发明内容
本发明的目的就是提供异体间质血管层细胞和异体间充质祖细胞在预防或治疗类风湿性关节炎中的应用。
在本发明的第一方面,提供了一种异体间质血管层细胞(SVF)和异体间充质祖细胞(haMPCs)的用途,它们被用于制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物组合物。
在另一优选例中,所述的异体间质血管层细胞为异体间质血管层细胞群。
在另一优选例中,所述的异体间充质祖细胞为异体间充质祖细胞群。
在另一优选例中,所述的异体间质血管层细胞具有选自下组的任一或多种特征:
(i)30%以上的细胞具有表面抗原CD29;
(ii)50%以上的细胞具有表面抗原CD73;
(iii)85%以上的细胞具有表面抗原CD49d;
(iv)55%以上的细胞具有表面抗原CD90。
在另一优选例中,35%以上的细胞具有表面抗原CD29。
在另一优选例中,55%以上的细胞具有表面抗原CD73。
在另一优选例中,90%以上的细胞具有表面抗原CD49d。
在另一优选例中,60%以上的细胞具有表面抗原CD90。
在另一优选例中,所述的异体间质血管层细胞具有选自下组的任一或多种特 征:
(v)85%以下的细胞具有表面抗原CD34;
(vi)15%以下的细胞具有表面抗原CD45。
在另一优选例中,80%以下的细胞具有表面抗原CD34。
在另一优选例中,12%以下的细胞具有表面抗原CD45。
在另一优选例中,所述的异体间质血管层细胞分泌选自下组的细胞因子:干细胞生长因子(HGF),血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)、人转化生长因子β(TGF-β)、巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2(IL-2)、白介素-10(IL-10)、或其组合。
在另一优选例中,所述的异体间质血管层细胞为异体间质血管层细胞群。
在另一优选例中,异体间质血管层细胞分泌的干细胞生长因子(HGF)的浓度≥0.5ng/ml,较佳地≥0.8ng/ml。
在另一优选例中,异体间质血管层细胞分泌的血管内皮生长因子(VEGF)的浓度≥35pg/ml,较佳地≥40pg/ml。
在另一优选例中,异体间质血管层细胞分泌的人转化生长因子β(TGF-β)的浓度≥150pg/ml,较佳地≥180pg/ml。
在另一优选例中,异体间质血管层细胞分泌的白介素-2(IL-2)的浓度≥15pg/ml,较佳地≥20pg/ml,更佳地≥30pg/ml。
在另一优选例中,异体间质血管层细胞分泌的白介素-10(IL-10)的浓度≥15pg/ml,较佳地≥20pg/ml,更佳地≥30pg/ml,最佳地≥40pg/ml。
在另一优选例中,所述的异体间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特征:
(i)95%以上的细胞具有表面抗原CD90;
(ii)95%以上的细胞具有表面抗原CD73;
(iii)95%以上的细胞具有表面抗原CD29;
(iv)95%以上的细胞具有表面抗原CD49d。
在另一优选例中,98%以上的细胞具有表面抗原CD90。
在另一优选例中,98%以上的细胞具有表面抗原CD73。
在另一优选例中,98%以上的细胞具有表面抗原CD29。
在另一优选例中,98%以上的细胞具有表面抗原CD49d。
在另一优选例中,所述的异体间充质祖细胞具有选自下组的任一或多种特 征:
(v)2%以下的细胞具有表面抗原HLA-DR;
(vi)2%以下的细胞具有表面抗原Actin;
(vii)2%以下的细胞具有表面抗原CD34;
(viii)2%以下的细胞具有表面抗原CD45;
(viiii)2%以下的细胞具有表面抗原CD14。
在另一优选例中,1%以下的细胞具有表面抗原HLA-DR。
在另一优选例中,1%以下的细胞具有表面抗原Actin。
在另一优选例中,1%以下的细胞具有表面抗原CD34。
在另一优选例中,1%以下的细胞具有表面抗原CD45。
在另一优选例中,1%以下的细胞具有表面抗原CD14。
