ES2623141T3

ES2623141T3 - Nuevos métodos para modular respuestas inflamatorias y/o inmunitarias

Info

Publication number: ES2623141T3
Application number: ES08724478.6T
Authority: ES
Inventors: Vivienne S. Marshall; Richard A. Banas; Catherine J. Trumpower
Original assignee: Noveome Biotherapeutics Inc
Current assignee: Noveome Biotherapeutics Inc
Priority date: 2007-01-17
Filing date: 2008-01-11
Publication date: 2017-07-10
Anticipated expiration: 2028-01-11
Also published as: US20100068180A1; EP2118267B1; EP2118267A2; US8221741B2; EP2118267A4; WO2008088738A3; WO2008088738A2

Abstract

Una composición que comprende una población de células progenitoras multipotentes derivadas del amnios no inmunogénicas (células AMP) que son células epiteliales que son positivas para la expresión de citoqueratinas y negativas para la expresión de CD34, en la que la población de células AMP no inmunogénicas que son células epiteliales se prepara con el método de: (a) disociar células AMP que son células epiteliales de una membrana amniótica de un amnios aislado de una placenta; (b) recoger las células AMP disociadas que son células epiteliales; y (c) cultivar las células AMP recogidas que son células epiteliales en medio de cultivo que no contiene materiales derivados de animal distintos de proteínas humanas; en la que las células AMP no inmunogénicas son para su uso en la supresión, prevención o mejora de una respuesta inmunitaria en un sujeto que se podría beneficiar de la misma; y en la que la respuesta inmunitaria: (a) es una respuesta autoinmunitaria tal como diabetes de Tipo I, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Grave, anemia hemolítica autoinmune, penfigoide ampolloso, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, pénfigo o anemia perniciosa; o (b) es una respuesta alogénica tal como enfermedad de injerto contra hospedador o enfermedad de hospedador contra injerto.

Description

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DESCRIPCION

Nuevos metodos para modular respuestas inflamatorias y/o inmunitarias

Declaracion con Respecto a la Investigacion o Desarrollo Patrocinado Federalmente

La presente invencion se realizo en parte con el apoyo del gobierno de Estados Unidos otorgado por la siguiente agencia: U.S. Army Medical Research Acquisition Activity, ERMS N.° 06100002. Estados Unidos puede tener ciertos derechos con respecto a la presente invencion.

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad bajo 35 USC § 119(e) con respecto a la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 60/880.745, presentada el 17 de enero de 2007, Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 60/902.440, presentada el 21 de febrero de 2007, Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 60/997.604, presentada el 4 de octubre de 2007.

Campo de la invencion

El campo de la invencion se refiere a nuevos metodos para modular respuestas inflamatorias y/o inmunitarias. Los metodos de este tipo utilizan composiciones que comprenden celulas extraembrionarias (denominadas celulas EE en el presente documento) que incluyen, pero no se limitan a celulas progenitoras multipotentes derivadas del amnios (denominadas celulas AMP en el presente documento); solas o en combinacion con entre si y/o en combinacion con otros agentes activos adecuados.

Descripcion de la tecnica relacionada

La Solicitud Publicada de Estados Unidos N.° 2006026337 desvela las propiedades inmunomoduladoras de celulas progenitoras adultas multitpotentes, denominadas MAPC, y los usos de las mismas.

Ueta, M., et al., (Clin Exp Immunol 2002; 129: 464-470) describen las propiedades inmunosupresoras de la membrana amniotica descelularizada.

Klyushnenkova, E., et al., (Journal of Biomedical Science, 2005, 12: 47-57) describen respuestas de linfocitos T con respecto a celulas madre mesenquimaticas humanas alogenicas, denominadas MSC.

Williams, M. (Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research, 2003, 12: 757-758) discuten la expresion funcional de HLA-G y si se puede explotar para trasplante e injerto de celulas madre satisfactorios.

Gotherstrom, C., et al., (The Hematology Journal, 2005, 90 (8): 1017-1026) desvelan que las celulas madre mesenquimaticas derivadas de medula osea de adulto no expresan protefna HLA-G.

Chang, L., et al., (Cell Research, 2005, 15 (7): 539-547) desvela que las celulas madre mesenquimaticas derivadas de placenta humana suprimen la proliferacion de linfocitos en sangre de cordon umbilical alogenica.

Mailo, M., et al., (Transplantation, 2004, 78 (10): 1439-1448) desvela el potencial de injerto de celulas de amnios y corion humanos derivadas de placenta a termino.

Zhang, Y., et al., (Experimental Hematology, 2004, 32 (7): 657-664) desvela que las que las celulas progenitoras mesenquimaticas derivadas de placenta humana soportan la expansion del cultivo de celulas de inicio del cultivo a largo plazo partir de celulas CD34+ de sangre de cordon umbilical.

Aggarwal, S., et al., (Blood, 2005, 105 (4): 1815-1822) desvela que las que las celulas madre mesenquimaticas humanas modulan respuestas celulares inmunologicas alogenicas.

El documento WO 2007/070870 A1 desvela composiciones y metodos para inhibir respuestas inmunitarias adversas en trasplante con falta de coincidencia de histocompatibilidad.

El documento WO 2007/047468 A2 desvela inmunomodulacion usando celulas madre de placenta.

Miki y Strom (Stem Cell Review, 2006, 2 (2): 133-141) desvela celulas madre pluripotentes/multipotentes derivadas del amnios.

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Antecedentes de la invencion

Las celulas madre tienen el notable potencial de proliferar y diferenciarse en muchos tipos de celulas diferentes en el cuerpo. Al servir como un sistema de reparacion para el cuerpo, teoricamente pueden dividirse sin lfmite para reponer otras celulas a lo largo de la vida de una persona. Cuando una celula madre se divide, cada nueva celula tiene el potencial de permanecer como una celula madre o convertirse en otro tipo de celula con una funcion mas especializada, tal como una celula muscular, un globulo rojo, o una celula cerebral. Quizas la aplicacion potencial mas importante de las celulas madre humanas es la generacion de celulas y tejidos que se podrfan usar para terapias basadas en celulas. Se proporcionan ejemplos de estudios de celulas madre (Tylki-Szymanska, A., et al., Journal of Inherited Metabolic Disease, 1985. 8 (3): p. 101-4; Yeager, A.M., et al., American Journal of Medical Genetics, 1985. 22 (2): p. 347-55; John, T., 2003. 16 (1): p. 43-65, vi.).

El tejido placentario esta abundantemente disponible como una fuente descartada de muchos tipos de celulas potencialmente utiles, incluyendo un tipo de celula multipotente denominada celulas derivadas de placenta. Aunque se descarta en el momento del parto como parte de las membranas placentarias, el analisis del linaje muestra que, la capa epitelial del amnios, a partir de la que se pueden aislar estas celulas multipotentes, desciende unicamente del epiblasto en el desarrollo embrionario. El epiblasto contiene las celulas que en ultima instancia se diferenciaran en el embrion y las celulas que daran lugar a un tejido extraembrionario, el amnios. Hasta ahora, en la bibliograffa solo se han descrito cuatro tipos de celulas como pluripotentes. Se trata de la masa celular interna (ICM) del embrion de implantacion previa, que da lugar al epiblasto, al propio epiblasto, tallo embrionario (ES) y celulas germinales embrionarias (EG). Por lo tanto, la identificacion, purificacion y propagacion de una poblacion de celulas multipotentes a partir de tejidos amnioticos descartados proporcionarfa una fuente extremadamente valiosa de celulas madre para terapia celular de reemplazo.

Con un rendimiento medio de mas de 200 millones de celulas por placenta, en esta fuente hay disponibilidad de un gran numero de celulas. Si estas celulas se convirtieran en celulas utiles para medicina de trasplante, podrfan proporcionar un suministro casi inagotable de material de partida en cualquier parte en el mundo. Ninguna fuente de celulas madre proporciona una poblacion inicial tan grande de celulas, y la recoleccion no requiere un procedimiento invasivo ni destructivo. Ademas, no existen problemas eticos, religiosos o sociales asociados con estas celulas ya que el tejido se obtiene a partir de la placenta.

Otra consideracion importante en las terapias de trasplante de celulas madre y organos es la tolerancia al injerto. En los seres humanos, originalmente se penso que la expresion del marcador de superficie celular HLA-G estaba limitado a sitios inmunes privilegiados tales como la placenta, asf como celulas relacionadas, incluyendo algunas aisladas del lfquido amniotico, macrofagos placentarios y sangre del cordon umbilical, implicando de ese modo su papel en la tolerancia materno-fetal (Urosevic, M. y Dummer, R. (2002) ASHI Quarterly; 3rd Quarter 2002: 106-109). Ademas, los estudios que implican la aceptacion del injerto de corazon han sugerido que la expresion proteica de HLA-G puede mejorar la tolerancia al injerto (Lila, N., et al., (2000) Lancet 355: 2138; Lila, N. et al., (2002) Circulation 105: 1949-1954). La protefna HLA-G no se expresa en la superficie de celulas madre embrionarias indiferenciadas o diferenciadas (Drukker, M, et al., (2002) PNaS 99 (15): 9864-9869). Por lo tanto, es deseable que las celulas madre destinadas a terapias basadas en celulas expresen la protefna HLA-G.

La transferencia de celulas, tejidos u organos vivos de un donante a un receptor, con la intencion de mantener la integridad funcional del material trasplantado en el receptor define el trasplante. Un objetivo principal en el trasplante de organos solidos es el injerto permanente del organo donante sin una respuesta inmunitaria de rechazo al injerto generada por el receptor, conservando al mismo tiempo la inmunocompetencia del receptor para responder a otros antfgenos extranos. Por lo general, con el fin de prevenir las respuestas de rechazo del hospedador, se usan agentes inmunosupresores no especfficos tales como ciclosporina, metotrexato, esteroides y FK506. Estos agentes se deben administrar diariamente y si se detiene su administracion, por lo general se produce rechazo al injerto. A pesar del uso de agentes inmunosupresores, el rechazo cronico de los injertos sigue siendo una fuente importante de morbilidad y mortalidad en el trasplante de organos humanos. La mayorfa de los trasplantes humanos fallan en 10 anos sin aceptacion permanente del injerto. Solo un 50 % de los trasplantes de corazon sobreviven 5 anos y un 20 % de los trasplantes de rinon sobreviven 10 anos (Opelz, et al., Lancet, 1: 1223 (1981); Gjertson, UCLA Tissue Typing Laboratory, p. 225 (1992); Powles Lancet, p. 327 (1980); y Ramsay, New Engl. J. Med., p. 392 (1982)).

Entre las reacciones adversas mas destacadas encontradas como resultado de las terapias de trasplante se encuentran: (i) la respuesta del hospedador contra el injerto ("HVG") (rechazo del trasplante por un hospedador inmunocompetente), y (ii) enfermedad de injerto contra hospedador ("GVHD") (que se produce principalmente en un hospedador inmunocomprometido cuando se reconoce como no propio por celulas inmunocompetentes en el injerto). El rechazo al injerto en un hospedador se puede evitar combinando perfectamente el donante y el tejido hospedador. Sin embargo, los emparejamientos perfectos son practicamente inexistentes (con la excepcion de los gemelos identicos). Una manera potencial con respecto a esto es el uso de tejido autologo (singeneico). Desafortunadamente, el tejido hospedador a menudo no es adecuado o no se recogio antes de la necesidad. De hecho, la necesidad de la terapia de trasplante con frecuencia es reemplazar el tejido danado en el hospedador. Esto significa que el uso de tejido autologo (singeneico) generalmente no es util en aplicaciones practicas.

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Otra opcion es emparejar un donante y un hospedador alogenicos tan proximos como sea posible usando formacion de tipos de sangre y/o tejido. Desafortunadamente, incluso el mas cercano de los emparejamientos no previenen el HVG grave, por lo que las terapias de trasplante alogenico requieren inmunosupresion y farmacos inmunosupresores (vease a continuacion).

Otro enfoque para evitar el HVG y sus complicaciones en terapias de trasplante es desactivar el sistema inmunologico del hospedador receptor. Un inconveniente para tal inmunoablacion o supresion es que compromete las defensas inmunitarias del hospedador de un modo tal que el hospedador es facilmente susceptible a las infecciones, una causa principal de morbilidad y mortalidad entre los pacientes trasplantados. Comprometer el sistema inmunologico del hospedador tambien causa o exacerba la enfermedad de injerto contra hospedador ("GVHD"). La GVHD se produce cuando el tejido donante contiene celulas inmunocompetentes que reconocen las protefnas MHC del receptor como no propias. Esto activa los linfocitos T denominados linfocitos TH1 que a su vez secretan citoquinas proinflamatorias, tales como IL-2, interferon gamma y TNF alfa, que desencadenan un ataque inmunologico contra las dianas receptoras incluyendo la piel, tracto GI, hfgado y organos linfoides (Ferrara y Deeg, 1991). En particular, el GVHD es un problema en los trasplantes de medula osea, en los que se ha mostrado que estan mediados principalmente por linfocitos T (Grebe y Streilein, 1976).

Se ha desarrollado un numero de farmacos inmunosupresores y se usan para prevenir y/o tratar estas disfunciones del sistema inmunologico. Desafortunadamente, ninguno de los farmacos inmunosupresores disponibles en la actualidad son totalmente eficaces y todos ellos tienen inconvenientes graves y efectos secundarios perjudiciales. Se sabe que los glucocorticoides, que se usan principalmente para tratar la inflamacion y las enfermedades inflamatorias, son inmunosupresores y se consideran el mejor tratamiento primario para HVG y GVHD. Inhiben la proliferacion de linfocitos T y respuestas inmunitarias dependientes de linfocitos T. Los farmacos que actuan sobre las inmunofilinas (es decir ciclosporina, tacrolimus, sirolimus) pueden ser eficaces para reducir las reacciones inmunologicas adversas en los pacientes trasplantados, pero tambien debilitan el sistema inmunologico de un modo tal que los pacientes se vuelven altamente vulnerables a las infecciones. Los agentes citostaticos (es decir metotrexato, azatiopina, mercatopurina, y antibioticos citotoxicos) tambien se usan ampliamente ya sea solos o en combinacion con otros farmacos. Causan una diversidad de efectos secundarios, algunos de los cuales pueden ser perjudiciales para el paciente. Tambien se han usado anticuerpos (policlonales y monoclonales tales como anticuerpos anti-receptor de linfocitos T (CD23) y anti-receptor de IL2 (CD25)). Tambien se han usado otros muchos farmacos (es decir interferon, opioides, protefnas de union al TNF, micofenolato, y agentes biologicos pequenos tales como FTY720). Ninguno de los farmacos inmunosupresores, ya sea usado solo o en combinacion con otros agentes, es totalmente eficaz y por lo general todos ellos dejan a los pacientes aun susceptibles a HVG y GVHD y debilitan su capacidad de defenderse contra la infeccion. Ademas, todos estos farmacos causan efectos secundarios graves, incluyendo toxicidad gastrointestinal, nefrotoxicidad, hipertension, mielosupresion, hepatotoxicidad e hipertension, por nombrar algunos.

Claramente, un tipo mas especffico de supresion inmunologica sin los inconvenientes enumerados anteriormente serfa ideal. Por ejemplo, un agente que puede suprimir o eliminar linfocitos T alorreactivos, de forma especffica, podrfa ser eficaz frente a HVG y GVHD (al menos para los injertos alogenicos) sin los efectos secundarios negativos que se producen con agentes que por lo general atacan y comprometen al sistema inmunologico. Sin embargo, hasta la fecha, no se han desarrollado agentes similares. Por lo tanto, un objeto de la presente invencion es satisfacer esta necesidad no satisfecha.

Resumen de la Invencion

De acuerdo con la presente divulgacion, los Solicitantes han descubierto que las celulas extraembrionarias (celulas EE) que incluyen, pero no se limitan a celulas positivas para HLA-G extraembrionarias (celulas EHP) y de las celulas progenitoras multipotentes derivadas del amnios (celulas AMP), y/o lisados celulares y/o medios condicionados derivados de las mismas, solas o en combinacion entre si y/u otros agentes activos adecuados, son agentes utiles capaces de suprimir, prevenir, mejorar o tratar HVG, GVHd, asf como otros muchos agentes inmunologicos y/o enfermedades y trastornos inflamatorios. Las celulas de la presente divulgacion expresan HLA-G, no expresan antfgenos de Clase II de MHC, son negativas con respecto a la telomerasa, no forman teratomas, no son inmortales, segregan factores de modulacion celular y estan facilmente disponibles en grandes numeros.

