KR101659158B1

KR101659158B1 - 메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물

Info

Publication number: KR101659158B1
Application number: KR1020140104574A
Authority: KR
Inventors: 조미라; 양철우; 박성환; 문수진; 곽승기; 박민정; 이선영; 이성희; 정정희; 양은지; 김은경; 김석중; 이은정
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-08-16
Filing date: 2014-08-12
Publication date: 2016-09-23
Also published as: KR20150020112A

Abstract

본 발명은 CD105, CD29 및 CD44는 양성이며 CD34, CD45 및 HLA-DR는 음성의 면역학적 특징을 갖는 간엽줄기세포에 메트포민을 처리하여, 28~42℃의 온도에서 14 ~ 21일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β)를 대량생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 간엽줄기세포, 상기 간엽줄기세포를 함유하는 면역질환 치료 또는 예방용 세포치료제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포는 면역조절능을 갖는 인자인 IDO, TGF-beta 또는 IL-10의 발현이 증가되어 있고, 자가포식작용 및 미토콘드리아 활성을 증가되어 있어 면역질환 치료를 위한 세포치료제로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물{Mesenchymal stem cells treated metformin having immuno-modulating activity and cell therapeutic agent for preventing or treating immune disease}

본 발명은 메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물에 관한 것이다.

면역(Immunity)은 생체 조직으로 침입하거나 주입되는 모든 외부 고분자물질(항원)에 대한 생체의 자기보호 체계의 하나이다. 면역체계의 주요한 구성성분으로 림프구가 있는데, 이는 골수에서 만들어져서 혈액을 따라 림프 조직이나 기관, 주로 림프절비장편도 등으로 순환하는 백혈구다. B세포는 적절한 항원에 의해 자극되면 빠르게 증식하여, 그 항원을 중화시킬 특별한 항체(면역글로불린)를 만들어내는 클론을 형성한다. B세포가 생성하는 항체는 체액에서 순환하면서 체액성면역을 수행한다. T세포는 흉선에서 만들어져 림프 조직으로 이동하는데, 항원을 직접 공격하는 세포매개성면역을 담당한다.

또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 많은 비자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다.

이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하면서 각종 자가면역질환이 발병하게 된다.

한편, 이러한 자가면역질환을 치료하는 주된 방법은 주로 자기면역 기능을 억제하는 약물이 사용되고 있다. 그러나 부작용이 많아 지속적으로 사용하기 곤란하고 재발을 충분히 막지 못하여 치료에 한계가 있다.

따라서 보다 효과적인 새로운 면역질환 치료제의 개발이 연구 및 개발되고 있는데, 최근 들어 면역질환 치료를 위한 세포치료제가 개발이 되고 있으며, 세포치료제로서 줄기세포를 이용하려는 연구가 점점 증가하고 있다.

특히, 줄기세포 중 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)는 아직까지 면역조절능력에 대한 정확한 작용기전이 밝혀져 있지 않고 우수한 면역질환 치료 효과를 갖는 줄기세포의 제조에 대한 연구도 거의 없는 실정이다.

이에 본 발명자들은 줄기세포를 이용하여 효과적으로 면역치료를 위한 세포치료제를 연구하던 중, 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)가 우수한 면역질환 치료 효과를 갖는다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허출원번호 2007-0017970

