ES2862248T3 - Uso de células alogénicas de la capa vascular intersticial y células progenitoras mesenquimales alogénicas para prevenir o tratar la osteoartritis - Google Patents

Uso de células alogénicas de la capa vascular intersticial y células progenitoras mesenquimales alogénicas para prevenir o tratar la osteoartritis Download PDF

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende células progenitoras mesenquimales alogénicas (haMPC) y células alogénicas de la capa vascular intersticial (SVF) para su uso para prevenir y/o tratar la osteoartritis; dichas células progenitoras mesenquimales alogénicas tienen las siguientes características: (i) más del 95 % de las células tienen el antígeno de superficie CD90; (ii) más del 95 % de las células tienen el antígeno de superficie CD73; (iii) más del 95 % de las células tienen el antígeno de superficie CD29; (iv) más del 95 % de las células tienen el antígeno de superficie CD49d; y dichas células alogénicas de la capa vascular intersticial tienen las siguientes características: (i) más del 30 % de las células tienen el antígeno de superficie CD29; (ii) más del 50 % de las células tienen el antígeno de superficie CD73; (iii) más del 85 % de las células tienen el antígeno de superficie CD49d; (iv) más del 55 % de las células tienen el antígeno de superficie CD90.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de células alogénicas de la capa vascular intersticial y células progenitoras mesenquimales alogénicas para prevenir o tratar la osteoartritis
Campo de la invención
La presente invención pertenece al campo de las células madre y la biomedicina. Específicamente, la presente invención se refiere al uso de células alogénicas de la capa vascular intersticial y células progenitoras mesenquimales alogénicas para prevenir o tratar la osteoartritis.
Antecedentes de la invención
La osteoartritis (OA) es una enfermedad crónica de las articulaciones caracterizada por la degeneración y destrucción del cartílago articular, así como la hiperplasia ósea. La morbilidad de la OA es del 50 % en las poblaciones mayores de 60 y del 80 % en las mayores de 75, y la tasa de discapacidad de la OA es de hasta el 53 % ("Osteoartritis Treatment Guidelines (Rev)", Asociación Médica China de Ortopedia, 2007). La OA es común en articulaciones como la rodilla, específicamente osteoartritis de rodilla (KOA), que sufren una gran carga y actividades frecuentes. La osteoartritis de rodilla es una de las principales enfermedades que conduce a una disfunción de la actividad en personas mayores y genera una pesada carga financiera para el seguro médico y para la familia.
En la actualidad, el principio general para el tratamiento de la osteoartritis de rodilla (KOA) es la combinación de terapia farmacológica y no farmacológica con cirugías cuando es necesario, para lograr aliviar o eliminar el dolor, corregir la deformidad, mejorar o restaurar la función articular y mejorar así la calidad de vida.
La terapia farmacológica comprende principalmente analgésicos como antiinflamatorios no esteroideos (AINE), inyección intraarticular de ácido hialurónico (AH) o corticoesteroides, fármacos para mejorar el estado de la enfermedad, agentes protectores del cartílago, etc. Estos fármacos pueden retrasar hasta cierto punto el curso de la enfermedad y mejorar los síntomas de los pacientes. Sin embargo, su eficacia es limitada, la progresión patológica es irreversible, el daño del cartílago es irreparable y la mayoría de los fármacos tienen efectos secundarios obvios. Cuando la terapia convencional resulta inválida, se necesitan cirugías para los pacientes con deformidad articular y disfunción articular. Los tratamientos quirúrgicos se realizan principalmente mediante cirugía artroscópica (con endoscopio) y abierta. Aunque pueden aliviar temporalmente el dolor, estos tratamientos son costosos y tienen un efecto deficiente a largo plazo. Se reporta que, entre 10 y 15 años después de una cirugía de reemplazo articular, la prótesis comienza a desgastarse o incluso a aflojarse. Por lo tanto, los estudios actuales tienen como objetivo explorar nuevos tratamientos y estrategias de reparación.
La ingeniería de tejidos se dedica al trasplante de condrocitos autólogos o al trasplante de condrocitos autólogos inducido por matriz y proporciona la posibilidad de una solución a largo plazo para reparar o regenerar biológicamente los tejidos articulares degradados. Sin embargo, este tipo de tecnología se limita principalmente al tratamiento de grandes defectos del cartílago. Factores como daños en el sitio del donante, la desdiferenciación y el tiempo limitado de supervivencia de las células del cartílago hacen que el método no sea adecuado para pacientes con KOA.
Actualmente, muchos estudios están dirigidos a células progenitoras mesenquimales alogénicas de otras fuentes, como las células progenitoras mesenquimales alogénicas adiposas. Las células progenitoras mesenquimales alogénicas adiposas se caracterizan por su gran disponibilidad, seguridad, baja inmunogenicidad y excelente capacidad de inmunorregulación, que proporcionan un efecto único en los tratamientos para KOA. El solicitante también ha desarrollado células progenitoras mesenquimales adiposas autólogas con efectos curativos clínicos definidos. Sin embargo, a algunos pacientes con KOA no se les puede proporcionar tejido adiposo autólogo, como los pacientes que padecen enfermedades infecciosas o pacientes ancianos y demacrados, lo que hace que no puedan utilizar células progenitoras mesenquimales adiposas autólogas para tratar la KOA.
El documento US2004/166096A1 describe una composición que comprende una célula madre adulta derivada de tejido adiposo aislada y diferenciada para expresar al menos una característica de un condrocito, en combinación con un material líquido viscoso biocompatible, implantada en un huésped que necesita reparación del cartílago articular.
El documento US2012/201791A1 se refiere a un método para tratar o prevenir una enfermedad en un paciente que consiste en administrar al paciente una composición terapéutica que comprende células madre mesenquimales, y en donde la enfermedad se selecciona de un grupo que consiste en osteoartritis, artritis reumatoide, etc.
El documento US2011/262402A1 describe una composición farmacéutica para el tratamiento de la artritis que comprende células madre mesenquimales humanas, en donde el sujeto es preferentemente un ser humano.
El documento US2012/269774A1 describe un método de terapia con células madre alogénicas para el tratamiento de enfermedades como la osteoartritis, en donde las células madre son preferentemente células madre mesenquimales obtenidas a partir de tejido adiposo.
El documento WO2013/003899A1 describe un método para tratar enfermedades reumáticas que incluyen la osteoartritis, mediante la administración de una población de células progenitoras mesenquimales (MPC) enriquecidas con células positivas para STRO-1.
Por tanto, el solicitante desarrolla células progenitoras mesenquimales alogénicas para satisfacer las demandas de esos pacientes.
