KR101788885B1 - 세포 요법에 사용하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 요법의 림프 내 투여 방법에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 태양은 상기와 같은 방법과 관련된 조성물, 키트 및 그의 용도를 제공한다.

Description

세포 요법에 사용하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR USE IN CELLULAR THERAPIES}
본 발명은 세포 요법의 제공 방법, 및 그의 치료학적 용도에 관한 것이다.
고등 척추동물의 면역 체계는 다양한 질병의 감염 인자인 세균, 진균 및 바이러스와 같은 미생물을 포함하여, 척추동물의 몸에 들어갈 수 있는 다양한 항원들에 대한 방어의 최전선을 나타낸다. 더욱이, 상기 면역 체계는 다양한 다른 질병 또는 질환, 예를 들어 자가면역 또는 면역병리학적 질병, 면역결핍 증후군, 죽상경화증 및 다양한 종양 질병과도 또한 관련 있다. 이러한 질병의 치료에 이용할 수 있는 방법들이 있지만, 다수의 현행 요법들은 적합하다고는 할 수 없는 결과들을 제공한다. 새로이 떠오르는 치료 전략들 가운데, 세포 요법을 기본으로 하는 것들이 다수의 질병을 치료하기에 잠재적으로 유용한 도구를 구성하는 것으로 보인다. 따라서, 현재 연구자들은 상기 목적을 성취하기 위해 많은 노력을 수행하고 있는 중이다.
자가면역 질병
자가면역 질병은 신체의 면역 체계(세균, 바이러스 및 임의의 다른 외래 생성물에 대해 상기 신체를 방어하게 되어 있다)가 제대로 작동하지 않고 건강한 조직, 세포 및 기관에 대해 병리학적 반응들을 생성시킬 때 유발된다. 항체, T 세포 및 대식세포는 이로운 보호를 제공하지만, 유해하거나 치명적인 면역학적 반응들을 또한 생성시킬 수도 있다.
자가면역 질병은 기관 특이적이거나 전신적일 수 있으며 상이한 발병 기전에 의해 유발된다. 기관 특이적인 자가면역은 주 조직적합성 복합체(MHC) 항원의 이상 발현, 항원 모방 및 MHC 유전자의 대립유전자 변이를 특징으로 한다. 전신적인 자가면역 질병은 다클론성 B 세포 활성화, 및 면역조절 T 세포, T 세포 수용체 및 MHC 유전자의 이상을 수반한다. 기관 특이적인 자가면역 질병의 예는 당뇨병, 갑상선 기능항진증, 자가면역 부신 기능부전, 순수한 적혈구 빈혈증, 다발성 경화증 및 류머티스성 심장염이 있다. 전형적인 전신성 자가면역 질병은 전신 홍반성 루푸스, 만성 염증, 쇼그렌 증후군, 다발성 근염, 피부근염 및 강피증이다.
자가면역 질병의 현행 치료는 면역억제제, 예를 들어 코르티손, 아스피린 유도체, 하이드록시클로로퀸, 메토트렉세이트, 아자티오프린 및 사이클로포스파미드 또는 이들의 조합을 투여함을 포함한다. 그러나 면역억제제 투여시 직면하는 딜레마는 상기 자가면역 질병을 더 유효하게 치료할수록 상기 대상이 감염으로부터의 공격에 더 무방비로 되고, 또한 종양의 발생에 더 민감해진다. 따라서, 자가면역 질병의 치료를 위한 새로운 요법들이 대단히 필요하다.
염증성 질환
염증은 신체의 백혈구 및 분비 인자들이 우리의 몸을 외래 물질, 예를 들어 세균 및 바이러스에 의한 감염으로부터 보호하는 과정이다. 사이토킨 및 프로스타글란딘과 같은 공지된 분비 인자들은 상기 과정을 억제하며, 혈액 또는 감염된 조직 내로, 정렬되고 자기 제어적으로 연속(cascade) 방출된다.
염증성 장 질병(IBD)
IBD는 최종적으로 원위 소장 및 결장 점막의 손상에 이르게 되는 점막 T 세포의 기능 장애, 변경된 사이토킨 생산 및 세포 염증을 특징으로 하는 만성적이고, 특발성이며, 재발성이고 조직 파괴적인 질병의 한 군이다. IBD는 임상적으로 2 개의 표현형, 즉 크론병(CD)과 궤양성 대장염으로 세분된다. CD는 현재 0.05%의 이환율을 갖는 불치성 자가면역 질병으로서 만성 염증으로 되어 일련의 위장 및 장 외 증상, 예를 들어 복부 통증, 직장 출혈, 설사, 체중 감소, 피부 및 안 질환, 및 아동에 있어서 성장 지연 및 성 조숙증을 생성시킨다. 이러한 증상은 대상의 복지, 삶의 질, 및 기능의 능력에 크게 영향을 미칠 수 있다. CD는 만성적이고 전형적으로는 30 세 이전에 발병하기 때문에, 대상들은 일반적으로 평생 치료를 필요로 한다. 그의 병인은 여전히 알려져 있지 않지만, CD가 점막 면역 체계의 내생 항원에 대한 면역 반응의 감독(attenuation) 실패와 연계된다는 추정적인 증거가 존재한다.
현재 CD에 사용되는 치료제, 예를 들어 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 항생제 및 메토트렉세이트는 전적으로 유효하지는 않으며, 비특이적이고, 다수의 부작용을 갖는다. 대부분의 경우에, 외과적 절제가 최종적인 대안이다. 따라서, 현재의 치료 전략은 상기 질병의 2 가지 요소, 즉 염증 및 T-세포 구동된 반응을 모두 특이적으로 조절하는 약물 또는 작용제를 발견하는 것이다.
최근에, 약물 인플릭시맵이, 표준 요법에 반응하지 않는 보통 내지 중증 크론병의 치료, 및 개방된 배액 누공의 치료에 승인되었다. 크론병에 대해 특효 승인된 첫 번째 치료제인 인플릭시맵은 종양 억제 괴사인자(TNF) 항체이다. TNF는 크론병과 관련된 염증을 일으킬 수도 있는 면역 체계에 의해 생산되는 단백질이다. 항-TNF는 TNF가 장에 도달하기 전에 상기 TNF를 혈류로부터 제거하여 염증을 방지한다. 그러나, 상기 항-TNF는 전신 효과를 가지며 TNF는 매우 다면 발현 인자이므로, 심한 부작용이 비교적 흔하고, 그의 장기적인 안전성도 아직 결정되지 않고 있다. 또한, 대상들에게서 발생하는 염증 과정들 중 다수는 TNF 신호전달에 의존하지 않으므로 상기 효능도 또한 제한적이다.
류머티스성 관절염(RA)
류머티스성 관절염 및 소아 류머티스성 관절염은 염증성 관절염의 유형이다. 관절염은 관절의 염증을 기술하는 일반적인 용어이다. 전부는 아니지만, 일부 유형의 관절염은 잘못 겨냥된 염증의 결과이다. 류머티스성 관절염은 세계 인구의 약 1%가 걸려 있으며 본질적으로는 장애이다. 류머티스성 관절염은 자가면역 질환이며, 이때 신체의 면역 체계는, 관절에 윤활액을 분비하는 활액 막을 외래물질로서 부적합하게 인지한다. 염증이 발생하고, 관절 중 및 관절 주위 연골 및 조직이 손상되거나 파괴된다. 신체는 손상된 조직을 상처 조직으로 대체하여, 관절 내 정상 공간을 좁아지게 하고 뼈들이 함께 융합되게 한다.
류머티스성 관절염에서, 지속적인 항원 제공, T-세포 자극, 사이토킨 분비, 활액 세포 활성화, 및 관절 파괴의 자가면역 주기가 존재한다.
관절염에 대한 현행 요법은 상기 관절의 염증을 소염성 또는 면역억제성 약물로 감소시키는데 초점을 두고 있다. 임의의 관절염 치료의 최전선은 대개 소염제, 예를 들어 아스피린, 이부프로펜 및 콕스(Cox)-2 억제제, 예를 들어 셀레콕시브 및 로페콕시브이다. 항-TNF 인간화된 단클론 항체, 예를 들어 인플릭시맵이 또한 사용되지만, 이는 많은 2차 효과 또는 부작용들을 가지며 그의 효능이 매우 낮다. "차선의 약물"은 금, 메토트렉세이트 및 스테로이드를 포함한다. 이들은 관절염에 잘 확립된 치료제이지만, 극소수의 대상만이 이러한 계열의 치료제만으로 차도가 있으며, 류머티스성 관절염 대상들에 대한 난치 문제는 여전하다.
일반적으로, 만성 염증성 질환의 현행 치료제들은 매우 제한된 유효성을 가지며, 이들 중 다수는 높은 부작용 발생률을 갖거나 질병 진행을 완전히 방지하지는 못한다. 지금까지, 어떠한 치료도 이상적이지 않았으며 이러한 유형의 병리에 대한 치유는 없었다. 따라서, 염증성 질환의 치료를 위한 신규 요법이 대단히 필요하다.
본 발명은 세포 요법이 필요한 대상의 상기 세포 요법에 대한 개선된 방법을 제공한다. 본 발명의 추가의 태양은 림프 내로 전달되는 세포 요법에 사용하기 위한 키트 및 조성물을 제공한다.
하나의 태양에서, 손상된 조직 및/또는 염증성 및/또는 면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 갖는 대상에 있어서, 손상된 조직을 치료 또는 회복하고/하거나, 염증성 및/또는 면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 조절, 예방 및/또는 개선하는 방법을 개시하며, 상기 방법은 상기 대상의 림프계에 예방 또는 치료 효과량의, 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다. 하나의 실시태양에서 본 발명은 림프 기관으로의 세포 요법의 직접적인 전달을 포함하는, 개인에게서 면역 및/또는 염증성 질병을 예방, 치료 또는 개선시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 세포 요법을 항원과 함께 전달한다.
또 다른 태양에서,
(i) 손상된 조직의 치료 또는 회복; 및/또는
(ii) 염증성 및/또는 면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 조절, 개선 및/또는 예방
의 방법에 사용하기 위한 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포를 개시하며, 여기에서 상기 세포를 림프계에 투여한다.