따라서 본 발명의 목적은 간엽줄기세포에 메트포민을 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β)를 대량생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 방법으로 제조된 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β)를 대량 생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 간엽줄기세포에 메트포민을 처리하는 단계를 포함하는, 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β)를 대량생산하고, 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 CD105, CD29 및 CD44는 양성이며 CD34, CD45 및 HLA-DR는 음성의 면역학적 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 메트포민을 처리한 간엽줄기세포를 28 ~ 42℃의 온도에서 14 ~ 21일 동안 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 메트포민은 간엽줄기세포 2 × 10⁵~ 1 × 10⁶ 세포수를 기준으로 0.2 ~ 2mM의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 메트포민의 처리에 의해 IDO, TGF-beta 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현이 증가될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 제조된 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β)를 대량 생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 투여개체의 체중 kg 당 2 × 10⁵ 내지 2.5 × 10⁷ 세포수로 투여할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Diesese), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergy), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(mitochondrial disease)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 CD105, CD29 및 CD44는 양성이며 CD34, CD45 및 HLA-DR는 음성의 면역학적 특징을 갖는 간엽줄기세포에 메트포민을 처리하여 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β)를 대량생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 간엽줄기세포, 상기 간엽줄기세포를 함유하는 면역질환 치료 또는 예방용 세포치료제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포는 면역조절능을 갖는 인자인 IDO, TGF-beta 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현이 증가되어 있고, 자가포식작용 및 미토콘드리아 활성을 증가되어 있어 면역질환 치료를 위한 세포치료제로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 말초 혈액에서 분리한 간엽줄기세포의 세포 모양을 현미경으로 관찰한 결과와, 간엽줄기세포의 세포 표지자 발현 여부를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 말초 혈액에서 분리한 간엽줄기세포 및 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포에서의 IDO 및 TGF-beta 발현 정도를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 말초 혈액에서 분리한 간엽줄기세포 및 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포 각각을 대상으로 염증인자 및 종양인자와 관련된 유전자인 HMGB-1, IL-6, IL-1beta의 발현 변화를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 말초 혈액에서 분리한 간엽줄기세포 및 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포 각각을 대상으로 전자현미경을 통해 자가포식 소낭(autophagic vacuoles) 및 미토콘드리아의 활성 정도를 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 지방조직으로부터 분리한 간엽줄기세포 및 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포에서의 IL-10 및 TGF-beta 발현 정도를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 지방조직으로부터 분리한 간엽줄기세포 및 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포에서의 IL-10 및 IDO 발현 정도를 DAPI 염색방법을 통해 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 골관절염이 유도된 마우스 모델을 대상으로 메트포민을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포를 주입한 군(Met-MSC), 골관절염 마우스에 메트포민 미처리 간엽줄기세포만을 주입한 군(MSC) 및 골관절염 마우스 군(MIA; 아무것도 처리하지 않은 군)에서의 통증 분석 결과를 나타낸 것이고(A), 연골의 파괴정도를 인디아 잉크 염색법으로 염색하여 관찰한 것을 나타낸 것이다(B).
도 8은 염증성장질환이 유도된 마우스 모델을 대상으로 메트포민을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포를 주입한 군(MSC+Metformin), 간엽줄기세포만을 주입한 군(MSC; 메트포민 미처리군), 아무것도 처리하지 않은 군(IBD; 염증성 장질환 군)에서의 몸무게 변화(A), IBD 질병활성도(B) 및 대장의 길이와 두께변화(C)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 염증성장질환이 유도된 마우스 모델을 대상으로 메트포민을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포를 주입한 군(MSC+Metformin), 간엽줄기세포만을 주입한 군(MSC; 메트포민 미처리군), 염증성 장질환 군(IBD), 아무것도 처리하지 않은 군(WT)에서의 H&E 염색을 통한 장내 염증세포 침윤 및 세포 조직 형태 변화(A)와 immunochimistry 염색을 통한 TNF-a 관찰 결과를 나타낸 것이다(B).
도 10은 관절염 모델인 IL-1Ra Knockout mouse를 대상으로 메트포민을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포를 주입한 군(Met-MSC), 간엽줄기세포만을 주입한 군(MSC; 메트포민 미처리군) 및 아무것도 처리하지 않은 군(즉, 관절염 발명 군; IL-1Ra Knockout mouse)에서의 관절염 지수를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 류마티스 관절염 동물모델을 대상으로 메트포민을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포(Met-MSC), 간엽줄기세포(MSC; 메트포민 미처리 간엽줄기세포) 및 아무것도 처리하지 않은 군(control)에서의 류마티스 관절염 치료효과를 관절염 지수를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 골관절염이 유도된 마우스 모델을 대상으로 메트포민을 처리하여 제조한 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포를 주입한 군(Met-MSC), 골관절염 마우스에 메트포민 미처리 간엽줄기세포만을 주입한 군(MSC) 및 골관절염 마우스 군(MIA; 아무것도 처리하지 않은 군)의 골관절염증과 연골의 파괴정도를 분석하기 위해 H&E 염색, Toluidin 염색 및 saffranin O 염색을 시행한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있는 세포치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포가 메트포민을 처리하지 않은 간엽줄기세포에 비해 면역질환의 치료 효과가 현저하게 우수함을 실험을 통해 확인하였다.

본 발명은 하기 화학식 1의 메트포민(Metformin)을 간엽줄기세포에 처리하는 것을 특징으로 하며, 메트포민은 IUPAC 명명법으로 N,N-Dimethylimidodicarbonimidic diamide이고, 분자식은 C₄H₁₁N₅이며, 분자량은 129.16364이다.

따라서, 본 발명은 메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 제공할 수 있으며, 상기 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물을 제공할 수 있다.

상기 간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSC)는 골수(bone marrow), 혈액, 진피 및 골막 등에서 분리되는 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포, 연골세포 및 뼈세포 등으로 분화할 수 있는 전능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다.

