ES2479542T3 - Métodos y composiciones para su uso en terapias celulares - Google Patents

Abstract

Una población celular aislada que consiste esencialmente en células inmunomoduladoras específicas de antígeno asociado a esclerosis múltiple que expresan uno o más de CD62-L, FOXP3 y CTLA4.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

DESCRIPCION

Metodos y composiciones para su uso en terapias celulares

Proposito y campo de aplicacion

La presente invencion se refiere a metodos para proporcionar terapias celulares, y uso terapeuticos de los

mismos.

Antecedentes de la Invencion

Le sistema inmune en los vertebrados superiores representa la primera lfnea de defensa contra varias antfgenos que pueden entrar en el cuerpo del vertebrado, incluyendo microorganismos como bacterias, hongos y virus que son agentes causantes de una variedad de enfermedades. Ademas, el sistema inmune esta tambien implicado en una variedad de otras enfermedades o trastornos, incluyendo enfermedades autoinmunes o inmunopatologicas, sfndromes de inmunodeficiencia, aterosclerosis y diversas enfermedades neoplasicas. Aunque hay metodos disponibles para tratar estas enfermedades, muchas terapias actuales proporcionan resultados menos que adecuados. Entre las nuevas estrategias terapeuticas emergentes, las basadas en terapia celular parecen constituir una herramienta potencialmente util para tratar una gran numero de enfermedades. Asf, se esta haciendo actualmente un gran esfuerzo por los investigadores para lograr dicho objetivo.

ENFERMEDADES AUTOINMUNES

Las enfermedades autoinmunes se provocan cuando el sistema inmune del cuerpo, que se supone que debe defender el cuerpo contra bacterias, virus y cualquier otro producto extrano, funciona mal y produce una respuesta patologica contra tejido, celulas y organos sanos. Los anticuerpos, celulas T y macrofagos proporcionan proteccion beneficiosa, pero tambien pueden producir respuestas inmunologicas perjudiciales o mortales.

Las enfermedades autoinmunes pueden ser especfficas de organos o sistemicas y estan provocadas por diferentes mecanismos patogenicos. La autoinmunizacion especffica de organos se caracteriza por la expresion aberrante de antfgenos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), mimetismo antigenico y variaciones alelicas en genes de MHC. Las enfermedades autoinmunes sistemicas implican la activacion de celulas B policlonales y anormalidades de celulas T inmunorreguladoras, los receptores de celulas T y genes de MHC. Ejemplos de enfermedades autoinmunes especfficas de organos son diabetes, hipertiroidismo, insuficiencia suprarrenal autoinmune, anemia pura de los globulos rojos, esclerosis multiple y carditis reumatica. Enfermedades autoinmunes sistemicas representativas son lupus eritematoso sistemico, inflamadon cronica, sfndrome de Sjogren, polimiositis, dermatomiositis y esclerodermia.

El tratamiento actual de enfermedades autoinmunes implica administrar agentes inmunosupresores como cortisona, derivados de aspirina, hidroxicloroquina, metotrexato, azatioprina y ciclofosfamida o combinaciones de los mismos. El dilema al que nos enfrentamos al administrar agentes inmunosupresores, sin embargo, es que cuanto mas eficazmente se trata la enfermedad autoinmune, mas se deja al paciente sin defensas contra ataques de infecciones, y tambien se le hace mas susceptible a desarrollar tumores. Por lo tanto, hay una gran necesidad de nuevas terapias para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

TRASTORNOS INFLAMATORIOS

La inflamacion es un proceso por el que los globulos blancos del cuerpo y factores secretados protegen nuestros cuerpos de infeccion por sustancias extranas, como bacterias o virus. Los factores secretados conocidos como citoquinas y prostaglandinas controlan este proceso, y se liberan en una cascada ordenada y auto-limitativa en la sangre o tejidos afectados.

Enfermedad Inflamatoria del Intestino (IBD)

La IBD es una familia de enfermedades cronicas, idiopaticas, reincidentes y destructoras de tejido caracterizada por la disfuncion de celulas T de la mucosa, produccion de citoquina alterada e inflamacion celular que lleva finalmente a dano del intestino delgado distal y la mucosa del colon. La IBD se subdivide clfnicamente en dos fenotipos: enfermedad de Crohn (CD) y colitis ulcerosa. LA CD es una enfermedad autoinmune actualmente incurable con un prevalencia del 0,05% que lleva a inflamacion cronica que da como resultado un intervalo de sfntomas gastrointestinales y extraintestinales, induyendo dolor abdominal, sangrado rectal, diarrea, perdida de peso, trastornos de la piel y los ojos, y crecimiento y maduracion sexual retrasadas en ninos. Estos sfntomas pueden tener gran impacto en el bienestar del paaente, calidad de vida y capacidad de funcion. debido a que la CD es cronica y tiene tfpicamente un comienzo antes de los 30 anos de edad, los pacientes requieren generalmente

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

tratamiento de por vida. Aunque su etimologfa sigue siendo desconocida, hay evidencia circunstancial de enlazar la CD con un fallo del sistema inmune de la mucosa para atenuar la respuesta inmune de antfgenos endogenos.