Resumen de la invención
El objeto de la presente invención es proporcionar el uso de células alogénicas de la capa vascular intersticial y células progenitoras mesenquimales alogénicas para el tratamiento o la prevención de la osteoartritis de rodilla. El primer aspecto de la invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende células progenitoras mesenquimales alogénicas (haMPC) y células alogénicas de la capa vascular intersticial (SVF) para prevenir y/o tratar la osteoartritis; dichas células progenitoras mesenquimales alogénicas tienen las siguientes características:
(i) más del 95 % de las células tienen el antígeno de superficie CD90;
(ii) más del 95 % de las células tienen el antígeno de superficie CD73;
(iii) más del 95 % de las células tienen el antígeno de superficie CD29;
(iv) más del 95 % de las células tienen el antígeno de superficie CD49d;
y dichas células alogénicas de la capa vascular intersticial tienen las siguientes características:
(i) más del 30 % de las células tienen el antígeno de superficie CD29;
(ii) más del 50 % de las células tienen el antígeno de superficie CD73;
(iii) más del 85 % de las células tienen el antígeno de superficie CD49d;
(iv) más del 55 % de las células tienen el antígeno de superficie CD90.
En otra modalidad preferida, dicha osteoartritis se selecciona de un grupo que consiste en osteoartritis de rodilla, osteoartritis espinal, osteoartritis de cadera y una combinación de las mismas.
En otra modalidad preferida, dicha osteoartritis es osteoartritis de rodilla.
En otra modalidad preferida, dichas células alogénicas de la capa vascular intersticial son poblaciones de células alogénicas de la capa vascular intersticial.
En otra modalidad preferida, dichas células progenitoras mesenquimales alogénicas son poblaciones de células progenitoras mesenquimales alogénicas.
En otra modalidad preferida, más del 35 % de las células tienen el antígeno de superficie CD29.
En otra modalidad preferida, más del 55 % de las células tienen el antígeno de superficie CD73.
En otra modalidad preferida, más del 90 % de las células tienen el antígeno de superficie CD49d.
En otra modalidad preferida, más del 60 % de las células tienen el antígeno de superficie CD90.
En otra modalidad preferida, dichas células alogénicas de la capa vascular intersticial tienen una o varias características seleccionadas del grupo siguiente:
(v) menos del 85 % de las células tienen el antígeno de superficie CD34;
(vi) menos del 15 % de las células tienen el antígeno de superficie CD45.
En otra modalidad preferida, menos del 80 % de las células tienen el antígeno de superficie CD34.
En otra modalidad preferida, menos del 12 % de las células tienen el antígeno de superficie CD45.
En otra modalidad preferida, las citocinas secretadas por dichas células alogénicas de la capa vascular intersticial se seleccionan de un grupo que consiste en, factor de crecimiento de células madre (HGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGf), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante P (TGF-P), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), interleucina-2 (IL-2), interleucina-10 (IL-l0) y combinaciones de las mismas.
En otra modalidad preferida, dichas células alogénicas de la capa vascular intersticial son poblaciones de células alogénicas de la capa vascular intersticial.
En otra modalidad preferida, la concentración del factor de crecimiento de células madre (HGF) secretado a partir de células alogénicas de la capa vascular intersticial es > 0,5 ng/ml, preferentemente > 0,8 ng/ml.
En otra modalidad preferida, la concentración del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) secretado a partir de células alogénicas de la capa vascular intersticial es > 35 pg/ml, preferentemente > 40 pg/ml.
En otra modalidad preferida, la concentración del factor de crecimiento transformante P (TGF-P) secretado a partir de células alogénicas de la capa vascular intersticial es > 150 pg/ml, preferentemente > 180 pg/ml.
En otra modalidad preferida, la concentración de interleucina-2 (IL-2) secretada a partir de células alogénicas de la capa vascular intersticial es >15 pg/ml, preferentemente >20 pg/ml y con mayor preferencia >30 pg/ml.
En otra modalidad preferida, la concentración de interleucina-10 (IL-10) secretada a partir de células alogénicas de la capa vascular intersticial es > 15 pg/ml, preferentemente > 20 pg/ml, con mayor preferencia > 30 pg/ml y con la máxima preferencia > 40 pg/ml.
En otra modalidad preferida, dichas células progenitoras mesenquimales alogénicas tienen una o varias características seleccionadas del siguiente grupo:
(i) más del 98 % de las células tienen el antígeno de superficie CD90;
(ii) más del 98 % de las células tienen el antígeno de superficie CD73;
(iii) más del 98 % de las células tienen el antígeno de superficie CD29;
(iv) más del 98 % de las células tienen el antígeno de superficie CD49d.
En otra modalidad preferida, más del 98 % de las células tienen el antígeno de superficie CD90.
En otra modalidad preferida, más del 98 % de las células tienen el antígeno de superficie CD73.
En otra modalidad preferida, más del 98 % de las células tienen
Figure imgf000004_0001
ntígeno de superficie CD29.
En otra modalidad preferida, más del 98 % de las células tienen
Figure imgf000004_0002
ntígeno de superficie CD49d.
En otra modalidad preferida, dichas células progenitoras mesenquimales alogénicas tienen una o varias características seleccionadas del siguiente grupo:
(v) menos del 2 % de las células tienen el antígeno de superficie HLA-DR;
(vi) menos del 2 % de las células tienen el antígeno de superficie actina;
(vii) menos del 2 % de las células tienen el antígeno de superficie CD34;
(viii) menos del 2 % de las células tienen el antígeno de superficie CD45;
(ix) menos del 2 % de las células tienen el antígeno de superficie CD14.
En otra modalidad preferida, menos del 1 % de las células tienen el antígeno de superficie HLA-DR.
En otra modalidad preferida, menos del 1 % de las células tienen el antígeno de superficie actina.
En otra modalidad preferida, menos del 1 % de las células tienen el antígeno de superficie CD34.
En otra modalidad preferida, menos del 1 % de las células tienen el antígeno de superficie CD45.
En otra modalidad preferida, menos del 1 % de las células tienen el antígeno de superficie CD14.
En otra modalidad preferida, las citocinas secretadas por dichas células progenitoras mesenquimales alogénicas se seleccionan del grupo que consiste en, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento transformante a (TGF-a), factor de crecimiento transformante P (TGF-P), factor estimulante de colonia de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4) e interleucina-l0 (IL-10).
En otra modalidad preferida, la concentración del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) secretado por las células progenitoras mesenquimales alogénicas es > 10 pg/ml, preferentemente > 15 pg/ml.
En otra modalidad preferida, la concentración del factor de crecimiento transformante p (TGF-P) secretado por las células progenitoras mesenquimales alogénicas es > 300 pg/ml, preferentemente > 400 pg/ml.
En otra modalidad preferida, la concentración del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) secretado por las células progenitoras mesenquimales alogénicas es > 30 ng/ml, preferentemente > 40 ng/ml. En otra modalidad preferida, la concentración del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) secretado por las células progenitoras mesenquimales alogénicas es > 0,4 ng/ml, preferentemente > 0,5 ng/ml.
En otra modalidad preferida, la concentración del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) secretado por las células progenitoras mesenquimales alogénicas es > 0,008 ng/ml, preferentemente > 0,01 ng/ml.
En otra modalidad preferida, la concentración de interleucina-2 (IL-2) secretada por las células progenitoras mesenquimales alogénicas es > 25 pg/ml, preferentemente > 30 pg/ml.