더욱 또 다른 태양에서, 키트를 개시하며, 상기 키트는 (i) 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포 집단을 포함하는 약제; 및 (ii) 손상된 조직을 치료 또는 회복하고/하거나 염증성 및/또는 면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 조절, 예방 및/또는 개선하는 것이 필요한 대상의 림프계에 예방 또는 치료 효과량의 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상의 상기 치료 또는 회복; 및/또는 치료, 조절, 예방 및/또는 개선을 위한 방법에 대한 설명서를 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 손상된 조직의 치료 또는 회복; 및/또는 염증성 및/또는 면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 조절, 예방 및/또는 개선을 위한 약제의 제조에 있어서 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포의 용도를 개시하며, 상기 용도는 상기 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포를 상기 림프계에 투여함을 포함한다.
또 다른 태양은 림프계에 투여하기 위한 줄기 세포, 조절성 T-세포 또는 섬유아세포에 관한 것이다. 더욱 또 다른 태양은 요법에 사용하기 위한 상기 세포에 관한 것이다.
더욱 또 다른 태양은 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포, 및 항원을 포함하는, 림프계에 투여하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
다른 태양, 특징 및 이점들은 하기의 내용 및 첨부된 청구의 범위로부터 보다 충분히 자명해질 것이다.
도 1은 확대된 지방 유래된 줄기 세포의 투여가 콜라겐 유발된 관절염 마우스 모델에서 관절염 점수를 감소시키고 림프 내 투여가 정맥 내 경로보다 치료학적으로 더 유효함을 예시한다. 군 A: 처리되지 않은 대조군; 군 C: 5일 연속해서 100만 개의 ASC IV 투여됨; 군 D: 제1일에 3백만 개의 ASC 투여되고 제3일 및 제5일에 100만 개의 ASC 투여됨; 군 E: 제1일 및 제7일에 320,000 개의 ASC 림프 내 투여됨; 군 F: 제1일 및 제7일에 비히클 림프 내 투여됨.
정의
본 발명의 명세서에 대한 이해를 촉진하기 위해서, 본 발명과 관련하여 일부 용어 및 표현의 의미를 하기에 설명할 것이다. 추가의 정의들을 필요에 따라 본 명세서 전체를 통해 포함시킬 것이다.
본 발명에 따른 "림프 내 주사에 적합한" 또는 "결절 내 주사에 적합한" 또는 "액와부 및/또는 서혜부 림프절 내로의 직접 주사에 적합한"이란 용어들은 림프 내 또는 결절 내 주사에 적합한, 바람직하게는 면역조절 세포를 포함하는, 가장 바람직하게는 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포뿐만 아니라 이를 포함하는 약제 및 약학 조성물을 포함하는 세포 요법이, 의학적 치료제로서 상기를 손상된 조직(바람직하게는 중간엽 조직)의 치료 또는 회복 및/또는 염증 및/또는 면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 조절, 예방 및/또는 개선이 필요한 대상에서 상기와 같은 치료를 위해 개인, 특히 인간, 훨씬 더 바람직하게는 인간 대상의 림프 조직에 주사하기에 유리하거나 필요한 물리적, 화학적, 생물학적 및 다른 특성들을 가짐을 의미한다. 더욱 또한 본 발명에 따른 "림프 내 주사에 적합한" 또는 "결절 내 주사에 적합한" 면역조절 세포뿐만 아니라 상기 세포를 포함하는 약제 및 약학 조성물은 상기 조성물의 모든 구성성분들을, 림프 조직 내로 적합한 부피, 바람직하게는 0.01 이하, 바람직하게는 0.05 이하, 바람직하게는 0.1 이하, 바람직하게는 0.2 이하, 바람직하게는 0.3 이하, 바람직하게는 0.4 이하, 바람직하게는 0.6 이하, 바람직하게는 0.8 이하, 바람직하게는 1.0 이하, 바람직하게는 2 ㎖ 이하의 부피로 적합한 양의 모든 구성성분들의 적용을 허용하는 농도로 함유한다. 더욱 또한 "림프 내 또는 결절 내 주사에 적합한" 조성물은 잠재적인 유해 물질, 예를 들어 용매 및 항원보강제(너무 많은 양으로 적용되는 경우 림프 조직을 손상시킬 수도 있다)를 함유하지 않거나 단지 제한된 양으로만 함유해야 한다. 림프 조직의 손상이란 세포에의 독성 효과에 기인하거나, 세포의 화학적 파괴에 기인하는 직접적인 손상, 예를 들어 염증 반응, 괴사 등의 유발에 의한 세포에의 간접적인 손상을 의미한다.
더욱 또한, 본 발명에 따른 "림프 내 또는 결절 내 주사에 적합한" 조성물은 이상적으로는, 주사가 림프 조직을 빗 맞히는 경우 및 최악의 경우 면역조절 세포뿐만 아니라 이를 포함하는 약제 및 약학 조성물이 혈액 순환 내로 직접 주사되는 경우에 상기 면역조절 세포뿐만 아니라 이를 포함하는 약제 및 약학 조성물의 우발적인 전신 적용을 방지하는, 일종의 안전성-기전을 갖는다. 상기와 같은 안전성-기전은 상기 생물학적 활성 물질의 짧은 세포 외 반감기를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "주사"란 용어는 신체의 일부, 대개는 피부를 찔러 상기 신체에 작용제를 전달함을 지칭하는, 당해 분야의 통상적인 의미로 제공되는 것이다. 상기 용어는 중공 주사기 및 고압 제트 주사 장치의 사용을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "동종 이계"란 용어는 동일한 종의 상이한 개체로부터를 의미하는 것으로 간주될 것이다. 하나 이상의 유전자 좌에서 유전자들이 동일하지 않은 경우 상기 2 개 이상의 개체를 서로 동종 이계라고 한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "자기 조직"이란 용어는 동일한 개체로부터를 의미하는 것으로 간주될 것이다.
"면역 질병"이란 용어는 대상의 면역학적 반응에 의해 유발된 세포, 조직 및/또는 기관 상해를 특징으로 하는 상기 대상의 병을 지칭한다. "자가면역 질병"이란 용어는 대상 자신의 세포, 조직 및/또는 기관에 대한 상기 대상의 면역학적 반응에 의해 유발된 세포, 조직 및/또는 기관 상해를 특징으로 하는 상기 대상의 병을 지칭한다. 본 발명의 면역조절 세포에 의해 치료될 수 있는 자가면역 질병의 예시적인 비 제한적인 예로는 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 부신의 자가면역 질병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성유사천포창, 심근증, 셀리악 스푸르-피부염, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 처그-스트라우스 증후군, 흉터유사천포창, CREST 증후군, 한랭 응집소병, 원반모양 루프스, 필수 혼합 한랭 글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑-바레, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소증 자반(ITP), IgA 신경병증, 소아 관절염, 편평 태선, 메니에르 병, 혼합 결합 조직 질병, 다발성 경화증, 1형 또는 면역 매개된 당뇨병, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발성 동맥염, 다연골염, 다선성 증후군, 류머티스성 다발성 근육통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이놀드 현상, 라이터 증후군, 유육종증, 강피증, 진행성 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 굿패스쳐 증후군, 근육 강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 예를 들어 포진성 피부염 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증, 항사구체기저막 질병, 항인지질 증후군, 신경계의 자가면역 질병, 가족성 지중해열, 램버트-이튼 근무력증, 교감성 안염, 다발성 내분비병증, 건선 등이 있다.
"면역 매개된 염증성 질병"이란 용어는 정상 면역 반응의 조절곤란으로부터 생성되거나, 이와 관련되거나 이에 의해 촉발되는 만성 또는 급성 염증을 특징으로 하는 임의의 질병, 예를 들어 크론병, 1형 당뇨병, 류머티스성 관절염, 염증성 장 질병, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 전신 홍반성 루프스, 하시모토병, 이식편 대 숙주병, 쇼그렌 증후군, 악성 빈혈, 애디슨병, 강피증, 굿패스쳐 증후군, 궤양성 대장염, 자가면역 용혈성 빈혈, 불임, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 바세도우씨병, 혈소판감소증 자반, 길랑-바레 증후군, 알러지, 천식, 아토피성 질병, 동맥경화증, 심근염, 심근증, 사구체 신염, 재생불량성빈혈, 및 기관이식 후 거부증을 의미하는 것으로 간주될 것이다.
"셀리악병"은 한편으로 복강 병, 복강 스프루, 비열대성 스프루, 풍토성 스프루, 글루텐 장질환 또는 글루텐-민감성 장질환, 및 글루텐 비내성(intolerance)이라 지칭된다.
본 원에 개시된 발명의 목적을 위해서, "면역 질환"은 자가면역 질병 및 면역학적으로 매개된 질병을 포함한다.
"염증성 질병"이란 용어는 대상에 있어서 염증, 예를 들어 만성 염증을 특징으로 하는 병을 지칭한다. 염증성 질환의 예시적인 비 제한적인 예로는 비 제한적으로 셀리악 병, 류머티스성 관절염(RA), 염증성 장 질병(IBD), 천식, 뇌염, 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD), 염증성 골용해, 알러지성 질환, 패혈성 쇼크, 폐 섬유증(예를 들어, 특발성 폐 섬유증), 염증성 혈관염(예를 들어, 결절성 다발성 동맥염, 베게너 육아종증, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염, 및 림프종양 육아종증), 외상 후 혈관 성형술(예를 들어, 혈관 성형술 후 재협착증), 미분화된 척추관절증, 미분화된 관절증, 관절염, 염증성 골용해, 만성 간염, 및 만성 바이러스 또는 세균성 감염으로부터 발생하는 만성 염증이 있다.
세포 집단에 적용되는 "단리된"이란 용어는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 상기 세포 집단과 관련된 하나 이상의 세포 집단이 실질적으로 없는, 인간 또는 동물 몸체로부터 단리된 세포 집단을 지칭한다. "MHC"(주 조직적합성 복합체)란 용어는 세포 표면 항원 제공 단백질을 암호화하는 유전자들의 부분집합을 지칭한다. 인간에서, 상기 유전자를 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자라 칭한다. 본 발명에서, 약어 MHC 또는 HLA는 호환적으로 사용된다. "대상"이란 용어는 동물, 바람직하게는 비-영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 또는 마우스) 및 영장류(예를 들어, 원숭이 또는 인간)를 포함한 포유동물을 지칭한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 대상은 인간이다.