在另一优选例中,所述的异体间充质祖细胞分泌选自下组的细胞因子:血管内皮生长因子(VEGF)、人转化生长因子α(TGF-α)、人转化生长因子β(TGF-β)、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生因子(PDGF)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)。
在另一优选例中,异体间充质祖细胞分泌的血管内皮生长因子(VEGF)的浓度≥10pg/ml,较佳地≥15pg/ml。
在另一优选例中,异体间充质祖细胞分泌的人转化生长因子β(TGF-β)的浓度≥300pg/ml,较佳地≥400pg/ml。
在另一优选例中,异体间充质祖细胞分泌的粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)的浓度≥30ng/ml,较佳地≥40ng/ml。
在另一优选例中,异体间充质祖细胞分泌的肝细胞生长因子(HGF)的浓度≥0.4ng/ml,较佳地≥0.5ng/ml。
在另一优选例中,异体间充质祖细胞分泌的血小板衍生因子(PDGF)的浓度≥0.008ng/ml,较佳地≥0.01ng/ml。
在另一优选例中,异体间充质祖细胞分泌的白介素-2(IL-2)的浓度≥25pg/ml,较佳地≥30pg/ml。
在另一优选例中,异体间充质祖细胞分泌的白介素-10(IL-10)的浓度≥30pg/ml,较佳地≥40pg/ml。
在本发明的第二方面,提供了一种用于预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物组合物,所述的药物组合物包括:有效量的异体间质血管层细胞(SVF)和 异体间充质祖细胞(haMPCs),以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的药物组合物为静脉注射试剂,和/或关节腔内注射试剂。
在另一优选例中,所述的药学上可接受的载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。
在另一优选例中,所述异体间质血管层细胞的浓度为0.1-100×104个/ml,较佳地为1-10×104个/ml,更佳地为2×105个/ml。
在另一优选例中,所述异体间充质祖细胞浓度为0.1-100×104个/ml,较佳地为1-10×104个/ml,更佳地为2×105个/ml。
在本发明的第三方面,提供了一种预防和/或治疗类风湿性关节炎的方法,包括步骤:给需要的对象施用异体间质血管层细胞(SVF)和异体间充质祖细胞(haMPCs)、或施用含有异体间质血管层细胞(SVF)和异体间充质祖细胞(haMPCs)的药物组合物。
在另一优选例中,所述的对象为人或非人哺乳动物,优选人。
在另一优选例中,所述的方法包括步骤:
(1)给需要的对象施用异体间质血管层细胞;和
(2)给需要的对象施用异体间充质祖细胞。
在另一优选例中,施用部位为所述对象的静脉内,和/或关节腔内。
在另一优选例中,步骤(1)与步骤(2)之间间隔时间为1个月以上,和/或3个月以上。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次意外地发现,异体间质血管层细胞和异体间充质祖细胞在预防或治疗类风湿性关节炎中具有极为优异的效果。具体地,给需要的对象施用本发明的异体脂肪来源的异体间质血管层细胞和异体间充质祖细胞,或施用含有异体脂肪来源的异体间质血管层细胞和异体间充质祖细胞的药物组合物,对于类风湿性关节炎有显著的预防或治疗作用。
异体间充质祖细胞具有很高的细胞因子分泌能力,在体内合适条件下可对机体的损伤进行修复:异体间质血管层细胞和异体间充质祖细胞具有成软骨分化及成骨化的能力。本发明还提供了一种预防和治疗类风湿性关节炎的方法以及含有异体间质血管层细胞和异体间充质祖细胞的药物组合物。
在此基础上,发明人完成了本发明。
术语
如本文所用,术语“以上”和“以下”包括本数,例如“95%以上”指≥95%,“0.2%以下”指≤0.2%。
类风湿性关节炎
如本文所用,术语“类风湿性关节炎”与“rheumatoid arthritis”或“RA”互换使用。