특히 본 발명에서 사용되는 상기 간엽줄기세포는, 동물의 간엽줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 간엽줄기세포일 수 있다. 또한 본 발명의 간엽줄기세포는 골수, 지방조직, 말초혈액, 간, 폐, 양수, 태반의 융모막 또는 제대혈로부터 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 지방조직 또는 말초혈액에서 유래한 것을 사용할 수 있다.

참고로, 간엽줄기세포는 상기와 같이 다양한 소스로부터 수득할 수 있는데, 간엽줄기세포를 얻는 과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다: (1) 인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는, 인간의 간엽줄기세포 소스, 예컨대, 혈액 또는 골수 또는 지방조직으로부터 간엽줄기세포를 분리하는 단계; (2) 분리된 세포를 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및 (3) 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된 간엽줄기세포를 수득하는 단계를 통하여 얻을 수 있다.

상기 과정에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM(Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM(Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640(Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12(Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10(Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM(Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1(Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A(McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다.

또한, 분리하여 배양한 간엽줄기세포의 확인은 유세포 분석을 통하여 할 수 있다. 이러한 유세포 분석은, 간엽줄기세포의 특이한 표면 마커를 이용하여 실시된다. 바람직하게 본 발명에서 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조를 위해 사용할 수 있는 간엽줄기세포는 CD105, CD29 및 CD44는 양성이며 CD34, CD45 및 HLA-DR는 음성의 면역학적 특징을 갖는 세포를 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에서는 다양한 소스로부터 유래한 간엽줄기세포를 면역질환의 치료 용도로 사용하고자 메트포민을 처리하여 면역조절능을 갖는 새로운 간엽줄기세포를 제조하였다.

메트포민은(Metformin)은 현재 비-인슐린 의존성 당뇨병 멜리튜스(non-insulin dependent diabetes mellitus, NIDDM)의 치료기술에서 사용되고 있는 경구용 항과혈당 약물로써, 기초 플라즈마 글루코스 및 식후의 플라즈마 글루코스를 모두 낮춤으로써 NIDDM 환자들에 있어서 글루코스 내성을 향상시킨다. 이처럼 메트포민(Metformin)은 주로 2형 당뇨병 치료제로 널리 이용되고 왔고, 다낭성 난소 증후군(polycystic ovary syndrome), 체중 감소, 암 치료제 등에 대해 임상적 접근이 이루어지고 있다. 그러나, 아직까지 메트포민을 이용한 면역질환 치료 기술 및 메트포민을 이용한 간엽줄기세포의 제조방법에 대한 내용은 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 이러한 메트포민과 간엽줄기세포를 이용한 새로운 면역질환 치료제를 개발하기 위해, 간엽줄기세포에 메트포민을 처리한 결과, 메트포민을 처리하여 배양 및 수득한 간엽줄기세포는 세포 내에서 면역조절능과 관련된 인자인 TGF-beta, IDO 및 IL-10 유전자의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 확인되었으며, 특히 말초혈액 유래의 간엽줄기세포에 메트포민을 처리한 경우, 메트포민을 처리하지 않은 군에 비해 TGF-beta가 약 10배 증가하는 것으로 나타났다(도 2 및 도 4 참조).

참고로 면역조절능과 관련성이 있는 상기 TGF-beta, IDO 및 IL-10 중에서, IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase)는 면역계의 기능 및 활성을 측정하는 인자로 알려져 있으며, 최근 IL-10과 함께 염증을 억제하는 활성이 있는 것으로 밝혀졌고, TGF-beta(transforming growth factor beta)는 TGF1, TGF2, 및 TGF3로 불리워지는 3개 이소폼이 존재하는 분비된 단백질로서, TGF는 큰 단백질 전구체로서 코딩되는데, TGF1는 390개 아미노산을 포함하고, TGF2 및 TGF3은 각각 412개 아미노산을 포함한다. 특히 TGF는 대부분의 세포에 대하여 성장억제 활성을 가지므로, TGF는 정상적인 TGF 수용체를 발현하는 암세포에 대해서도 성장억제 활성을 가진다(참조: Twardzik et al., J. Natl. Cancer Institute, 81:1182-1185, 1989). 따라서, 종양세포는 자체의 TGF 수용체 발현을 억제함으로써 TGF에 의한 성장저해로부터 벗어나기도 한다. 참고로 TGF-beta 존재 하에서 Foxp3의 발현은 naive T cell로 부터 유도되고 이렇게 유도된 Treg은 동일한 면역 억제 기능을 갖는다. 또한 TGF-beta유전자의 결핍은 염증 면역세포의 활성을 제어하지 못하여 심한 자가 면역 질환을 유발시킬 수 있다. 따라서 TGF-beta의 생산 촉진은 면역질환을 치료할 수 있는 작용과 관련되어 있다.