"면역조절"이란 용어는 비 제한적으로 면역 반응 및 염증 상태의 하향 조절뿐만 아니라 사이토킨 프로파일, 세포독성 활성 및 항체 생산의 변화를 포함한 면역 체계의 하나 이상의 생물 활성의 억제 또는 감소를 지칭한다. "항원 특이적 면역조절"이란 용어는 동종 항원 및 자가 항원 모두를 포함한, 특정한 항원 또는 항원들과 관련된 면역 체계의 하나 이상의 생물 활성의 억제 또는 감소를 지칭한다. "면역조절"이란 용어는 "항원 특이적 면역조절"을 포함하는 것으로 간주될 것이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 세포 표면 마커에 대하여 사용된 "음성" 또는 "-"는 세포 집단에서 상기 세포의 20%, 10% 미만, 바람직하게는 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 상기 마커를 발현하거나 전혀 발현하지 않음을 의미하는 것으로 간주될 것이다. 세포 표면 마커의 발현은, 예를 들어 통상적인 방법 및 장치(예를 들어, 상업적으로 입수할 수 있는 항체 및 당해 분야에 공지된 표준 프로토콜과 함께 사용되는 벡크만 쿨터 에픽스(Beckman Coulter Epics) XL FACS 시스템)를 사용하여 특정한 세포 표면 마커에 대한 유식 세포측정에 의해 측정될 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "림프계"란 용어는 당해 분야의 통상적인 의미로 제공되며 림프관 및 림프 모세관의 통도 시스템에 의해 연결되는 림프 조직을 지칭한다. "림프 기관"이란 용어는 림프절, 가장 바람직하게는 액와부 또는 서혜부 림프절, 또는 림프절이 없거나 그의 결함이 있는 개인의 경우, 림프 조직 또는 면역 세포를 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "중간엽 줄기 세포"(또한 본 발명에서는 "MSC"라고도 칭함)는 원래는 중간엽으로부터 유래된, 다수의 상이한 유형의 세포를 생성시킬 수 있는 세포를 의미하는 것으로 간주될 것이다. 상기 용어는 조골세포, 연골세포, 지방세포 및 근육 세포 중 하나 이상으로 분화할 수 있는 세포를 지칭한다. MSC를 임의의 유형의 조직으로부터 단리할 수 있다. 일반적으로 MSC는 골수, 지방 조직, 탯줄 또는 말초 혈액으로부터 단리될 것이다. 본 발명에 사용되는 MSC는 일부 실시태양에서 골수(BM-MSC) 또는 지방 조직(ASC)으로부터 단리될 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양에서, MSC를 지방 조직으로부터 수득한 지방기질(lipoaspirate) 자체로부터 수득한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "현저한 발현" 또는 그의 등가 용어인 "양성" 및 "+"란 표현은 세포 표면 마커에 대해 사용될 때, 세포 집단에서 상기 세포의 20% 초과, 바람직하게는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 초과 또는 심지어 상기 세포 전체가 상기 마커를 발현함을 의미하는 것으로 간주될 것이다.
세포 표면 마커의 발현은, 예를 들어 통상적인 방법 및 장치(예를 들어, 상업적으로 입수할 수 있는 항체 및 당해 분야에 공지된 표준 프로토콜과 함께 사용되는 벡크만 쿨터 에픽스 XL FACS 시스템)를 사용하여 유식 세포측정 시 배경 신호 이상의 특정한 세포 표면 마커에 대한 신호를 나타내는 통상적인 방법 및 장치(예를 들어, 상업적으로 입수할 수 있는 항체 및 당해 분야에 공지된 표준 프로토콜과 함께 사용되는 벡크만 쿨터 에픽스 XL FACS 시스템)를 사용하는 특정한 세포 표면 마커에 대한 유식 세포측정에 의해 측정될 수 있다. 상기 배경 신호는 통상적인 FACS 분석에서 각각의 표면 마커를 검출하는데 사용되는 특이 항체와 동일한 아이소타입의 비-특이 항체에 의해 제공되는 신호 강도로서 정의된다. 양성으로 간주되는 마커의 경우, 상기 관찰되는 특정 신호는 통상적인 방법 및 장치(예를 들어, 상업적으로 입수할 수 있는 항체 및 당해 분야에 공지된 표준 프로토콜과 함께 사용되는 벡크만 쿨터 에픽스 XL FACS 시스템)를 사용하여 상기 배경 신호 강도보다 20% 초과, 바람직하게는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 500%, 1000%, 5000%, 10000% 초과, 또는 그 이상 더 강하다.
더욱 또한, 상기 세포-표면 마커(예를 들어, 세포 수용체 및 막통과 단백질)에 대한 상업적으로 입수할 수 있는 단클론 항체 및 공지된 단클론 항체를 사용하여 관련된 세포를 동정할 수 있다.
"결합 조직"이란 용어는 중간엽으로부터 유래된 조직을 지칭하며 세포가 세포 외 기질 내에 포함됨을 특징으로 하는 여러 조직을 포함한다. 결합 조직의 예로는 비 제한적으로 지방 및 연골 조직이 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "섬유아세포"란 용어는 활액 세포와 같은 섬유아세포를 포함하는 것으로 간주될 것이다.
"T-세포"란 용어는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 림프구의 부분집합인 면역 체계의 세포를 지칭한다. "조절성 T-세포"(또한 본 발명에서 T-조절 세포라 칭한다)란 용어는 상기 면역 체계의 활성화를 능동적으로 억제하고 병적인 자기-반응성, 즉 자가면역 질병을 방지하는 T 세포 부분집합을 지칭한다. "조절성 T-세포" 또는 "T-조절 세포"란 용어는 천연 t-세포(FoxP3+ T-조절 세포), 및 FoxP3 분자를 발현하지 않는 적응 T-세포(또한 Tr1 세포 또는 Th3 세포로서 공지됨) 모두를 포함하는 것으로 간주될 것이다.
"글루텐"이란 용어는 글리아딘 및 글루테닌 성분을 포함하는 단백질을 의미하는 것으로 간주될 것이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "치료하다", "치료" 및 "치료하는"이란 용어는 대상 또는 피실험자에 관하여 직접 사용될 때, 비 제한적으로 염증성 질환, 자가면역 질병, 또는 이식된 기관 및 조직의 거부를 포함한 면역학적으로 매개된 질병을 포함한 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 개선을 의미하는 것으로 간주될 것이며, 여기에서 상기 개선은 본 발명의 면역조절 세포, 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 상기 치료가 필요한 대상에게 투여함으로부터 생성된다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "회복" 및 "회복하는"이란 용어는 손상된 조직에 대해 직접 사용될 때, 손상된 조직의 재생과 같은 직접적인 기전에 의해서뿐만 아니라 간접적인 기전을 통해, 예를 들어 염증을 감소시켜 조직을 형성시킴에 의한 상기와 같은 손상의 개선을 의미하는 것으로 간주될 것이다.
"복합 요법"이란 용어는 비 제한적으로 염증성 질환, 자가면역 질병, 또는 이식된 기관 및 조직의 거부를 포함한 면역학적으로 매개된 질병을 포함한 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 개선을 위해, 본 발명의 방식으로 다른 활성제 또는 치료 양식과 함께 본 발명의 면역조절 세포 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 사용함을 지칭한다. 이들 다른 작용제 또는 치료제는 상기와 같은 질환의 치료에 대해 공지된 약물 및 요법, 예를 들어 비 제한적으로 코르티코스테로이드 및 비 스테로이드성 소염 화합물을 포함할 수도 있다.
본 발명의 면역조절 세포, 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 또한 다른 치료 양식들, 예를 들어 코르티코스테로이드, 비 스테로이드성 소염 화합물, 또는 염증 치료에 유용한 다른 작용제와 병용할 수 있다. 본 발명의 작용제와 상기 다른 요법 또는 치료 양식들과의 병용은 동시적이거나 연속적으로 제공될 수 있다, 즉 상기 두 치료제를, 상기 면역조절 세포 또는 이를 포함하는 약학 조성물이 다른 요법 또는 치료 양식 전에 또는 그 후에 제공될 수 있도록 분할할 수도 있다. 주치의는 상기 면역조절 세포 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 다른 작용제, 요법 또는 치료 양식들과 함께 투여하는 적합한 순서를 결정할 수 있다.
발명의 상세한 설명
하나의 태양에서, 본 발명은 치료가 필요한 대상에서 손상된 조직(바람직하게는 중간엽 조직)을 치료 또는 회복하고/하거나 염증 및/또는 면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 조절, 예방 및/또는 개선하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상의 림프계에 예방 또는 치료 효과량의, 세포 요법을 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다. 따라서, 추가의 태양에서, 본 발명은 손상된 조직(바람직하게는 중간엽 조직)을 치료 또는 회복하고/하거나 염증 및/또는 면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 조절, 예방 및/또는 개선하는데 사용하기 위한, 바람직하게는 면역조절 세포를 포함하는, 가장 바람직하게는 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포를 포함하는 세포 요법을 제공하며, 여기에서 상기 세포 요법을 림프계에 투여한다. 상기 림프 내 투여를 바람직하게는 림프 내 주사에 의해 수행한다. 상기 세포 요법은 림프 내 투여, 바람직하게는 림프 내 주사에 적합하다.
줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포의 림프계 내로의 직접적인 투여는 종래 기술, 즉 상기 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포의 통상적인 피하 주사보다 여러 가지 이점을 갖고, 예를 들어 보다 적은 양의 면역조절 세포로 충분하며; 상기 요법은 규칙적인 피하 주사보다 대상에게 더 고통스럽지 않고; 부작용이 더 적다. 더욱이, 상기 림프 조직에의 직접적인 적용에 의해, 예를 들어 결절 내 주사에 의해, 상기 면역조절 세포를 상기 손상된 조직의 치료 또는 회복 부위에 더 가깝게 전달한다.
면역조절 세포뿐만 아니라 이를 포함하는 약제 및 약학 조성물을 본 발명에 따라 림프 내 투여와 동시에, 피하 투여 또는 설하 투여, 경구, 경 피(국소 백신화), 피 내, 경막 내, 척수 내, 심실 내, 비 내, 결막, 기관지 내, 경 피, 직장 내, 복강 내, 근육 내, 폐 내, 질, 직장 또는 안 내와 같은 통상적인 경로에 의해 투여할 수도 있다.
본 발명에 따른 세포 요법은 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포를 포함하는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는 상기 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포(이후부터 MSC라 또한 지칭한다)이고, 가장 바람직하게는 지방 유래된 중간엽 줄기 세포(이후부터 ASC라 또한 지칭한다)이며, 이는 지방 조직, 일반적으로 인간 지방 조직(hASC)으로부터 기원하는 MSC이다.
