JP6250706B2

JP6250706B2 - 変形性関節症の予防または治療における異系間質血管層細胞および異系間葉前駆細胞の使用

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Publication number: JP6250706B2
Application number: JP2015555579A
Authority: JP
Inventors: カオ，ウェイ; ツェン，シャオリン; アブドゥルカイウム，モハンマド; ツォウ，ユウジエ
Original assignee: Cellular Biomedicine Group Wuxi Ltd; Cellular Biomedicine Group Shanghai Ltd
Current assignee: Cellular Biomedicine Group Wuxi Ltd; Cellular Biomedicine Group Shanghai Ltd
Priority date: 2013-02-04
Filing date: 2014-01-28
Publication date: 2017-12-20
Anticipated expiration: 2034-01-28
Also published as: US9956250B2; AU2014211790A1; EP2952199B1; US20160000830A1; AU2014211790B2; EP2952199A1; JP2016506937A; CN103961373A; US10751371B2; WO2014117733A1; EP2952199A4; US20180296605A1; ES2862248T3; EP3878459A1

Description

本発明は、幹細胞および生物医薬の分野に属する。具体的に、本発明は、変形性関節症の予防または治療における異系間質血管層細胞および異系間葉前駆細胞の使用に関する。

変形性関節症（osteoarthritis、OA）は、関節軟骨の変性、破壊および骨増殖を特徴とする慢性関節症である。OAは、60歳以上の人では罹患率が50％で、75歳以上の人では80％に達し、障害率が53％と高い（中華医学会骨科学分会、2007年、「変形性関節症の診察治療指南」改訂版）。OAは、負担が大きく、活動が多い関節、例えば膝関節に発症することが多く、変形性膝関節症（KOA）と言われる。変形性膝関節症は、年寄りの活動機能障害を起こす主な疾患の一つで、また医療保険および家庭に重い経済的負担をもたらす。
現在、変形性膝関節症（KOA）の全体的な治療原則は、薬物と非薬物の治療を合わせ、必要な場合手術治療を行うことで、疼痛を軽減または解消し、変形を矯正し、関節の機能を改善または回復し、生活の品質を向上させる目的を果たす。

薬物治療は、主に、非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）などの鎮痛薬、関節腔内へ注射されるヒアルロン酸（HA）または糖質コルチコイド、病状を改善する薬物や軟骨保護剤などを含む。これらの薬物は、ある程度で疾患経過を緩和し、患者の症状を改善することができるが、治療効果が限られ、病理過程を逆転させること、または軟骨の損傷を修復することができず、かつ薬物の大半は副作用が顕著である。

通常の治療法では効果がない場合、関節の変形や関節機能障害が現れた患者は、外科手術治療が必要になる。外科治療は、主に関節鏡や開放手術によるもので、一時に疼痛を緩和することができるが、費用が高く、かつ長期的効果が望ましくない。報告によれば、関節置換手術は、通常、10〜15年後に摩損、ひいては義肢の緩みが現れる可能性がある。そのため、現在、研究は新たな治療および修復の策略の探求を目的とする。

組織工学では、自家軟骨細胞移植または基質に誘導される自家軟骨細胞移植に重点を置き、退化した関節組織の生物的修復または再生に長期的に解決する可能性を提供した。しかしながら、このような技術の限界は、主に、比較的大きい軟骨の損傷を治療できないことにある。ドナー部位に対する破壊、脱分化および軟骨細胞の限られる生存時間などの要素への影響のため、KOA患者に適しない。

現在、他の由来の異系間葉前駆細胞、例えば脂肪の異系間葉前駆細胞から着手する研究も少なくない。脂肪の異系間葉前駆細胞は、広い分布、安全、低い免疫プロトタイプや優れた免疫調節能力などの特性を有し、KOAの治療で独特な治療効果を示す。本社も、自家由来の脂肪の異系間葉前駆細胞を開発し、臨床の治療効果が確実である。しかし、一部のKOA患者、例えば伝染病の患者や衰弱の高齢者は、自家の脂肪を提供することができないため、このような患者は、自家の脂肪の異系間葉前駆細胞を用いてKOAを治療することができない。
そのため、本社は、さらに異系由来の脂肪の異系間葉前駆細胞を開発し、このような患者の需要を補う。

本発明の目的は、変形性膝関節症の予防または治療における異系間質血管層細胞および異系間葉前駆細胞の使用を提供することである。
本発明の第一は、変形性関節症を予防および/または治療する薬物組成物の製造に使用される、異系間質血管層細胞（SVF）および異系間葉前駆細胞（haMPCs）の使用を提供する。

もう一つの好適な例において、前記の変形性関節症は、変形性膝関節症、変形性脊椎関節症、変形性股関節症、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の変形性関節症は、変形性膝関節症である。
もう一つの好適な例において、前記の異系間質血管層細胞は、異系間質血管層細胞集団である。
もう一つの好適な例において、前記の異系間葉前駆細胞は、異系間葉前駆細胞集団である。

もう一つの好適な例において、前記の異系間質血管層細胞は、
（i）30％以上の細胞が表面抗原CD29を有すること、
（ii）50％以上の細胞が表面抗原CD73を有すること、
（iii）85％以上の細胞が表面抗原CD49dを有すること、
（iv）55％以上の細胞が表面抗原CD90を有すること、
からなる群から選ばれる任意の1つまたは2つ以上の特徴を有する。
もう一つの好適な例において、35％以上の細胞が表面抗原CD29を有する。
もう一つの好適な例において、55％以上の細胞が表面抗原CD73を有する。
もう一つの好適な例において、90％以上の細胞が表面抗原CD49dを有する。
もう一つの好適な例において、60％以上の細胞が表面抗原CD90を有する。