类风湿性关节炎是一种慢性对称性多关节疾病,尤其属于一种全身性自身免疫性疾病;其病理特征是关节滑膜的慢性炎性增生、血管翳形成、软骨及软骨下骨破坏,最终导致关节畸形和强直。临床表现为慢性、进行性、对称性、侵蚀性多关节炎,以双手近指、掌指、腕、肘关节和双足跖趾、踝、膝关节受累最为常见,造成关节软骨、骨和关节囊破坏,最终导致关节畸形和功能丧失。疾病进展亦会系统地影响其他关节外的组织,包括皮肤、血管、心脏、肺部及肌肉等。
特别需要说明的是,类风湿性关节炎与常见的骨性关节炎(即OA)不同, 骨性关节不属于自身免疫性疾病,并且病变关节多见于负重关节,如膝关节,胯关节等。
脂肪
异体脂肪是整形和抗衰老治疗的优良来源,脂肪组织材料可以来源于腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位。本领域技术人员可采用通用的技术方法获得异体脂肪组织,包括(但不限于)抽吸、手术分离等方法。
在本发明中,脂肪组织或脂肪原料没有特别限制,可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织,优选人的脂肪组织。较佳地,脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织。
异体间质血管层细胞
如本文所用,术语“异体间质血管层细胞”、“异体SVF”、或“异体间质血管碎片”可以互换使用。
异体间质血管层细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。SVF能够在体外稳定增殖且衰亡率低,它取材容易、体内储备量大、适宜大规模培养、对机体损伤小、来源广泛、适宜自体移植。SVF是祖细胞辅助脂肪移植中最重要的组分。通过胶原酶消化,从脂肪组织中分离的多种细胞混合物形成的细胞团就叫做间质血管碎片。间质血管碎片中含有丰富的间充质细胞,可分化为多种谱系的细胞,是再生医学、组织工程等最理想的种子细胞,
本领域的技术人员能够使用通用的方法进行SVF的分离和纯化。
如本文所用,术语“分离方法”、“SVF的分离方法”可以互换使用,都指从原始的脂肪组织中获得分离的SVF的方法和过程。对于获得的SVF的脂肪细胞材料,首先进行洗涤,除去血细胞;脂肪破碎,消化;去除未消化的组织,获得含SVF的滤液;离心得到SVF。得到的SVF可以用于进一步传代、培养或冻存。
在一个优选的实施例中,分离SVF可以包括步骤(但不限于):将吸脂后的脂肪用PBS反复冲洗两次,然后在37℃条件下用胶原酶消化30min,1200g离心10min后即获得高密度的SVF碎片,其中主要包括间质细胞、血管内皮细胞和壁细胞。另外,SVF中也包括一些血管来源的细胞,如白细胞和红细胞等,各种细胞之间具有协同效应。
异体间质血管层细胞的抗原检测
用本发明使用的SVF具有很高的纯度,基本上不含有其他类型的细胞或干细胞。这可通过细胞表面抗原的检测加以验证。
SVF具有多种特异性抗原和受体,主要有CD3、CD13、D29、CD34、CD45、CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC等。
CD34抗原是一种高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白,它选择性的表达于人类造血干细胞(HSC),祖细胞(PC)和血管内皮细胞(EC)表面,带有CD34的脂肪组织祖细胞在总干细胞的比例优选为≤0.2%,更佳地,≤0.2%。
CD45存在于所有造血细胞的表面,包括造血干细胞和破骨细胞。带有CD45的脂肪组织祖细胞在总干细胞的比例优选为≤0.1%。
CD29、CD73、CD49d、CD90等主要存在于脂肪异体间充质祖细胞表面。
带有CD29的SVF在总干细胞的比例优选为≥30%,更佳地≥32%,最佳地≥35%。
带有CD73的SVF在总干细胞的比例优选为≥50%,更佳地≥60%,最佳地≥70%。
带有CD49d的SVF在总干细胞的比例优选为≥85%,更佳地≥90%,最佳地≥95%。