본 발명에 사용된 섬유아세포는 세포 외 기질의 합성 및 유지와 관련된 중간엽 유래된 결합 조직이며 활액 세포와 같은 섬유아세포를 포함하는 것으로 간주될 것이다. 상기 섬유아세포를 임의의 적합한 동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 조절성 T-세포(때때로 억제인자 T-세포로서 공지됨)는 임의의 적합한 출처, 예를 들어 혈액 또는 비장으로부터 유래할 수도 있다. 상기 조절성 T-세포는 천연 CD4+Foxp3+ 세포이거나, 생체 외 단리된 및/또는 확대된 조절성 T-세포일 수도 있다. 조절성 T-세포의 생체 외 확대 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 전혈로부터의 단리(예를 들어, PBMC 분획의 일부로서)에 이어서, 예를 들어 중간엽 줄기 세포 또는 라파마이신을 사용한 확대를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용된 MSC는 바람직하게는 결합 조직으로부터 유래한다. 바람직한 실시태양에서 상기 MSC는 지방 조직으로부터 유래하며 추가의 바람직한 실시태양에서 상기 지방 조직의 기질 분획으로부터 유래한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 MSC는 유리질 연골의 연골세포로부터 수득된다. 추가의 실시태양에서, 상기 MSC는 피부로부터 수득된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 MSC는 골수로부터 수득된다.
상기 MSC는 임의의 적합한 동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 결합 조직의 임의의 적합한 출처로부터 수득될 수 있다. 상기 세포를 비병원성 포유동물 출처, 바람직하게는 출산 후(예를 들어, 설치류 또는 영장류) 출처로부터 수득한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 MSC는 결합 조직의 출처, 예를 들어 비 제한적으로 지방 조직의 기질 분획, 유리질 연골, 골수 또는 피부로부터 수득된다. 가장 바람직하게는 본 발명의 방법의 MSC는 비병원성의 출산 후 인간 기질 지방 조직으로부터 수득된다.
본 발명의 방법에 따라 투여되는 바와 같은 면역조절 세포의 의도하는 수용자에 대해서, 상술한 방법에 사용되는 MSC, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포는 동종 이계(공여자) 또는 자가 조직(대상) 기원의 것일 수 있다. 상기 방법의 하나의 실시태양에서, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포는 동종 이계 기원의 것이다. 상기 방법의 하나의 실시태양에서, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포는 자가 조직 기원의 것이다.
본 발명의 방법에 사용된 MSC, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포는 바람직하게는 (i) 이들 세포가 항원 제공 세포에 특이적인 마커를 발현하지 않고, (ii) 이들 세포가 IDO(인돌아민 2,3-다이옥시게나제)를 구성적으로 발현하지 않고, (iii) 이들 세포가 IFN-감마로 자극 시 IDO를 발현하고, MSC의 경우에 (iv) 이들 세포가 2 개 이상의 세포 계통으로 분화되는 능력을 제공함을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포는 바람직하게는 주사에 적합한 생리학적으로 허용 가능한 담체 중에서 전달된다. 일반적으로, 사용이 공지된 임의의 생리학적으로 허용 가능한 담체를 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 상기와 같은 담체의 선택은 비 제한적으로 링거액, 물, 표준 염수 용액, 덱스트로스 용액 및 알부민 수를 포함하며, 상기 선택은 당해 분야의 기술 내에서 용이하다.
선택적으로, 상기 림프계 또는 그의 일부, 예를 들어 림프관 또는 림프 기관의 국소화된 영역, 바람직하게는 림프절을 상기 주사 과정 동안 가시화할 수 있다. 초음파, 방사선 또는 다른 가시화 수단, 예를 들어 컴퓨터 단층 촬영(CAT 스캔)을 사용하여 상기 림프절을 가시화하고 상기 바늘의 위치 및 상기 림프절의 변화, 예를 들어 팽창을 모니터링할 수 있다. 액와부 및 서혜부 림프절 내로의 주사가 초음파 유도되는 위치 및 주사의 용이성으로 인해 바람직하다.
주사에 사용되는 기법은 당해 분야의 기술 내에 있다. 한 가지 방법은 액체 제형 중에 상기 세포를 함유하는 단일 챔버 주사기를 사용하는 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 치료가 필요한 대상에서 손상된 조직(바람직하게는 중간엽 조직)을 치료 또는 회복하고/하거나 염증 및/또는 면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 조절, 예방 및/또는 개선하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상의 림프계에 예방 또는 치료 효과량의, 세포 요법(가장 바람직하게는 MSC, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포를 포함한다)을 포함하는 조성물을 투여함을 포함하고, 추가로 상기 대상의 림프계에 직접 항원을 투여함을 포함한다. 상기 항원을 상기 세포 요법의 투여 전 또는 후 또는 투여와 동시에 투여할 수 있다. 상기 항원을 상기 세포 요법 투여의 1, 2, 3, 5 또는 10 시간 이상 전 또는 후에 투여할 수 있다.
상기 방법에 사용되는 항원은 선택된 항원, 항원들의 군, 또는 상기 항원 또는 항원들을 발현하고/하거나 제공하는 세포 유형일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원을 자가면역으로 고통받는 대상으로부터 유래된 자가 항원, 펩타이드 항원, 핵산, 변경된 펩타이드 리간드, 재조합 단백질 또는 그의 단편의 혼합물을 포함하는 군 중에서 선택한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원은 관절염과 관련이 있다(예를 들어, 비 제한적으로 콜라겐 항원). 또 다른 실시태양에서 상기 항원은 셀리악 병과 관련이 있다. 셀리악 병과 관련된 항원은 일부 형태의 프롤아민을 포함한 글루텐 군의 구성원이다(예를 들어, 비 제한적으로 글리아딘, 호르데인 및/또는 세칼린의 항원). 추가의 실시태양에서, 상기 항원은 다발성 경화증과 관련이 있다(예를 들어, 비 제한적으로 미엘린 항원). 상기와 같은 항원의 단리, 정제 및 제조 방법들은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
본 발명의 모든 태양의 세포 요법을 림프 기관, 가장 바람직하게는 말초 림프 기관, 예를 들어 비 제한적으로 림프절, 가장 바람직하게는 액와부 또는 서혜부 림프절에 직접 투여하는 것이 특히 바람직하다. 림프절이 없거나 림프절의 결함이 있는 개인에 있어서, 상기 세포 요법을 림프 조직이나 면역 세포에 전달할 수도 있다.
림프 내 투여 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 주사 장치(예를 들어, 주사기)에 의해 통상적으로 수행된다. 화상 장치, 예를 들어 비 제한적으로 방사선, 초음파 및 컴퓨터 단층 촬영(CAT 스캔)에 의해 상기 투여를 돕고 관찰할 수 있다. 이는 상기 세포 요법의 정확한 투여를 허용하며 또한 상기 림프 기관을 부작용에 대해 모니터링할 수 있게 한다. 상기 방법의 한 태양에서, 상기 대상을 수 회 용량의 림프 내로 투여된 세포 요법으로 치료한다. 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 10 또는 15 회 이상의 용량 간격으로 투여한다. 상기 방법의 추가의 태양에서 상기 각각의 용량은 10,000 내지 5,000,000 개의 세포를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 각각의 용량은 10,000 내지 100,000 개의 세포; 100,000 내지 500,000 개의 세포; 500,000 내지 1,000,000 개의 세포 또는 1,000,000 내지 5,000,000 개의 세포를 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 상기 림프계에의 투여를 위한 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상기 림프계 내로의 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포의 투여에 의해, 손상된 조직(바람직하게는 중간엽 조직)을 치료 또는 회복하고/하거나 염증 및/또는 면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 조절, 예방 및/또는 개선하기 위한 약제로서의 상기 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양은 상기 림프계 내로의 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포의 투여에 의해, 손상된 조직(바람직하게는 중간엽 조직)을 치료 또는 회복하고/하거나 염증 및/또는 면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 조절, 예방 및/또는 개선하기 위한 약제의 제조에 있어서 상기 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포의 용도를 제공한다.
추가의 태양에서 본 발명은 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포를 포함하는, 림프계에의 투여를 위한 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 손상된 조직, 또는 염증 및/또는 면역 질환, 예를 들어 비 제한적으로 자가면역 질병, 염증성 질환, 및 이식된 기관 및 조직의 거부를 포함한 면역학적으로 매개된 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 회복, 예방 및/또는 개선하는데 유용하다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 항원, 항원들의 군, 또는 상기 항원 또는 항원들을 발현하고/하거나 제공하는 세포 유형을 추가로 포함할 수도 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원은 자가면역으로 고통받는 대상으로부터 유래된 자가 항원, 펩타이드 항원, 핵산, 변경된 펩타이드 리간드, 재조합 단백질 또는 그의 단편의 혼합물을 포함하는 군 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원은 관절염과 관련이 있다(예를 들어, 비 제한적으로 콜라겐 항원). 또 다른 실시태양에서 상기 항원은 셀리악 병과 관련이 있다. 셀리악 병과 관련된 항원은 일부 형태의 프롤아민을 포함한 글루텐 군의 구성원이다(예를 들어, 비 제한적으로 글리아딘, 호르데인 및/또는 세칼린의 항원). 글루텐 및 그의 성분, 글루타닌 및 글리아딘은 셀리악 병과 관련된 바람직한 항원이다. 추가의 실시태양에서, 상기 항원은 다발성 경화증과 관련되며, 예를 들어 비 제한적으로 미엘린 항원 및 미엘린 성분 항원, 예를 들어 미엘린 염기성 단백질(MBP), 미엘린 희돌기교세포 당단백질(MOG), 단백지질 단백질(PLP) 및 미엘린 당지질, 예를 들어 갈락토세레브로사이드가 있다. 상기와 같은 항원의 단리, 정제 및 제조 방법들은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 예방 또는 치료 효과량의 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포, 선택적으로 항원 및 약학 담체를 포함한다. 이들 세포 유형 각각에 대한 투여량 및 투여 섭생의 예는 상기에 제공되어 있다. 적합한 약학 담체는 당해 분야에 공지되어 있으며 바람직하게는 동물, 보다 특히 인간에의 사용에 대해 미국 연방 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인된 것들 또는 미국 약전 또는 유럽 약전, 또는 다른 일반적으로 승인된 약전에 나열된 것들이다. "담체"란 용어는 상기 치료제와 함께 투여되는 희석제, 항원보강제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 상기 조성물은, 경우에 따라, 소량의 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 적합한 약학 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", E W Martin]에 개시되어 있다. 상기와 같은 조성물은 바람직하게는 정제된 형태로 예방 또는 치료 효과량의 예방제 또는 치료제를, 대상에게 적합한 투여형을 제공하기에 적합한 양의 담체와 함께 함유할 것이다. 상기 제형은 투여 방식에 적합해야 한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 멸균성이며 대상, 바람직하게는 동물 대상, 보다 바람직하게는 포유동물 대상, 가장 바람직하게는 인간 대상에게 투여하기에 적합한 형태이다.
