究通过北京协和医院伦理委员会伦理审批。

表1 SLE患者的特征(n=161)

通过流式细胞仪检测细胞表面CD200和CD200R1的表达。外周血经淋巴细胞分离液分离PBMC，用不同荧光标记的CD4、CD25、 CD11c、CD123、CD200、CD200R1等抗体进行组合，直接表面染色，4℃避光30分钟，FACS buffer洗涤细胞2遍，1%多聚甲醛固定，流式细胞仪检测。

通过实时定量多聚酶链反应检测SLE患者和健康对照PBMC中CD200或CD200R1的mRNA水平。以TRIzol(美国Invitrogen公司)试剂提取SLE患者和健康对照外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)的总RNA，合成第一链cDNA，并用SYBR Green(日本TAKARA公司)染料检测DNA的扩增。所用引物：

CD200：5′-CCGTCAACAAAGGCTATTGG-3′(上游)

5′-ATTTAGGGCTCTCGGTCCTG-3′(下游);

CD200R1：5′-GACCAGAGAGGGTCTCACCA-3′(上游)

5′-TTGAAGCGGCCACTAAGAAG-3′(下游);

内参GAPDH：5′-ACTTCAACAGCGACACCCACT-3′(上游)

5′-GCCAAATTCGTTGTCATACCAG-3′(下游)。

SLE患者和健康血清CD200水平用CD200 Duoset ELISA试剂盒(购自美国R&D公司)按照生产厂商说明进行检测。

结果表明，SLE患者PBMC中CD200⁺细胞比例显著高于健康对照(12.03±9.67%vs.6.68±2.69%，p=0.026)(图1A和1B),尤以CD4⁺T细胞(9.17±3.26%vs.6.45±2.82%，p=0.012)、CD11c-CD123^high浆样树突细胞(pDC)(15.57±10.48%vs.7.89±4.26%，p=0.004)和CD11c⁺CD123^-髓样树突细胞(mDC)(6.55±3.46%vs.4.01±2.10%，p=0.016)(图1B和图2)为著,而CD8⁺T细胞、CD19⁺B细胞和CD14⁺单核细胞无此趋势(p>0.05)。CD3⁺CD200⁺细胞比例与血清C3水平负相关(r=0.486,p<0.05)(图1C)。不同细胞亚群中CD200荧光强度在SLE患者与健康对照之间无显著差异(p>0.05)。尽管表达CD200的细胞比例增高，SLE患者PBMC中CD200mRNA的表达却显著低于健康对照(中位数0.44,四分位间距0.20-1.02vs.1.67,0.93-2.80,p<0.001)(图1F)。

与细胞表面CD200表达增加一致，SLE患者血清中CD200水平也显著高于健康对照(中位数142.22pg/ml,四分位间距82.26-469.29vs.76.62pg/ml,45.9-124.93pg/ml,p=0.001)，且血清CD200的水平与血清C3水平负相关(r=-0.45,p=0.014)(图1G),但不与SLEDAI评分相关(p>0.05)。

与CD200表达趋势不同，SLE患者PBMC中CD200R1⁺细胞比例显著低于健康对照(3.10±2.24%vs.6.88±3.61%,p=0.001)，尤以CD4⁺T细胞(10.11±7.37%vs.15.08±7.50%,p=0.004)、pDC(45.93±24.07%vs.71.28±13.91%,p<0.001)和mDC(18.91±14.90%vs.34.75±16.82%,p<0.001)中为著(图1D，1E)。SLE患者PBMC中CD200R1 mRNA的表达也显著低于健康对照(中位数1.45,四分位间距0.85-3.42vs.4.69,2.33-6.33,p<0.001)(图1F)。值得注意的是，不论是在SLE患者还是在健康对照，CD4⁺CD45RA⁺纯真T细胞中CD200R1的表达均显著低于CD4⁺CD45RO⁺记忆T细胞(p<0.05),而SLE患者与健康对照之间并无差异(图3)。