En otra modalidad preferida, la concentración de interleucina 10 (IL-10) secretada por las células progenitoras mesenquimales alogénicas es > 30 pg/ml, preferentemente > 40 pg/ml.
El segundo aspecto de la invención es proporcionar una composición farmacéutica para prevenir y/o tratar la osteoartritis, dicha composición farmacéutica comprende: células alogénicas de la capa vascular intersticial (SVF) y células progenitoras mesenquimales alogénicas (haMPC) con dosis eficaces y portadores farmacéuticamente aceptables.
En otra modalidad preferida, dicha composición farmacéutica es un agente de inyección subcutánea.
En otra modalidad preferida, dichos portadores farmacéuticamente aceptables comprenden (pero no se limitan a): solución salina, solución tampón, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.
En otra modalidad preferida, la concentración de dichas células alogénicas de la capa vascular intersticial es 0,1-100x104 células/ml, preferentemente 1-10x104 células/ml, con mayor preferencia 2x105 células/ml.
En otra modalidad preferida, la concentración de dichas células progenitoras mesenquimales alogénicas es 0,1-100x104 células/ml, preferentemente 1-10x104 células/ml, con mayor preferencia 2x105 células/ml.
El tercer aspecto de la invención es proporcionar un método para prevenir y/o tratar la osteoartritis que comprende la etapa de: administrar células alogénicas de la capa vascular intersticial (SVF) o células progenitoras mesenquimales alogénicas (haMPC), o administrar una composición farmacéutica que comprende células alogénicas de la capa vascular intersticial (SVF) o células progenitoras mesenquimales alogénicas (haMPC) a un sujeto que lo necesite. En otra modalidad preferida, dicho sujeto es un mamífero humano o no humano, preferentemente humano.
En otra modalidad preferida, dicho método comprende las etapas de:
(1) administrar células alogénicas de la capa vascular intersticial a un sujeto que lo necesite; y
(2) administrar células progenitoras mesenquimales alogénicas a un sujeto que lo necesite.
En otra modalidad preferida, el sitio de administración es dentro de la artrosis de dicho sujeto.
En otra modalidad preferida, el intervalo de tiempo entre la etapa (1) y la etapa (2) es más de un mes y/o más de 3 meses.
Debe entenderse que, en la presente invención, cada una de las características técnicas descritas anteriormente y a continuación (como en los Ejemplos) pueden combinarse entre sí, para constituir de esta manera soluciones técnicas nuevas o preferidas que no necesitan ser especificadas nuevamente en la presente descripción.
Descripción de Figuras
Las siguientes figuras se usan para ilustrar las modalidades específicas de la presente invención en lugar de limitar el alcance de la presente invención definido por las reivindicaciones.
La Figura 1 muestra el proceso de tratamiento de KOA mediante tratamiento mixto de SVF y haMPC alogénicas. La Figura 2 muestra los resultados de la detección de antígeno de superficie de SVF, en donde las Figuras 2A-2I muestran respectivamente el resultado de la detección de antígeno para CD34, CD29, CD73, CD49d, CD90, CD14, CD45, actina y HLA-DR.
La Figura 3 muestra el cambio en las cantidades de secreción de VEGF de las haMPC; la Figura 3A muestra el cambio en las cantidades de secreción de VEGF de las haMPC después de una estimulación de 24 h por LPS; la Figura 3B muestra el efecto de la estimulación de la hipoxia sobre las cantidades de secreción de VEGF de las haMPC.
La Figura 4 muestra el resultado de los experimentos de inducción condrogénica de haMPC.
La Figura 5 muestra el resultado de los experimentos de inducción osteogénica de haMPC.
Modalidades detalladas
Tras estudios extensos e intensivos, el inventor ha descubierto inesperadamente por primera vez que células alogénicas de la capa vascular intersticial y las células progenitoras mesenquimales alogénicas poseen un efecto excelente en la prevención y/o el tratamiento de la osteoartritis. Específicamente, pueden lograrse efectos prominentes sobre la prevención o el tratamiento de la osteoartritis mediante la administración a un sujeto que lo necesite de las células alogénicas de la capa vascular intersticial o las células progenitoras mesenquimales alogénicas derivadas de tejido adiposo alogénico de acuerdo con la presente invención, o la composición farmacéutica que comprende a células alogénicas de la capa vascular intersticial o las células progenitoras mesenquimales alogénicas derivadas de tejido adiposo alogénico. Las células progenitoras mesenquimales alogénicas poseen una excelente capacidad para la secreción de citocinas y pueden reparar las lesiones corporales en condiciones adecuadas in vivo. Las células alogénicas de la capa vascular intersticial y las células progenitoras mesenquimales alogénicas poseen capacidad de diferenciación condrogénica y capacidad de diferenciación osteogénica. La presente invención también proporciona un método para prevenir y/o tratar la osteoartritis, y una composición farmacéutica que comprende células alogénicas de la capa vascular intersticial o células progenitoras mesenquimales alogénicas. La presente invención se completa sobre esta base.
Términos
Como se usa en la presente descripción, los términos "más que" y "menos que" incluyen el número en sí, por ejemplo, "más del 95 %" significa > 95 %, "menos del 0,2 %" significa < 0,2 %.
Osteoartritis
Como se usa en la presente descripción, los términos "osteoartritis" y "OA" pueden usarse indistintamente.
La osteoartritis es una enfermedad articular crónica con cambios principales de degeneración de la superficie del cartílago articular e hiperostosis secundaria que manifiesta dolor y rigidez articular. La radiografía muestra estrechamiento del espacio articular, endurecimiento del hueso subcondral, fractura de la trabécula ósea, esclerosis, degeneración quística, hiperplasia labial en el borde de la articulación, deformación del capítulo en la etapa tardía, irregularidad en la superficie articular, denudación del cartílago articular y cuerpos libres intraarticulares formados por huesos fracturados caídos.
En la presente invención, dicha osteoartritis puede ser cualquier osteoartritis seleccionada del siguiente grupo que consiste en osteoartritis de rodilla, osteoartritis espinal, osteoartritis de cadera y las combinaciones de las mismas. La osteoartritis en la presente invención es preferentemente osteoartritis de rodilla.
Tejido Adiposo
La grasa es una buena fuente de tratamientos plásticos y antienvejecimiento. Los materiales del tejido adiposo pueden obtenerse de partes de la cintura, las caderas, el abdomen, los muslos, la parte superior de los brazos, etc. Los expertos en la técnica pueden obtener tejidos adiposos mediante técnicas y métodos comunes que incluyen (pero no se limitan a) succión o separación quirúrgica, etc.
En la presente invención, los tejidos adiposos o las fuentes adiposas no están específicamente limitadas. Pueden derivarse de cualquier parte de tejidos adiposos animales o humanos, preferentemente tejidos adiposos humanos. Preferentemente, los tejidos adiposos pueden ser tejidos de la cintura, caderas, abdomen, muslos, brazos, etc. Células alogénicas de la capa vascular intersticial
Como se usa en la presente descripción, el término "célula alogénica de la capa vascular intersticial", "SVF" o "fragmento(s) vascular(es) estromal(es)" pueden usarse indistintamente.