Un objeto de la divulgacion es proporcionar metodos para modular las respuestas inflamatorias y/o inmunitarias mediante la administracion de celulas EHP, y en particular, celulas AMP. Tambien es un objeto de la presente invencion suprimir, tratar, prevenir y/o mejorar enfermedades y trastornos inflamatorios, inmunologicos y/o alergicos en un sujeto con necesidad de los mismos mediante la administracion de celulas AMP. Un objeto adicional de la invencion es proporcionar metodos para modular las respetas inflamatorias y/o inmunitarias y/o tratar, prevenir y/o mejorar enfermedades y trastornos inflamatorios, inmunitarios y/o alergicos en un sujeto con necesidad de los mismos mediante la administracion de medios condicionados derivados de celulas EHP, lisados celulares derivados de las mismas, o productos celulares derivados de las mismas, cada uno solo o en combinacion, incluyendo en combinacion entre si y/o otros agentes activos adecuados. Un objeto adicional de la invencion es proporcionar metodos para modular las respuestas inflamatorias y/o inmunitarias y/o tratar, prevenir y/o mejorar enfermedades y trastornos inflamatorios, inmunitarios, y/o alergicos en un sujeto con necesidad de los mismos mediante la

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administracion de medios condicionados derivados de celulas AMP, que en el presente documento se denominan solucion de citoquina derivada del amnios (ACCS), lisados celulares derivados de las mismas, o productos celulares derivados de las mismas, cada uno solo o en combinacion, incluyendo entre si y/o en combinacion con diversas matrices extracelulares y/o dispositivos y/u otros agentes activos adecuados.

La caracterizacion fenotfpica de celulas AMP revela que son candidatos ideales para terapia celular para enfermedades y trastornos mediados por el sistema inmunologico. Como se muestra en el ejemplo que sigue a continuacion, los datos in vitro muestran que las celulas AMP no son inmunogenicas y tienen propiedades inmunomoduladoras. Las celulas AMP regular de manera negativa las respuestas de los linfocitos T a diversos estfmulos, incluyendo las respuestas de mitogeno, alo-antfgeno (MLR), y respuestas de linfocitos T de memoria. Los mecanismos mediante los que las celulas AMP pueden facilitar un entorno inmunomodulador regulado de forma negativa pueden incluir varios aspectos. En primer lugar, las celulas AMP regulan de forma positiva la expresion de los ligandos de muerte celular programada, PD-L1 y PD-L2, cuando se exponen a citoquinas proinflamatorias tales como IFN-y. Estos ligandos se pueden unir a sus receptores (PD-1) en linfocitos T, dando como resultado la regulacion negativa de la activacion y la secrecion de citoquinas. Las celulas AMP tambien son positivas para la expresion del antfgeno Fas. Este antfgeno puede interactuar con ligando de Fas expresado en linfocitos T activados e iniciar la muerte celular de estos linfocitos T. Por ultimo, las celulas AMP tienen alta expresion de antfgeno de superficie HLA-G cuando se exponen a IFN-y y citoquinas proinflamatorias. De hecho, las celulas AMP regulan de forma positiva la expresion de HLA-G en su superficie durante el cultivo en un LMR. Se ha demostrado que HLA-G tiene funciones inmunomoduladoras sustanciales, incluyendo el deterioro de la proliferacion de linfocitos T aloespecfficos, la inhibicion de la actividad de los linfocitos NK, tolerancia de celulas dendrfticas e induccion de linfocitos T reguladores. Como se muestra en el ejemplo que sigue a continuacion, las celulas AMP no tienen efectos inmunomoduladores en los linfocitos T cuando se separan de estas celulas que responden a traves de membranas Transwell. Por lo tanto, los mecanismos de accion de las celulas AMP mas probablemente implican el contacto de celula a celula con celulas que median al sistema embriologico de respuesta. Estas caracterfsticas unicas de las celulas AMP las identifican como una terapia celular ideal para afecciones que implican mecanismos mediados por el sistema inmunologico.

En un primer aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende una poblacion de celulas progenitoras multipotentes derivadas del amnios no inmunogenicas (celulas AMP) que son celulas epiteliales que son positivas para la expresion de citoqueratinas y negativas para la expresion de CD34, en la que la poblacion de celulas AMP no inmunogenicas que son celulas epiteliales se prepara con el metodo de:

(a) disociar celulas AMP que son celulas epiteliales de una membrana amniotica de un amnios aislado de una placenta;

(b) recoger las celulas AMP disociadas que son celulas epiteliales; y

(c) cultivar las celulas AMP recogidas que son celulas epiteliales en medio de cultivo que no contiene materiales derivados de animal distintos de protefnas humanas;

en la que las celulas AMP no inmunogenicas son para su uso en la supresion, prevencion o mejora de una respuesta inmunitaria en un sujeto que se podrfa beneficiar de la misma; y en la que la respuesta inmunitaria:

(a) es una respuesta autoinmunitaria tal como diabetes de Tipo I, esclerosis multiple, lupus eritematoso sistemico, enfermedad de Grave, anemia hemolftica autoinmune, penfigoide ampolloso, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, penfigo o anemia perniciosa; o

(b) es una respuesta alogenica tal como enfermedad de injerto contra hospedador o enfermedad de hospedador contra injerto.

En un segundo aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende una poblacion de celulas AMP no inmunogenicas que son celulas epiteliales que son positivas para la expresion de citoqueratinas y negativas para la expresion de CD34, en la que la poblacion de celulas AMP no inmunogenicas que son celulas epiteliales se prepara con el metodo de:

(b) recoger las celulas AMP disociadas que son celulas epiteliales; y

(c) cultivar las celulas AMP recogidas que son celulas epiteliales en medio de cultivo que no contiene materiales derivados de animal distintos de protefnas humanas

para su uso en la supresion, prevencion o mejora de una respuesta inflamatoria en un sujeto que se podrfa

beneficiar de la misma; y

en la que la respuesta inflamatoria es:

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(a) una enfermedad inflamatoria del sistema tegumentario tal como psoriasis o dermatitis atopica;

(b) una enfermedad inflamatoria del intestino tal como colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn; o

(c) una enfermedad reumatica tal como osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, fibromialgia, esclerodermia, espondiloartropatfas, gota, artritis infecciosa, polimialgia reumatica, polimiositis, artritis psoriasica, bursitis, tendinitis, Sfndromes Periodicos Autoinflamatorios relacionados con CIASI (CAPS), enfermedad inflamatoria pelvica, cistitis intersticial, purpura de Henoh-Schonlein o sfndrome de Behcet.

En un tercer aspecto, la invencion proporciona una composicion para su uso de acuerdo con el primer o segundo aspectos, en la que el sujeto es un ser humano o un animal no humano.

En un cuarto aspecto, la invencion proporciona una composicion para su uso de acuerdo con el primer o segundo aspectos, en la que:

(a) la composicion que comprende la poblacion de celulas AMP no inmunogenicas que son celulas epiteliales, se administra por via topica, por via parenteral o por via enterica, o

(b) la composicion de una poblacion de celulas AMP no inmunogenicas que son celulas epiteliales que son positivas para la expresion de citoqueratinas y negativas para la expresion de CD34, se coadministra con uno o mas agentes activos.

En un quinto aspecto, la invencion proporciona una composicion para su uso de acuerdo con el cuarto aspecto, en la que el uno o mas agentes activos es corticosteroides, ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, metotrexato, azatiopina, mercatopurina, antibioticos citotoxicos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, interferon, opioides, protefnas de union al TNF, micofenolato, FTY720 u otros tipos de celulas.

En un sexto aspecto, la invencion proporciona una composicion para su uso de acuerdo con el quinto aspecto, en la que los anticuerpos monoclonales son anticuerpos anti-receptores de linfocitos T (CD23) o anti-receptores de IL2 (CD25).

En un septimo aspecto, la invencion proporciona una composicion para su uso de acuerdo con el primer o segundo

aspectos, en la que la poblacion de celulas AMP no inmunogenicas que son celulas epiteliales que son positivas

para la expresion de citoqueratinas y negativas para la expresion de CD34 es alogenica para el sujeto.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: Reaccion linfocitaria mixta (MLR). Celulas mononucleares de sangre periferica normales con respecto a celulas AMP con falta de coincidencia para HLA-DR (Clase II).

Figura 2: Respuesta de celulas mononucleares normales con respecto a mitogeno, MLR, y citomegalovirus (CMV) de antfgeno de recuerdo mas la adicion de celulas AMP con falta de coincidencia para HLA-DR (Clase II).

Figura 3: Efectos de celulas AMP diluidas en serie en MLR Alo-Antfgeno.

Figura 4: Efectos de celulas AMP diluidas en serie en respuesta de memoria a citomegalovirus (CMV).

Definiciones

Como se define en el presente documento "aislado" se refiere a un material retirado de su entorno original y por lo tanto se ve alterado por "la mano del hombre" a partir de su estado natural.

Como se usa en el presente documento, la expresion "marcador proteico" se refiere a cualquier molecula de protefna caracterfstica de la membrana plasmatica de una celula o, en algunos casos, de un tipo celular especffico.

Como se usa en el presente documento, "enriquecido" se refiere concentrado de forma selectiva o para aumentar la cantidad del uno o mas materiales por eliminacion de los materiales no deseados o seleccion y separacion de materiales deseados de una mezcla (es decir, separar celulas con marcadores celulares especfficos a partir de una poblacion de celulas heterogeneas en la que no todas las celulas en la poblacion expresan el marcador).

Como se usa en el presente documento, la expresion "purificado sustancialmente" se refiere a una poblacion de celulas sustancialmente homogeneas para un marcador o combinacion de marcadores en particular. Por sustancialmente homogeneo se hace referencia a homogeneo en al menos un 90 %, y preferentemente un 95 % para un marcador o combinacion de marcadores en particular.

El termino "placenta" como se usa en el presente documento se refiere a placenta tanto pretermino como termino.

Como se usa en el presente documento, la expresion "celulas totipotentes" tendra significado que sigue a continuacion. En mamfferos, las celulas totipotentes tienen el potencial de convertirse en cualquier tipo de celula en

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el cuerpo adulto; cualquier tipo(s) de celula de las membranas extraembrionarias (por ejemplo, placenta). Las celulas totipotentes son el huevo fertilizado y aproximadamente las 4 primeras celulas producidas por su escision.

Como se usa en el presente documento, la expresion "celulas madre pluripotentes" tendra significado que sigue a continuacion. Las celulas madre pluripotentes son celulas madre verdaderas con el potencial de hacer cualquier celula diferenciada en el cuerpo, pero no pueden contribuir a preparar los componentes de las membranas extraembrionarias que se obtienen a partir del trofoblasto. El amnios se desarrolla a partir del epiblasto, no del trofoblasto. Hasta la fecha se han confirmado tres tipos de celulas madre pluripotentes: Celulas Madre Embrionarias (ES) (tambien pueden ser totipotentes en primates), Celulas Germinales Embrionarias (EG), y Celulas de Carcinoma Embrionarias (EC). Estas celulas EC se pueden aislar a partir de teratocarcinomas, un tumor que ocasionalmente se produce en la gonada de un feto. A diferencia de las otras dos, normalmente son aneuploides.

Como se usa en el presente documento, la expresion "celulas madre multipotentes" son celulas madre verdaderas pero solamente se pueden diferenciar en un numero de tipos limitado. Por ejemplo, la medula osea contiene celulas madre multipotentes que dan lugar a todas las celulas de la sangre pero pueden no ser capaces de diferenciarse en otros tipos de celulas.

Como se usa en el presente documento, la expresion "tejido extraembrionario" se refiere a tejido localizado fuera del cuerpo embrionario que esta implicado con la proteccion, nutricion, retirada de residuos, del embrion, etc. el tejido extraembrionario se descarta en el momento del nacimiento. El tejido extraembrionario incluye, pero no se limita al amnios, corion (trofoblasto y mesodermo extraembrionario incluyendo cordon umbilical y vasos), saco vitelino, alantoides y lfquido amniotico (incluyendo todos los componentes contenidos en el mismo). El tejido extraembrionario y las derivadas del mismo tienen el mismo genotipo que el embrion en desarrollo.

Como se usa en el presente documento, la expresion "celulas extraembrionarias" o "celulas EE" se refiere a una poblacion de celulas derivadas del tejido extraembrionario.

Como se usa en el presente documento, la expresion "celulas EHP" se refiere a una poblacion de celulas derivadas del tejido extraembrionario que tienen las caracterfsticas de ser positivas para HLA-G despues de su aislamiento, son negativas para la Clase II de MHC, no expresan las moleculas coestimulatorias CD80 y CD86 y no son las MAPC como se describe en la Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos N.° 20060263337.

Como se usa en el presente documento, la expresion "celula progenitora multipotente derivada del amnios" o "celula AMP" se refiere a una poblacion de celulas epiteliales que se obtienen a partir del amnios. Ademas de las caracterfsticas que se han descrito anteriormente para las celulas EHP, las celulas AMP crecen sin capas alimentadoras, no expresan la protefna telomerasa y no son tumorigenicas. Las celulas AMP no expresan la protefna CD34 marcadora de celulas madre hematopoyeticas. La ausencia de celulas positivas para CD34 en esta poblacion indica que los aislados no estan contaminados con celulas madre hematopoyeticas tales como sangre del cordon umbilical o fibroblastos embrionarios. Practicamente un 100 % de las celulas reaccionan con anticuerpos a citoqueratinas de bajo peso molecular, lo que confirma su naturaleza epitelial. Las celulas AMP recien aisladas no accionaran con anticuerpos para los marcadores de celulas madre/progenitoras, c-kit y Thy-1. En la tecnica se conocen varios procedimientos usados para obtener celulas de placenta a termino completo o pretermino (veanse, por ejemplo, documento US 2004/0110287; Anker et al., 2005, Stem Cells 22: 1338-1345; Ramkumar et al., 1995, Am. J. Ob. Gyn. 172:493-500). Sin embargo, los metodos usados en el presente documento proporcionan composiciones y poblaciones de celulas mejoradas. Las celulas AMP se han descrito anteriormente como "celulas derivadas del amnios" (veanse las Solicitudes Provisionales de Estados Unidos N.° 60/666.949, 60/699.257, 60/742.067, Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 60/813.759, Solicitud de Estados Unidos N.° 11/333.849, Solicitud de Estados Unidos N.° 11/392.892, y documento PCTUS06/011392).

La expresion "composicion de celulas extraembrionarias" como se usa en el presente documento incluye las celulas y composiciones que se describen en la presente solicitud y en los documentos US2003/0235563, US2004/0161419, US2005/0124003, Solicitudes Provisionales de Estados Unidos N.°s 60/666.949, 60/699.257, 60/742.067, 60/813.759, Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 11/333.849, Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 11/392.892, documento PCTUS06/011392, documento US2006/0078993, documento PCT/US00/40052, Patente de Estados Unidos N.° 7.045.148, documento US2004/0048372, y documento US2003/0032179.

Con el termino "sin animal", cuando se hace referencia a composiciones, condiciones de crecimiento, medios de cultivo, etc., descritos en el presente documento, se hace referencia a materiales no derivados de animales, tales como suero derivado de animal, distinto de materiales humanos, tales como protefnas humanas nativas o producidas de forma recombinante, se usan en la preparacion, crecimiento, cultivo, expansion o formulacion de la composicion o proceso.

Con el termino "expandida", por referencia a composiciones de celulas EHP, se hace referencia a que la poblacion de celulas EHP constituye una concentracion de celulas significativamente mas elevada que la que se obtiene usando los metodos anteriores. Por ejemplo, el nivel de celulas por gramo de tejido amniotico en composiciones expandidos de celulas AMP es al menos 50 y hasta 150 veces mas elevado que el numero de celulas en el cultivo

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primario despues de 5 pasajes, en comparacion con un aumento de aproximadamente 20 veces en las celulas de este tipo usando los metodos anteriores. En otro ejemplo, el nivel de celulas por gramo de tejido amniotico en composiciones expandidas de celulas AMP es al menos 30 y hasta 100 veces mas elevado que el numero de celulas en el cultivo primario despues de 3 pasajes. Por consiguiente, una poblacion "expandida" tiene una mejora de al menos 2 veces, y hasta 10 veces, en numeros de celulas por gramo de tejido amniotico con respecto a los metodos anteriores. El termino "expandido" pretende cubrir solamente las situaciones en las que una persona ha intervenido para elevar el numero de las celulas EHP. Como se usa en el presente documento, "pasaje" o "paso" se refiere a subcultivo de celulas. Por ejemplo, las celulas aisladas a partir del amnios se denominan celulas primarias. Las celulas de este tipo se expanden en cultivo al ser cultivadas en el medio de crecimiento que se describe en el presente documento. Cuando las celulas primarias de este tipo se subcultivan, cada ronda de subcultivo se denomina pasaje. Como se usa en el presente documento, "cultivo primario" se refiere a la poblacion de celulas EHP recien aisladas.