もう一つの好適な例において、前記の異系間質血管層細胞は、
（v）85％以下の細胞が表面抗原CD34を有すること、
（vi）15％以下の細胞が表面抗原CD45を有すること、
からなる群から選ばれる任意の1つまたは2つ以上の特徴を有する。
もう一つの好適な例において、80％以下の細胞が表面抗原CD34を有する。
もう一つの好適な例において、12％以下の細胞が表面抗原CD45を有する。

もう一つの好適な例において、前記の異系間質血管層細胞は、幹細胞増殖因子（HGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、ヒトトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-10（IL-10）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるサイトカインを分泌する。
もう一つの好適な例において、前記の異系間質血管層細胞は、異系間質血管層細胞集団である。
もう一つの好適な例において、異系間質血管層細胞に分泌される幹細胞増殖因子（HGF）の濃度は≧0.5ng/mlで、好ましくは≧0.8ng/mlである。

もう一つの好適な例において、異系間質血管層細胞に分泌される血管内皮増殖因子（VEGF）の濃度は≧35pg/mlで、好ましくは≧40pg/mlである。
もう一つの好適な例において、異系間質血管層細胞に分泌されるヒトトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）の濃度は≧150 pg/mlで、好ましくは≧180 pg/mlである。
もう一つの好適な例において、異系間質血管層細胞に分泌されるインターロイキン-2（IL-2）の濃度は≧15pg/mlで、好ましくは≧20pg/mlで、より好ましくは≧30pg/mlである。
もう一つの好適な例において、異系間質血管層細胞に分泌されるインターロイキン-10（IL-10）の濃度は≧15pg/mlで、好ましくは≧20pg/mlで、より好ましくは≧30pg/mlで、最も好ましくは≧40pg/mlである。

もう一つの好適な例において、前記の異系間葉前駆細胞は、
（i）95％以上の細胞が表面抗原CD90を有すること、
（ii）95％以上の細胞が表面抗原CD73を有すること、
（iii）95％以上の細胞が表面抗原CD29を有すること、
（iv）95％以上の細胞が表面抗原CD49dを有すること、
からなる群から選ばれる任意の1つまたは2つ以上の特徴を有する。
もう一つの好適な例において、98％以上の細胞が表面抗原CD90を有する。
もう一つの好適な例において、98％以上の細胞が表面抗原CD73を有する。
もう一つの好適な例において、98％以上の細胞が表面抗原CD29を有する。
もう一つの好適な例において、98％以上の細胞が表面抗原CD49dを有する。

もう一つの好適な例において、前記の異系間葉前駆細胞は、
（v）2％以下の細胞が表面抗原HLA-DRを有すること、
（vi）2％以下の細胞が表面抗原アクチンを有すること、
（vii）2％以下の細胞が表面抗原CD34を有すること、
（viii）2％以下の細胞が表面抗原CD45を有すること、
（ix）2％以下の細胞が表面抗原CD14を有すること、
からなる群から選ばれる任意の1つまたは2つ以上の特徴を有する。
もう一つの好適な例において、1％以下の細胞が表面抗原HLA-DRを有する。
もう一つの好適な例において、1％以下の細胞が表面抗原アクチンを有する。
もう一つの好適な例において、1％以下の細胞が表面抗原CD34を有する。
もう一つの好適な例において、1％以下の細胞が表面抗原CD45を有する。
もう一つの好適な例において、1％以下の細胞が表面抗原CD14を有する。

もう一つの好適な例において、前記の異系間葉前駆細胞は、血管内皮増殖因子（VEGF）、ヒトトランスフォーミング増殖因子α（TGF-α）、ヒトトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、肝細胞増殖因子（HGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-10（IL-10）からなる群から選ばれるサイトカインを分泌する。
もう一つの好適な例において、異系間葉前駆細胞に分泌される血管内皮増殖因子（VEGF）の濃度は≧10pg/mlで、好ましくは≧15pg/mlである。

もう一つの好適な例において、異系間葉前駆細胞に分泌されるヒトトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）の濃度は≧300pg/mlで、好ましくは≧400pg/mlである。
もう一つの好適な例において、異系間葉前駆細胞に分泌される顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）の濃度は≧30ng/mlで、好ましくは≧40ng/mlである。
もう一つの好適な例において、異系間葉前駆細胞に分泌される肝細胞増殖因子（HGF）の濃度は≧0.4ng/mlで、好ましくは≧0.5ng/mlである。
もう一つの好適な例において、異系間葉前駆細胞に分泌される血小板由来成長因子（PDGF）の濃度は≧0.008ng/mlで、好ましくは≧0.01ng/mlである。

もう一つの好適な例において、異系間葉前駆細胞に分泌されるインターロイキン-2（IL-2）の濃度は≧25pg/mlで、好ましくは≧30pg/mlである。
もう一つの好適な例において、異系間葉前駆細胞に分泌されるインターロイキン-10（IL-10）の濃度は≧30pg/mlで、好ましくは≧40pg/mlである。
本発明の第二は、変形性関節症の予防および/または治療に使用される薬物組成物であって、有効量の異系間質血管層細胞（SVF）および異系間葉前駆細胞（haMPCs）と、薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は、皮下注射製剤である。

もう一つの好適な例において、前記薬学的に許容される担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
もう一つの好適な例において、前記異系間質血管層細胞の濃度は0.1〜100×10⁴個/mlで、好ましくは1〜10×10⁴個/mlで、より好ましくは2×10⁵個/mlである。
もう一つの好適な例において、前記異系間葉前駆細胞の濃度は0.1〜100×10⁴個/mlで、好ましくは1〜10×10⁴個/mlで、より好ましくは2×10⁵個/mlである。