带有CD90的SVF在总干细胞的比例优选为≥55%,更佳地≥60%,最佳地≥65%。
本领域内技术人员可以使用通用的方法检测SVF的纯度和分化程度,如流式细胞仪法。检测时,加入不同的与有针对性的特异抗体,抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体,也可以是具有免疫活性的抗体片段,如Fab’或(Fab)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人,美国专利No.4,946,778);或嵌合抗体,如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。加入抗体与细胞表面的抗原结合一定时间,用流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选。
异体脂肪来源的间充质祖细胞
如本文所用,术语“异体脂肪来源的间充质祖细胞”、“allogeneic haMPCs”或“allogeneic adipose tissue-derived mesenchymal progenitor cells”含义相同,可以互换使用。
本发明使用的脂肪来源的异体间充质祖细胞优选人来源的脂肪来源的异体间充质祖细胞;更优选人自体脂肪来源的异体间充质祖细胞。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法进行allogeneic haMPCs的分离和培养,在一个优选例的实施例中,包括步骤:
a.分装脂肪:将抽取的脂肪装至离心管中,抽取的脂肪分两部分,一部分用胶原酶消化洗涤后,用于制备成SVF细胞悬液,直接进行现场回输;另一部分获得SVF后继续培养,以获得脂肪祖细胞;
b.脂肪分解:向离心管中加入酶剂,置恒温振荡器中,进行脂肪消化,待消化完毕,离心后弃去上层消化后的脂肪,收集沉淀并洗涤;
c.过滤:加细胞洗液,混匀,用细胞滤网过滤后细胞计数,离心,洗涤沉淀。过滤后的细胞即为血管基质层细胞SVF(stromal vasvular fraction Cells)。SVF是从脂肪组织中分离的多种细胞混合物,是由多种同种异质细胞组成的细胞群,其中包括MPCs样细胞,内皮(祖)细胞,血管平滑肌细胞以及其他部分的血液来源细胞,包括粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等;
d.SVF悬液制备:将过滤后的SVF细胞配制成5ml细胞悬液,用注射剂将悬液吸入后,将悬液注入100ml生理盐水袋中;
e.细胞培养:根据计数细胞的量调整接种密度接种至培养瓶置CO2培养箱培养;
f.传代:接种3天左右出现少量贴壁异体间充质祖细胞,培养5-7天贴壁细胞呈集落时,消化传代,收集并计数细胞,原代贴壁情况1:1-2的比例传代,传代培养2至3周,收集细胞(自体脂肪来源的祖细胞);
g.制备脂肪来源的祖细胞悬液:将收集的脂肪来源的祖细胞离心洗涤后,注入生理盐水,制成细胞悬液。
异体脂肪间充质祖细胞的抗原检测
本发明使用的异体脂肪间充质祖细胞具有极高的纯度和活性。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法对异体脂肪间充质祖细胞表面抗原进行检测,如过流式细胞仪法等。
异体脂肪间充质祖细胞具有多种特异性抗原和受体,主要有:CD29、CD73、CD90、CD49d等。
带有CD73抗原的异体间充质祖细胞在总异体间充质祖细胞中的比例≥95 %,更佳地≥98%,更佳地≥99%,最佳地为100%。
带有CD90抗原的异体间充质祖细胞在总异体间充质祖细胞中的比例≥95%,更佳地≥98%,更佳地≥99%,最佳地为100%。
带有CD29抗原的异体间充质祖细胞在总异体间充质祖细胞中的比例≥95%,更佳地≥98%,更佳地≥99%,最佳地为100%。
带有CD49d抗原的异体间充质祖细胞在总异体间充质祖细胞中的比例≥95%,更佳地≥98%,更佳地≥99%,最佳地为100%。
脂肪来源的异体间充质祖细胞的阴性指标包括:HLA-DR、Actin、CD34、CD45、CD14等。