본 발명의 약학 조성물은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이러한 형태로는, 예를 들어 반 고체, 및 액체 투여형, 예를 들어 동결건조된 제제, 액체 용액 또는 현탁액, 주사용 및 주입용 용액 등이 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 상기 약학 조성물은 바람직하게는 주사 가능하다.
본 발명의 방법, 약제, 조성물 및 세포를, 손상된 조직(바람직하게는 중간엽 조직)을 치료 또는 회복하고/하거나 염증 및/또는 면역 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 조절, 예방 및/또는 개선하기 위해 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 방법 및 세포는 상기 증상 중 어느 하나 또는 전부를 특징으로 하는 임의의 질환의 치료에 유용하다. 상기와 같은 질환의 전형적인 총 망라되지 않은 목록을 상기 정의 섹션에 제공하고 있다. 면역 매개된 염증성 질병의 치료에 있어서 본 발명의 방법, 약제, 조성물 및 세포의 용도가 특히 바람직하다. 당뇨병, 류머티스성 관절염(RA), 염증성 장 질병(IBD, 크론병 및/또는 궤양성 대장염 포함), 및 다발성 경화증(MS)의 치료에 있어서 본 발명의 방법, 약제, 조성물 및 세포의 용도가 더욱 바람직하다. 류머티스성 관절염의 치료에 있어서 본 발명의 방법, 약제, 조성물 및 세포의 용도가 훨씬 더 특히 바람직하다.
본 발명의 방법 또는 조성물이 하나 이상의 항원을 포함한다는 점에서 상기 방법 또는 조성물을 상기 항원과 관련되거나 상기 항원에 의해 유발되는 질환의 치료에 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들어 상기 항원이 콜라겐이라는 점에서 상기 방법 또는 조성물을 관절염의 치료에 사용할 수 있으며, 상기 항원이 글루텐 성분이라는 점에서 상기 방법 또는 조성물을 셀리악 병의 치료에 사용할 수 있고, 상기 항원이 미엘린 성분이라는 점에서 상기 방법 또는 조성물을 다발성 경화증의 치료에 사용할 수 있다. 따라서, 바람직한 조성물은 관절염의 치료를 위해서 MSC, 바람직하게는 ASC, 및 콜라겐; 셀리악 병의 치료를 위해서 MSC, 바람직하게는 ASC, 및 글루텐 및/또는 글루텐 성분; 다발성 경화증의 치료를 위해서 MSC, 바람직하게는 ASC, 및 미엘린 및/또는 미엘린 성분을 포함한다.
추가의 태양에서 본 발명은 (i) 줄기 세포, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포 집단을 포함하는 약제, 및 (ii) 본 발명의 방법에 따른 그의 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
추가의 실시태양에서 상기 키트는 (iii) 하나 이상의 항원을 추가로 포함할 수도 있다.
MSC 표현형 마커
본 발명의 바람직한 방법에 사용되는 MSC는 바람직하게는 APC(항원 제공 세포) 표현형과 관련된 마커에 대해서 음성이다. 따라서, 상기 MSC는 하기의 마커들 중 하나, 둘, 셋, 넷 이상 또는 바람직하게는 전부에 대해 음성인 것이 바람직하다: CD 11b; CD 11c; CD14; CD45; HLAII. 더욱 또한, 상기 MSC는 바람직하게는 하기의 세포 표면 마커들 중 하나, 둘 이상, 또는 바람직하게는 전부에 대해서 음성이다: CD31; CD34; CD133.
특정한 실시태양에서, 본 발명의 방법에 사용된 바와 같은 MSC는 바람직하게는 상기 MSC가 하기의 표면 마커 CD9, CD44, CD54, CD90 및 CD105 중 하나, 둘, 셋, 넷 이상 또는 바람직하게는 전부를 발현함(즉, 이들에 대해 양성임)을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 MSC는 상기 MSC가 하기의 표면 마커 CD9, CD44, CD54, CD90 및 CD105 중 하나, 둘, 셋, 넷 이상 및 바람직하게는 전부의 현저한 발현 수준을 가짐을 특징으로 한다.
선택적으로, 상기 MSC는 또한 세포 표면 마커 CD 106(VCAM-1)에 대해서 음성일 수도 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 MSC의 예는 당해 분야, 예를 들어 WO2007/039150(본 발명에 내용 전체가 참고로 인용된다)에 개시되어 있다.
분화
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 MSC는 바람직하게는 다분화능 또는 분화다능 줄기 세포이며, 증식하고 2 개 이상, 보다 바람직하게는 3, 4, 5, 6, 7 개 또는 그 이상의 세포 계통으로 분화될 수 있는 능력을 나타낼 수도 있다. 상기 MSC가 분화될 수 있는 세포 계통의 예시적인 비 제한적인 예는 뼈세포, 지방세포, 연골세포, 건세포, 근육 세포, 심근 세포, 조혈-지지 기질 세포, 내피 세포, 신경세포, 성상 세포 및 간세포를 포함한다. MSC는 통상적인 방법에 의해 증식하고 다른 계통의 세포로 분화될 수 있다. 분화된 세포를 미분화된 대응물로부터 식별하고 후속적으로 단리하는 방법을 또한 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다.
MSC 단리
MSC의 단리 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, ASC의 단리는 하기의 단계들을 포함할 수 있다:
(i) 지방세포의 샘플로부터 세포 현탁액을 제조하는 단계;
(ii) 상기 세포 현탁액으로부터 상기 세포를 회수하는 단계;
(iii) 상기 세포를 세포가 고체 표면에 부착하고 증식하도록 하는 조건 하에서 상기 고체 표면상의 적합한 세포 배양 배지에서 배양하는 단계;
(iv) 배양 후 상기 고체 표면을 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하는 단계;
(v) 상기와 같은 배지에서 2 회 이상 계대 배양시킨 후에 상기 고체 표면에 부착된 채로 유지되는 세포를 선택하는 단계; 및
(vi) 상기 선택된 세포 집단이 관심 표현형을 나타내는지를 확인하는 단계.
본 발명에 사용된 바와 같이, "고체 표면"이란 용어는 상기 ASC가 부착할 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 특정 실시태양에서, 상기 물질은 포유동물 세포의 상기 표면에의 부착을 촉진하도록 처리된 플라스틱 물질, 예를 들어 폴리-D-리신 또는 다른 시약으로 선택적으로 코팅된 상업적으로 입수할 수 있는 폴리스타이렌 플레이트이다.
단계 (i) 내지 (vi)를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 기법에 의해 수행할 수 있다. 간단히, 상기 ASC를 상술한 바와 같이 임의의 적합한 동물로부터의 임의의 적합한 결합 조직의 출처로부터 통상적인 수단에 의해 수득할 수 있다. 전형적으로는, 인간 지방세포를 잘 인식된 프로토콜, 예를 들어 수술 또는 지방흡입술을 사용하여 살아있는 공여자로부터 수득한다. 실제로, 지방흡입술은 매우 통상적이므로, 지방흡입 유출물은 상기 ASC가 유래될 수 있는 특히 바람직한 촐처이다. 따라서, 특정 실시태양에서, 상기 ASC는 지방흡입에 의해 수득된 인간 지방조직의 기질 분획으로부터의 것이다.
상기 조직을 바람직하게는, 상기 ASC를 상기 물질의 나머지로부터 분리하기 위해 처리하기 전에 세척한다. 하나의 통상적으로 사용되는 프로토콜에서, 상기 조직의 샘플을 생리학적으로 적합한 염수 용액(예를 들어, 포스페이트 완충된 염수(PBS))으로 세척하고 이어서 격렬하게 교반하고 방치하여 침전시키며, 이는 느슨한 물질(예를 들어, 손상된 조직, 혈액, 적혈구 등)을 상기 조직으로부터 제거하는 단계이다. 따라서, 상기 세척 및 침전 단계를 일반적으로는 상기 상등액이 찌꺼기 없이 비교적 등명해질 때까지 반복한다. 상기 남아있는 세포는 일반적으로 다양한 크기의 덩어리들로 존재할 것이며 상기 프로토콜은, 상기 세포 자체에 대한 손상은 최소화하면서 총체적인 구조를 열화시키도록 맞춘 단계를 사용하여 진행한다. 상기 목적을 성취하는 한 가지 방법은 상기 세척된 세포 덩어리를, 세포 간의 결합을 약화하거나 파괴하는 효소(예를 들어, 콜라게나제, 디스파제, 트립신 등)로 처리하는 것이다. 상기와 같은 효소 처리의 양 및 지속기간은 상기 사용되는 조건에 따라 다양할 것이나, 상기와 같은 효소의 사용은 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 한편으로 또는 상기와 같은 효소 처리와 함께, 상기 세포의 덩어리를 다른 처리, 예를 들어 기계적 교반, 음파 에너지, 열 에너지 등을 사용하여 열화시킬 수 있다. 열화를 효소적인 방법에 의해 수행하는 경우, 상기 효소를 적합한 기간에 이어서 중화시켜 상기 세포에 대한 유해 영향을 최소화하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 열화 단계는 전형적으로는 응집된 세포의 슬러리 또는 현탁액 및 일반적으로 유리된 기질 세포(예를 들어, 적혈구, 평활근 세포, 내피 세포, 섬유아세포 및 줄기 세포)를 함유하는 유동성 분획을 생성시킨다. 상기 분리 과정의 다음 단계는 상기 응집된 세포를 상기 ASC로부터 분리시키는 것이다. 이를 원심분리에 의해 수행할 수 있으며, 상기 원심분리는 상기 세포를 상등액에 의해 덮여있는 펠릿 내로 강제로 밀어넣는다. 이어서 상기 상등액을 버리고 상기 펠릿을 생리학적으로 적합한 유체에 현탁시킬 수 있다. 더욱이, 상기 현탁된 세포는 전형적으로는 적혈구를 포함하며, 대부분의 프로토콜에서 상기 적혈구를 용해시키는 것이 바람직하다. 적혈구를 선택적으로 용해시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 임의의 적합한 프로토콜을 사용할 수 있다(예를 들어, 고장성 또는 저장성 배지에서의 배양, 염화 암모늄을 사용한 용해 등에 의해서). 물론, 상기 적혈구가 용해되는 경우, 나머지 세포를, 예를 들어 여과, 침전, 또는 밀도 분별에 의해 상기 용해물로부터 분리시켜야 한다.