本発明の第三は、変形性関節症を予防および/または治療する方法であって、必要な対象に異系間質血管層細胞（SVF）および異系間葉前駆細胞（haMPCs）、あるいは異系間質血管層細胞（SVF）および異系間葉前駆細胞（haMPCs）を含む薬物組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の対象は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物であり、好ましくはヒトである。

もう一つの好適な例において、前記の方法は、
（1）必要な対象に異系間質血管層細胞を投与する工程、および
（2）必要な対象に異系間葉前駆細胞を投与する工程、
を含む。
もう一つの好適な例において、投与部位は、前記対象の関節腔内である。
もう一つの好適な例において、工程（1）と工程（2）の間の間隔時間は1か月以上、および/または3か月以上である。

もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上述の各技術特徴および下記（例えば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好ましい技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
以下の図面は本発明の具体的な実施方案を説明するためのもので、特許請求の範囲で決められる本発明の範囲を限定するものではない。

図1は、異系由来のSVFとhaMPCsの混合治療法によってKOAを治療する流れを示す。図2は、SVFの表面抗原の検出結果を示し、図2A〜図2IはそれぞれCD34、CD29、CD73、CD49d、CD90、CD14、CD45、アクチン、HLA-DR抗原の検出結果を示す。図3は、haMPCsのVEGF分泌量の変化である。図3Aは、LPS刺激24h後のhaMPCsのVEGF分泌量の変化を示す。図3Bは、低酸素刺激のhaMPCsのVEGF分泌量に対する影響を示す。図4は、haMPCsの軟骨誘導の実験結果を示す。図5は、haMPCsの骨誘導の実験結果を示す。

具体的な実施形態
本発明者は、幅広く深く研究したところ、予想外なことに、異系間質血管層細胞および異系間葉前駆細胞が、変形性関節症の予防または治療において優れた効果を有することを初めて見出した。具体的には、必要な対象に本発明の異種脂肪由来の異系間質血管層細胞および異系間葉前駆細胞、あるいは異種脂肪由来の異系間質血管層細胞および異系間葉前駆細胞を含む薬物組成物を投与することは、変形性関節症に顕著な予防または治療作用を有することを見出した。異系間葉前駆細胞は、高いサイトカイン分泌能力を有し、体内で適切な条件では生体の損傷を修復することができる。異系間質血管層細胞および異系間葉前駆細胞は、軟骨形成分化および骨化の能力を有する。また、本発明は、変形性関節症を予防および/または治療する方法ならびに異系間質血管層細胞および異系間葉前駆細胞を含む薬物組成物を提供する。これに基づき、本発明を完成させた。

用語
ここで用いられるように、用語「以上」および「以下」はその数字を含み、例えば「95％以上」とは≧95％で、「0.2％以下」とは≦0.2％である。

変形性関節症
ここで用いられるように、用語「変形性関節症」は、「osteoarthritis」または「OA」と互換的に使用することができる。
変形性関節症は、慢性の関節症で、その主な変化は関節軟骨における変性および続発性の骨増殖で、関節の疼痛および運動の不便として現れ、X線では関節の隙間が狭くなり、軟骨の下は骨質が緻密で、骨梁が断裂し、硬化およびのう変性があり、関節の周縁に唇状の増殖があり、後に骨の端部が変形し、関節面が凹凸になり、関節内の軟骨が剥離し、骨質が割れて関節に入り、関節内の遊離体となる。
本発明において、前記の変形性関節症は、変形性膝関節症、変形性脊椎関節症、変形性股関節症、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる任意の変形性関節症でもよい。本発明に係る変形性関節症は、変形性膝関節症であることが好ましい。

脂肪
脂肪は、整形および抗老衰治療の優れた素材であり、脂肪組織の材料は、腰部、臀部、腹部、太もも、上腕などの部位由来のものでもよい。当業者は、汎用の技術方法によって脂肪組織を採取することができ、吸引、手術分離などの方法を含むが、これらに限定されない。
本発明において、脂肪組織または脂肪の素材に特に制限がないが、動物またはヒトの任意の部位由来の脂肪組織でもよく、好ましくはヒトの脂肪組織である。より好ましくは、脂肪組織は、腰部、臀部、腹部、太もも、上腕などの部位の組織でもよい。

異系間質血管層細胞
ここで用いられるように、用語「異系間質血管層細胞」、「SVF」、または「間質血管破片」は互換的に使用することができる。
異系間質血管層細胞は、脂肪細胞から分離された、多分化能を有する幹細胞である。SVFは、体外で安定して増殖することができ、かつ減衰率が低く、採取が容易で、体内の蓄積量が大きく、大規模培養に適し、生体に対する損傷が小さく、由来が幅広く、抗原性が低く、異系移植に適する。SVFは、幹細胞によって補助される脂肪移植において最も重要な成分である。コラゲナーゼによって消化され、脂肪組織から分離された複数種の細胞の混合物からなる細胞団は、間質血管破片と呼ばれる。間質血管破片に豊富な間葉細胞が含まれ、複数系の細胞に分化することができ、再生医学、組織工学などに最も理想の種細胞である。

当業者は、汎用の方法によってSVFの分離および精製を行うことができる。
ここで用いられるように、用語「分離方法」、「SVFの分離方法」は互換的に使用することができ、いずれも元の脂肪組織から分離されたSVFを得る方法および過程を指す。得られたSVFの脂肪細胞の材料に対し、まず、洗浄し、血細胞を除去し、脂肪を破砕し、消化し、消化されていない組織を除去し、SVFを含むろ液を得、遠心してSVFを得る。得られたSVFは、さらなる継代、培養または冷凍保存に使用することができる。
一つの好適な実施例において、SVFの分離は、吸引された脂肪をPBSで2回繰り返して洗浄し、さらに37℃の条件でコラゲナーゼで30min消化し、1200gで10min遠心した後、主に間質細胞、血管内皮細胞および壁細胞を含む高密度のSVF破片を得る工程を含んでもよいが、これらに限定されない。また、SVFには、血管由来の細胞、例えば白血球や赤血球なども含まれ、各種の細胞の間に相乗効果を有する。