带有HLA-DR抗原的异体间充质祖细胞在总异体间充质祖细胞中的比例≤2%,更佳地≤1%,更佳地≤0.5%,最佳地没有HLA-DR抗原。
带有Actin抗原的异体间充质祖细胞在总异体间充质祖细胞中的比例≤2%,更佳地≤1%,更佳地≤0.5%,最佳地没有Actin抗原。
带有CD34的异体间充质祖细胞在总异体间充质祖细胞中的比例≤2%,更佳地≤1%,更佳地≤0.5%,最佳地没有CD34。
带有CD45的异体间充质祖细胞在总异体间充质祖细胞中的比例≤2%,更佳地≤1%,更佳地≤0.5%,最佳地没有CD45。
带有CD14的异体间充质祖细胞在总异体间充质祖细胞中的比例≤2%,更佳地≤1%,更佳地≤0.5%,最佳地没有CD14。
本发明使用的haMPCs优选是可以大量分泌VEGF、TGF-a、TGF-β、GM-CSF、HGF、PDGF、IL-2、IL-4、IL-10等生子因子的人来源的haMPCs,并具有极强克隆形成能力和极低的免疫原性。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法对haMPCs进行使用、处理、施用等操作。如:每批haMPCs发放或使用之前,必须通过无菌、内毒素和支原体检查,以及DNA同一认定。每批发放的细胞都要符合细胞活力≥95%、细胞纯度(阳性指标≥95%,阴性指标<2%)。haMPCs急毒、过敏检测结果均呈阴性,均有一份相应的检测报告。
药物组合物及其应用
本发明还提供了一种药物组合物,它含有有效量的异体间质血管层细胞和异体间充质祖细胞,以及药学上可接受的载体。
通常,可将异体间质血管层细胞和异体间充质祖细胞配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,如生理盐水中,其中pH通常约为5-8,较佳地,pH约为7-8。
如本文所用,术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用,“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有的载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述异体间质血管层细胞和异体间充质祖细胞的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
本发明的药物组合物优选为皮下注射试剂与及静脉注射试剂同时使用。在另一优选例中,所述皮下注射试剂的异体间质血管层细胞的浓度为0.1-100×104个/ml,较佳地为1-10×104个/ml,更佳地为2×105个/ml;和/或异体间充质祖细胞浓度为0.1-100×104个/ml,较佳地为1-10×104个/ml,更佳地为2×105个/ml。
本发明还提供了一种使用本发明所述药物组合物的方法,在一个具体地实施例中,包括步骤:
(1)给需要的对象施用异体间质血管层细胞,和
(2)给需要的对象施用异体间充质祖细胞,优选的使用时间为步骤(1)之后的1个月,和/或3个月。
在本发明中,给所需要的对象施用异体间质血管层细胞异体间充质祖细胞,优选的施用部位为所述对象的关节腔,和/或静脉内,其机理是通过静脉注射达到全身免疫调节的目的,在关节腔内注射达到局部调节的目的,并刺激祖 细胞成骨化和成软骨化从而修复病变。
本发明所述的施用流程见图1。
本发明的主要优点如下:
(1)本发明的SVF和haMPCs在体内使用是安全的;
(2)本发明使用的haMPCs经LPS、低氧等刺激后,各种细胞因子的表达量会出现均明显上升,haMPCs具有较高的细胞因子分泌能力,在体内合适条件下能进行机体损伤修复;
(3)本发明的haMPCs具有典型的异体间充质祖细胞特性,在体内的合适条件下具有潜在的分化能力,从而满足机体相对需求;
(4)本发明的SVF与haMPCs混合疗法中,haMPCs在特定诱导条件下可转化为软骨细胞,应用于预防或治疗类风湿性关节炎。
(5)本发明的SVF与haMPCs混合疗法中,haMPCs在特定诱导条件下可转化为骨细胞,应用于预防或治疗类风湿性关节炎。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