Las células alogénicas de la capa vascular intersticial son un tipo de células madre con una potencia de diferenciación multidireccional extraídas de los tejidos adiposos. Las SVF pueden proliferar de forma estable in vitro con una tasa de atenuación baja. Pueden obtenerse fácilmente de una gran cantidad de reserva en el cuerpo, son adecuados para el cultivo a gran escala y hacen poco daño al cuerpo, y pueden obtenerse de fuentes diversas con baja antigenicidad, por lo que son adecuadas para aloinjertos. La sVf es el componente más importante en el trasplante adiposo asistido por células madre. Los grupos de células formados por mezclas que contienen variedades de células aisladas de los tejidos adiposos por digestión con colagenasa se denominan fragmentos vasculares estromales. Los fragmentos vasculares estromales comprenden abundantes células mesenquimales, que pueden diferenciarse en múltiples linajes de células, por lo que son las células semillas ideales en medicina regenerativa, ingeniería de tejidos, etc.
Como se usa en la presente descripción, los términos "método de separación" y "método de separación de SVF" pueden usarse indistintamente, ambos en referencia al método o los procesos para obtener SVF aisladas de los tejidos adiposos originales. Los materiales de adipocitos de SVF obtenidos se lavan en primer lugar para eliminar las células sanguíneas; luego se someten a rotura y digestión de grasas. Los tejidos no digeridos se eliminan para obtener un filtrado que contiene SVF y las SVF se obtienen por centrifugación. Las SVF obtenidas pueden usarse para un posterior pase, cultivo o crioconservación.
En una modalidad preferida, la separación de SVF puede incluir (pero sin limitarse a) las siguientes etapas: lavar con PBS dos veces el tejido adiposo obtenido de la liposucción, luego digerir a 37 °C durante 30 minutos con colagenasa, para obtener, por centrifugación a 1200 g durante 10 minutos, fragmentos de SVF de alta densidad que comprenden principalmente células mesenquimales, células endoteliales y células parietales. Además, las FVS comprenden algunas células derivadas de vasos, como leucocitos, eritrocitos, etc. Las diferentes células tienen efectos sinérgicos.
Detección de antígeno de células alogénicas de la capa vascular intersticial
Las SVF usadas en la presente invención están altamente purificadas y sustancialmente libres de otros tipos de células o células madre. Esto puede verificarse mediante la detección de antígenos de superficie celular.
La SVF tiene una variedad de antígenos y receptores específicos, principalmente CD3, CD13, D29, CD34, CD45, CD49e, CD59, CD73, CD90, CD105 o HLA-ABC, etc.
El antígeno CD34 es una proteína transmembrana de tipo I altamente glicosilada, que se expresa selectivamente en la superficie de células madre hematopoyéticas (HSC), células progenitoras (PC) y células endoteliales (EC) humanas. El porcentaje de células progenitoras del tejido adiposo con CD34 en las células madre totales es preferentemente < 0,2 %, con mayor preferencia < 0,2 %.
El CD45 existe en la superficie de todas las células sanguíneas, incluidas las células madre hematopoyéticas y los osteoclastos. El porcentaje de células madre de tejido adiposo con CD45 en las células progenitoras totales es preferentemente < 0,1 %.
CD29, CD73, CD49d, CD90, etc., existen principalmente en la superficie de las células progenitoras mesenquimales adiposas alogénicas.
El porcentaje de SVF con CD29 en las células madre totales es preferentemente > 30 %, con mayor preferencia > 32 %, con la máxima preferencia > 35 %.
El porcentaje de SVF con CD73 en las células madre totales es preferentemente > 50 %, con mayor preferencia > 60 %, con la máxima preferencia > 70 %.
El porcentaje de SVF con CD49d en las células madre totales es preferentemente > 85 %, con mayor preferencia > 90 %, con la máxima preferencia > 95 %.
El porcentaje de SVF con CD90 en las células madre totales es preferentemente > 55 %, con mayor preferencia > 60 %, con la máxima preferencia > 65 %.
Un experto en la técnica puede detectar la pureza y el grado de diferenciación de FVS mediante métodos comunes, como la citometría de flujo. Durante la detección, se añaden diferentes anticuerpos específicos dirigidos. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales intactos, o fragmentos de anticuerpos que tienen actividad inmunológica, tales como fragmentos Fab' o (Fab) 2; cadenas pesadas de anticuerpos; cadenas ligeras de anticuerpos; molécula Fv monocatenaria obtenida por ingeniería genética (Ladner y otros, patente de Estados Unidos N° 4,946,778); o anticuerpos quiméricos, tales como anticuerpos que tienen especificidad de unión a anticuerpos murinos mientras que mantienen las porciones del anticuerpo humano. Después de que los anticuerpos añadidos se unen con los antígenos de la superficie celular durante un cierto tiempo, las células se analizan automáticamente y se clasifican mediante citometría de flujo.
Células progenitoras mesenquimales derivadas de tejido adiposo alogénico
Como se usa en la presente descripción, el término "células progenitoras mesenquimales derivadas de tejido adiposo alogénico", "haMPC" o "células progenitoras mesenquimales derivadas de tejido adiposo" tiene el mismo significado y pueden usarse indistintamente.
Las células progenitoras mesenquimales derivadas de tejido adiposo alogénico son preferentemente células progenitoras mesenquimales alogénicas derivadas de tejido adiposo alogénico humano.
Los expertos en la técnica pueden separar y cultivar las haMPC mediante métodos convencionales. En una modalidad preferida, se realizan las siguientes etapas:
a. dispensar el tejido adiposo: transferir el tejido adiposo extraído a un tubo de centrífuga, en donde, el tejido adiposo extraído se divide en dos partes, una parte para el lavado y la digestión por colagenasa para preparar la suspensión de células SVF para autotransfusión directa, y la otra parte para el cultivo posterior después de obtener SVF para proporcionar células progenitoras adiposas;
b. digerir el tejido adiposo: añadir enzimas al tubo de centrífuga, someter a digestión del tejido adiposo en vibrador a temperatura constante. Tras la digestión, descartar el tejido adiposo digerido en la capa superior; y recoger el precipitado para lavar;
c. filtrar: añadir líquido para lavado de células y mezclar hasta homogeneizar; someter las células al recuento tras la filtración por malla de filtración, centrifugación y lavado para la precipitación. Las células filtradas son células de la fracción vascular estromal SVF. La SVF es una mezcla de varias células aisladas del tejido adiposo y es una población celular formada por varias células alogénicas, en donde, células similares a las MPC, células endoteliales (progenitoras), células del músculo liso vascular y otras células derivadas de la sangre, incluidas granulocitos, monocitos, linfocitos y similares;
d. preparar la suspensión de SVF: preparar las células de SVF filtradas en 5 ml de suspensión de células; inyectar la suspensión en una bolsa de solución salina de 100 ml tras succionar con una jeringa;
e. cultivar las células: inocular las células en un matraz de cultivo, en donde, la densidad de la inoculación se ajusta de acuerdo con los recuentos de células, y someter el producto a una incubadora de CO2 para cultivo; f. realizar pases: cultivar las células adherentes durante 5-7 días para formar colonias después de que algunas células progenitoras mesenquimales alogénicas adherentes comiencen a aparecer después de una inoculación de aproximadamente 3 días. Digerir, pasar y luego recoger las células para el recuento celular. Someter las células adherentes primarias a pases en una proporción de 1: 1-2 y cultivar durante 2-3 semanas. Recoger las células (células progenitoras derivadas de tejido adiposo alogénico);
g. preparar una suspensión de células progenitoras derivadas del tejido adiposo: centrifugar y lavar las células progenitoras derivadas del tejido adiposo recogidas y luego inyectar solución salina para producir una suspensión de células.