상기 적혈구가 용해되는 지의 여부와 관계없이, 상기 현탁된 세포를 세척하고, 원심분리하고, 1 회 이상 연속해서 재현탁시켜 보다 큰 순도를 성취할 수 있다. 한편으로, 상기 세포를 세포 표면 마커 프로파일을 근거로 또는 세포 크기 및 입도를 근거로 분리시킬 수 있다.
최종 단리 및 재현탁에 이어서, 상기 세포를 배양하고 경우에 따라 수 및 생육력을 분석하여 수율을 평가할 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포를 분화 없이 고체 표면상에서 적합한 세포 배양 배지를 사용하여 적합한 세포 밀도 및 배양 조건으로 배양할 것이다. 따라서, 특정 실시태양에서, 세포를 분화 없이, 대개는 플라스틱 물질로 제조된 고체 표면, 예를 들어 페트리 디쉬 또는 세포 배양 플라스크 상에서 적합한 세포 배양 배지[예를 들어, 전형적으로는 5 내지 15%(예를 들어, 10%)의 적합한 혈청, 예를 들어 소 태아 혈청 또는 인간 혈청이 보충된 DMEM]의 존재 하에서 배양하고, 세포가 상기 고체 표면에 부착하고 증식되게 하는 조건 하에서 배양한다. 배양 후, 세포를 부착되지 않은 세포 및 세포 단편의 제거를 위해 세척한다. 상기 세포를 동일한 배지 중에서 및 동일한 조건 하에서 상기 세포가 적합한 융합률, 전형적으로는 약 70%, 약 80% 또는 약 90%의 세포 융합률에 도달할 때까지, 필요에 따라 상기 세포 배양 배지를 교체하면서 배양물 중에서 유지시킨다. 목적하는 세포 융합률에 도달한 후에, 상기 세포를 탈착제, 예를 들어 트립신을 사용하고 새로운 세포 배양 표면상에 적합한 세포 밀도(대개는 2,000 내지 10,000 세포/㎠)로 시딩하여 연속적인 계대 배양에 의해 확대시킬 수 있다. 따라서, 세포를, 여전히 그의 발생적 표현형을 유지시키면서, 분화 없이 상기와 같은 배지에서 2 회 이상 계대 배양하고, 보다 바람직하게는, 상기 세포를 발생적 표현형의 상실 없이 10 회 이상(예를 들어, 15 회 이상 또는 심지어 20 회 이상) 계대 배양할 수 있다. 전형적으로는, 상기 세포를 목적하는 밀도, 예를 들어 약 100 세포/㎠ 내지 약 100,000 세포/㎠(예를 들어, 약 500 세포/㎠ 내지 약 50,000 세포/㎠, 보다 특히 약 1,000 세포/㎠ 내지 약 20,000 세포/㎠)로 도말한다. 보다 낮은 밀도(예를 들어, 약 300 세포/㎠)로 도말하는 경우, 상기 세포는 보다 쉽게 클론 단리될 수 있다. 예를 들어, 수일 후에, 상기와 같은 밀도로 도말된 세포는 동종 집단으로 증식할 것이다. 특정 실시태양에서, 상기 세포 밀도는 2,000 내지 10,000 세포/㎠이다.
2 회 이상의 계대 배양을 포함하는 상기와 같은 처리 후에 상기 고체 표면에 부착된 채로 있는 세포를 선택하고, 하기에 언급하는 바와 같이 상기 ASC의 정체를 확인하기 위해서 관심 표현형을 통상적인 방법에 의해 분석한다. 상기 첫 번째 계대 배양 후 상기 고체 표면에 부착된 채로 있는 세포는 이종 기원으로부터의 것이며; 따라서, 상기 세포에 적어도 또 다른 계대 배양을 가해야 한다. 상기 방법의 결과로서, 상기 관심 표현형을 갖는 동종의 세포 집단이 수득된다. 2 회 이상의 계대 배양 후 상기 고체 표면에 대한 세포의 부착은 상기 ASC를 선택하기 위한 본 발명의 바람직한 실시태양을 구성한다. 상기 관심 표현형의 확인을 통상적인 수단을 사용하여 수행할 수 있다.
바람직하게는 상기 확대를 1 회 이상, 2 회 이상, 3 회 이상, 4 회 이상, 5 회 이상, 10 회 이상, 15 회 이상, 또는 20 회 이상의 상기 집단의 중복 또는 3회 중복에 의해 수행한다. 추가의 실시태양에서, 상기 확대를 1 회 이상, 2 회 이상, 3 회 이상, 4 회 이상, 5 회 이상, 10 회 이상, 15 회 이상, 또는 20 회 이상의 계대 배양에 걸쳐 수행한다.
세포 표면 마커를 대개는 양성/음성 선택에 근거한 임의의 적합한 통상적인 기법에 의해 동정할 수 있고; 예를 들어 상기 세포 중의 존재/부재를 확인하고자 하는 세포 표면 마커에 대한 단클론 항체를 사용할 수 있지만; 다른 기법을 또한 사용할 수 있다. 따라서, 특정 실시태양에서, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34 및 CD133 중 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱 또는 바람직하게는 전부에 대한 단클론 항체를 상기 선택된 세포 중의 상기 마커의 부재의 확인을 위해 사용하며; CD9, CD44, CD54, CD90 및 CD105 중 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 전부에 대한 단클론 항체를, 상기 마커들 중 하나 이상, 바람직하게는 전부의 존재 또는 검출 가능한 발현 수준을 확인하기 위해 사용한다. 상기 단클론 항체는 공지되어 있거나, 상업적으로 입수할 수 있거나, 통상적인 방법에 의해 당해 분야의 숙련가에 의해 수득될 수 있다.
상기 선택된 세포 중의 IFN-γ 유도성 IDO 활성을 임의의 적합한 통상적인 분석에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택된 세포를 IFN-γ로 자극하고 IDO 발현에 대해 분석할 수 있으며; 이어서 IDO 단백질 발현에 대한 통상적인 웨스턴-블럿 분석을 수행하고 상기 선택된 세포의 IFN-γ 자극에 따른 IDO 효소 활성을, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석 및 판독으로서 상기 상등액 중의 키누레닌 농도의 광도측정을 통한 트립토판에서 키누레닌으로의 전환에 의해서 측정할 수 있다. 몇몇 조건 하에서 상기 ASC는 IDO를 발현하므로 IFN-γ 자극에 따른 IDO 활성의 검출을 허용하는 임의의 적합한 기법을 상기 ASC의 선택에 사용할 수도 있다. 생성되는 IDO의 양은 제곱 센티미터당 세포의 수(바람직하게는 5000 세포/㎠ 이상의 수준이나 상기 농도로 제한되지 않는다) 및 IFN-감마의 농도(이상적으로는 3 ng/㎖ 이상이나 상기 농도로 제한되지 않는다)에 따라 변한다. 상기 개시된 조건 하에서 생성되는 IDO의 활성은 24 시간 이상 후 마이크로 M 범위로 키누레닌을 검출 가능하게 생성시킬 것이다.
2 개 이상의 세포 계통으로 분화하는 상기 선택된 세포의 능력을 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 분석할 수 있다.
ASC를 경우에 따라 적합한 세포 집단 클로닝 방법을 사용하여 클론에 의해 확대시킬 수 있다. 예를 들어, 증식된 세포 집단을 물리적으로 채집하고 별도의 표면(또는 다중 웰 플레이트의 웰)에 시딩할 수 있다. 한편으로, 상기 세포를, 다중 웰 플레이트 상에 각 웰로의 단일 세포의 도말을 촉진하기 위한 통계학적 비로(예를 들여, 약 0.1 내지 약 1 세포/웰, 심지어 약 0.25 내지 약 0.5 세포/웰, 예를 들어 0.5 세포/웰) 서브 클로닝할 수 있다. 물론, 상기 세포를 저밀도로 도말하고(예를 들어, 페트리 디쉬 또는 다른 적합한 기재 중에) 이를 클로닝 고리와 같은 장치를 사용하여 다른 세포로부터 단리함으로써 클로닝할 수 있다. 상기 클론 집단의 생산을 임의의 적합한 배양 배지 중에서 확대시킬 수 있다. 어쨌든, 상기 단리된 세포를 그의 발생적 표현형을 평가할 수 있는 적합한 시점으로 배양할 수 있다.
분화의 유도 없이 상기 ASC의 생체 외 확대를, 예를 들어 특수하게 선별된 로트의 적합한 혈청(예를 들어, 소 태아 혈청 또는 인간 혈청)을 사용하여 연장된 기간 동안 수행할 수 있다. 생육력 및 수율의 측정 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 트립판 블루 축출).
본 발명의 세포 집단의 세포를 단리하기 위한 단계 및 과정 중 임의의 단계 및 과정을 경우에 따라 수동으로 수행할 수 있다. 한편으로, 상기와 같은 세포의 단리 공정을 하나 이상의 적합한 장치(그의 예는 당해 분야에 공지되어 있다)를 통해 촉진하고/하거나 자동화할 수 있다.
MSC 세포 배양물
상기 MSC는 또한 생체 외에서 확대될 수 있다. 즉, 단리 후에, 상기 MSC를 유지시키고 모든 배양 배지 중에서 생체 외 증식되게 할 수 있다. 상기와 같은 배지는, 예를 들어 항생제(예를 들어, 100 단위/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신)가 있거나 항생제가 없는 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 및 2 mM 글루타민으로 구성되고, 2 내지 20% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된다. 상기 사용된 세포에 대해 필요에 따라 배지 및/또는 배지 보충물의 농도를 변경하거나 조절하는 것은 당해 분야의 기술 내에 있다. 혈청은 종종 생육력 및 확대에 필요한 세포 및 비 세포 인자 및 성분들을 함유한다. 혈청의 예는 소 태아 혈청(FBS), 소 혈청(BS), 송아지 혈청(CS), 송아지 태아 혈청(FCS), 갓난 송아지 혈청(NCS), 염소 혈청(GS), 말 혈청(HS), 돼지 혈청, 양 혈청, 토끼 혈청, 래트 혈청(RS) 등을 포함한다. 상기 MSC가 인간 기원의 것인 경우, 상기 세포 배양 배지에 인간 혈청, 바람직하게는 자기 조직 기원의 것을 보충하는 것은 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 보체 캐스케이드의 성분들을 불활성화하는 것이 필요한 것으로 보이는 경우 상기 혈청을 55 내지 65 ℃에서 열-불활성화시킬 수 있음은 물론이다. 혈청 농도의 조절 및/또는 상기 배양 배지로부터 혈청의 회수를 또한 하나 이상의 목적하는 세포 유형의 생존을 증진하기 위해 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 MSC는 약 2% 내지 약 25%의 FBS 농도가 유리할 것이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 MSC를 한정된 조성의 세포 배양 배지에서 확대시킬 수 있으며, 여기에서 상기 혈청을 당해 분야에 공지된 바와 같은 혈청 알부민, 혈청 트랜스페린, 셀레늄, 및 비 제한적으로 인슐린, 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF) 및 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함한 재조합 단백질의 조합에 의해 대체한다.