Como se usa en el presente documento, "medio condicionado" es un medio en el que una celula especffica o poblacion de celulas se ha cultivado y a continuacion se han retirado. Cuando las celulas se cultivan en un medio, estas pueden secretar factores celulares que pueden proporcionar soporte o influir en el comportamiento de otras celulas. Los factores de este tipo incluyen, pero no se limitan a hormonas, citoquinas, matriz extracelular (ECM), protefnas, vesfculas, anticuerpos, quimioquinas, receptores, inhibidores y granulos. El medio que contiene los factores celulares es el medio condicionado. Los ejemplos de metodos de preparacion de medios condicionados se describen en la Patente de Estados Unidos N.° 6.372.494. Como se usa en el presente documento, el medio condicionado tambien se refiere a componentes, tales como protefnas, que se recuperan y/o se purifican a partir del medio condicionado o de celulas EHP incluyendo celulas AMP.

Como se usa en el presente documento, la expresion "solucion de citoquina celular derivada del amnios" o "ACCS" se refiere a medio condicionado que ha sido derivado de celulas AMP o celulas AMP expandidas. La ACCS se ha denominado anteriormente como "suspension de citoquina celular derivada del amnios".

Como se usa en el presente documento, "actividad especffica" se refiere a la actividad especffica de las celulas EHP, incluyendo celulas AMP, y se determina mediante el calculo de una dosificacion de inhibicion de un 50 % (DI 50). Por ejemplo, usando un MLR de antfgeno alogenico convencional, el 100 % de la respuesta se calcula mediante la determinacion de la respuesta que responde a PBMC con respecto al estimulador con falta de coincidencia sin adicion de celulas AMP. A continuacion, las celulas AMP se valoran en la MLR a diluciones en serie de 1:2. El numero de celulas AMP requeridas para la mitad de la respuesta de un 100 % se informa como la DI50.

El termino "lisado", como se usa en el presente documento, se refiere a la composicion obtenida cuando las celulas, por ejemplo, celulas EHP, se lisan y opcionalmente los desechos celulares (por ejemplo, membranas celulares) se retiran. Esto se puede conseguir por medios mecanicos, mediante congelacion y descongelacion, mediante el uso de detergentes, tales como EDTA, o mediante digestion enzimatica usando, por ejemplo, hialuronidasa, dispasa, proteasas y nucleasas.

Como se usa en el presente documento, el termino "sustrato" se refiere a un revestimiento definido sobre una superficie al que las celulas se unen, crecen y/o migran. Como se usa en el presente documento, el termino "matriz" se refiere una sustancia en la que las celulas crecen o sobre la que se pueden definir o no en sus componentes. La matriz incluye sustancias tanto biologicas como no biologicas. Como se usa en el presente documento, el termino "armazon" se refiere a una estructura tridimensional (sustrato y/o matriz) en la que las celulas crecen en o sobre la misma. Puede estar formada por componentes biologicos, componentes sinteticos o una combinacion de ambos. Ademas, puede estar construida de forma natural por celulas o construida de forma artificial. Ademas, el armazon puede contener componentes con actividad biologica en condiciones apropiadas.

La expresion "producto celular" o "productos celulares", como se usa en el presente documento se refiere a todas y cada una de las sustancias preparadas y secreta por una celula, que incluyen, pero no se limitan a, factores proteicos (es decir, factores de crecimiento, factores de diferenciacion, factores de injerto, citoquinas, morfogenos, proteasas (es decir, para estimular la deslaminacion celular endogena, inhibidores de proteasa), componentes de la matriz extracelular (es decir, fibronectina, etc.).

El termino "trasplante" se refiere a la administracion de una composicion ya sea en una forma indiferenciada, parcialmente diferenciada, o totalmente diferenciada en un ser humano u otro animal.

Como se usa en el presente documento, los terminos "un" o "uno" se refieren a uno o mas; al menos uno.

Como se usa en el presente documento, el termino "auxiliar" se refiere a conjuntamente, junto con, ademas de, en conjunto con, y similares.

Como se usa en el presente documento, el termino "coadministrar" puede incluir la administracion simultanea o secuencial de dos o mas agentes. Como se usa en el presente documento, el termino "singeneico" se refiere a miembros geneticamente identicos de la misma especie.

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Como se usa en el presente documento, el termino "alogenico" se refiere a variacion en alelos entre miembros de la misma especie.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "farmacos inmunosupresores" o "inmunosupresores" son farmacos que se usan en terapia inmunosupresora para inhibir o prevenir la actividad del sistema inmunologico.

Como se usa en el presente documento, el termino "GVHD" se refiere a una enfermedad de injerto contra hospedador, que se refiere a los procesos que se producen principalmente en un hospedador inmunocomprometido cuando es reconocido como no propio por las celulas inmunocompetentes de un injerto.

Como se usa en el presente documento, el termino "HVG" se refiere a una respuesta de hospedador contra injerto, que se refiere a los procesos que se producen cuando un hospedador rechaza un injerto. Por lo general, HVG se activa cuando un injerto es reconocido como extrano (no propio) por las celulas inmunocompetentes del hospedador.

Como se usa en el presente documento, los terminos "inflamacion" o "respuesta inflamatoria" se refieren a la reaccion que se produce en las celulas afectadas y tejidos adyacentes como respuesta a una lesion o estimulacion anomala causada por una sustancia ffsica, qufmica o biologica.

Como se usa en el presente documento, la expresion "respuesta inmunitaria" se refiere a las celulas, tejidos y factores protefnicos (es decir, citoquinas) implicados en el reconocimiento y ataque de sustancias extranas dentro del cuerpo de un animal.

Como se usa en el presente documento, la expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a que los componentes, ademas del agente terapeutico, que comprenden la formulacion, son adecuados para su administracion al paciente que se esta tratando de acuerdo con la presente invencion.

Las expresiones "administracion parenteral" y "administrado por via parenteral" estan reconocidas en la tecnica y se refieren a modos de administracion distintos de la administracion enterica y topica, normalmente mediante inyeccion, e incluyen, pero no se limitan a, inyeccion e infusion intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, e intraesternal.

Como se usa en el presente documento "sujeto" puede hacer referencia a cualquiera de un ser humano o animal no humano.

Como se usa en el presente documento, el termino "tejido" se refiere a una agregacion de celulas especializadas de forma similar unidas en el rendimiento de una funcion en particular.

Como se usa en el presente documento, la expresion "protefna terapeutica" incluye una amplia gama de protefnas biologicamente activas que incluyen, pero no se limitan a, factores de crecimiento, enzimas, hormonas, citoquinas, inhibidores de citoquinas, factores de coagulacion sangufnea, crecimiento de peptidos y factores de diferenciacion.

"Tratamiento", "tratar" o "que trata", tal como se usan en el presente documento cubren cualquier tratamiento de una enfermedad o afeccion de un mamffero, en particular un ser humano, e incluyen: (a) evitar que se produzca la enfermedad o afeccion en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o afeccion pero que todavfa no se ha sido diagnosticado como si lo tuviera; (b) inhibir la enfermedad o afeccion, es decir, detener su desarrollo; (c) aliviar y/o mejorar la enfermedad o afeccion, es decir, causar la regresion de la enfermedad o afeccion; o (d) curar la enfermedad o afeccion, es decir, detener su desarrollo o progresion. Los sujetos tratados con los metodos de la invencion incluyen sujetos que padecen de la afeccion o enfermedad indeseable, asf como sujetos en riesgo de desarrollo de la afeccion o enfermedad.

Descripcion detallada

De acuerdo con la presente divulgacion, se pueden usar tecnicas convencionales de biologfa molecular, microbiologfa, y de ADN recombinante dentro de la experiencia en la tecnica. Las tecnicas de este tipo se explican completamente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual".

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la decima de la unidad del lfmite inferior, a menos que el contexto no indique claramente de otro modo, entre el lfmite superior e inferior de este intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado esta incluido dentro de la divulgacion. Los lfmites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos pueden estar incluidos de forma independiente en los intervalos mas pequenos que tambien estan incluidos dentro de la divulgacion, sujeto a cualquier excluido de forma especffica en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos de los lfmites, los intervalos que incluyen cualquiera de ambos de esos lfmites incluidos tambien estan incluidos en la divulgacion.

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A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que normalmente entiende alguien con una experiencia habitual en la materia a la que pertenece la presente invencion. Aunque cualquier metodo o material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento tambien se puede usar en la practica o ensayo de la presente invencion, los metodos y materiales precedentes se describen a continuacion.

Se debe indicar que, como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.

Aplicaciones Terapeuticas

Se ha encontrado que cantidades relativamente pequenas de celulas EHP pueden suprimir las respuestas inflamatorias e inmunitarias. Por consiguiente, se desvelan composiciones y metodos para tratar, mejorar, y/o prevenir o eliminar, respuestas adversas inmunitarias, tales como las que se producen en terapias de trasplante. La baja inmunogenicidad de las celulas EHP alogenicas, su capacidad para suprimir las respuestas inflamatorias e inmunitarias adversas y su alta actividad especffica (como se define en las definiciones y en cualquier parte en el presente documento) las hace particularmente valiosas para terapias adicionales en el tratamiento de tales enfermedades. Las celulas EHP tambien son utiles como terapias inmunosupresoras adicionales para el tratamiento de respuestas inmunitarias adversas que se producen en terapia de trasplante (es decir, HVG y GVHD). Otros trastornos y enfermedades inmunitarios se discuten con mas detalle en cualquier parte en el presente documento. Ademas, las celulas EHP pueden ser utiles en terapia inmunosupresora adicional en el tratamiento de ciertas enfermedades inflamatorias. Dichas enfermedades se discuten con mayor detalle a continuacion y en otras partes de la memoria descriptiva. Se deberfa observar que las enfermedades y afecciones que se discuten a continuacion pretenden ser ejemplos de enfermedades y afecciones adecuadas que se pueden tratar con los metodos de la divulgacion. Los expertos en la materia reconoceran que el tratamiento de otras muchas enfermedades y afecciones relacionadas tambien se contemplan mediante los metodos de la divulgacion.

Usando los metodos que se describen en el presente documento para el aislamiento, caracterizacion y expansion de celulas EHP, junto con la divulgacion de las propiedades inmunosupresoras de celulas EHP, las celulas EHP se pueden usar para prevenir, suprimir, o disminuir trastornos, disfunciones, enfermedades inmunitarios, que incluyen, por ejemplo, reacciones inmunitarias adversas, tales como las que resultan de otras terapias, incluyendo aquellas que complican las terapias de trasplante, tales como HVG y GVHD. Tales trastornos, disfunciones, enfermedades tambien incluyen trastornos inmunitarios congenitos y enfermedades autoinmunes, entre otros. Las celulas EHP son utiles tanto como agentes terapeuticos primarios como adicionales. Las celulas EHP se pueden usar de forma terapeutica solas o junto con otros agentes; se pueden administrar antes, durante, y/o despues de tales agentes; se pueden usar solas o con otros agentes; se pueden administrar antes, durante, y/o despues de un trasplante. Si se administran durante el transplante, las celulas EHP se pueden administrar junto con el material del trasplante o por separado. Si se administran por separado, las celulas EHP se pueden administrar de manera secuencial o simultanea con el trasplante. Ademas, las celulas EHP se pueden administrar antes del transplante y/o despues del trasplante. Otros agentes que se pueden usar en conjunto con las celulas EHP, en terapias de trasplante en particular, incluyen agentes inmunomoduladores. En el presente documento se describe una diversidad de agentes de este tipo. En elementos de la divulgacion, los agentes inmunomoduladores son agentes inmunosupresores, tales como los que se describen en cualquier parte en el presente documento.

En elementos de la divulgacion, las celulas EHP se administran mediante inyeccion, tal como mediante inyeccion intravenosa; se encapsulan para su administracion; se administran in situ (es decir, trasplante de organos solidos y reparacion de organos). Estas y otras formas de administracion se discuten con detalle en cualquier parte en el presente documento. En algunas divulgaciones, las celulas EHP se administran en dosis medidas mediante la proporcion de celulas EHP (celulas) con respecto a masa corporal (peso). Como alternativa, se pueden administrar en dosis de un numero fijo de celulas. La dosificacion, vfas de administracion, formulaciones y similares se discuten con mayor detalle en cualquier parte en el presente documento.

Debido a sus nuevas propiedades inmunomoduladoras, las celulas EHP, incluyendo celulas AMP, medios condicionados derivados de las mismas, lisados celulares derivados de las mismas, o productos celulares derivados de las mismas, cada uno solo o en combinacion, o en combinacion con otros agentes activos, son particularmente utiles en la prevencion y/o la mejora de la respuesta inflamatoria y/o respuestas inmunitarias y/o reacciones alergicas. Las respuestas inflamatorias se caracterizan por la dilatacion de los vasos sangufneos en la zona afectada, lo que da como resultado un aumento del flujo sangufneo a la zona. Si se produce en la superficie, hace que la piel se vea roja y se sienta caliente. Los capilares en la zona se vuelven mas permeables permitiendo que el fluido se filtre en el tejido circundante dando como resultado un hinchamiento edematoso alrededor del sitio infectado. La hinchazon y los efectos de algunos de los productos qufmicos liberados dan como resultado dolor. Por lo tanto, las caracterfsticas clfnicas de la respuesta inflamatoria se conocen como enrojecimiento, calor, edema y dolor. La respuesta inflamatoria se produce como resultado de mensajes qufmicos producidos por "mediadores". Existen dos clases principales de mediadores: 1) mediadores derivados de celulas que son producidos por leucocitos y 2) mediadores derivados de plasma que se encuentran en el plasma sangufneo. Los mediadores derivados de celulas incluyen derivados del acido araquidonico (es decir, prostaglandinas y leucotrinas), citoquinas,

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linfoquinas y monoquinas, interleuquina, factor activador de plaquetas (PAF), histamina y bradiquinina. Los mediadores derivados de plasma incluyen complemento e interferones. Las respuestas inflamatorias pueden ser de naturaleza genetica (es decir CAPS, vfas y a continuacion para mas detalles). Se pueden inducir de forma ambiental o se pueden inducir de forma vfrica. Los ejemplos no limitantes de enfermedades que tienen respuestas inflamatorias que son adecuadas para el tratamiento con celulas EHP, incluyendo celulas AMP, medios condicionados derivados de las mismas, lisados celulares derivados de las mismas, o productos celulares derivados de las mismas, cada uno solo o en combinacion, incluyendo en combinacion con otros agentes activos, incluyen los siguientes:

Enfermedades Inflamatorias del Sistema Tegumentario que incluyen psoriasis y eccema (es decir, dermatitis atopica). La psoriasis es una enfermedad inflamatoria de la piel. Hay cinco tipos, cada uno con signos y sfntomas unicos. Entre un 10 % y un 30 % de las personas que desarrollan psoriasis presentan una forma relacionada de artritis denominada "artritis psoriasica", que produce inflamacion en las articulaciones. La psoriasis en placas es el tipo de psoriasis mas comun. Aproximadamente un 80 % de las personas que desarrollan psoriasis tienen psoriasis en placas, que aparece como parches de piel elevada y rojiza cubiertos de escamas de color blanco plateado. Estos parches, o placas, se forman frecuentemente en los codos, rodillas, espalda baja y cuero cabelludo. Sin embargo, se pueden producir en cualquier parte del cuerpo. Los otros tipos son psoriasis en gotas (pequenas manchas rojas en la piel), psoriasis pustular (pustulas de color blanco rodeadas de piel de color rojo), psoriasis inversa (se forman lesiones lisas y rojas formadas en pliegues cutaneos) y psoriasis eritrodermica (enrojecimiento generalizado, picor intenso y dolor). Independientemente del tipo, la psoriasis suele causar molestias. La piel a menudo pica, y puede romperse y sangrar. En casos severos, la picazon y la incomodidad pueden mantener a una persona despierta por la noche, y el dolor puede dificultar las tareas cotidianas. La psoriasis es una afeccion cronica, lo que significa para toda la vida, porque en la actualidad no hay cura. Las personas suelen experimentar a menudo brotes y remisiones a lo largo de su vida. El control de los signos y sfntomas por lo general requiere terapia de por vida. Eccema es un termino general que incluye diversas afecciones de piel inflamada. Una de las formas mas comunes de eccema es la dermatitis atopica. Aproximadamente un 10-20 % de la poblacion mundial se ve afectada por esta erupcion cronica, recidivante y que produce mucho pico en algun momento de la infancia. Afortunadamente, muchos ninos con eccema encuentran que la enfermedad se espacia y con frecuencia desaparece. En general, la dermatitis atopica ira y vendra, a menudo basandose en factores externos. Aunque su causa es desconocida, parece que la afeccion es una respuesta anomala del sistema inmunologico del cuerpo. En las personas con eccema, la respuesta inflamatoria a las sustancias irritantes sobreactua, causando picazon y rascado. El eccema no es contagioso y, al igual que muchas enfermedades, en la actualidad no se puede curar. Sin embargo, para la mayorfa de los pacientes la afeccion se puede controlar bien con tratamiento y evitando los desencadenantes.

