KR20180009435A

KR20180009435A - 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법

Info

Publication number: KR20180009435A
Application number: KR1020160090856A
Authority: KR
Inventors: 김성환
Original assignee: 가톨릭관동대학교산학협력단
Priority date: 2016-07-18
Filing date: 2016-07-18
Publication date: 2018-01-29
Also published as: KR101843952B1

Abstract

본 발명은 지방조직-유래 기질혈관분획(adipose-derived stromal vascular fraction, AD-SVF)의 분리 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법은 종래의 방법에 비해 향상된 세포 수율 및 세포 생존율을 제공하므로 소량의 지방조직으로도 환자에게 이식하기 충분한 양과 우수한 품질의 지방조직-유래 기질혈관분획을 얻을 수 있게 된다. 상기 방법에 따라 얻어진 지방조직-유래 기질혈관분획은 기존 세포치료제를 대신하여 각종 난치성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법 {Methods for isolation adipose-derived stromal vascular fraction from fat tissues}

본 발명은 지방조직-유래 기질혈관분획(adipose-derived stromal vascular fraction, AD-SVF)의 분리 방법에 관한 것이다.

최근의 보고들에 의하면, 지방조직이 다분화 가능한 줄기세포의 중요한 근원 중의 하나임이 보고되고 있다(비특허문헌 1 및 2). 즉, 인간 지방조직 내에는 미분화한 성체 줄기세포들이 존재하고 있고, 이는 다양한 세포, 예를 들어 지방세포, 골형성세포, 연골모세포 등으로도 분화가 가능하고, 특히 다양한 조직 계통에 교차 분화능이 뛰어난 것으로 알려져 있다(비특허문헌 3). 또한, 이들 세포가 다른 심장 근육재생과 신경세포 재생을 촉진하는 능력이 있다는 것이 동물 실험을 통하여 보고된 바 있다. 지방조직은 다른 조직에 비해 환자에게서 비교적 대량으로 줄기세포를 추출할 수 있고 자가 지방조직을 이용할 경우 면역 관련 부작용을 없앨 수 있다는 장점들이 있어서, 유망한 줄기세포의 공급원으로서 고려되고 있다.

지방조직-유래 기질혈관분획(adipose-derived stromal vascular fraction, AD-SVF)은 지방 전구 세포(preadipocytes), 내피 세포(EC), 혈관내피전구 세포(EPC), 혈관 평활근 세포(SMC), 혈관 주위 세포(pericytes), 벽세포, 대식세포(macrophages), 섬유 모세포 및 지방 유래 줄기/기질 세포(ASC)를 포함하는 이종 세포 혼합물이다. AD-SVF 세포는 크론(Crohn's)병, 이식편 숙주 반응(graft-versus-host)병, 다발성 경화증과 염증 성장 질환(inflammatory bowel disease)과 같은 자가 면역 및 알러지 병리학, 급성 심근 경색(myocardial infarction), 하지 허혈, 불치성 만성 창상(chronic wounds), 방사선 장애(radiation injury), 요실금(urinary incontinence) 등의 증상에 대한 임상 시험, 및 여러 예비 질병 치료 모델에서 임상적 효과를 가지는 것이 입증되었다(비특허문헌 4). AD-SVF는 또한 자가 지방 이식의 생존을 연장하는 것으로 보여졌으므로 미용 및 재활 의약품에 큰 효과를 가진다. 요시무라 등에 의한 임상 연구(비특허문헌 5)는 가슴 성형을 위한 지방 이식에서의 AD-SVF 농축의 효능에 대해 발표하였다. 지방 이식은 수술 후, 가슴 재생, 미용 가슴 성형, 안면 골격의 재생, 주름 교정 및 많은 다른 연부조직 결손에 적용될 수 있다. 동물 모델의 연구에서 AD-SVF 세포들에 의한 지방 이식의 농축은 지방의 혈관 생성 향상, 지방 세포의 대사 향상, 및 항세포 고사 인자들의 생성에 의해 이식을 향상시킴을 보여주었다.