Los agentes terapeuticos usados actualmente para la CD, incluyendo aminosalicilatos, corticosteroides, azatioprina, 6-mercaptopurina, antibioticos y metotrexato, no son completamente efectivos, son no especfficos y tienen multiples efectos secundarios adversos. En la mayorfa de los casos, la reseccion quirurgica es la alternativa definitiva. Por lo tanto, la estrategia terapeutica actual es encontrar farmacos o agentes que modulen especfficamente ambos componentes de la enfermedad, es decir, las respuestas infamatorias y las impulsadas por celulas T.

recientemente, se ha aprobado el farmaco infliximab para el tratamiento de enfermedad de Crohn moderada a severa que no responde a las terapias estandar y para el tratamiento de fistulas con drenaje abiertas. El infliximab, el primer tratamiento aprobado especfficamente para la enfermedad de Crohn, es un anticuerpo anti factor de necrosis tumoral (TNF) El TNF es una proteina producida por el sistema inmune que puede provocar inflamacion asociada con la enfermedad de Crohn. El anti-TNF elimina el TNF del corriente sanguineo antes de que alcance los intestinos, previniendo de este modo la inflamacion. Sin embargo, como tiene un efecto sistemico, un TNF es un factor muy pleiotropico, los efectos secundarios severos con relativamente comunes, y se ha de determinar todavia su seguridad a largo plazo. Tambien la eficiencia es tambien limitada ya que muchos de los procesos inflamatorios que tienen lugar en los pacientes no son dependientes de la senalizacion de TNF.

Artritis reumatoide (RA)

La artritis reumatoide y la artritis reumatoide juvenil son tipos de artritis inflamatoria. La artritis es un termino general que describe inflamacion en las articulaciones. Algunos, pero no todos, los tipos de artritis son resultado de inflamacion mal dirigida. La artritis reumatoide afecta a alrededor del 1% de la poblacion mundial y es esencialmente discapacitante. La artritis reumatoide es un trastorno autoinmune por el que el sistema inmune del cuerpo identifica incorrectamente las membranas sinoviales que secretan el fluido lubricante en las articulaciones como extranas. Da lugar a inflamacion, y el cartflago y los tejidos en y alrededor de las articulaciones se danan o destruyen. El cuerpo reemplaza el tejido danado con tejido cicatrizal, provocando que los espacios normales dentro de las articulaciones se vuelvan estrechos y los huesos se fusionen entre si.

En artritis reumatoide, hay un ciclo autoinmune de presentacion de antfgenos persistente, estimulacion de celulas T, secrecion de citoquinas, activacion de celulas sinoviales y destruccion de articulaciones.

Las terapias actuales para la artritis se enfocan en reducir la inflamacion de las articulaciones con medicaciones antiinflamatorias o inmunosupresoras. La primera lfnea de tratamiento de cualquier artritis es habitualmente los antiinflamatorios, como aspirina, ibuprofeno e inhibidores de Cox-2 como celecoxib y rofecoxib. Tambien se utilizan anticuerpos monoclonales humanizados anti-TNF, como el Infliximab, sin embargo, tiene muchos efectos secundarios y su eficacia es bastante baja. Los "farmacos de segunda lfnea", incluyen oro, metotrexato y esteroides. Aunque estos son tratamientos bien establecidos para la artritis, muye pocos pacientes se remiten a estas lfneas de tratamiento solamente, y todavfa hay problemas de tratamiento diffciles para pacientes con artritis reumatoide.