SVF和haMPCs治疗类风湿性关节炎(RA)
患者女,53岁,双手指间关节及掌指关节反复肿痛5年余,晨僵持续1小时,化验RF352RU/ml、抗CCP565RU/ml,诊断为类风湿关节炎。
予口服非甾体消炎药、来氟米特口服治疗后,症状未见缓解。经患者同意后行SVF和haMPCs治疗。因患者瘦弱,BMI为16.8kg/m2,故建议采用异体SVF和异体haMPCs治疗。
抽脂志愿者为到整形外科抽脂减肥的32岁女性,排除传染性疾病及心、肝、肺、肾等慢性病。从下腹部抽取脂肪,取出约35ml脂肪用于治疗该患者。其中从10ml新鲜获取的脂肪组织中分离出血管基质部分,经胶原酶消化、过滤、离 心除去成熟脂肪细胞后得到SVF。
将剂量为1*107个细胞/100ml的SVF静脉输注,持续时间约为30分钟,再将剂量为1*107个细胞/2ml的SVF注射于患者患病关节腔内。剩余脂肪组织分离提纯后培养P2-P5代获得haMPCs。haMPCs冷冻保存,待解冻复苏后可再次培养,待首次注射后的第1、3个月再同上方法静脉输注加患病关节腔内注射,剂量均为1*107/个。
结果:疗程结束8周后患者自觉症状明显改善,12周后复查各项指标。血清抗体较治疗前明显降低,RF为56RU/ml,抗CCP为73.5RU/ml。
实施例2SVF及haMPCs的鉴定
1.流式检测
通过酶消化法将细胞收集到离心管中,细胞悬液调整密度为1×105/mL,800r/min(120g),离心5min,弃掉上清,用4℃的冷D-Hanks冲洗重悬细胞,再次将细胞悬液以800r/min,离心5min,之后弃去上清。然后用D-Hanks将细胞重悬至1mL,加入抗体5~10μL,避光,冰上放置30min。用D-Hanks冲洗,离心,弃上清,重复该冲洗过程2~3次,确保将未结合抗体除净最后,加入约200至300μL的D-Hanks制成悬液。
SVF的流式检测结果见表1。
表1
通过流式细胞仪对SVF进行细胞表面抗原标记表达的分析,结果表明:新鲜分离的祖细胞中SVF比例为60%,且造血祖细胞含量为70%,混合细胞较多。
haMPCs的流式检测结果见表2。
表2
抗体 |
比例(%) |
抗体 |
比例(%) |
CD90 |
99.94 |
Actin |
~0%阴性 |
CD29 |
99.95 |
DR |
~0%阴性 |
CD73 |
99.94 |
CD34 |
~0%阴性 |
CD49d |
99.93 |
CD14 |
~0%阴性 |
|
|
CD45 |
~0%阴性 |
2.细胞分泌因子的检测
将SVF及haMPCs在培养室培养48h,取上清,检测细胞分泌因子,脐带干细胞为对照组,检测结果见表3。
表3
细胞因子(单位) |
hADMPCs |
SVF |
脐带干细胞 |
VEGF(pg/ml) |
19.83 |
20.13 |
18.32 |
TGF-β(pg/ml) |
389.21 |
178.21 |
408.23 |
GM-CSF(ng/ml) |
43.31 |
61.21 |
65.89 |
HGF(ng/ml) |
0.54 |
0.63 |
0.53 |
PDGF(ng/ml) |
0.01 |
0.01 |
0.02 |
IL-2(pg/ml) |
34.51 |
37.21 |
32.78 |
IL-10(pg/ml) |
43.21 |
42.12 |
40.12 |
结果表明:SVF及haMPCs均有良好的分泌细胞因子的功能,与脐带干细胞相当。
实施例3
haMPCs刺激试验
(1)分别将新鲜及冻存的haMPCs置于完全培养基及5%FBS培养基中培养,并检测haMPCs分泌的VEGF。
结果显示(图2A),完全培养基培养的新鲜haMPCs组随着LPS浓度的增加,VEGF的浓度下降;5%FBS培养基培养的新鲜haMPCs组在200ng/ml时,VEGF与对照组浓度基本一样,100ng/ml和300ng/ml分别有所下降,完全培养基培养的冻存haMPCs组随着LPS浓度的增加,VEGF的浓度基本变化不大。整体来看,血清培养的要比完全培养基的VEGF要高。