Las Enfermedades Intestinales Inflamatorias (IBD) son enfermedades inflamatorias cronicas del tracto GI de etiologfa desconocida, e incluyen colitis ulcerosa (UC) y enfermedad de Crohn (CD), que tambien se conoce como enteritis regional, ileitis terminal o ileocolitis granulomatosa. La colitis ulcerosa es una enfermedad inflamatoria del intestino grueso, tambien llamado colon. En la colitis ulcerosa, el revestimiento interior (mucosa) del intestino se inflama y desarrolla ulceras (una ulcera es una llaga, lo que significa que es una herida abierta y dolorosa). La colitis ulcerosa a menudo es la mas grave en la zona rectal, lo que puede causar diarrea frecuente. A menudo aparecen moco y sangre en las heces si el revestimiento del colon se ha danado. La enfermedad de Crohn se diferencia de la colitis ulcerosa en las zonas del intestino que implica - mas comunmente afecta a la ultima parte del intestino delgado denominado el fleon terminal y partes del intestino grueso. Sin embargo, no se limita a estas zonas y puede atacar a cualquier parte del tracto digestivo. La enfermedad de Crohn causa inflamacion que se extiende mucho mas profundo en las capas de la pared intestinal que la colitis ulcerosa. En general, la enfermedad de Crohn tiende a afectar a toda la pared intestinal, mientras que la colitis ulcerosa solo afecta al revestimiento del intestino.

Las Enfermedades Reumaticas abarcan muchas enfermedades incluyendo:

Osteoartritis - Este es el tipo mas comun de artritis, que afecta a como una estimacion a 21 millones de adultos en Estados Unidos. La osteoartritis afecta principalmente al cartflago, que es el tejido que amortigua los extremos de los huesos dentro de la articulacion. En la osteoartritis, el cartflago comienza a desgastarse y se puede desgarrar por completo. La osteoartritis puede causar dolor y rigidez en las articulaciones. Mas frecuentemente, la discapacidad aparece cuando la enfermedad afecta a la columna vertebral y a las articulaciones portadoras de peso (las rodillas y caderas).

Artritis reumatoide - Esta enfermedad inflamatoria de la sinovia, o revestimiento de la articulacion, da como resultado dolor, rigidez, hinchazon, dano articular y perdida de la funcion de las articulaciones. La inflamacion afecta con mayor frecuencia a las articulaciones de las manos y los pies y tiende a ser simetrica (produciendose igualmente en ambos lados del cuerpo). Esta simetrfa ayuda a distinguir la artritis reumatoide de otras formas de la enfermedad. Aproximadamente un 1 por ciento de la poblacion de Estados Unidos (aproximadamente 2,1 millones de personas) tiene artritis reumatoide.

Artritis reumatoide juvenil - Esta es la forma mas comun de artritis en la infancia, causando dolor, rigidez, hinchazon y perdida de funcion de las articulaciones. La artritis puede estar asociada con erupciones cutaneas o fiebres, y puede afectar a varias partes del cuerpo.

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Fibromialgia - La fibromialgia es un trastorno cronico que causa dolor a traves de los tejidos que sostienen y mueven los huesos y las articulaciones. Dolor, rigidez y puntos sensibles localizados aparecen en los musculos y tendones, en particular los del cuello, columna vertebral, hombros y caderas. Los pacientes tambien pueden experimentar fatiga y trastornos del sueno.

Esclerodermia - Tambien conocida como esclerosis sistemica, esclerodermia significa literalmente "piel dura". La enfermedad afecta a la piel, vasos sangufneos y articulaciones. Tambien puede afectar a organos internos, tales como pulmones y rinones. En la esclerodermia, hay una produccion anomala y excesiva de colageno (una protefna similar a la fibra) en la piel u organos internos.

Espondiloartropatfas - Este grupo de enfermedades reumaticas afecta principalmente a la columna vertebral. Una forma comun -- espondilitis anquilosante - no solo afecta a la columna vertebral, sino que tambien puede afectar las caderas, hombros y rodillas a medida que los tendones y los ligamentos alrededor de los huesos y las articulaciones se inflaman, dando como resultado dolor y rigidez. La espondilitis anquilosante tiende a afectar a las personas en la adolescencia tardfa o en la epoca adulta temprana. La artritis reactiva, en ocasiones denominada sfndrome de Reiter, es otra espondiloartropatfa. Se desarrolla despues de una infeccion que involucra al tracto urinario inferior, intestino, u otro organo y se asocia comunmente a problemas oculares, erupciones cutaneas y llagas en la boca.

Gota - Este tipo de artritis aparece debido a depositos de cristales de acido urico en forma de aguja en las articulaciones. Los cristales causan inflamacion, hinchazon y dolor en la articulacion afectada, que es a menudo el dedo gordo del pie.

Artritis infecciosa - Este es un termino general usado para describir formas de artritis que son causadas por agentes infecciosos, tales como bacterias o virus. La artritis por parvovirus y la artritis gonococica son ejemplos de artritis infecciosa. Los sfntomas de la artritis tambien se pueden producir en la enfermedad de Lyme, que esta causada por una infeccion bacteriana despues de la picadura de ciertas garrapatas. En aquellos casos de artritis causada por bacterias, el diagnostico temprano y el tratamiento con antibioticos son fundamentales para deshacerse de la infeccion y minimizar el dano a las articulaciones.

Polimialgia reumatica - Dado que esta enfermedad involucra a tendones, musculos, ligamentos y tejidos alrededor de la articulacion, los sfntomas suelen incluir dolor, malestar y rigidez matutina en los hombros, caderas, cuello y espalda baja. A veces es el primer signo de arteritis de celulas gigantes, una enfermedad de las arterias caracterizada por inflamacion, debilidad, perdida de peso y fiebre.

Polimiositis - Se trata de una enfermedad reumatica que causa inflamacion y debilidad en los musculos. La enfermedad puede afectar a todo el cuerpo y causar discapacidad.

Artritis psoriasica - Esta forma de artritis se produce en algunos pacientes con psoriasis, un trastorno cutaneo con formacion de escamas. La artritis psoriasica a menudo afecta a las articulaciones en los extremos de los dedos de las manos y los pies y va acompanado por cambios en las unas de las manos y las unas de los pies. El dolor de espalda puede aparecer si la espina dorsal esta implicada.

Bursitis - Esta afeccion consiste en la inflamacion de las bolsas sinoviales, pequenos sacos llenos de lfquido que ayudan a reducir la friccion entre los huesos y otras estructuras moviles en las articulaciones. La inflamacion puede resultar de la artritis en la articulacion o lesion o infeccion de las bolsas sinoviales. La bursitis produce dolor y sensibilidad y puede limitar el movimiento de las articulaciones cercanas.

Tendinitis (Tendonitis) - Esta afeccion se refiere a una inflamacion de los tendones (cuerdas duras de tejido que conectan el musculo al hueso) causada por el uso excesivo, lesion, o una afeccion reumatica. La tendinitis produce dolor y sensibilidad y puede limitar el movimiento de las articulaciones cercanas.

Enfermedad inflamatoria pelvica (PID) - Es un termino general que se refiere a una infeccion e inflamacion del tracto genital superior en mujeres. Puede afectar al utero (matriz), trompas de Falopio (tubos que llevan los ovulos desde los ovarios hasta el utero), ovarios y otros organos relacionados con la reproduccion. La cicatrizacion que aparece en estos organos puede conducir a infertilidad, embarazo tubarico (ectopico), dolor pelvico cronico, abscesos (ulceras que contienen pus) y otros problemas graves. La PID es la causa prevenible mas comun de infertilidad en Estados Unidos.

Sfndromes Periodicos Autoinflamatorios relacionados con CIAS1 (CAPS) - es un espectro de afecciones inflamatorias hereditarias raras, que incluyen Sfndrome Autoinflamatorio Familiar Frio (FCAS), Sfndrome de Muckle- Wells (MWS) y Enfermedad Inflamatoria Multisistemica de Aparicion Neonatal (NOMID). Estos sfndromes se caracterizan por una inflamacion sistemica espontanea y se denominan trastornos autoinflamatorios. Una nueva caracterfstica de estas afecciones (en particular FCAS y MWS) es que la exposicion a grados leves de temperatura frfa puede provocar un episodio inflamatorio importante que se produce en horas. Los CAPS estan causados por una serie de mutaciones en el gen CIAS1 (tambien conocido como NALP3).

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Las enfermedades inflamatorias diversas incluyen cistitis intersticial, purpura de Henoh-Schonlein, y sfndrome de Behcet.

Los ejemplos no limitantes de enfermedades que tienen respuestas inmunitarias que son adecuadas para tratamiento con celulas EHP, incluyendo celulas AMP, medios condicionados derivados de las mismas, lisados celulares derivados de las mismas, o productos celulares derivados de las mismas, cada uno solo o en combinacion, incluyendo junto con otros agentes activos, incluyen:

GVHD se refiere a enfermedad de injerto contra hospedador, lo que hace referencia a los procesos que se producen principalmente en un hospedador inmunocomprometido cuando se reconoce como no propio por celulas inmunocompetentes de un injerto.

HVG se refiere a una respuesta de hospedador contra injerto, lo que hace referencia a la los procesos que se producen cuando un hospedador rechaza un injerto. Por lo general, HVG se activa cuando un injerto es reconocido como extrano (no propio) por celulas inmunocompetentes del hospedador.

La Diabetes Juvenil (Tipo I) se produce cuando el cuerpo forma anticuerpos que atacan a las celulas beta en los islotes de Langerhans en el pancreas. Dado que las celulas beta son responsables de la produccion de insulina, los diabeticos de Tipo I se deben inyectar insulina ellos mismos durante toda su vida.

El lupus sistemico eritematoso (tambien conocido como lupus o SLE) es una enfermedad autoinmune en la que el sistema inmunologico dana las propias celulas y tejidos sanos del cuerpo. Esto puede dar como resultado inflamacion y dano a las articulaciones, piel, rinones, corazon, pulmones, vasos sangufneos y cerebro.

La enfermedad de Grave esta causada por una respuesta anomala del sistema inmunologico que ataca a la glandula tiroides y causa demasiada produccion de hormonas tiroideas. Los factores de riesgo son ser una mujer de mas de 20 anos de edad, aunque el trastorno se puede producir a cualquier edad y tambien puede afectar a los hombres.

Los trastornos inmunitarios diversos incluyen anemia hemolftica autoinmune, penfigoide ampolloso, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, penfigo, y anemia perniciosa.

Las reacciones alergicas son sensibilidades a una sustancia especffica, denominada alergeno, que se pone en contacto a traves de la piel, se inhala en los pulmones, se traga o se inyecta. Las reacciones alergicas varfan. Pueden ser leves o graves. Se pueden limitar a una pequena zona del cuerpo o pueden afectar a todo el cuerpo. La mayorfa se producen en segundos o minutos despues de la exposicion al alergeno, pero algunas se pueden producir despues de varias horas, en particular si el alergeno produce una reaccion despues de su digestion parcial. En casos muy raros, las reacciones se desarrollan despues de 24 horas. La anafilaxis es una reaccion alergica repentina y severa que se produce a los minutos de la exposicion. Para esta afeccion se necesita atencion medica inmediata. Puede empeorar mucho, muy rapido y conducir a la muerte en 15 minutos si no se recibe el tratamiento.

Enfoques generales para trasplante/terapias basadas en celulas

Un experto en la materia reconocera que la expresion de HLA-G por celulas es importante en la capacidad de una celula para evadir la inmunovigilancia. Por lo tanto, cualquier celula que exprese HLA-G es potencialmente util en la practica de los metodos de la invencion. Por lo tanto, ademas de las celulas EHP y las celulas AMP, se incluyen celulas tales como ciertas celulas tumorales (vease, por ejemplo, Tripathi, P. y Agrawal, S., Cancer Invest 2006, 24 (2):178-186; Blaschitz, A., et al., Human Immunology 2000, 6l: 1074-1085), ciertas celulas en el timo (vease, por ejemplo, Mallet, V., et al., Int Immunol 1999, 11: 889-898; Mallet, V., et al., Reprod Immunol 1999, 43 (2): 225-234) y celulas positivas para HLA-G derivadas de placenta no progenitora (Blaschitz, A., et al., Human Immunology 2000, 61: 1074-1085).

Aislamiento, identificacion y caracterizacion de celulas EHP

En la tecnica se describen diversos metodos para aislar celulas a partir de tejido extraembrionario, que a continuacion se pueden usar para producir las celulas EHP de la divulgacion (veanse, por ejemplo, los documentos US2003/0235563, US2004/0161419, US2005/0124003, Solicitudes Provisionales de Estados Unidos N.°s 60/666.949, 60/699.257, 60/742.067, 60/813.759, Solicitud de Estados Unidos N.° 11/333.849, Solicitud de Estados Unidos N.° 11/392.892, documentos PCTUS06/011392, US2006/0078993, PCT/US00/40052, documento de Patente de Estados Unidos N.° 7.045.148, documento US2004/0048372, y documento US2003/0032179).

Identificacion de celulas EHP - Una vez que se afslan las celulas EE, es necesario identificar que celulas tienen las caracterfsticas asociadas con las celulas EHP. Por ejemplo, las celulas se someten a ensayo para la presencia de HLA-G, la ausencia de antfgenos de la Clase II de MHC, y la ausencia de moleculas coestimulatorias cD80 y CD86.

Aislamiento, identificacion y caracterizacion de celulas AMP

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De acuerdo con la invencion, las composiciones de celulas AMP se preparan usando las etapas de a) recuperacion del amnios de la placenta, b) disociacion de las celulas de la membrana amniotica, c) cultivo de las celulas en un medio basal con la adicion de una protefna humana obtenida de forma natural o producida de forma recombinante; y opcionalmente d) proliferacion adicional de las celulas usando aditivos adicionales y/o factores de crecimiento. Los detalles estan contenidos en la Publicacion de Estados Unidos N.° 2006-0222634-A1.

Las celulas AMP de la divulgacion se caracterizan como sigue a continuacion: Usando anticuerpos disponibles en el mercado para marcadores de celulas madre conocidos, las celulas AMP recien aisladas se han caracterizado ampliamente. En resumen, las celulas AMP recien aisladas son sustancialmente negativas con respecto a CD90 y CD117. Ademas, dichas poblaciones de celulas son esencialmente negativas para la expresion proteica de CD34, CD44, CD45, CD140b, CD105; esencialmente positivas para la expresion de protefnas de cD9 y CD29; entre aproximadamente un 70-95 % positivas para la expresion de protefnas de SSEA4, CD10, CD166 y CD227; entre aproximadamente un 60-95 % positivas para la expresion de protefnas de HLA-G, EGFR y CD26; y entre aproximadamente un 10-50 % positivas para la expresion de protefnas de CD71. Los detalles sobre este procedimiento estan contenidos en la Publicacion de Estados Unidos N.° 2006-0222634-A1.