다수의 세포 배양 배지는 이미 아미노산을 함유하나, 일부는 세포의 배양 전에 보충을 필요로 한다. 상기와 같은 아미노산으로는 비 제한적으로 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파트산, L-아스파라진, L-시스테인, L-시스틴, L-글루탐산, L-글루타민, L-글리신 등이 있다.
항균제가 또한 세균, 마이코플라스마, 및 진균 오염을 경감시키기 위해 세포 배양물에 전형적으로 사용된다. 전형적으로, 사용되는 항생제 또는 항진균 화합물은 페니실린/스트렙토마이신의 혼합물이나, 또한 비 제한적으로 암포테리신(펀지존(Fungizone(R)), 암피실린, 젠타마이신, 블레오마이신, 하이그로마이신, 가나마이신, 마이토마이신 등을 포함할 수 있다.
호르몬이 또한 세포 배양물에 유리하게 사용될 수 있으며, 비 제한적으로 D-알돌스테론, 다이에틸스틸베스트롤(DES), 덱사메타손, b-에스트라디올, 하이드로코르티손, 인슐린, 프로락틴, 프로제스테론, 소마토스타틴/인간 성장 호르몬(HGH) 등을 포함한다.
확대된 세포
하나의 실시태양에서, 상기 MSC, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포는 본 발명의 방법에 사용하기 전에 확대되었을 수도 있다. 세포 확대 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
유전자 조작된 세포
또 다른 실시태양에서, 상기 MSC, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포는 유전자 조작된 세포(예를 들어, 외래 핵산에 의해 형질도입되거나 형질감염된)이거나, 이로부터 유도될 수 있다.
예를 들어, 상기 세포를, 인돌아민 2,3-다이옥시게나제(IDO)를 구성적으로 발현하도록, 예를 들어 상기 효소를 암호화하는 적합한 핵산 구조물 및 선택적으로 적합한 프로모터 서열로 형질감염시킴으로써 유전자 조작할 수도 있다. 세포의 유전자 조작은 당해 분야에 공지되어 있으며 당해 분야의 숙련가에 의해 수행될 수도 있다.
조사된(irradiated) 세포
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 MSC, 조절성 T-세포 및/또는 섬유아세포는 본 발명의 방법에 사용되기 전에 조사되었을 수도 있다. 세포의 조사는 그의 증식 능력 및 생존 시간을 감소시킨다.
상기 조사를 적합한 조절된 이온화 조사원, 예를 들어 감마선 조사 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 조사 조건은 상기 MSC, 조절성 T 세포 및/또는 섬유아세포의 장기적인 생육 정지를 유발하는 조사 용량을 부여하는데 필요한 노출 시간을 측정하기 위해 당해 분야의 숙련가에 의해 실험적으로 조절되어야 한다. 하나의 실시태양에서, 상기 조사 용량은 1 내지 100 Gy; 5 내지 85 Gy, 10 내지 70 Gy, 12 내지 60 Gy로 이루어진 군 중에서 선택된 범위 이내이나, 상기 조사 용량은 15 내지 45 Gy의 범위 이내인 것이 특히 바람직하다.
CD26 길항물질 처리된 세포
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 MSC, 조절성 T 세포 및/또는 섬유아세포를 본 발명의 방법에 사용하기 전에 CD26 길항물질 또는 억제제로 처리할 수도 있다. CD26 길항물질 및 억제제는 당해 분야에 공지되어 있으며 비 제한적으로 아미노메틸피리딘; P32/98; NVP DPP728; PSN9301; 아이소류신 티아졸리딘; 데나글리프틴; 시타글리프틴; 빌다글리프틴; 삭사글리프틴; 알로글리프틴; 디프로틴 A를 포함하고; 상기와 같은 처리를 당해 분야의 숙련가에 의해 수행할 수 있다.
IFN-감마 자극된 세포
또 다른 실시태양에서, 상기 MSC, 조절성 T 세포 및/또는 섬유아세포를 본 발명의 방법에 사용하기 전에 인터페론 감마로 자극할 수도 있다. MSC의 자극을 위한 상기 MSC의 IFN-감마 처리는 당해 분야에 공지되어 있으며 당해 분야의 숙련가에 의해 수행될 수 있다.
항원 자극된 세포
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 MSC, 조절성 T 세포 및/또는 섬유아세포를 본 발명의 방법에 사용하기 전에 인터페론 항원으로 자극할 수도 있다. MSC의 자극을 위한 상기 MSC의 항원 처리는 당해 분야에 공지되어 있으며 당해 분야의 숙련가에 의해 수행될 수 있다.
마이토마이신 C 생산된 MSC
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 MSC, 조절성 T 세포 및/또는 섬유아세포를 본 발명의 방법에 사용하기 전에 마이토마이신 C로 처리할 수도 있다. MSC의 마이토마이신 C 처리는 당해 분야에 공지되어 있으며 당해 분야의 숙련가에 의해 수행될 수 있다.
더욱 또한, 경우에 따라, 상기 MSC, 조절성 T 세포 및/또는 섬유아세포를 본 발명의 방법에 사용하기 전에 상기 세포에 조사, IFN-감마 자극 및 마이토마이신 C 처리로 이루어진 군 중에서 선택된 처리 중 2 개 또는 3 개의 조합을 가할 수 있다.
상기 MSC의 유지 조건은 세포를 미분화된 형태로 남아있게 하는 세포 인자들을 또한 함유할 수 있다. 분화 전에, 세포 분화를 억제하는 보충물을 상기 배양 배지로부터 제거해야 함은 당해 분야의 숙련가들에게 자명하다. 모든 세포가 상기 인자들을 필요로 하는 것은 아님도 또한 자명하다. 실제로, 상기 인자들은 세포 유형에 따라 불필요한 효과들을 이끌어낼 수도 있다.
본 발명의 특징 및 이점들은 하기의 비 제한적인 실시예에 의해 보다 충분히 예시될 것이며, 여기에서 모든 부 및 퍼센트는 달리 나타내지 않는 한 중량 기준이다.
실시예 1 : ACS에 의한 콜라겐 유발된 관절염(CIA)의 치료
물질 및 방법
콜라겐 유발된 관절염( CIA ) 마우스 모델
DBA1/(H-2q) 수컷 마우스(6 내지 8 주 된 것)에서 실험적인 관절염을 유도하였다. 상기 연구의 개시일에, 각 마우스의 꼬리(몸으로부터 2 내지 3 ㎝)에, 완전 프로인트 항원보강제(마이코박테리움 튜베르큘로시스 1 ㎎/㎖ 최종 농도)(CFA) 중의 병아리 유형 II 콜라겐(CII)(1 ㎎/㎖ 최종 농도) 현탁액의 제 1 용량을 0.1 ㎖/동물의 부피로 피하 주사하였다. 상기 콜라겐의 제 1 주사 후 21일째에, CII(0.1 ㎖/동물)의 제 2 주사(추가 접종)를 각 동물에게 다시 상기 꼬리에 피하로, 그러나 상기 제 1 주사와 상이한 위치에 투여하였다. 이 경우에 상기 콜라겐 현탁액은 불완전 프로인트 항원보강제(IFA)로 제조되었다.
상기 관절염 점수 지수가 대략 2 내지 4일 때, 상기 동물들을 확대된 지방 유래된 줄기 세포 또는 대조용으로서 비히클(링거액)로 처리하였다. CIA의 점진적 변화를 미리 설정한 득점 시스템에 따라, 사지 관절의 염증-발적-교착을 측정함으로써 매일(월요일부터 금요일까지) 추적하였다.
각 동물의 양쪽 뒷발의 부피를 상기 시험 품목 또는 비히클의 투여 후에 매일 측정하고 상기 두 발에 대한 평균을 계산하였다. 더욱 또한 각 동물에 대해 제 1일에 측정된 상기 뒷발 부피(첫 번째 콜라겐 주사 전 및 기본 부피로서 간주됨)를 그 후 매일 측정되는 뒷발 부피로부터 공제하여 각 동물에 대한 순 발 부피 증가(또는 부종)를 획득하였다. 또한, 상기 관절염의 중증도를 하기의 관절염 지수 득점 시스템에 따라 앞발 및 뒷발 모두에서 동일한 횟수 및 타이밍으로 기록하였다:
0: 관절염 징후 없음
1: 발 또는 1자리 숫자의 팽창 및/발적
2: 2 개 군의 관절이 염증을 일으킴(팽창 및/또는 발적)
3: 2 개 군 초과의 관절이 염증을 일으킴(팽창 및/또는 발적)
4: 발 전체의 염증. 중증 관절염
최종 점수는 4 개 발의 점수들의 합이다. 최대 점수는 16이다.
실험 디자인
대조군
군 A = 처리 없음
정맥 내 투여
군 C = 용량당 100만 개의 세포를 정맥 내 주사함, 연속일당 1 회 용량. 총 5 회 용량.
군 D = 제 1 용량 300만 개 세포 및 제 2 및 제 3 용량 100만 개 세포의 정맥 내 주사, 연속일당 1 회 용량. 총 3 회 용량.
림프 내 투여
군 E = 용량당 320,000 개 세포의 림프 내 주사(우측 서혜부 결절 160,000, 좌측의 경우 160,000). 총 2 회 용량, 제 1 용량 7일 전에 제 2 용량.
비히클 대조군
군 F = 링거액의 림프 내 주사. 총 2 회 용량, 제 1 용량 7일 전에 제 2 용량.
N = 12 마우스/군
정맥 내 투여
상기 시험 품목을 멸균 나비 바늘(25G)을 사용하여 꼬리 정맥을 통해 정맥 내 투여하였다. 상기 동물들에게 5 회 연속 용량으로 또는 3일 교대(하루에 1 회)로 제공하였다. 동물들에게 상기 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 0.05 ㎖/분 속도의 주입으로서 0.2 ㎖의 시험 품목을 제공하였다.