실제로 AD-SVF의 이종 조성, 특히 고함량의 내피전구세포는 혈관 신생 인자 세포 요법 및 혈관 재생에 이상적이다. IGF-1, HGF 및 VEGF와 같은 성장 인자들의 방출을 통하거나 직접 혈관 형성을 자극할 수 있는 AD-SVF에서 CD34 양성 세포들을 여러 그룹이 특정하였으며, SVF 세포들은 동물 모델에서 신-신경성 효능을 가지는 것이 입증되었다.

그러나, AD-SVF를 분리하는 종래의 방법은 임상 적용의 면에서 여러 제한점을 가지는데, 그 중 가장 문제가 되는 것은 얻어진 AD-SVF 내의 세포의 수, 활성 및 품질이다. 예를 들어, AD-SVF 내의 세포의 수가 환자 이식에 충분하지 않다면 환자는 치료 중에 1회 이상의 시술을 받아야 하거나 자가 유래의 AD-SVF가 아닌 타가 유래의 AD-SVF를 추가로 이식 받아야 하는 문제가 있다.

A. Miranville et al., Circulation 110:349, 2004 S. Gronthos et al., J. Cell Physiol., 189:54, 2001 P.A. Zuk et al., Tissue Eng., 7:211, 2001 Gimble et al. Stem Cell Research & Therapy 2010, 1:19 Yoshimura et al., Aesthetic Plast Surg. 2008 Jan; 32(1):48-55

이에, 본 발명자들은 종래의 방법에 비해 세포 수율 및 세포 생존율이 향상된 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법을 제공하고자 한다. 또한 본 발명은 상기 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법에 따라 얻어진 지방조직-유래 기질혈관분획을 포함하는 세포치료제를 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은

지방조직을 항응고제가 함유된 PBS(phosphate buffer saline)로 세척하고,

세척한 지방조직에 콜라게나아제; 및 디스파아제 및 아큐타아제(accutase^®)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 포함하는 조직해리용 효소제제를 처리하고,

효소제제로 처리된 지방조직 침전물을 원심분리하여 세포 함유 지방층을 분리하고,

얻어진 세포 함유 지방층으로부터 지방조직-유래 기질혈관분획(adipose-derived stromal vascular fraction, AD-SVF)를 분리하는 것을 포함하는

지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 용어 “지방조직(adipose)”는 백색지방, 황색지방 또는 갈색지방으로 구성된 조직을 의미한다.

용어 “지방조직-유래 기질혈관분획(adipose-derived stromal vascular fraction, AD-SVF)”은 지방조직-유래된 원시 줄기세포(adipose-derived progenitor stem cells)들을 포함하고, 다른 세포들(예를 들어, 지방세포, 내피세포, 평활근 세포, 조혈모세포, 다른 기질세포 등)을 포함한다.

상기 지방조직은 살아있는 인간 또는 동물에서 얻게 되며, 바람직하게는 하복부, 종아리, 허벅지, 팔뚝, 유방 또는 슬관절 지방조직으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

얻어진 지방조직은 먼저 PBS(phosphate buffer saline)와 같은 생리학적-친화성(physiologically-compatible) 용액으로 세척하게 된다. 본 발명은 공지의 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법에서 PBS만 사용하는 것과는 달리 항응고제가 함유된 PBS를 사용하여 지방조직을 세척하는 것을 특징으로 한다. 항응고제의 사용은 혈액세포들의 응고를 억제해 주는 역할을 하는 것으로 여겨진다.

세척한 지방조직은 조직해리를 통해 지방과 세포들로 분리할 수 있다. 이때 조직해리를 위해 효소를 사용할 수 있다. 본 발명은 공지의 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법에서 콜라게나아제만을 사용하는 것과는 달리, 콜라게나아제; 및 디스파아제 및 아큐타아제(accutase^®)로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 포함하는 조직해리용 효소제제를 사용하는 것을 특징으로 한다. 콜라게나아제와 함께 디스파아제나 아큐타아제의 추가 효소를 사용하는 것은 지방조직-유래 기질혈관분획의 세포 수율 및 생존율에 있어 큰 차이를 나타내는 것으로 확인되었다.