En general, los tratamientos actuales para los trastornos inflamatorios cronicos tienen una eficiencia muy limitada, y muchos de ellos tienen una incidencia alta de efectos secundarios o no pueden prevenir completamente la progresion de la enfermedad. Hasta ahora, ningun tratamiento es ideal, y no hay cura para este tipo de patologfas. Por lo tanto, existe una gran necesidad para nuevas terapias para el tratamiento de trastornos inflamatorios. Gonzalez Manuel et al. (Arthritis & Rheumatism, vol. 60, no. 4, Abril 2009, paginas 1006-1019) describe la administracion intraperitoneal o intraarticular de celulas madres mesenquimales en artritis experimental. Zappia Emanuela et al. (Blood, vol. 106, no. 5, 1 Septiembre 2005, paginas 1755-1761) y Gerdoni Ezio et al. (Annals of Neurology, vol. 61, no. 3, Marzo 2007, paginas 219-227) usan administracion intravenosa de celulas madre mesenquimales en encefalomielitis autoinmune experimental. Gonzalez Manuel et al. (Gastroenterology, vol. 136, no. 3, Marzo 2009, paginas 978-989) describe la administracion intraperitoneal de celulas madre mesenquimales en colitis experimental. Karussis et al. (Journal of Neurological Sciences, vol. 265, no. 1-2, 11 Enero 2008, paginas 131135) usa la administracion intraventricular o intravenosa de celulas madre mesenquimales en encefalomielitis autoinmune experimental; tambien informa de la administracion intratecal e intravenosa de celulas madre mesenquimales en esclerosis multiple o esclerosis lateral amiotrofica (ALS). De Vries Jolanda et al. (Nature Biotechnology, vol. 23, no. 11, Noviembre 2005, paginas 1407-1413) describe la administracion intranodal de celulas dendrfticas a sujetos humanos con melanoma. Figdor Carl et al. (Nature Medicine, vol. 10, no. 5, Mayo 2004, paginas 475-480) informa de varios enfoques para la administracion de vacunas de celulas dendrfticas a sujetos humanos y menciona la administracion intradermica, intranodal e intravenosa.

Sumario de la Invencion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

La presente invencion proporciona metodos mejorados para la terapia celular de pacientes con necesidad de ella. La invencion proporciona una celula madre mesenquimal para su uso en un metodo para tratar, modular, mejorar y/o profilaxis de un trastorno inflamatorio y/o inmune, en el que la celula madre mesenquimal se administra al sistema linfatico por inyeccion intralinfatica. La invencion tambien proporciona el uso de una celula madre mesenquimal en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento, modulacion, profilaxis y/o mejora de un trastorno inflamatorio y/o inmune, por la administracion de la celula madre mesenquimal en el sistema linfatico por inyeccion intralinfatica. Tambien se proporciona una composicion farmaceutica para su uso en un metodo para tratar, mejorar y/o profilaxis de un trastorno inflamatorio y/o inmune, en el que la composicion farmaceutica se administra al sistema linfatica por inyeccion intralinfatica y comprende una celula madre mesenquimal y un portador farmaceutico. Aspectos adicionales de la divulgacion proporcionan kits y composiciones para su uso en una terapia celular administrada intralinfaticamente.

En un aspecto de la divulgacion, se describe un metodo para tratar o reparar tejido danado, y/o para el tratamiento, modulacion, profilaxis y/o mejora de uno o mas sfntomas asociados con trastornos inflamatorios y/o inmunes, que tienen tejido danado y/o uno o mas sfntomas asociados con trastornos inflamatorios y/o inmunes, que comprende administrar al sistema linfatico de dicho sujeto una cantidad profilactica o terapeuticamente efectiva de una composicion que comprende celulas madre, celulas T reguladoras y/o celulas de fibroblastos. En una realizacion la presente invencion proporciona un metodo para prevenir, tratar, o mejorar la enfermedad inmune y/o inflamatoria en un individuo que comprende la administracion directa de una terapia celular a un organo linfatico. En una realizacion de la invencion la terapia celular se administra en combinacion con un antfgeno.

En otro aspecto de la divulgacion, se describe una celula madre, celula T reguladora y/o celula de fibroblasto, para su uso en un metodo para:

i. tratar o reparar tejido danado; y/o

ii. tratar, modular, mejorar y/o profilaxis de uno o mas sfntomas asociados con trastornos inflamatorios y/o inmunes;

en el que la celula se administra al sistema linfatico.

En otro aspecto de la divulgacion, se describe un kit, dicho kit comprendiendo i) un medicamento que comprende una celula madre, celula t reguladora y/o poblacion de fibroblastos y ii) instrucciones para un metodo para tratar o reparar tejido danado, y/o para el tratamiento, modulacion, profilaxis y/o mejora de uno o mas sfntomas asociados con trastornos inflamatorios y/o inmunes, en un sujeto con necesidad de dicho tratamiento, que comprende administrar al sistema linfatico de dicho sujeto una cantidad profilactica o terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende celulas madre, celulas T reguladoras y/o celulas de fibroblastos.

En otro aspecto de la divulgacion, se describe el uso de una celula madre, celula T reguladora y/o celula de fibroblasto en la fabricacion de un medicamento para tratar o reparar tejido danado, y/o para el tratamiento, modulacion, profilaxis y/o mejora de uno o mas sfntomas asociados con trastornos inflamatorios y/o inmunes, dicho uso comprendiendo la administracion de la celula madre, celula T reguladora y/o celula de fibroblasto en el sistema linfatico.

Otro aspecto de la divulgacion se refiere a una celula madre, celula T reguladora o fibroblasto para su administracion al sistema linfatico. Otro aspecto se refiere a esa celula para su uso en terapia.