異系間質血管層細胞の抗原検出
本発明で使用されるSVFは、高い純度を有し、他の種類の細胞または幹細胞をほとんど含まない。これは細胞の表面抗原の検出によって検証することができる。
SVFは、様々な特異性抗原および受容体を有し、主にCD3、CD13、D29、CD34、CD45、CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABCなどがある。
CD34抗原は、高度にグリコシル化I型膜貫通タンパク質で、選択的にヒト造血幹細胞（HSC）、前駆細胞（PC）および血管内皮細胞（EC）の表面に発現され、CD34を持つ脂肪組織の前駆細胞の全幹細胞における割合は≦0.2％が好ましく、≦0.2％がより好ましい。
CD45は、造血幹細胞および破骨細胞を含むすべての造血細胞の表面に存在する。CD45を持つ脂肪組織の前駆細胞の全幹細胞における割合は≦0.1％が好ましい。

CD29、CD73、CD49d、CD90などは主に脂肪の異系間葉前駆細胞の表面に存在する。
CD29を持つSVFの全幹細胞における割合は≧30％が好ましく、≧32％がより好ましく、≧35％が最も好ましい。
CD73を持つSVFの全幹細胞における割合は≧50％が好ましく、≧60％がより好ましく、≧70％が最も好ましい。
CD49dを持つSVFの全幹細胞における割合は≧85％が好ましく、≧90％がより好ましく、≧95％が最も好ましい。
CD90を持つSVFの全幹細胞における割合は≧55％が好ましく、≧60％がより好ましく、≧65％が最も好ましい。

当業者は、汎用の方法、例えばフローサイトメトリー法によってSVFの純度および分化の程度を検出することができる。検出時、異なる特異的な抗体を入れるが、完全のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でもよく、免疫活性を有する抗体断片、例えばFab'または(Fab)2断片、抗体の重鎖、抗体の軽鎖、遺伝子工学によって改造された一本鎖Fv分子(Ladnerら、米国特許No.4,946,778)やキメラ抗体、たとえばマウス抗体結合特異性を持つがヒト由来の抗体部分が残った抗体でもよい。抗体を入れて細胞表面の抗体と所定時間で結合させ、フローサイトメトリーで細胞に対して自動分析および選別を行う。

異系脂肪由来の間葉前駆細胞
ここで用いられるように、用語「異系脂肪由来の間葉前駆細胞」、「haMPCs」または「adipose tissue-derived mesenchymal progenitor cells」は同じ意味であり、互換的に使用することができる。
本発明で使用される異系脂肪由来の間葉前駆細胞は、ヒト由来の脂肪由来の異系間葉前駆細胞が好ましい。
当業者は、通常の方法によってhaMPCsの分離および培養を行うことができるが、一つの好適な実施例において、以下の工程を含む。

a. 脂肪の分割：吸引した脂肪を遠心管に入れ、吸引した脂肪を二つに分け、一方はコラゲナーゼで消化して洗浄した後、SVF細胞の懸濁液の調製に使用し、そのままで自体輸血を行い、もう一方はSVFを得てから培養を続け、脂肪の前駆細胞を得る。
b. 脂肪の分解：遠心管に酵素剤を入れ、恒温シェーカーに置き、脂肪の消化を行い、消化終了後、遠心して上層の消化した脂肪を捨て、沈殿を収集して洗浄する。
c. ろ過：細胞洗浄液を入れ、均一に混合し、細胞ろ過ネットでろ過してから細胞をカウントし、遠心し、沈殿を洗浄する。ろ過後の細胞は、間質血管細胞群SVF（stromal vasvular fraction cells）である。SVFは、脂肪組織から分離された複数種の細胞の混合物で、複数種の同種異系細胞からなる細胞群で、中には、MPCs様細胞、内皮（前駆）細胞、血管平滑筋細胞および顆粒球、単核球、リンパ球などを含む他の部分の血液由来細胞が含まれる。

d. SVF懸濁液の調製：ろ過後のSVF細胞を5mlの細胞懸濁液とし、注射剤で懸濁液を吸引した後、懸濁液を100mlの生理食塩水袋に注入する。
e. 細胞の培養：細胞をカウントした量によって接種密度を調整し、培養瓶に接種し、CO₂インキュベーターに置いて培養する。
f. 継代：接種から3日くらいで少量の付着した異系間葉前駆細胞が現れ、5〜7日培養して付着細胞がコロニーになったとき、消化して継代し、収集して細胞をカウントし、初代の付着状況が1：1〜2の割合で継代し、2〜3週間継代培養を行い、細胞（異系細胞由来の前駆細胞）を収集する。
g. 脂肪由来の前駆細胞懸濁液の調製：収集した脂肪由来の前駆細胞を遠心して洗浄した後、生理食塩水を注入し、細胞懸濁液とする。

脂肪由来の異系間葉前駆細胞の抗原検出
本発明で使用される異系脂肪由来の間葉前駆細胞は、高い純度および活性を有する。
当業者は、通常の方法、例えばフローサイトメトリー法などによって異系間葉前駆細胞の表面抗原を検出することができる。
脂肪由来の異系間葉前駆細胞は、様々な特異性抗原および受容体を有し、主にCD29、CD73、CD90、CD49dなどがある。
CD73抗原を持つ異系間葉前駆細胞の全異系間葉前駆細胞における割合は≧95％が好ましく、≧98％がより好ましく、≧99％がさらに好ましく、100％が最も好ましい。
CD90抗原を持つ異系間葉前駆細胞の全異系間葉前駆細胞における割合は≧95％が好ましく、≧98％がより好ましく、≧99％がさらに好ましく、100％が最も好ましい。
CD29抗原を持つ異系間葉前駆細胞の全異系間葉前駆細胞における割合は≧95％が好ましく、≧98％がより好ましく、≧99％がさらに好ましく、100％が最も好ましい。
CD49d抗原を持つ異系間葉前駆細胞の全異系間葉前駆細胞における割合は≧95％が好ましく、≧98％がより好ましく、≧99％がさらに好ましく、100％が最も好ましい。
脂肪由来の異系間葉前駆細胞の陰性指標は、HLA-DR、アクチン、CD34、CD45、CD14などを含む。