En realizaciones alternativas se pueden crear poblaciones de celulas AMP substancialmente purificadas usando anticuerpos frente a marcadores de protefna expresada (seleccion positiva) o no expresada (seleccion negativa) en la superficie celular de las celulas AMP. Estos anticuerpos se pueden usar para identificar, caracterizar, aislar o crear tales poblaciones sustancialmente purificadas de celulas AMP que expresan esos marcadores de protefna usando una diversidad de metodos. Los detalles sobre este procedimiento estan contenidos en la Publicacion de Estados Unidos N.° 2006-0222634-A1.

Ademas, los marcadores de protefnas que no se expresan en la superficie de las celulas AMP tambien se pueden usar para identificar, aislar o crear poblaciones de celulas AMP que no expresan esos marcadores. Los procedimientos de este tipo pueden implicar un metodo de seleccion negativa, tal como el paso de celulas de muestra sobre una columna que contiene anticuerpos marcadores antiprotefna o por union de celulas a anticuerpos conjugados con perlas magneticas a los marcadores de protefna o mediante exploracion en placas revestidas con anticuerpos marcadores de protefna y recogiendo de las celulas no unidas. Como alternativa, una suspension de una sola celula puede estar expuesta a uno o mas anticuerpos etiquetados con fluorescencia que se unen de forma inmunoespecffica para los marcadores de protefna. Los detalles sobre este procedimiento estan contenidos en la Publicacion de Estados Unidos N.° 2006-0222634-A1.

Poblaciones expandidas de celulas EHP, incluyendo celulas AMP

Un experto en la materia reconocera que cualquiera de las celulas EHP desveladas se pueden expandir usando los metodos que se describen a continuacion para las celulas AMP.

Como se describe en el presente documento y en la Publicacion de Estados Unidos N.° 2006-0222634-A1, los Solicitantes han descubierto un nuevo metodo para aislar y propagar celulas AMP multipotentes. Tales metodos dan como resultado composiciones de celulas AMP que se expanden para celulas multipotentes, proporcionando de ese modo, por primera vez, cantidades suficientes de celulas para permitir el trasplante de celulas terapeuticas. Las composiciones de celulas AMP expandidas son composiciones en las que el nivel de celulas por gramo de tejido amniotico es al menos 50 veces y hasta 150 veces mayor despues de 5 pasajes, en comparacion con aproximadamente 20 veces usando metodos anteriores. Como alternativa, las composiciones de celulas AMP expandidas son composiciones en las que el nivel de celulas por gramo de tejido amniotico es al menos 30 veces y hasta 100 veces mayor despues de 3 pasajes.

Ademas, los metodos usados para cultivo y proliferacion celular proporcionan un medio para cultivar las celulas, asf como otras celulas que incluyen, pero no se limitan a celulas multipotentes, celulas pluripotentes o celulas totipotentes, que incluyen, pero no se limitan a, celulas madre embrionarias, en un sistema sin animal. Ademas, las condiciones de cultivo descritas proporcionan una celula que es menos dependiente de la union a una superficie de cultivo para su viabilidad, permitiendo de este modo la propagacion de las celulas usando el cultivo en suspension para una ampliacion eficaz. Los detalles sobre este procedimiento estan contenidos en la Publicacion de Estados Unidos N.° 2006-0222634-A1.

Las composiciones de celulas AMP expandidas que se describen en el presente documento demuestran un amplio potencial proliferativo, expresan ciertos genes que se sabe que se expresan solo en celulas indiferenciadas (es decir, Nanog y Oct-4) y pueden diferenciar tipos de celulas que normalmente surgen de las tres capas germinales embrionarias (endodermo, ectodermo y mesodermo). Este potencial de diferenciacion sugiere que estas celulas AMP expandidas pueden ser capaces de contribuir a una diversidad de tipos de celulas. Las composiciones de celulas AMP que se describen en el presente documento tambien son utiles como capas de alimentacion para el crecimiento de una diversidad de tipos de celulas, que incluyen, pero no se limitan a, celulas madre embrionarias (celulas ES). Las celulas AMP, incluyendo las que se describen en el presente documento, tambien producen una gran diversidad de citoquinas y factores de crecimiento, formando de ese modo tanto las composiciones celulares, medios condicionados derivados de las celulas (ACCS), lisados celulares de los mismos, matrices extracelulares

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producidas por las celulas, y combinaciones de los mismos utiles para una diversidad de aplicaciones terapeuticas, en particular aplicaciones terapeuticas basadas en celulas tales como terapias de trasplante.

Ademas, las nuevas propiedades inmunomoduladoras posefdas por las composiciones de la divulgacion y que se describen en el presente documento hacen que las composiciones sean utiles en entornos clfnicos en los que esta indicada la modulacion de la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria y/o tratamiento, evitando y/o mejorando las propiedades inflamatorias, inmunitarias y/o enfermedades y trastornos en un sujeto que lo necesite. Tales usos se consiguen mediante la administracion de celulas EHP, incluyendo celulas AMP, medios condicionados derivados de las mismas, lisados celulares derivados de las mismas y productos celulares derivados de las mismas, cada uno de ellos solo o en combinacion, incluyendo entre si y/o otros agentes activos adecuados. Los detalles adicionales sobre el potencial terapeutico de estas celulas y productos celulares estan contenidos en la Publicacion de Estados Unidos N.° 2006-0222634-A1.

Composiciones - Las composiciones de la divulgacion incluyen poblaciones substancialmente purificadas de celulas EHP, incluyendo celulas AMP, asf como lisados celulares y/o medios condicionados derivados de las mismas, solas o en combinacion entre si y/o otros agentes activos adecuados, y composiciones farmaceuticas de las mismas. Las composiciones de la invencion se pueden preparar de diversas maneras dependiendo del uso pretendido de las composiciones. Por ejemplo, una composicion util para poner en practica la divulgacion puede ser un lfquido que comprende un agente de la divulgacion, es decir, una poblacion sustancialmente purificada de celulas EHP, en solucion, en suspension, o ambas (solucion/suspension). El termino "solucion/suspension" se refiere a una composicion lfquida en la que esta presente una primera porcion del agente activo en solucion y una segunda porcion del agente activo esta presente en forma de partfculas, en suspension en una matriz lfquida. Una composicion lfquida tambien incluye un gel. La composicion lfquida puede ser acuosa o en forma de una pomada, unguento, crema, o similares.

Una suspension acuosa o solucion/suspension util para poner en practica los metodos de la invencion puede contener uno o mas polfmeros como agentes de suspension. Los polfmeros utiles incluyen polfmeros solubles en agua tales como polfmeros celulosicos y polfmeros insolubles en agua tales como polfmeros que contienen carboxilo reticulado. Una suspension acuosa o solucion/suspension de la presente invencion es preferentemente viscosa o mucoadhesiva, o aun mas preferentemente, tanto viscosa como mucoadhesiva. Ademas, las composiciones se pueden combinar con otros agentes activos. Tales otros agentes activos incluyen, pero no se limitan a, agentes inmunosupresores tales como ciclosporina, metotrexato, FK-506, corticosteroides y similares (vease a continuacion).

Composiciones farmaceuticas - La presente divulgacion proporciona composiciones farmaceuticas de poblaciones sustancialmente purificadas de celulas EHP, incluyendo celulas AMP, asf como lisados celulares y/o medios condicionados derivados de las mismas, solas o en combinacion entre sf y/o otros agentes activos adecuados, y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. La expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o estatal o listado en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y mas particularmente, en seres humanos. El termino "vehfculo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, vehfculo con el que se administra la composicion. Tales vehfculos farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen en petroleo, animal, vegetal o sintetico, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. Los excipientes farmaceuticos adecuados incluyen almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sflice, estearato sodico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sodico, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composicion, si se desea, tambien puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulgentes, o agentes tampon de pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pfldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y similares. Los ejemplos de vehfculos farmaceuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin, y tambien otros son familiares para los expertos en la materia.

Las composiciones farmaceuticas de la divulgacion se pueden formular como formas neutras o salinas. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos amino libre tales como los derivados de los acidos clorhfdrico, fosforico, acetico, oxalico, tartarico, etc., y los formados con grupos carboxilo libre tales como los derivados de hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, ferricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procafna, etc. Ademas, las composiciones farmaceuticas se pueden combinar con uno o mas agentes activos. Tales otros agentes activos incluyen, pero no se limitan a, agentes inmunosupresores tales como ciclosporina, metotrexato, FK-506, corticosteroides y similares (vease a continuacion).

Kits de Tratamiento - La divulgacion tambien proporciona un artfculo de fabricacion que comprende un material de envasado y una composicion farmaceutica de la divulgacion contenida en el material de envasado, en el que la composicion farmaceutica comprende una poblacion sustancialmente purificada de celulas EHP, incluyendo celulas AMP, asf como lisados celulares y/o medios condicionados derivados de los mismos, solos o en combinacion entre sf y opcionalmente en combinacion con otros agentes activos y en el que el material de envasado comprende una etiqueta o prospecto que indica que la poblacion sustancialmente purificada de celulas EHP incluyendo celulas AMP, asf como lisados celulares y/o medios condicionados derivados de los mismos, solos o en combinacion entre sf se pueden usar para tratar una diversidad de trastornos que incluyen, pero no se limitan a, HVG, GVHD y otras

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enfermedades y trastornos inflamatorios e inmunitarios, reacciones alergicas, etc.

Las celulas EHP, incluyendo celulas AMP, asf como lisados celulares y/o medios condicionados derivados de los mismos, solos o en combinacion entre sf, son utiles como agentes y modalidades terapeuticos tanto primarios como auxiliares. Dichas composiciones se pueden usar de forma terapeutica solas o en combinacion con otros agentes. Las composiciones de este tipo se pueden administrar antes, durante, y/o despues de tales agentes. De forma analoga, ya sea usadas solas o con otros agentes, las composiciones de este tipo se pueden administrar antes, durante, y/o despues de un trasplante u otra terapia basada en celulas. Si se administran durante el transplante u otra terapia basada en celulas, las composiciones se pueden administrar en combinacion con el trasplante u otro material de terapia basada en celulas, o se pueden administrar por separado. Si se administran por separado, las composiciones se pueden administrar de forma secuencial o de forma simultanea con el trasplante u otra terapia basada en celulas. Ademas, las composiciones se pueden administrar antes del trasplante u otra terapia basada en celulas y/o despues del trasplante u otra terapia basada en celulas. Ademas, las composiciones se pueden administrar como el trasplante. En las situaciones de este tipo, se pueden administrar solas o en combinacion con otros agentes activos, etc.

Otros agentes utiles para la coadministracion.

Las celulas EHP, incluyendo las celulas AMP, medios condicionados derivados de las mismas, lisados celulares derivados de las mismas, productos celulares derivados de las mismas, cada uno solo o en combinacion se pueden administrar con otros agentes farmaceuticamente activos. En algunas divulgaciones, uno o mas de dichos agentes se formulan en combinacion con las composiciones para su administracion. En algunas otras divulgaciones, las composiciones y el uno o mas agentes son formulaciones separadas. Ademas, en algunas otras divulgaciones, las composiciones que comprenden las celulas EHP, incluyendo celulas AMP, medios condicionados derivados de las mismas, lisados celulares derivados de las mismas, productos celulares derivados de las mismas, cada uno solo o en combinacion y/o el uno o mas agentes se formulan con respecto al uso auxiliar entre sf.

Las celulas EHP, incluyendo celulas AMP, medios condicionados derivados de las mismas, lisados celulares derivados de las mismas, o productos celulares derivados de las mismas, cada uno solo o en combinacion, se pueden administrar en una formulacion que comprende agentes inmunosupresores, tales como cualquier combinacion de cualquier numero de corticosteroides (es decir glucocorticoides), ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, metotrexato, azatiopina, mercatopurina, antibioticos citotoxicos, anticuerpos policlonales y monoclonales tales como anticuerpos anti-receptores de linfocitos (CD23) y anti-receptores de IL2 (CD25), interferon, opioides, protemas de union al TNF, micofenolato, y pequenos agentes biologicos tales como FTY720. Los agentes inmunosupresores de acuerdo con lo mencionado anteriormente pueden ser los unicos agentes adicionales o se pueden combinar con otros agentes.

Los agentes de este tipo tambien incluyen agentes antibioticos, agentes antifungicos y agentes antivirales, por nombrar solo algunas otras sustancias farmacologicamente activas y composiciones que se pueden usar. Los antibioticos o compuestos antimicoticos habituales incluyen, pero no se limitan a, penicilina, estreptomicina, anfotericina, ampicilina, gentamicina, kanamicina, acido micofenolico, acido nalidixico, neomicina, nistatina, paromomicina, polimixina, puromicina, rifampicina, espectinomicina, tetraciclina, tilosina, zeocina y cefalosporinas, aminoglicosidos y equinocandinas.

Los agentes adicionales se pueden usar en conjunto con las celulas EHP, incluyendo las celulas AMP de la presente invencion, para dirigir las celulas a un sitio en particular, tal como uno de trastorno inmune, disfuncion, o enfermedad, en los que podnan ser necesarios. Los agentes de este tipo pueden incluir factores de crecimiento y agentes de senalizacion troficos, tales como citoquinas. Se pueden usar para atraer celulas EHP a sitios terapeuticamente dirigidos. Se pueden administrar a un sujeto antes del tratamiento con celulas EHP, junto con celulas EHP, o despues de que se administran las celulas EHP. Ciertas citoquinas, por ejemplo, alteran o afectan a la migracion de celulas EHP o celulas diferenciadas a partir de las mismas a sitios con necesidad de terapia, tales como sitios inmunocomprometidos. Las citoquinas que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, factor 1 derivado de celulas del estroma (SDF-1), factor de celulas madre (SCF), angiopoyetina-1, factor de crecimiento derivado de placenta (PIGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), citoquinas que estimulan la expresion de las moleculas de adhesion endotelial tales como las ICAM y las VCAM, y citoquinas que engendran o que facilitan el direccionamiento. Se pueden administrar a un sujeto como un tratamiento previo, junto con celulas EHP, incluyendo celulas AMP, o despues de que se hayan administrado las composiciones, para estimular la migracion a los sitios deseados y para conseguir un efecto terapeutico mejorado. Los factores de este tipo se pueden combinar con celulas EHP, incluyendo celulas AMP, solas o en combinacion en una formulacion adecuada para que se administren en conjunto. Como alternativa, los factores de este tipo se pueden formular y administrar por separado.

El orden de administracion, formulaciones, dosis, frecuencia de dosificacion y vfas de administracion de factores (tales como las citoquinas) y celulas EHP, incluyendo celulas AMP, medios condicionados derivados de las mismas, lisados celulares derivados de las mismas, o productos celulares derivados de las mismas, cada uno solo o en combinacion, por lo general variaran con el trastorno o enfermedad que se esta tratando, su gravedad, el sujeto,

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otras terapias que se estan administrando, el estadio del trastorno o enfermedad, y factores de pronostico, entre otros. Los regfmenes generales que se han establecido para otros tratamientos proporcionan un marco para determinar la dosificacion adecuada en terapia directa o auxiliar mediada por celulas EHP. Estos, junto con la informacion adicional proporcionada en el presente documento, permitiran al experto en la materia determinar los procedimientos de administracion adecuados sin experimentacion excesiva.

Vias y Formulaciones

Las composiciones que comprenden celulas EHP, incluyendo celulas AMP, medios condicionados derivados de las mismas, lisados celulares derivados de las mismas, o productos celulares derivados de las mismas, cada uno solo o en combinacion, o celulas diferenciadas a partir de las mismas se pueden formular de cualquier manera convencional usando uno o mas veldculos fisiologicamente aceptables que comprenden excipientes y agentes auxiliares. La formulacion adecuada depende de la via de administracion elegida. Las composiciones de la invencion se pueden envasar con instrucciones escritas para el uso de las celulas en la regeneracion de tejidos, o para restablecer una funcion metabolica terapeuticamente importante. Las composiciones tambien se pueden administrar al receptor en uno o mas veldculos fisiologicamente aceptables. Los veldculos de estas celulas pueden incluir, pero no se limitan a, soluciones de solucion tampon fosfato salino (PBS) o solucion de Ringer con lactato que contiene una mezcla de sales en concentraciones fisiologicas.