实施例2拮抗性抗CD200R1抗体促进TCR活化驱动的SLE CD4+T细胞增殖

选取实施例1中的5例SLE样本和5例健康对照样本。

通过测定可溶性CD200Fc和拮抗性抗CD200R1抗体对磷酸化DOK2分子表达的影响了解其对CD4⁺T细胞中CD200/CD200R1信号传导的影响。

CD4⁺T细胞经/不经拮抗性抗CD200R1预先处理后，与重组人CD200Fc(同型IgGFc作为对照)共培养,5天后收集细胞，冷PBS洗涤细胞两遍，细胞裂解液[含20mM HEPES(pH7.9)、20%甘油、1%NP-40、1mM MgCl₂、0.5mM EDTA、0.1mM EGTA、1mM DTT、1mM PMSF及蛋白酶抑制剂(BD Biosciences)]裂解，裂解物冰浴1小时，每10分钟震荡混匀一次，13,000rpm 4℃离心，SDS-PAGE(Invitrogen)蛋白电泳分离，转印至PVDF膜(Millipore)，封闭液(含5%牛奶、0.5%吐温20的PBS)封闭后与抗DOK2(ab47507，英国Abcam)或抗磷酸化DOK2(ab47376，英国Abcam)抗体孵育，再以HRP标记二抗处理，加入免疫印迹发光剂Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences)显色，凝胶显像仪处理结果。

研究显示CD200Fc可诱导CD4⁺T细胞DOK2磷酸化，而预先与拮抗性抗CD200R1抗体孵育则可阻断这一效应，提示可溶性CD200Fc可募集并激活CD200R1，而拮抗性抗CD200R1则可拮抗CD200/CD200R1信号传导(图4)。

为进一步了解这些试剂的作用，我们测定了其对CD4⁺T细胞增殖的影响。

实验方法：PBMC以5μM CFSE标记，给予抗CD3和抗CD28单抗刺激增殖，同期加入CD200Fc或拮抗性抗CD200R1抗体或对照蛋白共培养，5天后收集细胞流式细胞仪检测CFSE衰减情况，以细胞分裂指数(Cell division index，CDI)评价细胞增殖情况。CDI定义为刺激后增殖的CFSE荧光衰减的子代细胞与非刺激对照的比例。

在给予抗CD3/抗CD28抗体刺激后，CD200-Fc对SLE和健康对照细胞增殖情况并不产生明显影响(p>0.05,图5A)。然而，拮抗性抗CD200R1抗体可促进抗CD3/抗CD28抗体刺激下的SLE患者CD4⁺T细胞的增殖，并呈量效关系，健康对照未见这一趋势(图5B)。SLE T细胞经抗CD3/抗CD28抗体刺激并接受IgGFc或拮抗性抗CD200R1抗体20ng/ml或拮抗性抗CD200R1抗体100ng/ml处理后的CDI分别为0.87±0.54,1.43±0.92,and 2.34±1.85(p<0.05)。

实施例3 SLE凋亡淋巴细胞增加伴CD200表达上调

选取实施例1中的45例SLE样本和15例健康对照样本。

PBMC培养于PBS观察自发凋亡情况，或通过X线加速器(5Gray)诱导PBMC凋亡，培养于RPMI 1640完全培养基，37℃二氧化碳孵箱孵育48小时。进行Annexin V和propidium iodide(碘化丙啶，PI)染色以区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并进行CD200荧光抗体表面染色，流式细胞仪检测。CD200⁺活细胞、CD200^-活细胞、CD200⁺凋亡细胞、CD200^-凋亡细胞和坏死细胞通过流式细胞仪Moflo(Cytomation,USA)分选。分选设门严格限定于前向角和侧向角确定的淋巴细胞门。

实验显示SLE患者PBMC中早期自发凋亡细胞(Annexin V⁺PI^-)显著高于健康对照(中位数6.80,四分位间距4.38-11.23vs.4.50,3.50-5.30,p<0.05)(图6A)。有趣的是，在SLE患者，早期凋亡细胞上的CD200表达显著高于活细胞(Annexin V^-PI^-)(中位数14.5,四分位间距8.5-28.7vs.6.30,3.60-9.70,p<0.001)，而以同一荧光标记的CD4在凋亡细胞和活细胞中表达并无差异(图6B)。以凋亡细胞和活细胞中CD200的阳性率之比作为CD200相对表达率，则SLE患者CD200相对表达率显著高于健康对照(中位数2.83,四分位间距1.50-6.04vs.1.64,1.38-2.42,p<0.05)(图6C)。

实施例4早期凋亡细胞中CD200的表达与DC结合吞噬能力下降有关

选取实施例1中的5例SLE样本。

进一步测定了凋亡细胞CD200的表达与DC结合吞噬凋亡细胞能力的相关性。通过IL-4和GM-CSF与人单核细胞共培养6天获得未成熟DCs。以PKH67标记未成熟DCs，以PKH-26标记靶细胞(包括照射诱导的CD200⁺/CD200^-凋亡细胞、CD200⁺/CD200^-活细胞)，二者以既定比例共培养3小时，测定DCs对靶细胞的结合和捕获。结果显示DCs结合并吞噬的凋亡细胞显著多于活细胞，且靶细胞上 CD200的表达与DCs结合吞噬凋亡细胞能力的下降相关(图7A-C)。通过荧光显微镜计数，结合吞噬CD200^-凋亡细胞的DCs与结合吞噬CD200⁺凋亡细胞的DCs分别为44.54±4.33%vs.36.76±6.09%(p=0.037)。流式细胞仪测定PKH26和PKH67双阳性的比例二组分别为31.60±22.98%vs.21.71±20.20%(p=0.046)。