나아가 본 발명자들은 메트포민을 처리하여 제조한 본 발명의 간엽줄기세포가 자가포식 작용 및 미토콘드리아 활성도 우수함을 확인하였는데, 자가포식 작용(autophagy)은 세균이 자신의 소기관이나 세포성분을 분해하는 과정으로서, 세포 외에서 고분자를 음작용이나 식작용 등의 세포내 섭취에 의해 받아들이는 헤테로파지와는 구분되는 작용이다. 세포가 영양소 결핍에 반응하여 자신의 단백질을 분해하거나, 세포의 재구축 등의 과정에서 불필요한 세포 성분을 제거하기 위해 작용하며, 세포 성분은 소포체에 유래하는 막에 둘러싸여 자식식포를 형성하고, 또한 리소솜과 융합하여 자식파고리소솜을 형성하여 분해하게 한다.

또한, 이러한 자가포식 작용은 면역과 염증의 유익하거나 해로운 효과를 조절할 수 있고 감염성 질환, 자가면역과 염증질환을 방지할 수 있는 효과가 있기 때문에, 본 발명에서 메트포민이 처리된 상기 간엽줄기세포는 자가포식작용을 가지고 있어 면역 및 염증질환의 치료에 보다 유용할 수 있다. 또한, 미토콘드리아 활성이 조절되지 못하는 상황에서는 더 심한 염증이 생기며 이로 인하여 면역염증 질환의 발생에 미토콘드리아의 이상 반응이 매우 중요하다고 알려져 있다. 미토콘드리아의 활성이 저하될 경우에는 병인 세포의 제어 시스템이 불안하게 되고 이로 인하여 과도한 세포의 활성이나 증식을 유발하게 된다.

따라서 본 발명에서는 실험을 통해 간엽줄기세포에 메트포민을 처리한 경우, 메트포민을 처리하지 않은 경우에 비해 자가포식 작용이 증가되었음을 확인할 수 있는 자가포식 소낭 증가를 확인하였고 미토콘드리아 활성 증가도 확인하였기에 메트포민이 처리된 간엽줄기세포는 보다 효과적으로 면역질환을 치료할 수 있다고 볼 수 있다.

또한, 본 발명은 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β)를 대량생산하고 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 CD105, CD29 및 CD44는 양성이며 CD34, CD45 및 HLA-DR는 음성의 면역학적 특징을 갖는 간엽줄기세포에 메트포민을 처리하여, 28~42℃의 온도에서 14 ~ 21일 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 메트포민을 처리할 수 있는 간엽줄기세포는 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 간엽줄기세포를 사용할 수 있으며, 상기 메트포민은 간엽줄기세포 2 × 10⁵~ 5 × 10⁵ 세포수를 기준으로 0.2 ~ 2mM의 농도로 처리할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 면역조절능을 갖는 메트포민을 처리하여 제조된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 세포치료제란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 줄기세포 치료제이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 면역세포 치료제로 분류할 수 있다.

본 발명의 세포치료제 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여(intravenous therapy, i.v), 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.

본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 용어 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 조성물에는 투여개체의 체중 kg 당 2.5 × 10⁵ 내지 2.5 × 10⁷ 세포수로 투여되는 세포치료제가 포함될 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명의 상기 세포치료제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 포유동물은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 세포치료제 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 조성물에 포함되는 세포치료제는 투여개체의 체중 kg 당 1 × 10⁴내지 1 × 10⁸세포수의 양을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명에서 메트포민 처리에 의해 제조된 간엽줄기세포 및 상기 세포를 포함하는 면역질환 치료용 세포 치료제 조성물이 치료하고자 하는 상기 면역질환은 이에 제한되지는 않으나, 골관절염, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis), 천식(Asthma), 피부염(Dermititis), 건선(Psoriasis), 낭섬유증(Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환(Inflammatory Bowel Diesese), 크론 병(Crohns disease), 자가면역성 당뇨(Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증(Diabetic retinopathy), 비염(Rhinitis), 허혈-재관류 손상(Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착(Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환(Chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 그레이브병(Graves disease), 위장관 알러지(Gastrointestinal allergy), 결막염(Conjunctivitis), 죽상경화증(Atherosclerosis), 관상동맥질환(Coronary artery disease), 협심증(Angina), 암 전이, 소동맥 질환 및 미토콘드리아 질환(mitochondrial disease)을 포함할 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