Un experto en la materia puede determinar facilmente la concentracion apropiada de celulas EHP, incluyendo celulas AMP, para un fin particular. El experto en la materia reconocera que una dosis preferente es aquella que produce un efecto terapeutico, tal como suprimir una respuesta inflamatoria o inmunitaria, en un paciente con necesidad de la misma. Los expertos en la materia tambien reconoceran que todos y cada uno de los metodos y modalidades convencionales para terapias de trasplante basadas en tejidos, organos y celulas actualmente en practica clmica y desarrollo clmico son adecuados para poner en practica los metodos de la invencion. Ademas, las dosis apropiadas de celulas EHP, incluyendo celulas AMP, y lisados celulares derivados de las mismas y medios condicionados derivados de las mismas (es decir ACCS), y regfmenes de dosificacion son facilmente determinados por los expertos en la materia y es necesaria su determinacion de forma empmca en el momento de su uso basandose en varias variables que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad que se esta tratando; edad del paciente, peso, sexo, salud; otros medicamentos y tratamientos que se estan administrando al paciente; y similares. Las vfas de administracion, formulacion, coadministracion con otros agentes (si fuera apropiado) y similares se discuten con detalle en cualquier parte en el presente documento. Una dosis preferente esta en el intervalo de aproximadamente 0,25-2,0 x 106 celulas. Otros intervalos de dosis preferentes son 0,1-10,0 x 106 celulas por cendmetro cuadrado de area aplicada basandose en experimentos tanto in vitro como in vivo. Se ha encontrado que cantidades relativamente pequenas de celulas EHP pueden suprimir las respuestas inflamatorias e inmunitarias. Por ejemplo, solo 1.000-100.000 celulas AMP por reaccion en MLR es suficiente para reducir la respuesta de los linfocitos T a potentes estimuladores en mas de un 99 % in vitro.

Ademas, alguien con experiencia en la materia puede determinar facilmente la concentracion apropiada de medio condicionado, incluyendo, por ejemplo, ACCS, para un fin particular. Una dosis preferente esta en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 1000 microgramos por cendmetro cuadrado de area aplicada. Otros intervalos de dosis preferentes son de 1,0 a 50,0 microgramos/area aplicada.

Las celulas EHP, incluyendo celulas AMP, medios condicionados derivados de las mismas, lisados celulares derivados de las mismas, o productos celulares derivados de las mismas, cada uno solo o en combinacion, o celulas diferenciadas a partir de las mismas se pueden administrar mediante inyeccion en un sitio diana de un sujeto, preferentemente a traves de un dispositivo de administracion, tal como un tubo, por ejemplo, cateter. En una divulgacion, el tubo contiene adicionalmente una aguja, por ejemplo, una jeringa, a traves de la cual las celulas se pueden introducir en el sujeto en un lugar deseado. Los ejemplos espedficos, no limitantes de la administracion de celulas a sujetos tambien pueden incluir la administracion mediante inyeccion subcutanea, inyeccion intramuscular, o inyeccion intravenosa. Si la administracion es intravenosa, una suspension lfquida inyectable de celulas se puede preparar y administrar mediante un goteo continuo o como un bolo.

Las composiciones de la invencion tambien se pueden insertar en un dispositivo de administracion, por ejemplo, una jeringa, de diferentes formas. Por ejemplo, las celulas se pueden suspender en una solucion contenida en tal dispositivo de administracion. Como se usa en el presente documento, el termino "solucion" incluye un veldculo o diluyente farmaceuticamente aceptable en el que las celulas de la invencion permanecen viables. Los veldculos y diluyentes farmaceuticamente aceptables incluyen solucion salina, soluciones tampon acuosas, disolventes y/o medios de dispersion. El uso de tales veldculos y diluyentes se conoce bien en la tecnica. La solucion es preferentemente esteril y fluida en la medida en que exista una facil capacidad de inyeccion. Preferentemente, la solucion es estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y se conserva frente a la accion contaminante de microorganismos tal como bacterias y hongos a traves del uso de, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal, y similares. Las soluciones de la invencion se pueden preparar mediante la incorporacion de celulas EHP, incluyendo celulas AMP, medios condicionados derivados de las mismas, lisados celulares derivados de las mismas, o productos celulares derivados de las mismas, cada uno solo o en combinacion, o celulas diferenciadas como se describe en el presente documento, en un veldculo o diluyente

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farmaceuticamente aceptable y, si fuera necesario, otros ingredientes enumerados anteriormente, seguido de esterilizacion por filtracion.

Las celulas EHP no diferenciadas, parcialmente diferenciadas o totalmente diferenciadas, incluyendo celulas AMP, medios condicionados derivados de las mismas, lisados celulares derivados de las mismas, cada uno solo o en combinacion, se pueden administrar por via sistemica (por ejemplo por via intravenosa) o por via local (por ejemplo directamente en un defecto miocardico bajo gufa ecocardiografica o por aplicacion directa bajo visualizacion durante la cirugfa). Para las inyecciones de este tipo, las composiciones pueden estar en una preparacion de suspension lfquida inyectable o en un medio biocompatible que sea inyectable en forma lfquida y que se convierta en semisolido en el sitio del tejido danado. Se puede usar una jeringa intracardiaca o un dispositivo de administracion endoscopica controlable convencionales siempre y cuando el lumen o diametro de la aguja sea de diametro suficiente (por ejemplo, calibre 30 o mayor) de modo que las fuerzas de cizallamiento no danen ninguna celula que se esta suministrando.

Las matrices de soporte en las que se puede incorporar o embeber las celulas EHP, incluyendo celulas AMP, y/o lisados celulares y/o medios condicionados derivados de las mismas incluyen matrices que son compatibles con el receptor y que se degradan en productos que no son daninos para el receptor. Estas matrices proporcionan soporte y proteccion para las celulas EHP indiferenciadas y diferenciadas in vivo y, por lo tanto, son la forma preferente en la que las celulas de este tipo se trasplantan en los sujetos receptores.

Las matrices biodegradables naturales y/o sinteticas son ejemplos de las matrices de este tipo. Las matrices biodegradables naturales incluyen coagulos de plasma, por ejemplo, derivados de matrices de un mamffero, colageno, fibronectina y laminina. El material sintetico adecuado para una matriz de trasplante de celulas debe ser biocompatible para evitar la migracion y las complicaciones inmunologicas y deberfa ser capaz de soportar un amplio crecimiento celular y una funcion celular diferenciada. Tambien debe ser reabsorbible, lo que permite un reemplazo de tejido completamente natural. La matriz deberfa ser configurable en una diversidad de formas y deberfa tener una resistencia suficiente para evitar el colapso tras el implante. Los estudios recientes indican que los polfmeros de poliester biodegradables hechos de acido poliglicolico cumplen todos estos criterios (Vacanti, et al., J. Ped. Surg. 23: 3-9 (1988); Cima, et al., Biotechnol. Bioeng. 38:145 (199l); Vacanti, et al., Plast. Reconstr. Surg. 88: 753-9 (1991)). Otras matrices sinteticas de soporte biodegradables incluyen polfmeros sinteticos tales como polianhfdridos, poliortoesteres y acido polilactico. En la tecnica tambien se conocen ejemplos adicionales de polfmeros sinteticos y metodos para incorporar o embeber celulas en estas matrices. Veanse por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos N.° 4.298.002 y 5.308.701.

La union de las celulas al polfmero se puede aumentar revistiendo los polfmeros con compuestos tales como componentes de la membrana basal, agar, agarosa, gelatina, goma arabiga, colagenos de tipo I, II, III, IV y V, fibronectina, laminina, glicosaminoglicanos, mezclas de los mismos y otros materiales conocidos por los expertos en la materia de cultivo celular. Todos los polfmeros para su uso en la matriz deben satisfacer los parametros mecanicos y bioqufmicos necesarios para proporcionar un soporte adecuado para las celulas con posterior crecimiento y proliferacion. Los polfmeros se pueden caracterizar con respecto a propiedades mecanicas tales como resistencia a la traccion usando una maquina de ensayo Instron, para el peso molecular de polfmero mediante cromatograffa de permeacion en gel (GPC), temperatura de transicion vftrea mediante calorimetrfa de barrido diferencial (DSC) y estructura de enlace mediante espectroscopfa de infrarrojos (IR) con respecto a la toxicologfa mediante ensayos de identificacion sistematica que implican ensayos de Ames y ensayos de teratogenicidad in vitro, y estudios de implante en animales para estudios de inmunogenicidad, inflamacion, liberacion y degradacion.

Una de las ventajas de una matriz polimerica biodegradable es que se pueden incorporar agentes angiogenicos y otros compuestos bioactivos directamente en la matriz de soporte de manera que se liberen lentamente a medida que la matriz de soporte se degrada in vivo. A medida que la estructura de celula-polfmero se vasculariza y la estructura se degrada, las celulas EHP se pueden diferenciar de acuerdo con sus caracterfsticas inherentes. En la matriz se podrfan incorporar o se podrfan proporcionar en conjunto con la matriz algunos factores, incluyendo nutrientes, factores de crecimiento, inductores de diferenciacion o desdiferenciacion (es decir, hacer que las celulas diferenciadas pierdan caracterfsticas de diferenciacion y adquieran caracterfsticas tales como proliferacion y funcion mas general), productos de secrecion, inmunomoduladores, inhibidores de la inflamacion, factores de regresion, compuestos biologicamente activos que potencian o permiten el crecimiento de la red linfatica o fibras nerviosas, acido hialuronico y farmacos que son conocidos por los expertos en la materia y que estan disponibles en el mercado con instrucciones con respecto a lo que constituye una cantidad eficaz, de proveedores tales como Collaborative Research, Sigma Chemical Co., factores de crecimiento vascular tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento epidermico (EGF) y factor de crecimiento epidermico de union a heparina tal como el factor de crecimiento (HB-EGF). De forma analoga, se pueden sintetizar polfmeros que contienen peptidos tales como el peptido de union RGD (Arg-Gly-Asp) para su uso en la formacion de matrices (veanse por ejemplo las Patentes de los Estados Unidos N.° 4.988.621, 4.792.525, 5.965.997, 4.879.237 y 4.789.734).

En otro ejemplo, las celulas EHP no diferenciadas, parcialmente diferenciadas o totalmente diferenciadas, incluyendo las celulas AMP, se pueden trasplantar en una matriz de gel (tal como Gelfoam de Upjohn Company) que

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se polimeriza para formar un sustrato en el que pueden crecer las celulas. Se han desarrollado diversas tecnologfas de encapsulacion (por ejemplo Lacy et al., Science 254: 1782-84 (1991); Sullivan et al., Science 252: 718-712 (1991); documento WO 91/10470; documento WO 91/10425; Patente de Estados Unidos N.° 5.837.234; Patente de Estados Unidos N.° 5.011.472; Patente de Estados Unidos N.° 4.892.538). Durante procedimientos quirurgicos abiertos, que implican acceso ffsico directo al tejido y/u organos danado, todas las formas descritas de preparaciones de administracion de celulas EHP no diferenciadas, parcialmente diferenciadas o completamente diferenciadas son opciones disponibles. Estas celulas se pueden trasplantar repetidamente a intervalos hasta conseguir un efecto terapeutico deseado.

La divulgacion tambien proporciona el suministro de celulas EHP, incluyendo composiciones de celulas AMP que se describen en el presente documento, en conjunto con cualquiera de las matrices de soporte mencionadas anteriormente, asf como membranas derivadas del amnios. Las membranas de este tipo se pueden obtener como un subproducto del proceso que se describe en el presente documento para la recuperacion de celulas AMP, o mediante otros metodos, tal como se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 6.326.019 que describe un metodo para fabricar, almacenar y usar un injerto quirurgico de membrana amniotica humana, el documento US 2003/0235580 que describe membranas amnioticas reconstituidas y recombinantes para suministro sostenido de moleculas, protefnas o metabolitos terapeuticos, a un sitio en un hospedador, el documento US 2004/0181240, que describe una cubierta de membrana amniotica para una superficie de tejido que puede prevenir adherencias, excluir bacterias o inhibir la actividad bacteriana, o estimular la cicatrizacion o crecimiento de tejido, y la Patente de Estados Unidos N.° 4.361.552, que pertenece a la preparacion de membranas amnioticas reticuladas y su uso y metodos para tratar quemaduras y heridas. Las celulas EHP se pueden cultivar en tales membranas, se pueden anadir a la membrana en una forma indiferenciada, parcialmente diferenciada o completamente diferenciada, o se pueden anadir medios condicionados o lisados celulares a las membranas de este tipo. Como alternativa, el tejido amniotico en el que las celulas AMP no se han separado se puede usar para suministrar celulas EHP a un sitio en particular. En todos los casos, las celulas EHP se pueden usar en conjunto con tejido amniotico u otras matrices en combinacion con otras celulas terapeuticamente utiles y/o celulas que expresan agentes terapeuticos biologicamente activos tales como los que se describen a continuacion.

Las celulas EHP se pueden modificar geneticamente para producir una protefna terapeutica en particular. La protefna terapeutica incluye una amplia gama de protefnas biologicamente activas que incluyen, pero no se limitan a, factores de crecimiento, enzimas, hormonas, citoquinas, inhibidores de citoquinas, factores de coagulacion sangufnea, crecimiento de peptidos y factores de diferenciacion. Las celulas diferenciadas en particular se pueden disenar mediante ingenierfa con una protefna que se expresa normalmente por el tipo de celula en particular. Por ejemplo, las celulas pancreaticas se pueden disenar por ingenierfa para producir enzimas digestivas. Los hepatocitos se pueden disenar para producir el inhibidor enzimatico, A1AT, o factores de coagulacion para tratar la hemofilia. Ademas, las celulas neuronales se pueden disenar por ingenierfa para producir transmisores qufmicos.

Los metodos que son bien conocidos por los expertos en la tecnica se pueden usar para construir vectores de expresion que contienen un acido nucleico que codifica la protefna de interes relacionada con las senales de control de la transcripcion/traduccion apropiadas. Veanse, por ejemplo, las tecnicas descritas en Sambrook et al., 2001, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"; Ausubel, ed., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology" Volumenes I- III; Celis, ed., 1994.

Los metodos adecuados para transferir vector o plasmidos en celulas EHP o celulas diferenciadas de las mismas incluyen complejos lipfdico/ADN, tales como los que se describen en las Patentes de Estados Unidos N.'*5 5.578.475; 5.627.175; 5.705.308; 5.744.335; 5.976.567; 6.020.202; y 6.051.429. Los reactivos adecuados incluyen lipofectamina, una formulacion liposomica 3:1 (p/p) del lfpido policationico, trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N- [2(espermincarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), (nombre de Registro en Chemical Abstracts: N- [2-(2,5-bis[(3-aminopropil)amino]-1-oxpentil)amino)etil-]-N,N-dimetil-2,3-bis(9-octadeceniloxi)-1-propanamin- trifluoroacetato), y el lfpido neutro dioleofl fosfatidiletanolamina (DOPE) y agua filtrada por membrana. Una formulacion a modo de ejemplo es Lipofectamine 2000™ (disponible en Gibco/Life Technologies N.° 11668019). Otros reactivos incluyen: Reactivo de Transfeccion FuGENE™ 6 (una mezcla de lfpidos en forma no liposomica y otros compuestos en etanol al 80 %, obtenible en Roche Diagnostics Corp. N.° 1814443); y reactivo de transfeccion LipoTAXI™ (una formulacion lipfdica de Invitrogen Corp., N.° 204110). La transfeccion de celulas EHP se puede realizar por electroporacion, por ejemplo, como se describe en Roach y McNeish (Methods in Mol. Biol. 185:1 (2002)). Los sistemas de vectores virales adecuados para producir celulas madre con alteraciones geneticas estables se pueden basar en adenovirus, lentivirus, retrovirus y otros virus, y se pueden preparar usando componentes de virus disponibles en el mercado.

La invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no se deberfan interpretar como limitantes dado que el alcance de la invencion solo se puede determinar con las reivindicaciones.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se establecen con el fin de proporcionar a las personas con experiencia habitual en la materia una divulgacion y descripcion completa de como preparar y usar los metodos y composiciones de la

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invencion, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores contemplan como su invencion. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precision con respecto a los numeros usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se deberfan tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular medio, la temperatura esta en grados Centfgrados, y la presion es o casi es la atmosferica.