(2)检测在低氧刺激下haMPCs的VEGF的分泌量,结果发现,低氧刺激下VEGF的分泌量是正常培养下中的2-3倍,且48小时的分泌量是24小时的2倍,VEGF的增量与细胞浓度的增量成正比(图2B)。
实施例4
haMPCs成软骨分化试验
采用GIBCO STEMPRO成软骨分化试剂盒制备成软骨分化培养基,将haMPCs消化离心获取P3代细胞,使用标准培养基制备1.6x10∧7活细胞/mL的细胞悬液待用。用加样枪吸取5μL细胞悬液(细胞量8x104),接种于多孔培养板板孔中心,置于CO2培养箱中预培养2小时。
预培养结束后,在实验孔中添加1mL37°C水浴锅预热的成软骨分化完全培养基,在对照孔中添加1mL37°C水浴锅预热标准培养基,并将多孔培养板置于37°C,5%CO2浓度的CO2培养箱中进行培养。在培养过程中,每隔2-3天对相应板孔进行换液。经过足够培养时间后(7、14天),在当天配置4%福尔马林溶液(1mL40%甲醛溶于9mL水中)和1%Alcian Blue染液(0.1g Alcian Blue溶于10mL0.1N HCL中)。对各孔进行固定和染色处理。吸除培养基,DPBS洗涤一次,并将细胞使用4%福尔马林溶液固定30分钟。固定后用DPBS洗涤,然后加入1%Alcian Blue溶液(溶于0.1N的HCl)染色30分钟。使用0.1N的HCl洗涤三次,加入蒸馏水中和酸性,然后在光镜下对各实验组及对照组进行观察,保存图片。成功分化为软骨细胞的实验组经Alcian Blue染色后会因软骨细胞合成的蛋白聚糖而呈蓝色。
实验结果:在实验进行第7天对细胞生长状况进行观察,并选取A1、A3、C1孔拍照分析。经观察可见孔A1(图3.1)中细胞集中于接种的中心区域,细胞形态为圆形,与软骨细胞接近,细胞的贴壁紧密程度一般,但经过几次换液仍能保持贴壁状态;孔A3(图3.2)中的细胞形成了一个球状高度聚集的细胞团结构,在肉眼下可见一个乳白色小球状结构,该结构经过几次换液之后仍然存在,而且排除了污染的可能性;孔C1(图3.3)作为对照组加入标准培养基,细胞形态和标准的haMPCs贴壁细胞相符合。因此,从形态上来看,经分化培养基培养的haMPCs与对照组相比有比较明显的差异。
在实验进行第14天的Alcian Blue染色结果表明,C1孔(图3.6)没有出现明显蓝色染色;相比之下,A1(图3.4)孔出现了明显的蓝色染色,证明存在软骨细胞合成的粘多糖;而A3(图3.5)孔可能由于细胞过于致密,所以导致染色呈蓝黑色。因此,经分化培养基培养的haMPCs在经典染色条件下呈现了分化为软骨细胞的特征。
综上所述,本实施例表明,本发明的haMPCs在分化培养基的培养条件下 在细胞形态学及经典化学染色处理呈现了软骨细胞的特征,表明haMPCs具备向软骨细胞的分化潜能。
实施例5
haMPCs成骨分化试验
采用GIBCO STEMPRO成骨分化试剂盒制备成骨分化培养基,将haMPCs消化离心获取P3代细胞,使用适量的生长培养基制备细胞悬液待用。按照5*103个细胞/cm2的密度将haMPCs接种于多孔培养板,置于CO2培养箱中预培养2小时。
预培养结束后,在实验孔中添加1mL37°C水浴锅预热的成骨分化完全培养基,在对照孔中添加1mL37°C水浴锅预热标准培养基,并将多孔培养板置于37°C,5%CO2浓度的CO2培养箱中进行培养。在培养过程中,每隔3-4天对相应板孔进行换液。经过足够培养时间后(>21天),在当天配置4%福尔马林溶液和2%Alizarin Red S染液,对各孔进行固定和染色处理。吸除培养基,DPBS洗涤一次,并将细胞使用4%福尔马林溶液固定30分钟。固定后用蒸馏水洗涤2次,然后加入2%Alizarin Red S染液(PH为4.2)染色2-3分钟。使用蒸馏水洗涤三次,然后在光镜下对各实验组及对照组进行观察,保存图片。
实验结果:在实验进行第25天对细胞生长状况进行观察:实验组染色显示结节状沉积为淡棕色,证实了结节状沉积为钙盐沉积(图4.1);对照组染色显示为阴性(图4.2)。
综上所述,本实施例表明,本发明的haMPCs在成骨分化培养基的培养条件下在细胞形态学及经典化学染色处理呈现了骨细胞的特征,表明haMPCs具备向骨细胞的分化潜能。