Detección de antígeno de células progenitoras mesenquimales alogénicas derivadas de tejido adiposo alogénico
Las células progenitoras mesenquimales derivadas de tejido adiposo alogénico usadas en la presente invención están altamente purificadas y tienen una actividad excelente.
Los expertos en la técnica pueden detectar el antígeno de superficie de células progenitoras mesenquimales alogénicas mediante métodos convencionales, por ejemplo, por citometría de flujo.
Las células progenitoras mesenquimales alogénicas derivadas del tejido adiposo alogénico tienen varios antígenos y receptores específicos, que comprenden principalmente: CD29, CD73, CD90, CD49d, etc.
El porcentaje de células progenitoras mesenquimales alogénicas con antígeno CD73 en células progenitoras mesenquimales alogénicas totales es > 95 %, preferentemente > 98 %, con mayor preferencia > 99 %, con la máxima preferencia 100 %.
El porcentaje de células progenitoras mesenquimales alogénicas con antígeno CD90 en células progenitoras mesenquimales alogénicas totales es > 95 %, preferentemente > 98 %, con mayor preferencia > 99 %, con la máxima preferencia 100 %.
El porcentaje de células progenitoras mesenquimales alogénicas con antígeno CD29 en células progenitoras mesenquimales alogénicas totales es > 95 %, preferentemente > 98 %, con mayor preferencia > 99 %, con la máxima preferencia 100 %.
El porcentaje de células progenitoras mesenquimales alogénicas con antígeno CD49d en células progenitoras mesenquimales alogénicas totales es > 95 %, preferentemente > 98 %, con mayor preferencia > 99 %, con la máxima preferencia 100 %.
Los marcadores negativos de células progenitoras mesenquimales alogénicas derivadas del tejido adiposo alogénico son: HLA-DR, Actina, CD34, CD45, CD14, etc.
El porcentaje de células progenitoras mesenquimales alogénicas con antígeno HLA-DR en células progenitoras mesenquimales alogénicas totales es < 2 %, preferentemente < 1 %, con mayor preferencia < 0,5 %, con la máxima preferencia sin antígeno HLA-DR.
El porcentaje de células progenitoras mesenquimales alogénicas con antígeno actina en células progenitoras mesenquimales alogénicas totales es < 2 %, preferentemente < 1 %, con mayor preferencia < 0,5 %, con la máxima preferencia sin antígeno actina.
El porcentaje de células progenitoras mesenquimales alogénicas con CD34 en células progenitoras mesenquimales alogénicas totales es < 2 %, preferentemente < 1 %, con mayor preferencia < 0,5 %, con la máxima preferencia sin CD34.
El porcentaje de células progenitoras mesenquimales alogénicas con CD45 en células progenitoras mesenquimales alogénicas totales es < 2 %, preferentemente < 1 %, con mayor preferencia < 0,5 %, con la máxima preferencia sin CD45.
El porcentaje de células progenitoras mesenquimales alogénicas con CD14 en el total de células progenitoras mesenquimales alogénicas es <2 %, preferentemente <1%, con mayor preferencia <0,5 %, con la máxima preferencia sin CD14.
Las haMPC usadas en la presente invención son preferentemente haMPC derivadas de seres humanos que pueden secretar una gran cantidad de citocinas tales como VEGF, TGF-a, TGF-p, GM-CSF, HGF, PDGF, IL-2, IL-4, IL-10, y tienen una notable capacidad clonogénica y baja inmunogenicidad.
Los expertos en la técnica pueden usar, tratar, administrar o realizar otras operaciones en las haMPC mediante métodos convencionales. Por ejemplo, cada lote de haMPC debe pasar las pruebas de esterilización, endotoxina y micoplasma, y la identificación de ADN antes de su liberación o uso. Cada lote de células liberado debe cumplir los requisitos de: viabilidad celular > 95 %, pureza celular (marcadores positivos > 95 %, marcadores negativos <2 %) y resultados negativos en las pruebas de alergia y toxicidad aguda de haMPC. Cada uno de los anteriores debe tener su correspondiente informe de prueba.
Composiciones farmacéuticas y su uso
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica, que comprende células alogénicas de la capa vascular intersticial o células progenitoras mesenquimales alogénicas con cantidades eficaces y portadores farmacéuticamente aceptables.
Normalmente, las células alogénicas de la capa vascular intersticial y las células progenitoras mesenquimales alogénicas pueden prepararse en un medio acuoso no tóxico, inerte y farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, cuyo pH es aproximadamente 5-8, preferentemente, aproximadamente 7-8.
Como se usa en la presente descripción, el término "cantidad eficaz" o "dosis eficaz" se refiere a la cantidad que puede generar una función o actividad en seres humanos y/o animales y puede ser aceptada por seres humanos y/o animales.
Como se usa en la presente descripción, un componente "farmacéuticamente aceptable" es una sustancia que puede aplicarse a seres humanos y/o mamíferos sin efectos secundarios adversos (como toxicidad, irritación y reacciones alérgicas), es decir, sustancias con una relación beneficio/riesgo razonable. El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador para la administración de un agente terapéutico, que incluye varios excipientes y diluyentes.
Los portadores de las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen (pero no se limitan a): solución salina, solución tampón, glucosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. Las preparaciones farmacéuticas generalmente deben coincidir con el método de administración. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse en forma de inyecciones, por ejemplo, preparadas con soluciones salinas o acuosas que contienen glucosa y otros adyuvantes, mediante métodos convencionales. Las composiciones farmacéuticas se preparan preferentemente en condiciones estériles. La cantidad de ingrediente activo administrada es una cantidad terapéuticamente eficaz. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención también pueden prepararse en formulaciones de liberación prolongada.
Las células alogénicas de la capa vascular intersticial y la cantidad eficaz de células progenitoras mesenquimales alogénicas de la presente invención pueden variar según el modo de administración y la gravedad de las enfermedades que se tratan. Una opción preferida para la cantidad eficaz puede basarse en una variedad de factores determinados por los expertos en la técnica (por ejemplo, mediante ensayos clínicos). Los factores incluyen, pero no se limitan a: los parámetros farmacocinéticos tales como biodisponibilidad, metabolismo, vida media y similares; la gravedad de la enfermedad del paciente a tratar, el peso corporal o el estado inmunológico del paciente, la vía de administración, etc.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son preferentemente reactivos para inyección subcutánea. En otra modalidad preferida, la concentración del reactivo de células alogénicas de la capa vascular intersticial para la inyección subcutánea es 0,1-100x104 células/ml, preferentemente 1-10x104 células/ml, con mayor preferencia 2x105 células/ml; y/o la concentración de las células progenitoras mesenquimales alogénicas es 0,1-100x104 células/ml, preferentemente 1-10x104 células/ml, con mayor preferencia 2x105 células/ml.