Ejemplo 1: Caracterizacion de celulas progenitoras multipotentes derivadas del amnios (AMP) usadas en estudios

Para estudios inmunologicos, una caracterizacion adicional de los marcadores de superficie celular de las celulas AMP, una subpoblacion distinta de celulas aisladas de amnios humano que se han crioconservado, cultivado y propagado, se realizo antes del examen de sus caracterfsticas inmunologicas. En estas condiciones, las celulas AMP son negativas para el antfgeno CD117 (c-kit), distinguiendo las celulas AMP de las celulas derivadas de lfquido amniotico, y son ~74 % positivas para CD90 y ~97 % de SSEA-4. Las celulas AMP tambien presentan tincion para CD9 (~81 %), CD10 (~64 %), CD29 (~100 %), CD104 (~100 %), CD49f (~100 %), CD105 (~12 %) y CD44 (~7 %), pero son negativas para marcadores hematopoyeticos, CD34 y CD45, y para el receptor de PDGF, CD140b. El analisis adicional se realizo para establecer un perfil inmunologico relevante para celulas AMP. Las celulas AMP expresaban moleculas de la clase I de MHC, sin embargo no negativas para la Clase II de MHC. Las celulas AMP tambien eran negativas para las moleculas coestimulatorias, CD80 y CD86 (B7-1 y B7-2, respectivamente). La expresion de estos marcadores no se vela afectada por la incubacion en presencia de IFN-y. Se mostro que las celulas AMP tenfan expresion de Fas, proporcionando posiblemente un mecanismo frente a celulas efectoras activadas de expresion de FasL in vivo. De forma coherente con otros hallazgos de celulas derivadas de placenta, se encontro que las celulas AMP eran positivas tanto para PD-L1 como para PD-L2 despues de su exposicion a IFN-y. Por ultimo, las celulas AMP expresan el antfgeno HLA-G de clase I de HLA no clasico, un componente fundamental de los efectos inmunomoduladores del propio del amnios. El HLA-G estara presente en ~60-90 % de celulas en el momento del aislamiento, y disminufa de forma gradual durante el pasaje. La expresion de HLA-G se regulaba de forma positiva mediante la adicion de IFN-y. Las celulas AMP eran negativas, sin embargo, para los receptores de la clase I de HLA no clasicos, IL-T2, IL-T3, e IL-T4, en todos los momentos sometidos a ensayo. Estas moleculas se regulan de forma positiva por el propio HLA-G, pero la falta de estos receptores en las celulas AMP puede indicar la ausencia de cualquier regulacion autocrina por HLA-G en la superficie celular.

Ejemplo 2: Inmunogenicidad de las celulas AMP: Reaccion linfocitaria mixta (MLR). Celulas mononucleares perifericas normales con respecto a celulas AMP con falta de coincidencias de HLA-DR (Clase II)

El HLA-G es una molecula de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad no clasica (MHC) que tiene una distribucion limitada por tejido. Se ha demostrado que para proporcionar una tolerancia materno-fetal se expresa en citotrofoblastos en la superficie de contacto feto-materna. El hLA-G tambien se expresa mediante ciertos linajes de cancer, en los que puede tener un papel proporcionando un mecanismo de escape a la inmunovigilancia del organismo hospedador. Se ha mostrado (CMLS, 55, 1999, 327-333) que el HLA-G puede inhibir respuestas limitadas (linfocitos T) y no limitadas (linfocitos NK) por MHC a traves de Receptores Inhibidores Citolfticos (KIR) expresados en los linfocitos y linfocitos NK. Esto incluye respuestas lfticas, asf como proliferativas. Por lo tanto, el HLA-G tiene propiedades inmunomoduladoras de las celulas que lo expresan y del entorno en el que se localizan estas celulas.

Los solicitantes han encontrado que las celulas AMP expresan de forma variable el marcador de superficie celular HLA-G al aislarse del amnios (> 60 %, n = 20); Sin embargo, la expresion de este marcador disminuye a medida que las celulas se cultivan con el tiempo. Cuando se anaden citoquinas proinflamatorias (IFN-y (100 IU/ml) solas o con TNFa (10 ng/ml) e IL1p (10 ng/ml)) al cultivo, la expresion de HLA-G esta regulada de forma positiva. Ademas, los marcadores de la Clase II de MHC (es decir, DR, DP, DQ) no se expresan por celulas AMP ya sea en el aislamiento o despues del cultivo con o sin citoquinas proinflamatorias. Los solicitantes tambien han encontrado que las celulas AMP no expresan las moleculas coestimulatorias, CD80 y CD86, que son fundamentales en la senalizacion de una respuesta inmunitaria normal. Dado que las celulas AMP no tienen expresion de molecula de Clase II o coestimulatoria de MHC y tienen una expresion de HLA-G en la superficie celular, se produce la teorfa de que las celulas AMP no provocaran una respuesta inmunitaria de linfocitos T auxiliares y pueden tener propiedades inmunomoduladoras.

Para someter a ensayo esta hipotesis y determinar el potencial inmunogenico de las celulas AMP, tanto en el aislamiento como despues del cultivo, las celulas se sometieron a ensayo en una reaccion linfocitaria mixta convencional (MLR) (vease, por ejemplo, Bach, F.H., Hirschorn, H. "Lymphocyte interaction: A potential histocompatability test in vitro. Science 1964; 143: 813-814. Bain, B., Vaz, MR, Lowenstein, L. "The development of large immature mononuclear cells in mixed lymphocyte cultures". Blood 1964; 23: 108-116. Jeras, M. "The role of in vitro alloreactive T-cell functional tests in the selection of HLA matched and mismatched haematopoietic stem cell donors". Transplant Immunology 2002; 10: 205-214).

Las poblaciones de celulas que responden consistieron en celulas mononucleares de sangre periferica aisladas de Ficoll-Hypaque. Se eligieron dos voluntarios normales (Que responde 1 y Que responde 2) con sitios de HLA-DR con faltas de coincidencia. Las poblaciones de celulas estimuladoras consistfa en celulas AMP de las formaron tipos con tejido a nivel de ADN y se encontro que no tenfan coincidencias con ambos voluntarios que responden normales.

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Los voluntaries que responden normales tambien se usaron como estimuladores entre si como un control positivo. Las poblaciones de celulas estimuladoras se irradiaron con 2000 Rads para evitar la proliferacion durante la MLR unidireccional. Las celulas se mezclaron a 100.000 celulas que responden frente a 100.000 estimuladores de celulas en un pocillo de una placa de 96 pocillos y se desarrollaron por triplicado. Los cultivos se incubaron durante 6 dfas y a continuacion se sometieron a pulso con Timidina tritiada durante 1 dfa y a continuacion se cosecharon y se hizo su recuento usando un contador de centelleo beta. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 1.

Las celulas que responden se enumeran como numeros 1-21 en el eje X de la Figura 1. Los numeros 1-7 representan celulas AMP frente a celulas estimuladoras irradiadas (asterisco) mostradas en la leyenda. Los numeros 8-14 representan las celulas que Responden 1 frente a celulas estimuladoras irradiadas mostradas en la leyenda. Los numeros 15-21 representan las celulas que Responden 2 frente a celulas estimuladoras irradiadas mostradas en la leyenda.

Las PBMC normales no respondieron a ninguna de las celulas AMP estimuladoras irradiadas mostradas en la Figura 1. Las celulas que responden con falta de coincidencias de HLA-DR normales (1 y 2) solo presentaban una reaccion positiva por MLR cuando se cultivaban entre si. No hubo respuesta significativa de la celula que responde normal frente a las celulas AMP irradiadas ya sea en el punto de tiempo sin pasaje (P0), o cuando se cultivaban mas tiempo despues de pasaje (P1). La adicion de citoquina proinflamatoria (IFN-y sola o IFN-y, IL-1 y TNF-a) no aumentaba la respuesta de cualquiera de las celulas que responden normales con respecto a las celulas AMP, pero estas citoquinas pueden haber sido toxicas al mismo tiempo. Estos datos sugieren que las celulas AMP no son capaces de generar una respuesta inmunitaria en el nivel de linfocitos T auxiliares.

Ejemplo 3: Efectos inmunomoduladores de celulas AMP: Respuesta a Mitogenos. Reaccion Linfocitaria Mixta, y una respuesta de memoria especifica de antigeno a Citomegalovirus (CMV)

Las celulas PBMC normales responden de forma vigorosa a la estimulacion con el mitogeno Concanavelina A (Con A) en un cultivo de tres dfas. Para evaluar los efectos inmunomoduladores de las celulas AMP en la estimulacion Con A, se valoraron diversas concentraciones de celulas AMP en el ensayo. En resumen, las celulas PBMC se cultivaron a 1x10A5 celulas por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de fondo redondo de 96 pocillos (BD Falcon, N.° de Cat. 08-772-5) en presencia de Con A 10 pM (Sigma, N.° de Cat. C5275). Los cultivos se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % durante 2 dfas, a continuacion se sometieron a pulso durante una noche con 1 pCi de timidina tritiada (3H-dTR, Perkin Elmer, Waltham, MA) para medir la proliferacion de linfocitos T. A continuacion, los cultivos se cosecharon usando un cosechador de celulas de 96 pocillos Mach Ill (Tomtec, Hamden, CT) y se hizo el recuento usando un contador de centelleo Microbeta (Wallac lnc., Gaithersburg, MD). Los resultados se expresaron como valores medios de cultivos por triplicado en recuentos por minuto (CPM) y se muestran en la Figura 2. Las celulas AMP se cocultivaron con las PBMC y mitogeno a diluciones a 1:4, 1:16 y 1:64. Los controles positivos consistfan en PBMC mas mitogeno solo. Los controles negativos consistfan en PBMC solo y celulas AMP solas en medio de cultivo. Todos los cultivos se cosecharon y se hizo su recuento en el dfa 3. La inhibicion de la proliferacion de linfocitos T se determino con el porcentaje de reduccion en CPM de pocillos que contenfan celulas AMP con respecto a la proliferacion total de PBMC con respecto a Con A.

La MLR unidireccional se uso para evaluar la reactividad de los linfocitos T con respecto a la estimulacion alogenica. Para identificar si las celulas AMP eran inmunogenicas con respecto a las PBMC alogenicas, las celulas PBMC que responden se cultivaron en 200 pl de RPMl + 5% de suero AB humano a una concentracion de 1x10A5 celulas por pocillo en una placa de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocillos junto con celulas AMP irradiadas con estimulador 2000 en la misma concentracion por triplicado. Los cultivos se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % durante 6 dfas, a continuacion se sometieron a pulso durante 6 horas con 1 pCi de timidina tritiada para medir la proliferacion de linfocitos T. Los resultados se expresaron como valores medios de cultivos por triplicado en recuentos por minuto (CPM) y se muestran en la Figura 2. Este experimento se repitio varias veces usando oraciones normales de celulas PBMC con alelos de DR de HLA con falta de coincidencias. El control positivo inclufa cultivos de MLR entre dos PBMC con falta de coincidencias de HLA-DR. Los controles negativos consistfan en celulas que responden y estimuladoras solas en RPMl + 5 % de suero AB y las que responden con respecto a sf mismas (irradiadas). Para evaluar las caracterfsticas inmunomoduladoras de las celulas AMP in vitro, las celulas AMP se valoraron en serie en una MLR entre las PBMC aisladas de voluntarios normales con alelos HLA-DR con falta de coincidencias. Las PBMC estimuladoras y las celulas AMP se irradiaron con 2000 rads para evitar la proliferacion. Las celulas AMP se valoraron en la MLR a una concentracion de partida de 1:4, y se diluyeron adicionalmente a 1:16 y 1:64. La proliferacion de linfocitos T se midio como se ha descrito anteriormente. La inhibicion de la proliferacion de linfocitos T se determino mediante el porcentaje de reduccion en CPM de pocillos que contenfan celulas AMP con respecto a la proliferacion total entre celulas que responden normales y estimuladoras.

Los efectos inmunomoduladores de las celulas AMP en la respuesta de memoria de recuerdo de linfocitos T con respecto a antigeno de Citomegalovirus (CMV) tambien se sometieron a ensayo. Las PBMC seropositivas para CMV normales se aislaron como se ha descrito anteriormente y se cultivaron en presencia de antigeno de CMV soluble a 1x10A5 celulas por pocillo en placas de 96 pocillos por triplicado. Las celulas AMP irradiadas con 2000 rad se valoraron en los pocillos de cultivo celular a una concentracion de 1:4, y se diluyeron a 1:16 y 1:64. Estos cultivos se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % durante 6 dfas, a continuacion se sometieron a

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pulso durante 6 horas con 1 pCi de timidina tritiada para medir la proliferacion de linfocitos T. Los resultados se expresaron como valores medios de cultivos por triplicado en recuentos por minuto y se muestran en la Figura 2. El control positivo consistfa en las PBMC en presencia del antfgeno de CMV solo. Los controles negativos consistfan en las PBMC de respuesta y celulas AMP solas en medios de cultivo. La inhibicion de la proliferacion de linfocitos T se determino mediante el porcentaje de reduccion en CPM de pocillos que contenfan celulas AMP con respecto a la proliferacion total de PBMC con respecto al antfgeno de CMV soluble.

Resultados: En ausencia de celulas AMP, los linfocitos T respondfan de forma vigorosa a la estimulacion con Con A, MLR alogenico, y al antfgeno de CMV. Una inhibicion significativa se produjo cuando las celulas AMP se valoraron en estos ensayos de una manera dependiente de la dosis (p < 0,01). Este efecto de dosis fue mas prevalente en el ensayo de antfgeno de recuerdo, en el que los linfocitos T seropositivos se inhibieron en un promedio de un 95 % por celulas AMP valoradas en el ensayo a una dilucion de 1:4. Los resultados eran reproducibles cuando se sometfan a siete elementos de respuesta seropositivos para CMV frente al antfgeno de CMV soluble en presencia de cuatro poblaciones diferentes de AMP. Este efecto tambien se observo en la MLR de alo-antfgeno, en la que la inhibicion media alcanzo un 80,1 % de inhibicion. De nuevo, en estos ensayos se usaron siete diferentes conjuntos de elementos que responden y estimuladores con faltas de coincidencia con cuatro diferentes poblaciones de AMP. Por el contrario, la respuesta de Con A alcanzo solo un 51,6 % de inhibicion en presencia de celulas AMP en esta dilucion. Se sometieron a ensayo seis elementos que responden diferentes frente al mitogeno soluble con cuatro poblaciones diferentes de celulas de AMP. Estos efectos inhibitorios de celulas AMP no se vieron afectados por la adicion o incubacion previa de celulas AMP con IFN-y. El IFN-y tampoco regulaba de forma positiva la expresion de la clase II del MHC con respecto a las celulas AMP en ningun momento, pero la expresion de HLA-G estaba regulada de forma positiva hasta aproximadamente un 60 % en la superficie de las celulas AMP (Figura 2). Como las celulas AMP se diluyeron adicionalmente a 1:16, aun se produjo una inhibicion significativa dependiente de la dosis en los tres ensayos sometidos a ensayo, pero este efecto no estaba igualmente distribuido. La inhibicion mas elevada se observo con respuestas especfficas para CMV a un promedio de un 62 %, mientras que el alo-antfgeno y las respuestas a mitogeno disminuyeron hasta un promedio de inhibicion de un 47 % y un 34 %, respectivamente. A la dilucion final de las celulas AMP usada en estos ensayos (1:64), solamente la respuesta de recuerdo a CMV permanecfa inhibida en mas de un 50 %.

Ejemplo 4: Efectos de pasaje y respuesta a la dosis de celulas AMP en MLR de Alo-Antfgeno

Las celulas AMP se aislaron a partir de diversos momentos cultivo y se hizo su pasaje. P0 es el punto temporal mas inicial y se trata de celulas sin pasaje. P1, P2, y P3 se refieren a numeros de pasaje con P1 siendo celulas tomadas despues del primer pasaje, P2 el segundo, y P3 el tercero. Despues de la recogida, las celulas AMP se irradiaron y se colocaron en una MLR normal entre los elementos que responden 1 y 2 a 1x10A5 de concentracion de partida. A continuacion, las celulas AMP se diluyeron en serie a partir de esta concentracion de partida por debajo de 1:64 y se anadieron a la MLR para observar los efectos de los numeros de celulas menores en la inhibicion. La Figura 3 muestra los resultados de este experimento.

La respuesta sin inhibir total entre elementos que responden normales 1 y 2 por MLR se muestra como numeros 1-4 en el eje X de la Figura 3. Los efectos inhibitorios de las valoraciones de celulas AMP, P0, P1, P2 y P3 se representan con los numeros 5-32 en el eje X.