实施例6
SVF动物安全性试验
对SD大鼠采用尾静脉注射不同剂量人脂肪来源的间质血管层细胞(hSVF)48小时后,未见皮疹、皮毛竖起、呼吸急促、震颤等异常过敏反应,无大鼠死亡发生;观察10周,大鼠生活状态良好,体温、食欲和体重变化正常,其中平均体重变化适量组、高剂量组与对照组从原来100g分别增长至502g、489g及 493g,比较均无显著性差异。hSVF注射结束后2周SD大鼠血清白蛋白、球蛋白及白蛋白/球蛋白水平在正常范围(表4),ALT、尿素氮、肌酐、葡萄糖等指标也在正常范围(表5),实验组和对照组比较无明显差异。本研究结果表明静脉注射SVF对大鼠安全,异种间使用SVF未见免疫排斥反应。
表4
组别 |
白蛋白(g/L) |
球蛋白(g/L) |
A/G |
对照组 |
34.1±1.80 |
36.2±2.19 |
0.96±0.07 |
适量组 |
34.7±0.61 |
32.5±1.29 |
1.07±0.05 |
高剂量组 |
33.4±0.51 |
34.3±1.71 |
0.97±0.09 |
表5
组别 |
ALT(U/L) |
BUN(mmol/L) |
肌酐(umol/L) |
葡萄糖(mmol/L) |
对照组 |
62.1±7.45 |
8.13±1.70 |
36.7±4.34 |
5.93±1.12 |
适量组 |
68.0±7.30 |
6.88±0.56 |
37.5±2.08 |
6.38±0.82 |
高剂量组 |
64.9±6.05 |
6.05±0.50 |
36.7±4.34 |
6.54±0.37 |
实施例7
冻存复苏后haMPCs安全性试验
传代培养第三代(P3代)haMPCs冻存复苏后裸鼠体内注射,注射后连续观察14天,实验动物生活状态良好,未见异常反应,体温、食欲和体重变化正常,其中体重增长适量组、高剂量组与对照组分别为11.8%、13.9%及14.3%,组间比较无显著性差异。haMPCs体内注射未对肝、脾、肾、肺、脑、心、胸腺、甲状腺及睾丸/卵巢等主要脏器产生明显影响,脏器指数无显著改变。光镜下观察肝、肾、脾及睾丸/卵巢结构正常,未见间质增生、脂肪浸润及炎性细胞浸润等病理改变。只有在实验组脾脏中可见到明显增多的巨核或多核巨细胞,可能与haMPCs注射后的巨噬细胞免疫反应有关,有待进一步研究。本实验中小鼠血液生化指标均在正常范围内变化,适量组及高剂量组与对照组比较未见显著性差异(表6-8)。本研究结果表明静脉注射haMPCs对小鼠是安全的,异种间使用haMPCs未见免疫排斥反应。
表6
组别 |
WBC(*109/L) |
RBC(*1012/L) |
HB(g/L) |
Pla(*1012/L) |
对照组 |
5.93±1.35 |
8.69±6.17 |
142.8±6.17 |
494.0±42.24 |
适量组 |
7.50±1.66 |
8.69±0.44 |
145.8±3.37 |
448.2±49.8 |
高剂量组 |
5.82±1.80 |
8.90±0.64 |
144.7±8.69 |
477.5±62.9 |
表7
组别 |
白蛋白(g/L) |
球蛋白(g/L) |
A/G |
对照组 |
16.95.1±0.85 |
36.83±2.40 |
0.48±0.04 |
适量组 |
16.62±0.98 |
36.80±1.10 |
0.48±0.04 |
高剂量组 |
16.75.4±0.76 |
37.67±2.50 |
0.43±0.05 |
表8
组别 |
GPT(U/L) |
BUN(mmol/L) |
肌酐(umol/L) |
葡萄糖(mmol/L) |
对照组 |
23.0±2.10 |
8.65±0.23 |
5.83±1.32 |
5.28±0.39 |
适量组 |
22.8±2.86 |
7.46±1.03 |
3.8±1.10 |
6.3±0.76 |
高剂量组 |
22.67±3.14 |
7.48±3.98 |
5.83±1.47 |
5.94±0.64 |
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。