La presente invención también proporciona un método para usar las composiciones farmacéuticas de la presente invención, en una modalidad particular, que comprende las siguientes etapas:
(1) administrar células alogénicas de la capa vascular intersticial a un sujeto que lo necesite, un sitio de administración preferido es el interior de la artrosis de dicho sujeto; y
(2) administrar células progenitoras mesenquimales alogénicas a un sujeto que lo necesite, el sitio de administración preferido es el interior de la artrosis de dicho sujeto; el tiempo de administración preferido es un mes después de la etapa (1) y/o dos meses.
El proceso de aplicación de acuerdo con la invención se muestra en la Figura 1.
Los principales méritos de la presente invención son:
(1) Las SVF y haMPC de la presente invención pueden obtenerse de muchas fuentes;
(2) Las SVF y haMPC de la presente invención son seguras cuando se usan in vivo;
(3) Las SVF y haMPC de la presente invención no tienen ningún rechazo inmunitario entre especies cuando se usan en ratas;
(4) Después de estimuladas por LPS o hipoxia, etc., los niveles de expresión de las diversas citocinas en las haMPC de la presente invención aumentaron significativamente, las haMPC tienen una capacidad de secreción de citocinas relativamente alta y pueden realizar reparaciones de lesiones en condiciones apropiadas in vivo; (5) Las haMPC de la presente invención tienen características típicas de células madre mesenquimales, que poseen capacidad potencial de diferenciación en condiciones apropiadas in vivo, para satisfacer así la demanda relativa del cuerpo;
(6) Mediante la terapia de combinación de SVF y haMPC de la presente invención, las haMPC pueden transformarse en células de cartílago y células óseas en determinadas condiciones de inducción, por lo que pueden usarse en la prevención o el tratamiento de la osteoartritis.
La presente invención se ilustrará mejor a continuación con referencia a los ejemplos específicos. Debe entenderse que estos ejemplos son solo para ilustrar la invención pero no para limitar el alcance de la invención. Los métodos experimentales sin condiciones específicas descritos en los siguientes ejemplos se realizan generalmente en las condiciones convencionales, tales como las condiciones ilustradas en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) o de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 1
Tratamiento de la osteoartritis de rodilla (KOA) con SVF y haMPC
Paciente de sexo masculino, 53 años, dolor bilateral en rodilla de más de seis años, exacerbado durante un mes. Dolor continuo, solo se tolera al caminar en interiores, dificultad para subir escaleras, doloroso al caminar sobre terreno plano, acompañado de rigidez matutina. El examen de rayos X mostró: hiperplasia del borde articular, formación de osteofitos, estrechamiento del espacio articular y presencia de cambios escleróticos. Puntuación WOMAC 103. Diagnóstico: osteoartritis moderada de rodilla.
Se obtuvieron aproximadamente 30 ml de tejido adiposo limpio extraído con Lipokit (el proveedor de grasa era una mujer sana de 29 años que se hizo una cirugía plástica de liposucción para bajar de peso. El BMI antes de la liposucción era 26,73). Se separó la fracción vascular estromal de 10 ml de los tejidos adiposos recién obtenidos, se digirió con colagenasa, se filtró, se centrifugó para eliminar los adipocitos maduros y obtener las SVF, y se identificaron los antígenos de superficie en SVF. Los resultados de la identificación se muestran en la Figura 2. Se inyectaron 1 * 107 células/2 ml de SVF intraarticularmente a ambos lados del paciente. Los tejidos adiposos restantes se separaron y purificaron para cultivo durante las generaciones P2-P5 para obtener haMPC. Las haMPC se crioconservaron para su cultivo posterior después de la recuperación. El paciente se sometió a otra inyección intraarticular bilateralmente al primer mes y al tercer mes después de la primera inyección. Las cantidades de la inyección para cada lado fueron 1*107/mes/2 ml. Se realizaron análisis de sangre y orina habituales, pruebas para indicadores de función hepática y renal, función de coagulación, electrolitos, etc., a las 24 horas, 72 horas, una semana después de cada inyección.
Resultados: No se mostraron anomalías significativas en los exámenes anteriores. El dolor del paciente se alivió, la movilidad mejoró significativamente y se alivió el dolor al caminar sobre terreno plano y al subir escaleras. El examen de rayos X mostró que la superficie articular estaba ligeramente mejorada en comparación con la anterior. La puntuación WOMAC fue 62.
Ejemplo 2 Identificación de SVF y haMPC
1. Prueba de flujo
Las células se recogieron en un tubo de centrífuga tras la digestión enzimática, cuya densidad de la suspensión de células se ajustó a 1x105/ml y se centrifugó durante 5 min a 800 r/min (120 g). Se descartó el sobrenadante. Las células resuspendidas se lavaron con D-Hanks frío a 4 °C, la suspensión de células se centrifugó adicionalmente a 800 r/min durante 5 min y luego se descartó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 1 ml con D-Hanks. Se añadieron 5 ~ 10 pL de los anticuerpos, el producto se colocó en hielo durante 30 min y se mantuvo alejado de la luz. El producto se lavó con D-Hanks, se centrifugó y el sobrenadante se descartó. El procedimiento de lavado se repitió dos o tres veces para asegurar que los anticuerpos no unidos se eliminaran por completo. Finalmente, se añadieron aproximadamente 200 a 300 pL de D-Hanks para producir la suspensión, que se detectó mediante citometría de flujo (Figura 2).
El resultado de la citometría de flujo de las FVS se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1
Figure imgf000011_0001
El análisis de la expresión de los marcadores antigénicos de superficie celular de SVF se realizó mediante citometría de flujo, los resultados mostraron: el porcentaje de SVF en las células progenitoras recién aisladas fue del 60 % y el contenido de células progenitoras hematopoyéticas fue del 70 %, en donde, hay más células mezcladas.
Los resultados de la prueba de flujo de las haMPC se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2
Figure imgf000011_0002
2. Detección de citocinas secretadas por las células
Se cultivaron SVF y haMPC en la cámara de cultivo durante 48 h, se tomó el sobrenadante para detectar las citocinas secretadas por las células. Las células madre derivadas del cordón umbilical se usaron como grupo de control. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
Figure imgf000012_0001
Los resultados mostraron que: SVF y haMPC tienen una buena función de secreción de citocinas, que es comparable a las células madre del cordón umbilical.
Ejemplo 3
Prueba de estimulación de haMPC
(1) Las haMPC frescas y congeladas se colocaron por separado en medio de cultivo completo y medio FBS al 5 % para su cultivo y se detectó el VEGF secretado por las haMPC.