메트포민이 처리된 간엽줄기세포의 제조 및 면역조절능을 갖는 유전자의 발현 정도 분석

<1-1> 말초혈액으로 간엽줄기세포 분리 및 배양

정상인으로부터 혈액을 50cc 채취한 후 PBMC를 분리하여 20% FBS가 포함된 a-MEM 배지에서 5일간 배양 후 배양액 위에 뜬 세포들은 제거하였다. 이후 3일 간격으로 배지를 교체하였고, 세포증식 정도에 따라 세포를 배양 플레이트에서 떼어 재배양시켰으며, 재배양은 3회 수행하여(passage 3) 말초 혈액으로부터 간엽줄기세포를 수득하였고, 수득한 세포가 간엽줄기세포인지를 확인하기 위해 세포 표지자를 확인하였는데, 확인 결과, CD105+CD29+CD44 양성이며, CD34,CD45,HLA-DR 음성임을 확인하였다(도 1A 참조, 도 1A에서 왼쪽은 100배 확대한 사진이며, 오른쪽 사진은 40배 확대한 사진이다).

<1-2> 지방조직으로부터 간엽줄기세포 분리 및 배양

지방 흡입수술로 얻어진 지방 조직이나, 외과적 수술 후에 얻어진 지방 조직을 10% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 PBS로 10회 이상 세척하여 혈액과 이물질을 제거한 후, 조직을 0.2 ~ 0.3 g이 되도록 잘게 절단하였다. 0.2% 콜라게나아제 (Roche, Sandhofer Strasse, Mannheim, Germany) 용액에 넣어서 37℃의 수욕, 100 rpm에서 1시간 동안 반응시켰다. 100㎛ 메쉬를 이용하여 콜라게나아제에 의해서 분해된 용액층과 분해 되지 않은 조각을 분리한 후, 분리된 콜라게나아제 용액에 동량의 PBS를 첨가하였다. 이어, 4℃, 1200 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액인 지질과 지방층을 제거하고, 콜라게나아제 상층액을 제거하였다. 가라앉은 MSC로부터 남은 콜라게나아제 용액을 제거하기 위해서 MSCGM [mesenchymal stem cell growth media: MSC 기본 배지 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 간엽세포 성장 보조물 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 4 mM L-글루타민 및 페니실린(0.025 unit/500 ml)/스트렙토마이신(0.025 mg/500 ml)]를 넣어 다시 4℃, 1200 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. MSCGM은 우태아혈청을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 기초한 배지이다. 이어, 상층액을 제거하고, 얻어진 MSC는 배양접시에 접종하여 MSCGM로 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였다. 이틀에 한번 씩 배양액을 교체하면서 배양하였다.

<1-3> 메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조 및 제조된 간엽줄기세포에서 면역조절능과 관련된 유전자의 발현 정도 분석

상기 실시예 <1-1> 및 <1-2>에서 분리 및 배양한 간엽줄기세포를 대상으로 메트포민을 각각 처리한 다음, 면역조절능과 관련된 유전자인 IDO, TGF-beta, IL-10의 발현 변화를 분석하였다.

구체적으로, 말초 혈액 유래의 간엽줄기세포에는 2 × 10⁵세포수를 기준으로 1mM 농도의 메트포민을 처리하여 37℃ 온도 조건 하에서 배양하여 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 제조하였고, 지방조직 유래 간엽줄기세포에는 2 × 10⁵ 세포수에 대해 1mM 농도의 메트포민을 처리하여 37℃ 온도 조건 하에서 배양하여 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 제조하였다.

이때, 대조군으로는 메트포민이 처리되지 않은 간엽줄기세포를 사용하였으며, 메트포민이 처리된 간엽줄기세포에서 면역조절능 유전자의 발현 정도를 분석하였다.

분석결과, 말초혈액으로부터 분리되고 메트포민을 처리하여 제조된 간엽줄기세포의 경우, IDO 및 TGF-beta가 메트포민 처리에 의해 간엽줄기세포에서 발현이 증가되는 것으로 나타났으며, 특히 TGF-beta는 약 10배정도 증가하여 발현된 것으로 나타났다(도 2 참조).

또한, 이러한 결과는 지방조직으로부터 분리되고 메트포민을 처리하여 제조된 간엽줄기세포에서도 유사하게 나타났는데, IDO, TGF-beta 및 IL-10의 발현 정도가 메트포민을 처리하지 않은 간엽줄기세포에 비해 증가한 것으로 나타났다(도 5 참조).