바람직하게는 상기 조직해리용 효소제제 중 콜라게나아제의 함유량은 95 내지 99.9%일 수 있다. 또한, 상기 콜라게나아제의 처리 농도는 400 내지 800 units/ml일 수 있다. 상기 콜라게나아제는 콜라게나아제 I, II, III, IV, V 중 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.

한편, 상기 조직해리용 효소제제 중 디스파아제 및 아큐타아제(accutase^®)로부터 선택되는 하나 이상의 효소의 함유량은 0.1 내지 5%일 수 있다. 또한, 상기 조직해리용 효소제제 중 디스파아제 및 아큐타아제(accutase^®)로부터 선택되는 하나 이상의 효소가 사용되는 경우, 이들 효소는 각각 다음과 같은 농도로 처리될 수 있다: 디스파아제 처리 농도는 1 내지 2.4 Unit/ml, 아큐타아제 처리 농도는 400 내지 800 Unit/ml.

상기 조직해리용 효소제제의 효소 조성 및 효소 처리 농도는 지방조직-유래 기질혈관분획의 세포 수율 및 생존율 향상을 위해 중요하다.

상기 조직해리용 효소제제는 이에 제한되는 것은 아니나, 교반기 내에서 세척한 지방조직에 0.5 내지 6시간 동안 처리될 수 있다. 효소 활성의 최적화를 고려할 때, 효소 처리 시의 교반기 내 온도는 25 내지 37℃로 유지하는 것이 바람직하다.

상기 효소제제로 처리된 지방조직 침전물은 원심분리하여 세포 함유 지방층을 분리할 수 있다. 이때 원심분리의 조건은 420g 내지 480g인 것이 바람직하다. 원심분리를 통해 분리된 지방층(lipid layers) 중 가장 아래층이 본 발명의 AD-SVF를 포함한다.

원심분리 후 얻어진 세포 함유 지방층으로부터 나머지 지방조직을 제거하고 순수한 AD-SVF를 분리하기 위해서는 필터링, 밀도에 따른 세포 분리 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 원심분리 후 얻어진 세포 함유 지방층으로부터 AD-SVF를 얻는 단계는 바람직하게는 메쉬 필터에 의한 필터링으로 수행될 수 있다.

이에 제한되는 것은 아니나, 상기 필터링은 100 내지 150mm의 메쉬 필터에 의해 수행되는 것이 바람직하다.

상기 방법에 따라 얻어진 AD-SVF는 CD14, CD34, CD36 및/또는 CD146의 발현이 3% 이상인 것으로 확인되었다. 또한, 상기 방법에 따라 얻어진 AD-SVF는 혈관 또는 조직 재생에 중요한 인자로 알려져 있는 IL-8의 발현량이 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)에 비해 약 3,000 배 이상인 것으로 확인되었다.

본 발명에 방법에 따라 얻어진 AD-SVF은 종래의 방법에 의해 얻어진 AD-SVF에 비해 동일 조건의 지방조직으로부터 더 많은 세포 수와 우수한 세포 생존율을 제공한다. 따라서, 소량의 지방조직으로도 환자에게 이식하기 충분한 양과 우수한 품질의 AD-SVF을 얻을 수 있게 된다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻어진 AD-SVF을 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.

본 발명에 따른 세포치료제는 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 비경구 투여(예컨대, 정맥 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여)에 적합한 약학적으로 허용되는 담체의 종류는 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명에 따른 지방조직-유래 기질혈관분획을 유효성분으로 포함하는 세포치료제의 투여량은 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 지방조직-유래 기질혈관분획을 유효성분으로 포함하는 세포치료제의 투여량은 바람직하게는 0.5 내지 5X10⁹ 개이다.