Los resultados muestran (Figura 3A) que la concentración de VEGF de las haMPC frescas en el grupo con medio de cultivo completo disminuyó con el aumento de la concentración de LPS; la concentración de VEGF de las haMPC frescas en el grupo con medio de cultivo FBS al 5 % fue la misma que la del grupo de control a 200 ng/ml, mientras que la concentración de VEGF disminuyó a 100 ng/ml y 300 ng/ml respectivamente. La concentración de VEGF de las haMPC congeladas cultivadas en medio de cultivo completo cambió sustancialmente poco cuando aumentaron las concentraciones de LPS. En general, la concentración de VEGF cultivado con medio de cultivo que contiene suero fue mayor que en el medio de cultivo completo.
(2) Se detectaron las cantidades de VEGF secretadas por las haMPC bajo estimulación por hipoxia. Se encontró que la secreción de VEGF bajo estimulación de hipoxia fue 2-3 veces mayor que la del cultivo normal, y la cantidad de secreción a las 48 horas fue 2 veces mayor que a las 24 horas, el incremento de VEGF fue proporcional al incremento de la concentración de células (Figura 3B).
Ejemplo 4
Prueba de diferenciación condrogénica de haMPC
Se empleó un kit de diferenciación condrogénica GIBCO STEMPRO para preparar un medio diferencial condrogénico. Las haMPC se digirieron y centrifugaron para obtener células de generación P3, y se usó un medio estándar para preparar una suspensión de células de 1,6 x 107 células vivas/ml para su posterior aplicación. 5 |_il de suspensión de células (el volumen celular fue de 8 x 104) se extrajeron con una pipeta, se sembraron en los centros de la placa de múltiples pocillos, y se sometieron a preincubación en una incubadora de CO2 durante 2 horas.
Una vez finalizada la preincubación, se añadió 1 ml de medio completo diferencial condrogénico precalentado en baño de agua a 37 °C a los pocillos de prueba y se añadió 1 ml de medio estándar precalentado con 1 ml de baño de agua a 37 °C a los pocillos de control. La placa de pocillos múltiples se colocó en una incubadora de CO2 para cultivo a 37 °C, 5 % de CO2. Durante el cultivo, el medio en los correspondientes pocillos de la placa se cambió cada 2-3 días. Después de un tiempo de incubación suficiente (7 o 14 días), se preparó el mismo día una solución de formaldehído al 4 % (1 mL de formaldehído al 40 % disuelto en 9 mL de agua) y colorante Azul Alcian al 1 % (0,1 g de Azul Alcian disuelto en 10 mL de HCl 0,1 N). Se realizó un tratamiento de fijación y tinción en cada pocillo. El medio se eliminó por succión y se lavó con DPBS una vez. Las células se fijaron con una solución de formalina al 4 % durante 30 minutos. Después de la fijación, se usó DPBS para lavar y luego se añadió una solución de Azul Alcian al 1 % (disuelta en HCl 0,1 N) para teñir durante 30 minutos. Se usó HCl 0,1 N para lavar tres veces y se añadió agua destilada para neutralizar el ácido. Los grupos experimentales y los grupos de control se observaron en el microscopio óptico y las imágenes se guardaron. Los grupos experimentales que se diferenciaron con éxito en células de cartílago se volvieron azules después de la tinción con Azul Alcian debido al proteoglicano sintetizado por condrocitos.
Resultados del experimento: en el séptimo día del experimento, se observó el crecimiento de las células y se seleccionaron los pocillos A1, A3 y C1 para el análisis de imágenes. Tras la observación, puede verse que las células se concentraron en el centro de la región de inoculación en el pocillo A1 (Figura 4.1), aunque la forma celular era circular, que es la aproximada a las células del cartílago, y la tensión de adherencia de las células era normal, podían mantener su estado adherente después de cambiar el medio varias veces; las células en el pocillo A3 (Figura 4.2) formaron una estructura de masa celular globular altamente agregada, y una estructura esférica de color blanco lechoso puede verse a simple vista; dicha estructura se mantuvo después de cambiar de medio varias veces, aunque se excluyó la posibilidad de contaminación; se añadió al pocillo C1 (Figura 4.3) medio estándar como grupo de control, en el que la morfología celular cumple con el estándar de células haMPC adherentes. Por tanto, morfológicamente, existen diferencias significativas entre las haMPC cultivadas a través de medio diferencial y el grupo control.
Los resultados de la tinción con Azul Alcian en el día 14 del experimento indicaron que el pocillo C1 (Figura 4.6) no mostró una tinción azul significativa, mientras que el pocillo A1 (Figura 4.4) mostró una tinción azul significativa, lo que demostró la existencia de glicosaminoglicano sintetizado por condrocitos; y la tinción del pocillo A3 (Figura 4.5) se volvió negro-azul probablemente debido a la densidad excesiva de las células. Por lo tanto, las haMPC cultivadas en medio de diferenciación mostraron las características de diferenciación de célula de cartílago en el proceso de tinción química clásica.
En resumen, el presente ejemplo muestra que las haMPC de la presente invención muestran características de células de cartílago en la morfología celular y en el proceso de tinción química clásica cuando se cultivan en medio de diferenciación, lo que indica que las haMPC tienen el potencial de diferenciación de los condrocitos.
Ejemplo 5
Prueba de diferenciación osteogénica de haMPC
Se empleó un kit de diferenciación de osteogénesis GIBCO STEMPRO para preparar medio diferencial de osteogénesis. Las haMPC se digirieron y centrifugaron para obtener células de generación P3, y se usó medio de crecimiento para preparar una suspensión de células para su posterior aplicación. Las haMPC se sembraron en una placa de múltiples pocillos a una densidad de 5 x 103 células/cm2, y se sometieron a precultivo en una incubadora de CO2 durante 2 horas.
Una vez finalizada la preincubación, se añadió 1 ml de medio completo diferencial condrogénico precalentado en baño de agua a 37 °C a los pocillos de prueba y se añadió 1 ml de medio estándar precalentado con 1 ml de baño de agua a 37 °C a los pocillos de control. La placa de pocillos múltiples se colocó en una incubadora de CO2 para cultivo a 37 °C, 5 % de CO2. Durante el cultivo, el medio en los correspondientes pocillos de la placa se cambió cada 3-4 días. Después de un tiempo de incubación suficiente (> 21 días), se preparó una solución de formaldehído al 4 % (1 ml de formaldehído al 40 % disuelto en 9 ml de agua) y un colorante Azul Alcian al 1 % (0,1 g de Azul Alcian disuelto en 10 ml de HCl 0,1 N) el mismo día. Se realizó un tratamiento de fijación y tinción en cada pocillo. El medio se eliminó por succión y se lavó con DPBS una vez. Las células se fijaron con una solución de formalina al 4 % durante 30 minutos. Después de la fijación, se usó agua destilada para lavar y luego se añadió una solución de Azul Alcian al 2 % (pH 4,2) para teñir durante 2-3 minutos. Se usó agua destilada para lavar tres veces. Los grupos experimentales y los grupos de control se observaron en el microscopio óptico y las imágenes se guardaron.