HLA-DR抗原を持つ異系間葉前駆細胞の全異系間葉前駆細胞における割合は≦2％が好ましく、≦1％がより好ましく、≦0.5％がさらに好ましく、HLA-DR抗原がないことが最も好ましい。
アクチン抗原を持つ異系間葉前駆細胞の全異系間葉前駆細胞における割合は≦2％が好ましく、≦1％がより好ましく、≦0.5％がさらに好ましく、アクチン抗原がないことが最も好ましい。
CD34を持つ異系間葉前駆細胞の全異系間葉前駆細胞における割合は≦2％が好ましく、≦1％がより好ましく、≦0.5％がさらに好ましく、CD34がないことが最も好ましい。
CD45を持つ異系間葉前駆細胞の全異系間葉前駆細胞における割合は≦2％が好ましく、≦1％がより好ましく、≦0.5％がさらに好ましく、CD45がないことが最も好ましい。
CD14を持つ異系間葉前駆細胞の全異系間葉前駆細胞における割合は≦2％が好ましく、≦1％がより好ましく、≦0.5％がさらに好ましく、CD14がないことが最も好ましい。

本発明で使用されるhaMPCsは、VEGF、TGF-ａ、TGF-β、GM-CSF、HGF、PDGF、IL-2、IL-4、IL-10などのサイトカインを大量に分泌することができ、かつ高いクローン形成能力および低い免疫原性を有するヒト由来のhaMPCsが好ましい。
当業者は、通常の方法によってhaMPCsに対して使用、処理、投与などの操作を行うことができる。例えば、毎回haMPCsを放出または使用する前、無菌、内毒素およびマイコプラズマの検査、ならびにDNAの同定を通過しなければならない。毎回放出する細胞は、細胞活力≧95％、細胞純度（陽性指標≧95％、陰性指標＜2％）に合わなければならない。haMPCsの急性毒性、アレルギー検出結果はいずれも陰性で、相応の検出報告がある。

薬物組成物およびその応用
また、本発明は、有効量の異系間質血管層細胞および異系間葉前駆細胞と、薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物を提供する。
通常、異系間質血管層細胞および異系間葉前駆細胞は無毒で不活性の薬学的に許容される水系媒体、例えば生理食塩水に配合してもよく、ここで、pHは通常約5〜8、好ましくは約7〜8である。
ここで用いられるように、用語「有効量」または「有効投与量」とは、ヒトおよび/または動物に機能や活性があり、かつヒトおよび/または動物にとって受けられる量である。
ここで用いられるように、「薬学的に許容される」成分は、ヒトおよび/または哺乳動物に適用する場合、過度の不良な副反応（例えば毒性、刺激とアレルギー反応）がない、すなわち、合理的なベネフィット/リスク比を持つ物質である。用語「薬学的に許容される担体」とは、治療剤の投与のための担体で、各種の賦形剤と希釈剤を含む。

本発明の薬物組成物に含まれる担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。通常、薬物製剤は、投与様態に応じるべきであるため、本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、例えば生理食塩水あるいはグルコースおよび他の助剤を含む水溶液を使用し通常の方法で製造することができる。前記の薬物組成物は、無菌条件で製造することが好ましい。活性成分の投与量は治療有効量である。本発明の薬物製剤は、徐放性製剤にしてもよい。
本発明に係る異系間質血管層細胞および異系間葉前駆細胞の有効量は、投与の様態と治療しようとする疾患の重篤度などによって変更することができる。好適な有効量の選択は、当業者が様々な要素によって決めることができる（例えば臨床試験による）。前記の要素は、前記薬物動態学のパラメーター、例えば生物的利用率、代謝、半減期など、患者の治療しようとする疾患の重篤度、患者の体重、患者の免疫状況、投与の経路などを含むが、これらに限定されない。

本発明の薬物組成物は、皮下注射製剤であることが好ましい。もう一つの好適な例において、前記皮下注射製剤の異系間質血管層細胞の濃度は0.1〜100×10⁴個/mlで、好ましくは1〜10×10⁴個/mlで、より好ましくは2×10⁵個/mlで、かつ/または異系間葉前駆細胞の濃度は0.1〜100×10⁴個/mlで、好ましくは1〜10×10⁴個/mlで、より好ましくは2×10⁵個/mlである。

また、本発明は、本発明に係る薬物組成物を使用する方法を提供するが、一つの具体的な実施例において、
（1）必要な対象に異系間質血管層細胞を投与し、好適な投与部位は前記対象の関節腔内である工程、および
（2）必要な対象に異系間葉前駆細胞を投与し、好適な投与部位は前記対象の関節腔内で、好適な使用時間は工程（1）の後の1か月、および/または2か月である工程、
を含む。
本発明に係る投与の流れは図1に示す。