본 발명에 따른 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법은 종래의 방법에 비해 향상된 세포 수율 및 세포 생존율을 제공하므로 소량의 지방조직으로도 환자에게 이식하기 충분한 양과 우수한 품질의 지방조직-유래 기질혈관분획을 얻을 수 있게 된다. 상기 방법에 따라 얻어진 지방조직-유래 기질혈관분획은 기존 세포 치료제를 대신하여 각종 난치성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

도 1은 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC), 인간 혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC), 지방조직-유래 기질혈관분획(AD-SVF) 그룹에서의 인터루킨-8 (IL-8)의 발현량을 확인한 qRT-PCR 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: AD-SVF 분리

지방흡인술로 얻은 5개의 지방샘플을 이용하여 본 발명의 방법에 따라 AD-SVF를 분리하였다.

먼저, 지방흡인술로 얻은 인간 복부 또는 슬관절 유래 지방조직을 잘게 자른 후 항응고제가 함유된 PBS(phosphate buffer saline) 용액으로 세척하였다. 세척한 지방조직은 37℃의 교반기에서 조직해리용 효소제제(콜라게나아제-I; 99%, 아큐타아제; 1%)를 1시간 동안 처리하였고, 이렇게 얻은 지방조직 침전물은 원심분리하여 세포 함유 지방층을 분리하였다. 분리된 지방층(lipid layers)은 그 중 가장 아래층의 세포만 분리하였다. 분리된 세포는 PBS를 다섯 번 분사하여 100mm 메쉬 필터로 필터링하고 최종적으로 AD-SVF를 분리하였다.

또한, 동일한 지방샘플을 셀디스사의 자동 세포 분리기기를 이용하여 AD-SVF를 분리하였다(본 명세서에서 “종래의 방법”으로 표시). 종래의 방법으로 얻은 AD-SVF와 비교하여 본 발명에 따라 얻은 AD-SVF의 세포수와 세포 생존율은 표 1에 나타내었다. 이때, 세포수와 세포 생존율은 세포 자동 측정기기 NC-200으로 측정하였다.

종래의 방법과 비교	본 발명의 방법
세포수 증가율 (%)	41±25
세포생존율 증가율(%)	23±17

표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 방법에 의하면 세포수가 종래의 방법에 비해 41±25% 증가하였고, 세포 생존율 또한 23±17% 증가하였다.

실시예 2: 형광-활성화 세포 분류(FACS) 분석

실시예 1의 본 발명의 방법에 따라 얻은 AD-SVF는 PBS(Cellgro, Manassas, MD)에 현탁시키고 20분 동안 PE- 또는 FITC-접합된 항체와 4℃에서 직접 항온 처리하였다. 항체는 항-CD4, 항-CD14, 항CD-25, , 항CD-31, 항CD-34, 항CD-36, 항-CD90, 항-CD105, 항CD-146(모두 BD로부터 입수)을 사용하였다. 이때 음성 대조군으로는 상응하는 아이소타입-동일성 IgG가 작용하였다. 세포 염색 후 세포 조성 FACS 분석을 위해 유세포분석기(BD)를 이용하여 실시하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

항체	CD4	CD14	CD25	CD31	CD34	CD36	CD90	CD105	CD146
%	0.3±0.1	4.5±2.3	0.4±0.2	0.9±0.3	5.2±3.7	3.1±2.5	17.3±5.1	1.5±0.9	5.6±3.2

FACS 분석 결과, AD-SVF 세포는 1% 미만의 혈액세포 마커(CD4)를 발현하였고, 중간엽 줄기세포의 마커인 CD90이 17.3%, 조혈모 줄기세포의 마커인 CD34가 5.2% 발현을 보여주었다. 따라서 중간엽 줄기세포와 조혈모 줄기세포의 함량이 5% 이상이므로 세포치료제로서 활용하기에 유용하다고 할 수 있다.