나아가 본 발명자들은 상기와 같은 결과를 DAPI 염색 방법을 통해서도 확인할 수 있었는데, 즉, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 염색 후 형광 현미경을 통해 메트포민이 처리된 간엽줄기세포에서의 IL-10과 IDO의 발현 정도를 분석하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 지방 조직 유래의 간엽줄기세포에 메트포민을 처리한 경우, 메트포민을 처리하지 않은 경우에 비해 붉은색으로 염색된 IL-10과 IDO가 더 증가한 것으로 나타났다.

<1-4> 메트포민이 처리된 면역조절능을 갖는 간엽줄기세포의 제조 및 제조된 간엽줄기세포에서 염증인자 및 종양인자와 관련된 유전자의 발현 정도 분석

상기 실시예 <1-1> 및 <1-2>에서 분리 및 배양한 간엽줄기세포를 대상으로 메트포민을 각각 처리한 다음, 염증인자 및 종양인자와 관련된 유전자인 HMGB-1, IL-6, IL-1beta의 발현 변화를 분석하였다.

구체적으로, 지방조직 유래 간엽줄기세포에는 5 × 10⁵ 세포수에 대해 1mM 농도의 메트포민을 처리하여 37℃ 온도 조건 하에서 배양하여 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 제조하였다.

이때, 대조군으로는 메트포민이 처리되지 않은 간엽줄기세포를 사용하였으며, 메트포민이 처리된 간엽줄기세포에서 염증인자 및 종양인자 유전자의 발현 정도는 realtime PCR 방법을 사용하여 분석하였다.

분석결과, 지방조직으로부터 분리되고 메트포민을 처리하여 제조된 간엽줄기세포의 경우, HMGB-1, IL-6, IL-1beta의 발현정도가 의미있게 감소되는 것으로 나타났다(도3 참조).

따라서 이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포의 경우, 메트포민을 처리하지 않은 경우에 비해, 면역조절능을 갖는IDO, IL-10 및 TGF-beta의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 확인하였고, 염증인자 및 종양인자와 관련된 유전자인 HMGB-1, IL-6, IL-1beta의 발현이 현저하게 감소되는 것을 확인하였다.

<실시예 2>

메트포민을 처리하여 제조한 간엽줄기세포에서 자가소화작용(autophagy)의 활성과 미토콘드리아 활성 분석

상기 실시예 1에서 분리 및 배양한 말초혈액 유래의 간엽줄기세포에 메트포민을 처리하여 제조한 면역조절능이 증가된 간엽줄기세포와 메트포민을 처리하지 않은 말초혈액 유래의 간엽줄기세포를 대상으로 전자 현미경을 통해 자가소화작용 활성과 미토콘드리아의 활성 변화를 관찰하였다.

이는 자가포식작용은 면역과 염증의 유익하거나 해로운 효과를 조절할 수 있고 감염성 질환, 자가면역과 염증질환을 방지할 수 있는 효과가 있기 때문에, 본 발명자들은 메트포민이 처리된 본 발명의 간엽줄기세포가 자가포식작용을 가지고 있어 면역 및 염증질환의 치료가 가능한지 확인하기 위함이다.

또한, 참고로 자가포식작용(autophagy)은 세포내부로 침입한 미생물(바이러스, 박테리아, 기생충 등)의 분해 관여한다고 알려져 있으며, 실제 면역반응과 그 조절에 관여 뿐만아니라 염증반응을 억제한다고 알려져 있다. 이는 다양한 병태 생리학적 과정에 대단히 중요한 역학을 하는 것을 보여주며 특히 자기방어(면역)체계를 조절할 수 있다. 최근 염증성 장질환 및 다양한 자가면역 질환에서 autophagy balance의 조절이 치료에 있어 중요함이 강조되고 있다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 메트포민이 처리된 간엽줄기세포는 메트포민을 처리하지 않은 군에 비해 자가포식 소낭(autophagic vacuoles)의 숫자가 증가하는 것으로 나타났으며(노란색 화살표), 미토콘드리아의 활성도 메트포민에 의해 증가된 것으로 나타났다(붉은색 화살표는 미토콘드리아를 가르키는 것임).

이러한 결과로부터 Met-MSC가 미토콘드리아 질환 치료에 효과적인 것을 알 수 있었다.

<실시예 3>

메트포민이 처리된 간엽줄기세포의 골관절염 치료효과

상기 본 발명에 따라 제조된 메트포민이 처리된 간엽줄기세포가 실제적으로 면역질환의 치료 효과에 유용한지 확인하기 위해 먼저 골관절염 유발 동물모델을 대상으로 치료 효과를 조사하였다.