本発明の主な利点は以下の通りである。
（1）本発明のSVFおよびhaMPCsの由来は幅広い。
（2）本発明のSVFおよびhaMPCsの体内での使用は安全である。
（3）本発明のSVFおよびhaMPCsがラットに使用された場合、異種間に免疫拒絶反応は現れなかった。
（4）本発明で使用されるhaMPCsはLPS、低酸素などの刺激を受けると、各種のサイトカインの発現量が顕著に上昇し、haMPCsは高いサイトカインの分泌能力を有し、体内で適切な条件で生体の損傷修復を行うことができる。
（5）本発明のhaMPCsは典型的な間葉幹細胞の特性を有し、体内の適切な条件で潜在的な分化能を有することで、生体の相応の需要に応える。
（6）本発明のSVFとhaMPCsの混合治療法において、haMPCsは特定の誘導条件で軟骨細胞および骨細胞に転化し、変形性関節症の予防または治療に応用することができる。

以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカー推奨の条件に従う。

実施例1 SVFおよびhaMPCsによる変形性膝関節症（KOA）の治療
患者は53歳の男性で、両側の膝関節の疼痛が6年余りで、1か月間ひどくなった。持続性疼痛で、室内の歩行しか耐えられず、階段の上り下りが困難で、平地の歩行が痛みを起こし、朝硬直する。X線検査では、関節の周縁が増殖し、骨棘が形成し、関節の隙間が狭くなり、硬化性の変化があることが示された。WOMACスコアは103点だった。診断：中度の変形性膝関節症。

整形外科からLipokitで抽出したクリーンな脂肪を約30ml採取した（脂肪の提供者は29歳の健康の女性で、ダイエットのために整形外科で脂肪吸引を受け、脂肪吸引前のBMIが26.73であった。）。10mlの新しく採取した脂肪組織から血管基質部分を分離し、コラゲナーゼで消化し、ろ過し、遠心で成熟脂肪細胞を除去して得られたSVFに対し、表面抗原の同定を行い、同定結果を図2に示す。

患者の両側の関節腔内に1×10⁷個細胞/2mlずつSVFを注射した。残りの脂肪組織を分離して精製した後、P2〜P5代を培養し、haMPCsを得た。haMPCsを冷凍保存し、解凍して回復させた後、さらに培養し、初めての注射から1、3か月目にさらにそれぞれ両側の関節腔に1×10⁷個細胞/2mlずつ注射した。毎回の注射から24時間、72時間、1週間の時点で一般血液・尿液検査、肝臓・腎臓機能、凝血機能、電解質などの指標を検出した。
結果：各回の上記指標の検出では顕著な異常が見られなかった。患者は疼痛が緩和し、運動機能が顕著に向上し、平地の歩行および階段の上り下りの時の疼痛が軽減し、X線検査では関節面が以前よりも改善された。WOMACスコアは62点だった。

実施例2 SVFおよびhaMPCsの同定
フローサイトメトリーによる検出
酵素消化法によって細胞を遠心管に収集し、細胞の懸濁液を密度が1×10⁵/mLとなるように調整し、800r/min(120g)で5 min遠心し、上清を捨て、4℃の冷やしたD-Hanksで細胞を洗浄して再懸濁させ、さらに細胞懸濁液を800 r/minで5 min遠心した後、上清を捨てた。その後、D-Hanksで細胞を1 mLに再懸濁させ、抗体5〜10 μLを入れ、光を避け、氷の上に30 min置いた。D-Hanksで洗浄し、遠心し、上清を捨て、結合していない抗体がなくなるようにこの洗浄過程を2〜3回繰り返し、約200〜300 μLのD-Hanksを入れて懸濁液とし、フローサイトメトリーで検出した（図2）。
SVFのフローサイトメトリーによる検出結果を表1に示す。

フローサイトメトリーでSVFに対して細胞表面の抗原マーカーの発現を分析したとこと、新しく分離された前駆細胞において、SVFの割合が60％で、かつ造血前駆細胞の含有量が70％で、混合細胞が多かったことが示された。
haMPCsのフローサイトメトリーによる検出結果を表2に示す。

細胞分泌因子の検出
SVFおよびhaMPCsを培養室で48h培養し、上清を取り、細胞分泌因子を検出し、臍帯幹細胞をコントロール群とし、検出結果を表3に示す。
結果から、SVFおよびhaMPCsはいずれも優れたサイトカインを分泌する機能を有し、臍帯幹細胞に相当することが示された。

実施例3 haMPCs刺激試験
（1）新鮮なhaMPCsおよび冷凍保存したhaMPCsをそれぞれ完全培地および5％FBS培地で培養し、かつhaMPCsによって分泌されるVEGFを検出した。
結果から（図3A）、完全培地で培養された新鮮なhaMPCs群では、VEGFの濃度がLPS濃度の増加に従って降下し、5％FBS培地で培養された新鮮なhaMPCs群では、200ng/mlの場合、VEGFの濃度がコントロール群とほぼ同様で、100ng/mlおよび300ng/mlではそれぞれやや降下し、完全培地で培養された冷凍保存haMPCs群では、VEGFの濃度は基本的にLPS濃度の増加によって変わらなかったことが示された。全体的に、血清で培養された場合は完全培地の場合よりもVEGFが高かった。
（2）低酸素刺激下でhaMPCsのVEGFの分泌量を検出したところ、低酸素刺激下でVEGFの分泌量は正常培養の場合の2〜3倍で、かつ48時間の分泌量は24時間の2倍で、VEGFの増量は細胞濃度の増量に正比例したことが見出された（図3B）。

実施例4 haMPCsの軟骨形成分化試験
GIBCO STEMPRO軟骨形成分化キットで軟骨形成分化培地を調製し、haMPCsを消化して遠心し、P3代細胞を得、標準培地で1.6×10⁷活細胞/mLの細胞懸濁液を調製して使用に備えた。ピペットで5μLの細胞懸濁液（細胞量8×10⁴）を吸い、マルチウェル培養プレートのウェルに接種し、CO₂インキュベーターで2時間予備培養した。