실시예 3: 정량적 RT-PCR(qRT-PCR) 분석

실시예 1의 본 발명의 방법에 따라 얻은 AD-SVF의 인터루킨-8(IL-8) 발현을 정량적으로 확인하기 위하여 qRT-PCR 분석을 실시하고, 이를 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)와 인간 혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)의 인터루킨-8(IL-8) 발현과 비교하였다.

RNA-stat 프로토콜(Iso-Tex Diagnostics, Friendswood, TX)을 이용하여 AD-SVF, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC), 인간 혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)로부터 각각 총 RNA(total RNA)를 분리하였다. 각각의 세포에서 동량으로 추출된 RNA를 이어서 cDNA 합성을 위하여 Taqman 역전사 시약(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 역전사시켰다. 실시간 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 위하여, 인간-특이적 프라이머와 프로브를 이용하였다. RNA의 양은 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템을 이용하여 정량하였다. 하우스키핑 대조 유전자 GAPDH에 정규화시키고 캘리브레이터에 상관시킨 후, 실험 샘플에서 표적 유전자의 상대적 발현 수준을 식 Rel Exp=2^- ^ΔCT(배수 차이)를 이용하여 결정하였으며, 여기서 ΔCt = (표적 유전자의 Ct) - (내인성 대조 유전자, GAPDH의 Ct)이다. PCR 사이클의 수는 Lightcycler 3.5 소프트웨어(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)를 이용하여 측정하였다.

qRT-PCR 분석 결과, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(AD-MSC)와 인간 혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) 그룹에 비하여 AD-SVF 그룹에서 인터루킨-8 (IL-8)의 높은 발현을 확인하였다(3.6 ± 0.2; HUVEC, 0.6 ± 0.03; AD-MSC, 2141 ± 96; AD-SVF)(도 1). 따라서 혈관 또는 조직 재생인자인 IL-8의 높은 발현은 향후 허혈성 질환 치료를 위한 세포치료제로서의 이용에 유용하다고 할 수 있다.

Claims

지방조직을 항응고제가 함유된 PBS(phosphate buffer saline)로 세척하고,
세척한 지방조직에 콜라게나아제; 및 디스파아제 및 아큐타아제(accutase^®)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 포함하는 조직해리용 효소제제를 처리하고,
효소제제로 처리된 지방조직 침전물을 원심분리하여 세포 함유 지방층을 분리하고,
세포 함유 지방층으로부터 지방조직-유래 기질혈관분획(adipose-derived stromal vascular fraction, AD-SVF)을 분리하는 것을 포함하는
지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 지방조직은 하복부, 종아리, 허벅지, 팔뚝, 유방 또는 슬관절 지방조직으로부터 유래된 것인 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 조직해리용 효소제제는 교반기 내에서 세척한 지방조직에 0.5 내지 6 시간 동안 처리되는 것인 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 조직해리용 효소제제 중 콜라게나아제의 함유량은 95 내지 99.9%인 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 조직해리용 효소제제 중 디스파아제 및 아큐타아제(accutase^®)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소의 함유량은 0.1 내지 5%인 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법.
제1항에 있어서,
세포 함유 지방층으로부터 AD-SVF를 분리하는 단계는 메쉬 필터에 의한 필터링으로 수행되는 것인 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 필터링은 100 내지 150mm의 메쉬 필터에 의해 수행되는 것인 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 AD-SVF는 CD14, CD34, CD36 및/또는 CD146의 발현이 3% 이상인 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 AD-SVF는 IL-8의 발현량이 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포에 비해 3,000배 이상인 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법.
제1항에 있어서,
상기 콜라게나아제의 처리 농도는 400 내지 800 units/ml인 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법.
제1항에 있어서,
디스파아제 처리 농도는 1 내지 2.4 Unit/ml, 아큐타아제 처리 농도는 400 내지 800 Unit/ml로 하는 지방조직-유래 기질혈관분획의 분리 방법.