먼저, 골관절염 동물모델을 제작하기 위해 200 ~ 250g인 5주령 수컷 Wistar rat(중앙실험동물)을 21 ~ 22℃의 온도에서 명암주기(light-dark cycle)를 12시간 간격으로 사육하였고 살균한 물과 사료를 공급하여 키웠다. 이후 골관절염 유도를 위해 3mg의 monosodium iodoacdtate(Sigma, ST. Louis, MO)를 오른쪽 무릎의 관절내에(intra-articular) 26.5G 주사기를 사용하여 50ul씩 주입하여 골관절염이 유도된 마우스 동물을 제작하였다.

이후, 골관절염이 유도된 마우스에 2 × 10⁶의 지방조직유래 간엽줄기세포 및 1mM농도로 메트포민이 처리된 지방조직유래 간엽줄기세포를 1주일에 한번씩, 총 2회 i.v.로 주입하였다. 이후, 7일 경과한 다음, 골관절염 유발 동물의 행동력에 미치는 영향을 평가하는 지표인 통증정도를 측정하였고, india ink 염색법으로 연골의 파괴정도를 분석하였다.

분석 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 메트포민을 처리하지 않은 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 메트포민을 처리한 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군의 경우, 통증반응정도가 정상 마우스에 거의 근접하게 회복되는 것으로 나타났고, 연골 파괴 정도도 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 처리한 군이 정상과 유사하게 회복되어 있는 것으로 나타났다. 참고로 도 7B 도면에서 위 아래의 도면은 골관절염이 유도된 마우스의 조인트(joint)를 다른 각도에서 관찰한 것을 나타낸 것이다.

나아가 본 발명자들은 7일이 경과한 후, H&E 염색, Toluidin blue 염색, saffranin O 염색 방법을 이용하여 염색 후 골관절염 유발 동물의 관절염증과 연골의 파괴정도를 분석하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 메포민이 처리된 간엽줄기세포를 주입한 마우스의 경우, 염증세포의 침윤이나 연골 파괴 정도가 의미있게 감소되어 있음을 확인하였다.

<실시예 4>

메트포민이 처리된 간엽줄기세포의 염증성 장질환 치료효과

염증성 장질환의 마우스 모델을 제조하기 위해, 시험동물은 C57BL/6(H-2kb) 마우스를 사용하였으며, 상기 마우스에 3.5% 덱스트란 설페이트 소듐(dextran sulfate sodium, DSS) 물을 1주일간 음용하게 하여 염증성 장 질환 유도 동물 모델을 제작하였다. 이후 상기 염증성 장질환 마우스 동물에 지방조직 유래 간엽줄기세포 및 메트포민이 1mM 농도로 처리된 지방조직유래 간엽줄기세포를 2 × 10⁶의 세포수로 i.v.로 일주일에 한 번씩 총 2회 주입하였고, 증상(몸무게, 대장의 길이, DAI(disease activity index))을 확인하였다.

분석 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 지방조직 유래 간엽줄기세포를 단독처리한 군에 비해 메트포민을 처리한 간엽줄기세포의 경우, 염증성 장질환으로 감소된 마우스의 몸무게가 더 효과적으로 회복되는 것으로 나타났고, IBD 질병 활성도 현저하게 감소되는 것으로 나타났으며(거의 질병 활동도가 0임), 대장의 두께와 길이도 회복되어진 것으로 나타났고, 장길이의 단축 현상이 정상과 유사하게 회복되는 것으로 확인되었다.

나아가 본 발명자들은 7일이 경과한 후, 염증성 장질환 동물 모델에서 조직 내 병인 H&E 염색 방법을 이용하여 장내 염증세포 침윤 및 세포 조직 형태 변화와 immunochemistry 염색을 통한 TNF-a 발현정도를 분석하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 지방조직 유래 간엽줄기세포를 단독처리한 군에 비해 메트포민을 처리한 간엽줄기세포의 경우, 마우스의 장내 염증세포 침윤이나 세포조직 형태가 정상마우스와 유사하게 유지되는 것을 관찰하였으며, 또한 장에서 염증성 사이토카인인 TNF-a를 immunochemistry 염색을 통해 관찰한 결과도 마찬가지로 간엽줄기세포를 단독처리한 군에 비해 메트포민을 처리한 간엽줄기세포의 경우 정상의 장조직과 유사한 정도로 TNF-a의 발현양이 감소됨을 확인하였다.