予備培養終了後、実験ウェルに1mLの37℃の水浴で熱しておいた軟骨形成分化完全培地を添加し、コントロールウェルに1mLの37℃の水浴で熱しておいた標準培地を添加し、かつマルチウェル培養プレートを37℃、5％CO₂濃度のCO₂インキュベーターで培養した。培養過程において、2〜3日おきに相応のウェルに対して液を交換した。十分な培養時間を経過した後（7、14日）、当日調製された4％ホルマリン溶液（1mLの40％ホルムアルデヒドを9mLの水に溶解させたもの）および1％のAlcian Blue染液（0.1gのAlcian Blueを10mLの0.1 N HClに溶解させたもの）で各ウェルの固定および染色処理を行った。培地を吸って除去し、DPBSで1回洗浄し、かつ細胞を4％ホルマリン溶液で30分間固定した。固定後、DPBSで洗浄し、さらに1％のAlcian Blue溶液（0.1NのHClに溶解させたもの）で30分間染色した。0.1NのHClで3回洗浄し、蒸留水を入れて酸性を中和し、さらに顕微鏡で各実験群およびコントロール群を観察し、画像を保存した。軟骨細胞への分化に成功した実験群は、Alcian Blue染色後、軟骨細胞で合成されたプロテオグリカンによって青色になる。

実験結果：実験の7日目に細胞の生長状況を観察し、かつA1、A3、C1ウェルを選んで撮影して分析した。観察では、ウェルA1（図4.1）で、細胞が接種の中心領域に集中し、細胞の形態が丸形で、軟骨細胞に近く、細胞の付着の密着度が普通であったが、数回の液交換後も付着の状態を維持した。ウェルA3（図4.2）で、細胞が球状の高度に集合した細胞団の構造となり、肉眼で乳白色の球状構造が見られ、この構造は数回の液交換後も存在し、しかも汚染の可能性も除かれた。ウェルC1（図4.3）では、コントロール群として標準培地を入れ、細胞の形態は標準のhaMPCs付着細胞に合っていた。そのため、形態から見ると、分化培地で培養されたhaMPCsはコントロール群と比べて顕著な差がある。

実験の14日目にAlcian Blue染色を行ったところ、C1ウェル（図4.6）では顕著な青色の染色が見られず、それに対し、A1（図4.4）ウェルでは顕著な青色の染色が見られ、軟骨細胞で合成されたムコ多糖の存在が証明されたが、A3（図4.5）ウェルでは、細胞が密集しすぎたためか、青黒色に染色された。そのため、分化培地で培養されたhaMPCsは代表的な染色条件で軟骨細胞に分化した特徴を示した。
このように、本実施例は、本発明のhaMPCsは分化培地の培養条件で細胞形態学および代表的な化学染色処理で軟骨細胞の特徴を表し、haMPCsが軟骨細胞への分化能を有することを示した。

実施例5 haMPCsの骨形成分化試験
GIBCO STEMPRO骨形成分化キットで骨形成分化培地を調製し、haMPCsを消化して遠心し、P3代細胞を得、適量の生長培地で細胞懸濁液を調製して使用に備えた。5×10³個細胞/cm²の密度でhaMPCsをマルチウェル培養プレートに接種し、CO₂インキュベーターで2時間予備培養した。
予備培養終了後、実験ウェルに1mLの37℃の水浴で熱しておいた骨形成分化完全培地を添加し、コントロールウェルに1mLの37℃の水浴で熱しておいた標準培地を添加し、かつマルチウェル培養プレートを37℃、5％CO₂濃度のCO₂インキュベーターで培養した。培養過程において、3〜4日おきに相応のウェルに対して液を交換した。十分な培養時間を経過した後（＞21日）、当日調製された4％ホルマリン溶液および2％のAlizarin Red S染液で各ウェルの固定および染色処理を行った。培地を吸って除去し、DPBSで1回洗浄し、かつ細胞を4％ホルマリン溶液で30分間固定した。固定後、蒸留水で2回洗浄し、さらに2％のAlizarin Red S染液（pH=4.2）を入れて2〜3分間染色した。蒸留水で3回洗浄し、さらに顕微鏡で各実験群およびコントロール群を観察し、画像を保存した。
実験結果：実験の25日目に細胞の生長状況を観察した。実験群では、染色で節状沈殿が淡褐色を示し、節状沈殿がカルシウム塩の沈殿であることが実証され（図5.1）、コントロール群では染色で陰性を示した（図5.2）。
このように、本実施例は、本発明のhaMPCsは骨形成分化培地の培養条件で細胞形態学および代表的な化学染色処理で骨細胞の特徴を表し、haMPCsが骨細胞への分化能を有することを示した。

実施例6 SVFの動物安全性試験
SDラットに尾静脈からヒト脂肪由来の間質血管層細胞（hSVF）を注射し、細胞投与量は、高投与量群では1.0×10⁹/65kgで、適量群では5.0×10⁷/65kgであった。48時間後、皮疹、鳥肌、呼吸加速、震えなど異常のアレルギー反応が見られず、ラットの死亡がなかった。10週間観察したところ、ラットの生存状況が良好で、体温、食欲および体重の変化が正常で、中では、平均体重の変化は、適量群、高投与量群およびコントロール群は元の100gからそれぞれ502g、489gおよび493gに増加し、顕著な差がなかった。hSVF注射終了後の2週間は、SDラットの血清アルブミン、グロブリンおよびアルブミン/グロブリンのレベルは正常の範囲内で（表4）、ALT、クレアチニン、尿素窒素、ブドウ糖などの指標も正常の範囲内で（表5）、実験群とコントロール群では顕著な差がなかった。本研究の結果は、SVFの静脈注射はラットには安全で、異種間でのSVFの使用で免疫拒絶反応が見られなかったことを示した。