实施例5 CD200Fc抑制DC迁移

选取实施例1中的5例SLE样本。

以CD14磁珠分选单核细胞，给予重组人GM-CSF(100ng/ml)和重组人IL-4(100ng/ml)刺激培养6天，获得单核细胞源性DC，单核细胞源性DC种植于tansewell上方小室，下方小室则分别注入IgGFc同型(100ng/ml)、CD200Fc(100ng/ml)、Rantes(50ng/ml)或CD200Fc(100ng/ml)+Rantes(50ng/ml)，孵育48小时后计数迁移至下方小室的DC细胞。

transwell实验显示可溶性CD200Fc抑制DC自发性迁移的潜在作用(IgGFc vs.CD200Fc:迁移率6.21±2.23%vs.4.38±2.42%，p=0.224)有限，但可明显阻断Rantes诱导的DC迁移(IgGFc vs.CD200Fc:迁移率10.32±2.94%vs.7.16±2.36%,p=0.029)(图7D)。

实施例6 CD200减少CD4⁺T细胞向Th17细胞分化

选取实施例1中的9例SLE样本和6例健康对照样本。

PBMC与CD200-Fc或拮抗性抗CD200R1抗体共培养48h,培养结束前5小时加入PMA、ionomycin刺激细胞活化分泌细胞因子，并加入Golgistop阻断细胞因子释放，收集细胞进行细胞表面染色，固定和破膜打孔液处理后充分洗涤细胞，进行胞内细胞因子IL-17染色，洗涤细胞后，固定液固定、流式细胞仪检测。

对CD200-CD200R1信号能否影响人CD4⁺T细胞的分化进行了研究，结果显示CD200-CD200R1信号对健康对照T细胞分化的影响可以忽略(表2),但CD200-Fc可减少SLE患者CD4⁺T细胞向Th17 细胞分化(p＜0.05)(图8A和8B)，提示CD200/CD200R信号通路在调节Th17分化中具有一定作用。

表2 CD200信号对T辅助细胞亚群分化的影响

所示数据为中位数，四分位间距。*p＜0.05。

实施例7 CD200信号纠正SLE患者CD4⁺CD25^highFoxP3⁺Treg细胞的生成缺陷

选取实施例1中的5例SLE样本和5例健康对照样本。

SLE和健康对照的PBMC经CD4⁺CD25⁺调节T细胞分离试剂盒以磁珠分离法分选出

细胞，给予抗CD3/抗CD28单抗、IL-2和TGF-β刺激培养，分别加入CD200-Fc或anti-CD200Rl孵育7天，结果显示TGF-β可成功诱导健康对照CD4⁺CD25^-T细胞发育为CD4⁺CD25^highFoxP3⁺Treg细胞，而SLE患者中这一诱导作用存在缺陷。CD200Fc可纠正这一缺陷(图9)，而拮抗性抗CD200R1抗体不能。在SLE患者中，由TGF-β+IgGFc与TGF-β+CD200Fc诱导的CD4⁺CD25^highFoxp3⁺Treg细胞分别为0.93±0.50％和6.23±0.72％(p＝0.013)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.CD200或CD200融合蛋白在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的CD200融合蛋白为CD200Fab、CD200Fc、CD200-毒素、CD200-细胞因子。

3.一种纠正SLE患者中诱导生成CD4⁺CD25^highFoxP3⁺Treg细胞缺陷的方法，其特征在于，施用有效量的CD200或CD200融合蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的诱导生成CD4⁺CD25^highFoxP3⁺Treg细胞缺陷为TGF-β信号转导分子诱导生成CD4⁺CD25^highFoxP3⁺Treg细胞缺陷。

5.一种治疗系统性红斑狼疮的药物，其特征在于，含有治疗有效量的CD200或CD200融合蛋白。

6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述的CD200融合蛋白为CD200Fab、CD200Fc、CD200-毒素、CD200-细胞因子。

7.激动型抗CD200R1抗体在制备系统性红斑狼疮治疗药物中的应用。

8.一种治疗系统性红斑狼疮的药物，其特征在于，含有治疗有效量的激动型抗CD200R1抗体。