Resultados experimentales: El día 25 del experimento, se observó el crecimiento de células. La tinción del grupo experimental mostró que las deposiciones nodulares eran de color marrón claro, lo que se verificó como deposiciones de calcio (Figura 5.1); mientras que la tinción del grupo de control resultó negativa (Figura 5.2).
En resumen, el presente ejemplo muestra que las haMPC de la presente invención muestran las características de los osteocitos en la morfología celular y en el proceso de tinción química clásica cuando se cultivan en un medio de diferenciación de osteogénesis, lo que indica que las haMPC tienen el potencial de diferenciación de los osteocitos.
Ejemplo 6
Prueba de seguridad animal de SVF
Se inyectaron células vasculares estromales derivadas de tejido adiposo humano (hSVF) a ratas SD a través de la vena caudal. Las dosis de células fueron 1,0x109/65 kg para el grupo de dosis más alta y 5,0x107/65 kg para el grupo de cantidad apropiada. Después de 48 horas, no se observó ninguna reacción alérgica anormal como erupción, piloerección, taquipnea o temblores. Ninguna de las ratas murió. La observación duró 10 semanas y las ratas se encontraban en buenas condiciones de vida con cambios normales de temperatura corporal, apetito y peso. En donde, el cambio de peso en el grupo de cantidad apropiada, el grupo de dosis alta y el grupo de control, se elevaron, respectivamente a 502 g, 489 g y 493 g desde los 100 g originales. No se mostró ninguna diferencia significativa. Dos semanas después del final de la inyección de hSVF, los niveles de albúmina sérica, globulina y albúmina/globulina en ratas SD estaban todos en el rango normal (Tabla 4), y los indicadores como ALT, nitrógeno ureico, creatinina, glucosa estaban todos dentro del rango normal (Tabla 5). No hubo diferencias significativas entre el grupo experimental y el grupo de control. Este estudio demostró que la inyección intravenosa de SVF es segura para las ratas y que el uso de SVF entre especies no causó rechazo inmunológico.
Tabla 4
Figure imgf000014_0004
Tabla 5
Figure imgf000014_0002
Ejemplo 7
Prueba de seguridad de haMPC después de la crioconservación y recuperación
Las haMPC de tercera generación (generación P3) obtenidas por pase y cultivo se crioconservaron, recuperaron y se inyectaron por vía intravenosa a los ratones a través de la vena caudal. Las dosis fueron 3,1x102/g para el grupo de cantidad apropiada y 1,5x103/g para el grupo de dosis alta. Se realizó una observación continua de 14 días después de la inyección, los animales experimentales estaban en buenas condiciones de vida y no se observó ninguna reacción anormal con la temperatura corporal, el apetito y el cambio de peso. En donde, el aumento de peso en el grupo de la cantidad apropiada, el grupo de dosis alta y el grupo de control fue de 11,8 %, 13,9 % y 14,3 % respectivamente, y no hubo diferencias significativas entre los grupos. La inyección in vivo de haMPC no produjo efectos significativos en el hígado, bazo, riñón, pulmón, cerebro, corazón, timo, tiroides, testículos/ovario u otros órganos principales, y los índices de órganos no cambiaron significativamente. Se observó que el hígado, el riñón, el bazo y los testículos/ovario eran estructuralmente normales bajo microscopía óptica, y no se observó ningún cambio patológico como hiperplasia del mesénquima, infiltración grasa o infiltración de células inflamatorias. Solo en el bazo del grupo experimental puede verse un aumento significativo de megacariocitos o células gigantes polinucleares, lo que probablemente estuvo relacionado con la respuesta inmune de los macrófagos provocada por la inyección de haMPC y está pendiente de estudio posterior. En este experimento, los parámetros bioquímicos de la sangre de los ratones estaban dentro del rango normal y no hubo diferencias significativas entre el grupo de cantidad apropiada, el grupo de dosis alta o el grupo de control (Tabla 6-8). Este estudio demostró que la inyección intravenosa de haMPC era segura para los ratones y que el uso entre especies de haMPC no provocó rechazo inmunológico.
Tabla 6
Figure imgf000014_0001
Tabla 7
Figure imgf000014_0003
Tabla 8
Figure imgf000015_0001

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Una composición farmacéutica que comprende células progenitoras mesenquimales alogénicas (haMPC) y células alogénicas de la capa vascular intersticial (SVF) para su uso para prevenir y/o tratar la osteoartritis; dichas células progenitoras mesenquimales alogénicas tienen las siguientes características:
    (i) más del 95 % de las células tienen el antígeno de superficie CD90;
    (ii) más del 95 % de las células tienen el antígeno de superficie CD73;
    (iii) más del 95 % de las células tienen el antígeno de superficie CD29;
    (iv) más del 95 % de las células tienen el antígeno de superficie CD49d;
    y dichas células alogénicas de la capa vascular intersticial tienen las siguientes características:
    (i) más del 30 % de las células tienen el antígeno de superficie CD29;
    (ii) más del 50 % de las células tienen el antígeno de superficie CD73;
    (iii) más del 85 % de las células tienen el antígeno de superficie CD49d;
    (iv) más del 55 % de las células tienen el antígeno de superficie CD90.
  2. 2. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde dichas células progenitoras mesenquimales alogénicas tienen una o más características seleccionadas del siguiente grupo:
    (i) más del 98 % de las células tienen el antígeno de superficie CD90;
    (ii) más del 98 % de las células tienen el antígeno de superficie CD73;
    (iii) más del 98 % de las células tienen el antígeno de superficie CD29;
    (iv) más del 98 % de las células tienen el antígeno de superficie CD49d.
  3. 3. La composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dichas células progenitoras mesenquimales alogénicas tienen una o más características seleccionadas del siguiente grupo: (v) menos del 2 % de las células tienen el antígeno de superficie HLA-DR;
    (vi) menos del 2 % de las células tienen el antígeno de superficie actina;
    (vii) menos del 2 % de las células tienen el antígeno de superficie CD34;
    (viii) menos del 2 % de las células tienen el antígeno de superficie CD45;
    (ix) menos del 2 % de las células tienen el antígeno de superficie CD14.
  4. 4. La composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichas células progenitoras mesenquimales alogénicas secretan citocinas seleccionadas del grupo que consiste en: factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento transformante a (TGF-a), factor de crecimiento transformante p (TGF-P), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4) e interleucina-10 (IL-10).
  5. 5. La composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende dichas células alogénicas de la capa vascular intersticial (SVF) y células progenitoras mesenquimales alogénicas (haMPC) con dosis eficaces y portadores farmacéuticamente aceptables.
  6. 6. La composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichas células alogénicas de la capa vascular intersticial tienen una o más características seleccionadas del siguiente grupo: (v) menos del 85 % de las células tienen el antígeno de superficie CD34;
    (vi) menos del 15 % de las células tienen el antígeno de superficie CD45.
  7. 7. La composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las células alogénicas de la capa vascular intersticial secretan citocinas que se seleccionan del grupo que consiste en: factor de crecimiento de células madre (HGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante p (TGF-P), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), interleucina-2 (IL-2), interleucina-10 (IL-10) y combinaciones de los mismos.
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