実施例7 冷凍保存後回復させたhaMPCsの安全性試験
継代培養の第三代（P3代）のhaMPCsを冷凍保存後回復させ、ヌードマウスに尾静脈から注射し、細胞投与量は、適量群では3.1×10²/gで、高投与量群では1.5×10³/gであった。注射後14日観察を続けたところ、実験動物の生存状況が良好で、異常反応が見られず、体温、食欲および体重の変化が正常で、中では、体重の増加は、適量群、高投与量群およびコントロール群はそれぞれ11.8％、13.9％および14.3％で、群間では顕著な差がなかった。haMPCsの体内への注射は、肝臓、脾臓、腎臓、肺、脳、心臓、胸腺、甲状腺および睾丸/卵巣などの主要な臓器に顕著な影響を与えず、臓器の指数に顕著な変化がなかった。顕微鏡で肝臓、腎臓、脾臓および睾丸/卵巣を観察したところ、構造が正常で、間質増殖、脂肪浸潤および炎症性細胞浸潤などの病理的変化が見られなかった。実験群で脾臓に顕著に増加した巨核球または多核巨細胞が見られただけで、haMPCs注射後のマクロファージの免疫反応に関連する可能性があるため、更なる研究が必要である。本実験において、マウスの血液の生物化学指標はいずれも正常範囲内で変化し、適量群および高投与量群とコントロール群で顕著な差が見られなかった（表6〜8）。本研究の結果は、haMPCsの静脈注射はマウスには安全で、異種間でのhaMPCsの使用で免疫拒絶反応が見られなかったことを示した。

各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。

Claims

変形性関節症を予防および/または治療する薬物組成物の製造に使用される、異系間質血管層細胞（SVF）および異系間葉前駆細胞（haMPCs）の使用であって、
異系間葉前駆細胞が、以下の特徴：
（i）95％以上の細胞が表面抗原CD90を有すること、
（ii）95%以上の細胞が表面抗原CD73を有すること、
（iii）95％以上の細胞が表面抗原CD29を有すること、
（iv）95％以上の細胞が表面抗原CD49dを有すること、
（vii）2％以下の細胞が表面抗原CD34を有すること、
を有し、
前記の異系間質血管層細胞が、
（i）30％以上の細胞が表面抗原CD29を有すること、
（ii）50％以上の細胞が表面抗原CD73を有すること、
（iii）85％以上の細胞が表面抗原CD49dを有すること、
（iv）55％以上の細胞が表面抗原CD90を有すること、
からなる群から選ばれる任意の1つまたは2つ以上の特徴を有し、
異系間葉前駆細胞が、異系脂肪由来である、前記使用。
前記の異系間質血管層細胞は、以下の特徴：
（i）30％以上の細胞が表面抗原CD29を有すること、
（ii）50％以上の細胞が表面抗原CD73を有すること、
（iii）85％以上の細胞が表面抗原CD49dを有すること、
（iv）55％以上の細胞が表面抗原CD90を有すること、
を有する、請求項1に記載の使用。
前記の異系間質血管層細胞は、
（v）85％以下の細胞が表面抗原CD34を有すること、
（vi）15％以下の細胞が表面抗原CD45を有すること、
からなる群から選ばれる任意の1つまたは2つ以上の特徴を有する、請求項1に記載の使用。
前記の異系間質血管層細胞は、幹細胞増殖因子（HGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、ヒトトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-10（IL-10）からなる群から選ばれるサイトカイン、またはこれらの組み合わせを分泌する、請求項1に記載の使用。
前記の異系間葉前駆細胞は、
（i）98％以上の細胞が表面抗原CD90を有すること、
（ii）98%以上の細胞が表面抗原CD73を有すること、
（iii）98％以上の細胞が表面抗原CD29を有すること、
（iv）98％以上の細胞が表面抗原CD49dを有すること、
からなる群から選ばれる任意の1つまたは2つ以上の特徴を有する、請求項1に記載の使用。
前記の異系間葉前駆細胞は、
（v）2％以下の細胞が表面抗原HLA-DRを有すること、
（vi）2％以下の細胞が表面抗原アクチンを有すること、
（vii）2％以下の細胞が表面抗原CD34を有すること、
（viii）2％以下の細胞が表面抗原CD45を有すること、
（ix）2％以下の細胞が表面抗原CD14を有すること、
からなる群から選ばれる任意の1つまたは2つ以上の特徴を有する、請求項1に記載の使用。
前記の異系間葉前駆細胞は、血管内皮増殖因子（VEGF）、ヒトトランスフォーミング増殖因子α（TGF-α）、ヒトトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、肝細胞増殖因子（HGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-10（IL-10）からなる群から選ばれるサイトカインを分泌する、請求項1に記載の使用。
変形性関節症の予防および/または治療に使用される薬物組成物であって、有効量の異系間質血管層細胞（SVF）および異系間葉前駆細胞（haMPCs）と、薬学的に許容される担体とを含み、
異系間葉前駆細胞が、以下の特徴：
（i）95％以上の細胞が表面抗原CD90を有すること、
（ii）95%以上の細胞が表面抗原CD73を有すること、
（iii）95％以上の細胞が表面抗原CD29を有すること、
（iv）95％以上の細胞が表面抗原CD49dを有すること、
（vii）2％以下の細胞が表面抗原CD34を有すること、
を有し、
前記の異系間質血管層細胞が、
（i）30％以上の細胞が表面抗原CD29を有すること、
（ii）50％以上の細胞が表面抗原CD73を有すること、
（iii）85％以上の細胞が表面抗原CD49dを有すること、
（iv）55％以上の細胞が表面抗原CD90を有すること、
からなる群から選ばれる任意の1つまたは2つ以上の特徴を有し、
異系間葉前駆細胞が、異系脂肪由来である、薬物組成物。