서혜부 림프절에의 림프 내 투여
DBA1 마우스를 코 마스크를 통해 2.0 내지 2.5% 아이소플로란의 흡입에 의해 마취시키고 37 ℃에서 가온 플레이트 상에 뉘었다. 상기 서혜부 부위의 제모(비트(Veet) 민감성 제모 크림) 및 70% 에탄올에 의한 소독 후에, 상기 서혜부 부위에 6 내지 8 ㎜ 절개를 수행하였다. 상기 서혜부 지방 내에 림프절이 위치하였으며 8 ㎕의 비히클 또는 ASC(2000만 개 세포/㎖의 밀도)를 갖는 비히클을 30 게이지 바늘을 갖는 해밀튼(Hamilton) 주사기로 상기 림프절에 주사하였다. 절개부를 하나 또는 2 개의 매듭에 의해 봉합하고 상기 시술을 다른 쪽 서혜부 결절에서 반복하였다. 마우스를 마취에서 회복되게 하였다. 7일 후에, 상기 시술을 반복하였다.
확대된 지방 유래된 줄기 세포 제조
인간 지방 조직을 국소 마취 및 일반적인 진정 하에서 지방흡입에 의해 수득하였다. 중공의 무딘 말단 캐뉼러를 작은 절개(직경 0.5 ㎝ 미만)를 통해 피하 공간 내에 도입시켰다. 서서히 흡입하면서, 상기 캐뉼러를 상기 지방 조직의 기계적 파괴를 위해 지방 조직 복벽 구획을 통해 이동시켰다. 염수 용액 및 혈관수축제 에피네프린을 상기 지방 조직 구획에 주사하여 혈액 손실을 최소화하였다. 이렇게 하여, 80 내지 100 ㎖의 생 지방기질을 치료하고자 하는 각각의 대상으로부터 수득하였다.
상기 생 지방기질을 멸균 포스페이트-완충된 염수(PBS; Gibco BRL, Paisley, Scotland, UK)로 광범위하게 세척하여 혈액 세포, 염수 및 국소 마취제를 제거하였다. 상기 세포 외 기질을 균형 염 용액(5 ㎎/㎖; Sigma, St. Louis, USA) 중의 II형 콜라게나제(0.075%; Gibco BRL) 용액으로 37 ℃에서 30 분간 절단하여 상기 세포 분획을 방출시켰다. 이어서 상기 콜라게나제를 동 부피의 세포 배양 배지(10% 소 태아 혈청(FBS; Gibco BRL)을 함유하는 둘베코의 변경된 이글 배지(DMEM; Gibco BRL))의 첨가에 의해 불활성화시켰다. 상기 세포의 현탁액을 250 x g에서 10 분간 원심분리하였다. 세포를 0.16 M NH4Cl에 재현탁하고 적혈구의 용해를 위해 실온(RT)에서 5 분간 정치시켰다. 상기 혼합물을 250 x g에서 원심분리하고, 세포를 DMEM + 10% FBS 및 1% 암피실린/스트렙토마이신 혼합물(Gbico BRL)에 재현탁하고 이어서 40 ㎛ 메쉬를 통해 여과하고 조직 배양 플라스크에 10 내지 30 x 103 세포/㎠의 농도로 도말하였다.
세포를 공기 중 5% CO2의 분위기에서 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 이어서 상기 배양 플라스크를 PBS로 세척하여 부착되지 않은 세포 및 세포 분획을 제거하였다. 상기 세포를 대략 80% 융합률에 도달할 때까지, 매 3 내지 4일마다 상기 배양 배지를 교체하면서 동일한 배지 중에서 및 동일한 조건 하에서 배양물 중에서 유지시켰다. 이어서 세포를 1:3의 희석 비(대략 5 내지 6 x 103 세포/㎠의 세포 밀도에 상응한다)로 트립신-EDTA(Gibco BRL)와 함께 계대 배양하였다.
상기 실험을 위해서, 세포를 12 내지 16의 중복 계대 시 트립신처리하고 비히클(링거액) 중에 목적하는 세포 밀도로 재현탁하였다. 이어서 주사기로 옮기고 상기 마우스에게 주사하였다.
통계학적 분석
상기 결과의 통계학적 유의수준을 통계 프로그램 그래프패드 인스타트(GraphPad Instat) 3을 사용하여 평가하였다. 결과를 평균 ± 상기 평균의 표준 오차로서 나타내며, 이때 n은 동물의 수이다.
도 1은 군 A 대 군 E의 비교에 대한 p-값을 예시하기 위해 도시된다. 유의수준 차이를 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001로서 나타낸다. 군간의 차이를 다수의 비교로부터 듄(Dunn)의 시험 후에 따른 홑 데이터에 대한 크루스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 검정에 의해 평가하였다. P<0.05의 값을 유의수준으로서 간주하였다.
결과
관절염을 병아리 콜라겐 II의 주사에 의해 DBA1 마우스에서 유발시켰다. 마우스가 2 내지 4의 관절염 점수를 나타내었을 때 상기 마우스를 정맥 내 또는 림프 내 경로에 의해 확대된 ASC로 처리하였다. 상기 림프 내 투여에 대한 대조군으로서 마우스를 상기 비히클로 처리하였다. 상기 관절염 점수를 매일 모니터링하였다(표 1 참조). 처리되지 않은 마우스 또는 비히클로 처리된 마우스가 시간 의존적인 방식으로 증가되는 상기 발의 높은 염증을 나타낸 반면, 림프 내-전달된 확대된 ASC로 처리한 마우스는 현저하게 감소된 염증을 나타내었다. 더욱이, 상기 림프 내 투여의 치료학적 효과는 정맥 내 투여보다 더 높았다(도 1 참조).
결론
본 연구는 DBA1 마우스에 대한 인간 ASC의 림프 내 투여가 관절염의 중증도를 통계학적 유의수준으로 감소시킴을 보인다(관절염 지수 점수가 가리키는 바와 같이).
더욱이, 총 640,000 개의 ASC(2 회 용량에서)의 림프 내 투여에 대한 치료학적 효과는 총 500만 개의 세포의 정맥 내 투여보다 현저하게 더 높았다. 이러한 결과는 상기 림프 내 투여 경로가, 더욱 낮은 수의 세포로 더 높은 치료 효과에 도달하므로, 더 효능이 있음을 가리킨다.
따라서, 본 발명을 본 발명의 특정한 태양, 특징 및 예시적인 실시태양들을 참고로 본 원에 개시하였지만, 본 발명의 유용성이 상기에 제한되는 것이 아니라 오히려 다수의 다른 태양, 특징 및 실시태양까지 연장되고 이들을 포함함을 알 것이다. 따라서, 이후의 청구의 범위를, 그의 진의 및 범위 내에서, 모든 상기와 같은 태양, 특징 및 실시태양을 포함하는 것으로서 상응하게 광범위하게 해석하고자 한다.

Claims (42)

  1. 예방 또는 치료 효과량의 중간엽 줄기 세포를 포함하는 염증 질환의 치료, 조절, 예방 또는 개선을 위하여 대상의 림프계에 투여되는 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    중간엽 줄기 세포가 지방 유래된 중간엽 줄기 세포인, 약학 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항원이 대상의 림프계에 투여되는 것을 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    항원이 조성물의 투여 전 또는 후 또는 투여와 동시에 투여되는, 약학 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서,
    항원이 조성물의 투여 1, 2, 3, 5 또는 10 시간 이상 전 또는 후에 투여되는, 약학 조성물.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    조성물이 림프 기관에 투여되는, 약학 조성물.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    조성물이 말초 림프 기관에 투여되는, 약학 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    말초 림프 기관이 림프절인, 약학 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    림프절이 액와부 또는 서혜부 림프절인, 약학 조성물.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    투여가 주사기에 의해 수행되는, 약학 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    방사선, 초음파 또는 화상 장치를 사용하여 주사 바늘의 위치를 모니터링하는 단계가 추가로 포함되는, 약학 조성물.
  12. 삭제
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  23. (i) 중간엽 줄기 세포를 포함하는 약제; 및
    (ii) 상기 중간엽 줄기 세포를 대상의 림프계에 투여하기 위한 설명서
    를 포함하는, 염증 질환의 하나 이상의 증상을 치료, 조절, 예방 또는 개선하기 위한 키트.
  24. 예방 또는 치료 효과량의 중간엽 줄기 세포를 포함하는 염증 질환을 치료, 조절, 예방 또는 개선하기 위하여 대상의 림프계에 투여되는 약제의 제조를 위한 약학 조성물.
  25. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    질환이 류머티스성 관절염으로 이루어진 군 중에서 선택되는, 약학 조성물.
  26. 삭제
  27. 제 24 항에 있어서,
    질환이 류머티스성 관절염으로 이루어진 군 중에서 선택되는, 약학 조성물.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 제 3 항에 있어서,
    항원이 콜라겐, 글루텐 또는 미엘린인, 약학 조성물.
  32. 제 24 항에 있어서,
    중간엽 줄기 세포가 지방 유래된 중간엽 줄기 세포인, 약학 조성물.
  33. 제 24 항 또는 제 32 항에 있어서,
    항원이 대상의 림프계에 투여되는 것을 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서,
    항원이 약제의 투여 전 또는 후 또는 투여와 동시에 투여되는, 약학 조성물.
  35. 제 33 항에 있어서,
    항원이 약제의 투여 1, 2, 3, 5 또는 10 시간 이상 전 또는 후에 투여되는, 약학 조성물.
  36. 제 24 항 또는 제 32 항에 있어서,
    약제가 림프 기관에 투여되는, 약학 조성물.
  37. 제 24 항 또는 제 32 항에 있어서,
    약제가 말초 림프 기관에 투여되는, 약학 조성물.
  38. 제 37 항에 있어서,
    말초 림프 기관이 림프절인, 약학 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서,
    림프절이 액와부 또는 서혜부 림프절인, 약학 조성물.
  40. 제 24 항 또는 제 32 항에 있어서,
    투여가 주사기에 의해 수행되는, 약학 조성물.
  41. 제 40 항에 있어서,
    방사선, 초음파 또는 화상 장치를 사용하여 주사 바늘의 위치를 모니터링하는 단계가 추가로 포함되는, 약학 조성물.
  42. 제 33 항에 있어서,
    항원이 콜라겐, 글루텐 또는 미엘린인, 약학 조성물.
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