<실시예 5>

메트포민이 처리된 간엽줄기세포의 자연발생적 염증 자가면역관절염 치료효과

나아가 본 발명자들은 메트포민이 처리된 간엽줄기세포가 관절염에도 치료 효과가 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저 자가면역 관절염 마우스 모델을 제조하기 위해, Y. Iwakura팀이 발표한 방법에 따라 IL-1 수용체 유전자를 결손시킨 마우스(IL-1Ra knockout mouse)를 제작하였는데, 이는 인터루킨1 수용체억제인자(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)가 IL-1수용체에 직접 작용하여, IL-1α, IL-1β가 수용체에 작용하지 못하도록 함으로써 자연적으로 자가면역관절염 질환이 유발되도록 하는 방법이다.

관절염이 유발된 마우스를 대상으로 본 발명에서 제조한 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 상기 질환 마우스에 주입하였는데, 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 2 × 10⁶의 세포수로 상기 마우스에 i.v.로 일주일에 한 번씩 총 3회 주입하였고, 1주일 후 이들 각 마우스들의 관절염 치수를 측정하였다. 이때 대조군으로는 관절염이 유발된 마우스 군, 지방조직 유래 간엽줄기세포만이 주입된 관절염 마우스군(메트포민을 처리하지 않은 간엽줄기세포 처리군)을 사용하였다.

분석 결과, 간엽줄기세포만을 처리한 군에 비해 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 투여한 마우스 군의 경우, 관절염 증상이 개선되는 것으로 나타났다(도 10 참조).

<실시예 6>

메트포민이 처리된 간엽줄기세포의 자가항원 활성 유도를 통한 류마티스 관절염 치료효과

먼저 관절염 마우스 모델을 제조하기 위해, DBA/1J 마우스에 type II collagen(CII)과 CFA(adjuvant) 1:1로 혼합하여, 마우스당 100ul의 CII를 tail base에 50ul 용량으로 주사하고, 2주 후 CII와 IFA 1:1 혼합액을 100ug/50ul로 2차 주입하였다.

마우스에 관절염을 유도시키고 1주일 후, 1주일에 1회 총3회 정맥을 통해 아무것도 처리되지 않은 간엽줄기세포 또는 메트포민이 처리된 간엽줄기세포 1 × 10⁵(체중 kg 당)를 투여한 후 관절염 평가를 진행하였다.

관절염 지수의 측정을 위해 실험의 내용을 알고 있지 않은 관찰자 세 명이 일주일에 세 번씩 관절 염증의 위증도를 평가하여 10주까지 관찰하였다. 이때 관절염의 평가는 Rossoliniec 등에 의한 평균 관절염 지수에 기준하여 마리당 2차 접종 때 CII/CFA를 투여한 다리를 제외한 나머지 세 다리에서 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 합하여 3으로 나눈 평균치를 얻고, 다시 각 동물 모델에서 3명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용하였다. 관절염 평가에 따른 점수와 기준은 다음과 같다.

0점 : 부족이나 종창이 없다.

1점 : 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적

2점 : 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적

3점 : 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적

4점 : 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적

이때 마리당 최고의 관절염 지수는 4점이므로 쥐 1마리당 최고의 질병지수는 16이다.

분석결과 도 11에 나타난 바와 같이, 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군에 비해 메트포민이 처리된 간엽줄기세포를 주입한 마우스 군의 경우, 관절염이 더욱 억제되는 것으로 나타났다(도 11 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 메트포민을 처리하여 제조된 간엽줄기세포는 면역반응을 효과적으로 조절할 수 있는 활성이 있어 면역질환, 특히 자가면역질환의 치료를 위한 새로운 세포치료제로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

간엽줄기세포에 메트포민을 처리하는 단계를 포함하는, 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β)를 대량생산하고, 면역질환의 예방 및 치료효능을 갖는 간엽줄기세포의 제조방법으로,
상기 면역질환은 골관절염, 염증성 장질환, 자가면역관절염 및 류마티스 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 간엽줄기세포의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 간엽줄기세포는 CD105, CD29 및 CD44는 양성이며 CD34, CD45 및 HLA-DR는 음성의 면역학적 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 메트포민을 처리한 간엽줄기세포를 28 ~ 42℃의 온도에서 14 ~ 21일 동안 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 간엽줄기세포는 말초혈액 또는 지방조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 메트포민은 간엽줄기세포 2 × 10⁵~ 1 × 10⁶ 세포수를 기준으로 0.2 ~ 2mM의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 간엽줄기세포는 메트포민의 처리에 의해 IDO, TGF-beta 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인자의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 간엽줄기세포의 제조방법.
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