Los resultados muestran una inhibicion significativa de la MLR normal sin ningun impacto del tiempo de pasaje de las celulas AMP. La MLR se inhibio hasta un 89 % a la dilucion de celulas AMP mas elevada. Se observo un efecto de valoracion, con inhibicion de celulas AMP que permanecfa sobre un 20 % incluso a la dilucion de 1:64. En estas celulas AMP, la expresion de HLA-G se midio a ~52 % en el aislamiento o P0 y todavfa se detectaba a P3 siendo (~12 %).

Ejemplo 5: Efectos de pasaje y respuesta a la dosis de celulas AMP sobre la respuesta de memoria a citomegalovirus (CMV)

Las caracterfsticas inmunomoduladoras de las celulas AMP tambien se evaluaron mediante un segundo experimento en el que las celulas AMP se irradiaron y se diluyeron en serie como se ha mencionado anteriormente, pero en lugar de cultivar en una MLR normal, las celulas se valoraron en una respuesta de memoria de antfgeno de recuerdo para un ensayo de Citomegalovirus. El elemento que responde 2 es tambien un elemento que responde seropositivo para CMV. Cuando se cultiva con antfgeno de CMV aislado, existe una alta respuesta tal como se mide mediante un fndice de estimulacion de la incorporacion de H3 Timidina. Se trata de una respuesta de memoria clasica a un antfgeno al que estos linajes celulares se expusieron previamente. Cuando las celulas AMP se valoraron en este sistema, se produjo una anulacion de esta respuesta de memoria, como se muestra en la Figura 4.

La respuesta sin inhibir total entre el elemento que responde seropositivo y el antfgeno de CMV se representa como numeros 1-4 en el eje X de la Figura 4. El efecto de las celulas aMp valoradas a P0, P1, P2, y P3 se representa con los numeros 5-32 en el eje X de la Figura 4.

La respuesta de CMV normal se inhibio en mas de un 90 % usando las 3 primeras diluciones en serie de las celulas

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AMP valoradas en el cultivo (1:1, 1:2 y 1:4). Esta inhibicion disminuyo constantemente con otras valoraciones. No se produjo ningun efecto significativo del numero de pasaje en los resultados de inclusion mostrados. Tornados en conjunto, estos datos ilustran que parece que las celulas AMP tienen una funcion inmunomoduladora y pueden regular de forma negativa la respuesta inmunitaria.

Ejemplo 6: El efecto inmunomodulador de las celulas AMP no es un efecto citotoxico

Para confirmar que el efecto observado es un efecto inmunmodulador de las celulas AMP y no un efecto citotoxico, se realizaron experimentos de cocultivo para evaluar el crecimiento y la viabilidad del elemento que responde. Los resultados de este experimento demuestran que los elementos que responden de PBMC cocultivados con celulas AMP tienen una viabilidad ligeramente inferior a los elementos que responden de PBMC solos. Los elementos que responden de PBMC a las PBMC alogenicas cultivadas con celulas AMP tambien presentaba una ligera disminucion en la viabilidad. Sin embargo, los elementos que responden de PBMC con respecto a los elementos que responden de PBMC alogenicas sin celulas AMP tambien presentaban una cierta disminucion de la viabilidad. Esta disminucion de la viabilidad puede ser debida a una duracion inadecuada del cultivo experimental.

Ejemplo 7 Efecto de las celulas AMP en el cultivo de celulas inducidas por factor de crecimiento: blastos de linfocitos T de IL-2 y linfocitos B transformados con virus de Epstein-Barr (EBV)

Las celulas AMP se analizaron para la inmunomodulacion potencial de los cultivos de linfocitos T y B activados previamente. Se produjeron blastos de linfocitos T dependientes de IL-2 cultivando 10x106 PBMC en presencia de Fitohemaglutinina 10 pM (PHA, Sigma N.° de Cat. L2646) y 10 U de rhIL-2 (Peprotech, N.° de Cat. 200-02) durante un periodo de 5 dfas en 20 ml de RPMI + suero AB humano al 5 % en Matraces de cultivo tisular de 25 cm2 (BD Falcon, N.° de Cat. 08-772-18). A continuacion, las celulas dependientes de IL-2 se recogieron por centrifugacion y se lavaron una vez y se transfirieron a placas tratadas con cultivo tisular de 96 pocillos a una concentracion de 1x105 celulas por pocillo en RPMI recien preparado + suero AB humano al 5 %. A continuacion, las celulas se volvieron a exponer a IL-2 durante tres dfas y la proliferacion se midio por absorcion de 3H-dTR como se ha descrito anteriormente. Las celulas AMP se anadieron a estas celulas en este momento a una dilucion de valoracion de 1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:500, y 1:1000 para evaluar los efectos inmunomoduladores. El control positivo consistfa en blastos de linfocitos T en medio de cultivo en presencia de IL-2. Los controles negativos consistfan en blastos de linfocitos T en medio de cultivo sin IL-2 y celulas AMP solo en medio de cultivo. La inhibicion de la proliferacion de blastos como respuesta a IL-2 se determino mediante el porcentaje de reduccion en CPM de los pocillos que contenfan celulas AMP con respecto a la proliferacion total de blastos de linfocitos T con respecto a IL-2.

Los blastos de linfocitos B transformados se crearon mediante cultivo de PBMC en presencia del virus de Epstein- Barr como se ha descrito anteriormente (Pope, J., Scott, W., Moss, D., Human lymphoid cell transformation by Epstein-Barr virus. National Review of Biology, 1973. 246: p. 140-141). Estos blastos activados previamente presentan una proliferacion autosostenida cuando se cultivan en un medio que contiene suero fetal de ternera. Los blastos se cultivaron a 1x105 celulas por pocillo en RPMI + suero fetal de ternera al 10 %. Las celulas AMP se anadieron a estas celulas en las mismas diluciones que se han mencionado anteriormente para evaluar los efectos sobre la proliferacion de blastos de linfocitos B. El control positivo era blastos de linfocitos B en medio solo. Los controles negativos consistfan en blastos de linfocitos B solos en medio sin suero fetal de ternera y celulas AMP solo en medio de cultivo. La inhibicion de la proliferacion de blastos de linfocitos B se determino mediante el porcentaje de reduccion en CPM de pocillos que contenfan las AMP con respecto a la proliferacion total de blastos de linfocitos B en medio con suero fetal de ternera.

Resultados: Los blastos de linfocitos T de IL-2 proliferaron como respuesta a la IL-2 exogena con un intervalo de CPM a 3560-12811. No se produjo inhibicion de la proliferacion de los blastos de linfocitos T para volver a exponerse a IL-2 usando cualquier dilucion de celulas AMP sometidas a ensayo. De hecho, el rango de inhibicion proliferativa fue CPM a 3472-12041, respectivamente (n = 3). Estos resultados se repitieron de manera coherente con cualquier dilucion de celulas AMP usadas, aunque la variabilidad era elevada debido a las grandes diferencias en la proliferacion de los linfocitos T. se encontraron resultados similares cuando las celulas AMP se cocultivaban con blastos de linfocitos B en presencia de suero de ternera fetal en el medio de cultivo (n = 6). Un ejemplo mostraba proliferacion de linfocitos B en medio de cultivo solo a CPM a 1259. Despues de la adicion de celulas AMP a una proporcion de 1:4 (la cantidad mas elevada), no se produjo efecto inhibitorio con CPM restante a 1701. En ninguna dilucion las celulas AMP inhibfan la proliferacion de blastos de linfocitos B con respecto a factores de crecimiento en medio de cultivo. Por lo tanto, habfa una falta total de inhibicion dependiente de la dosis por las celulas AMP observada en las celulas activadas por factor de crecimiento.

Ejemplo 8: Ensayos de Transwell y medios condicionados

Las celulas AMP no irradiadas se colocaron en la camara superior de placas de Transwell de 24 pocillos (Corning, tamano de poro de 4 pm, N.° de Cat. 3413) a una densidad confluente de 5x105 celulas AMP por pocillo. Se realizaron ensayos de estimulacion de mitogenos en las camaras inferiores consistentes en 5x105 celulas PBMC aisladas de donantes normales y 10 pg/ml de Concanavelina A. Despues de 3 dfas en cultivo, las celulas de la camara inferior se transfirieron a placas de fondo redondo de 96 pocillos por triplicado 200 pl/pocillo) y se sometieron

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a pulso con 3H-dTR y se cosecharon 18 horas mas tarde. Los grupos de comparacion consistfan en celulas PBMC normales mas mitogeno solo, con celulas AMP valoradas en los pocillos a una dilucion de 1:5, 1:50, y 1:500, con respecto a celulas AMP a las mismas valoraciones separadas de las PBMC y mitogeno por el aparato de membrana Transwell. Los datos se representan como porcentaje de proliferacion (fndice de proliferacion), en el que los linfocitos T en presencia de estimulacion con mitogeno solo eran iguales a un 100 %. La inhibicion en el fndice de proliferacion se calculo restando el porcentaje de inhibicion de cultivos en presencia de celulas AMP mas estimulacion a partir de cultivos solo con estimulacion.

Los medios condicionados se retiraron de los cultivos de celulas AMP despues de que el crecimiento alcanzara casi la confluencia en matraces de cultivo tisular T-75 (Fisher Scientific, N.° de Cat. 13-680-58). Los medios condicionados se anadieron de inmediato a los ensayos de mitogeno, MLR y de antfgeno de recuerdo descritos anteriormente por dilucion en serie produciendo diluciones finales de 1:2, 1:4 y 1:8 en cada experimento. Los controles positivos inclufan PBMC mas mitogeno solo, PBMC mas alo-PBMC irradiadas solas, y PBMC mas antfgeno de CMV solo. Los anticuerpos negativos eran PBMC en medio de cultivo solo y PBMC en medios

condicionados solos en cada dilucion con medio de cultivo. Los datos se representan como porcentaje de

proliferacion (fndice de proliferacion), en el que los linfocitos T en presencia de estimulacion con mitogeno por sf solo son iguales a un 100 %. La inhibicion en el fndice de proliferacion se calculo restando el porcentaje de inhibicion de cultivos en presencia de las AMP mas estimulacion a partir de cultivos con estimulacion solo.

Resultados: En el sistema Transwell, las celulas AMP eran incapaces de suprimir las PBMC a partir de la proliferacion como respuesta a mitogeno. La respuesta normal de las PBMC al mitogeno solo representa un fndice de proliferacion de un 100% (control). Como se ha mostrado anteriormente, las celulas AMP inhiben esta respuesta de una manera dependiente de la dosis. En este caso, las celulas AMP se valoraron en el ensayo a diluciones de 1:5, 1:50 y 1:500. Las celulas AMP redujeron el fndice de estimulacion de un 100 % hasta un promedio de un 50 ± 8,9% a 1:5, 56,7 ± 7,4 % a 1:50, y 72 ± 10,8 % a 1:500. Cuando las celulas AMP se separaron de las PBMC y del mitogeno a traves de los Transwell, no habfa inhibicion en el fndice de estimulacion. De hecho, a la dilucion de 1:5 de celulas AMP, el fndice de proliferacion en realidad aumento en 19,1 ± 14,6 por encima del control. A 1:50, se

produjo una disminucion de la proliferacion hasta un 90,1 ± 12,1% y a 1:500 se produjo un ligero aumento de un

2,3 ± 29,5%. La razon por la cual las desviaciones estandar eran considerablemente mas elevadas con los Transwells puede ser debido a las condiciones de ensayo usadas, dando como resultado cantidades desiguales de linfocitos T que responden que se transfieren entre las placas, contribuyendo de este modo a la amplia gama de CPM registradas. De cualquier modo, las celulas AMP aun eran incapaces de inhibir de forma significativa las respuestas de los linfocitos T a mitogeno. De hecho, los recuentos eran en realidad un poco mas altos en dos de las tres diluciones examinadas (1:5 y 1: 500).

Tambien se examino el efecto inmunomodulador de los medios condicionados extrafdos de celulas AMP en cultivo sobre mitogeno, alo-antigenico (MLR) y antfgeno de recuerdo con respecto a ensayos de CMV. Los medios condicionados en la concentracion mas elevada (dilucion 1:2) disminufan ligeramente la respuesta de las PBMC al mitogeno y presentaban una mayor inhibicion a las respuestas de MLR y del antfgeno de recuerdo, pero no alcanzaban una significacion estadfstica debido a la alta variabilidad. No se produjo inhibicion alguna en las diluciones de 1:4 y 1:8 sometidas a ensayo. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que las celulas AMP requieren contacto de celula a celula para provocar un efecto inmunomodulador y que este efecto no esta mediado por factores solubles.

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REIVINDICACIONES

1. Una composicion que comprende una poblacion de celulas progenitoras multipotentes derivadas del amnios no inmunogenicas (celulas AMP) que son celulas epiteliales que son positivas para la expresion de citoqueratinas y negativas para la expresion de CD34, en la que la poblacion de celulas AMP no inmunogenicas que son celulas epiteliales se prepara con el metodo de:

(a) disociar celulas AMP que son celulas epiteliales de una membrana amniotica de un amnios aislado de una placenta;

(b) recoger las celulas AMP disociadas que son celulas epiteliales; y

(c) cultivar las celulas AMP recogidas que son celulas epiteliales en medio de cultivo que no contiene materiales derivados de animal distintos de protefnas humanas;

en la que las celulas AMP no inmunogenicas son para su uso en la supresion, prevencion o mejora de una respuesta inmunitaria en un sujeto que se podrfa beneficiar de la misma; y en la que la respuesta inmunitaria:

(a) es una respuesta autoinmunitaria tal como diabetes de Tipo I, esclerosis multiple, lupus eritematoso sistemico, enfermedad de Grave, anemia hemolftica autoinmune, penfigoide ampolloso, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, penfigo o anemia perniciosa; o

(b) es una respuesta alogenica tal como enfermedad de injerto contra hospedador o enfermedad de hospedador contra injerto.
2. Una composicion que comprende una poblacion de celulas AMP no inmunogenicas que son celulas epiteliales que son positivas para la expresion de citoqueratinas y negativas para la expresion de CD34, en la que la poblacion de celulas AMP no inmunogenicas que son celulas epiteliales se prepara con el metodo de:

(a) disociar celulas AMP que son celulas epiteliales de una membrana amniotica de un amnios aislado de una placenta;

(b) recoger las celulas AMP disociadas que son celulas epiteliales; y

(c) cultivar las celulas AMP recogidas que son celulas epiteliales en medio de cultivo que no contiene materiales derivados de animal distintos de protefnas humanas

para su uso en la supresion, prevencion o mejora de una respuesta inflamatoria en un sujeto que se podrfa

beneficiar de la misma; y

en la que la respuesta inflamatoria es:

(a) una enfermedad inflamatoria del sistema tegumentario tal como psoriasis o dermatitis atopica;

(b) una enfermedad inflamatoria del intestino tal como colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn; o

(c) una enfermedad reumatica tal como osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, fibromialgia, esclerodermia, espondiloartropatfas, gota, artritis infecciosa, polimialgia reumatica, polimiositis, artritis psoriasica, bursitis, tendinitis, Sfndromes Periodicos Autoinflamatorios relacionados con CIASI (CAPS), enfermedad inflamatoria pelvica, cistitis intersticial, purpura de Henoh-Schonlein o sfndrome de Behcet.
3. La composicion para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en la que el sujeto es un ser humano o un animal no humano.
4. La composicion para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en la que:

(a) la composicion que comprende la poblacion de celulas AMP no inmunogenicas que son celulas epiteliales, se administra por via topica, por via parenteral o por via enterica, o

(b) la composicion de una poblacion de celulas AMP no inmunogenicas que son celulas epiteliales que son positivas para la expresion de citoqueratinas y negativas para la expresion de CD34, se coadministra con uno o mas agentes activos.
5. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que el uno o mas agentes activos es corticosteroides, ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, metotrexato, azatiopina, mercatopurina, antibioticos citotoxicos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, interferon, opioides, protefnas de union al TNF, micofenolato, FTY720 u otros tipos de celulas.
6. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que los anticuerpos monoclonales son anticuerpos anti-receptores de linfocitos T (CD23) o anti-receptores de IL2 (CD25).
7. La composicion para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en la que la poblacion de celulas AMP no inmunogenicas que son celulas epiteliales que son positivas para la expresion de citoqueratinas y negativas para la expresion de CD34 es alogenica para el sujeto.