Otro aspecto de la divulgacion se refiere a una composicion farmaceutica para su administracion al sistema linfatico que comprende una celula madre, celula T reguladora y/o fibroblasto, y un antfgeno.

Otros aspectos, caracterfsticas y ventajas seran mas completamente aparentes a partir de la divulgacion subsiguiente y las reivindicaciones anadidas.

Definiciones

Para facilitar la comprension de la presente descripcion, se explicaran a continuacion el significado de algunos terminos y expresiones en el contexto de la invencion. Definiciones adicionales se incluiran a lo largo de la descripcion como sea necesario.

Los terminos "adaptado para inyeccion intralinfatica" o "adaptado para inyeccion intranodal" o "adaptado para inyeccion directa en el ganglio linfatico axilar y/o inguinal" de acuerdo con la invencion significa que la terapia celular, preferiblemente comprendiendo celulas inmunomoduladoras, mas preferiblemente comprendiendo celulas madre, celulas T reguladoras y/o celulas de fibroblastos, asf como medicamentos y composiciones farmaceuticas que comprende las mismas, adaptados para la inyeccion intralinfatica o intranodal que tiene caracterfsticas ffsicas, qufmicas, biologicas y otras necesarias o beneficiosas para inyectar los mismos como un tratamiento de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

medicamento en el tejido linfatico de un individuo, especialmente un humano, incluso mas preferiblemente un paciente humano para el tratamiento o reparacion de tejido danado (preferiblemente tejido mesenquimal), y/o para el tratamiento, modulacion, profilaxis, y/o mejora de uno o mas sfntomas asociados con trastornos inflamatorios y/o inmunes en un sujeto con necesidad de dicho tratamiento. Ademas, las celulas inmunomoduladoras, asf como medicamentos y composiciones farmaceuticas que comprenden las mismas "adaptadas para inyeccion intrali nfatica" o "adaptadas para inyeccion intranodal" de acuerdo con la invencion contienen concentraciones de todos los constituyentes de la composicion permitiendo la aplicacion de cantidades apropiadas de todos los constituyentes en un volumen apropiado al tejido linfatico, preferiblemente un volumen de hasta 0,01, preferiblemente hasta 0,05, preferiblemente hasta 0,1, preferiblemente hasta 0,2, preferiblemente hasta 0,3, preferiblemente hasta 0,4, preferiblemente hasta 0,6, preferiblemente hasta 0,8, preferiblemente hasta 1,0, preferiblemente hasta 2 ml. Ademas, las composiciones "adaptadas para inyeccion intralinfatica o inyeccion intranodal" contendran ninguna o solo cantidades limitadas de sustancias daninas potenciales como solventes y adyuvantes, que pueden danar el tejido linfatico, si se aplican en cantidades demasiado grandes. Con dano al tejido linfatico se entiende dano directo debido a efectos toxcos a las celulas, debido a la destruccion qufmica de las celulas, debido a dano indirecto a las celulas por ejemplo induciendo reacciones inflamatorias, necrosis, etc.

Ademas, una composicion "adaptada para inyeccion intralinfatica o inyeccion intranodal" de acuerdo con la invencion tiene idealmente algun tipo de mecanismo de seguridad, que evita la aplicacion sistemica accidental de las celulas inmunomoduladoras, asf como medicaciones y composiciones farmaceuticas que comprenden las mismas, en caso de que la inyeccion falle el tejido linfatico y en el peor de los casos resulte en la inyeccion directa de las celulas inmunomoduladoras, asf como medicamentos y composiciones farmaceuticas que comprenden las mismas, en la circulacion sangufnea. Dicho mecanismo de seguridad incluye una vida media extracelular corta de las sustancias activas biologicas.

Al termino "inyeccion" como se usa en la presente se le debe dar su significado habitual en la tecnica, en referencia a la administracion de un agente al cuerpo perforando parte del cuerpo, habitualmente la piel. El termino incluye el uso de jeringuillas huecas y dispositivos de inyeccion de chorro de alta presion.

El termino "alogenico" como se usa en la presente debe entenderse que significa de diferentes individuos de la misma especie. Se dice que dos o mas individuos son alogenicos entre sf cuando los genes en uno o mas loci no son identicos.

El termino "autologo" como se usa en la presente debe entenderse que significa del mismo individuo.

El termino "enfermedad inmune" se refiere a una condicion en un sujeto caracterizada por lesion celular, tisular y/o organica provocada por una reaccion inmunologica del sujeto. El termino "enfermedad autoinmune" se refiere a una condicion en un sujeto caracterizada por lesion celular, tisular y/o organica provocada por una reaccion inmunologica del sujeto a sus propias celulas, tejidos y/o organos. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de enfermedades autoinmunes que pueden tratarse con las celulas inmunomoduladoras de la invencion incluyen, alopecia areata, espondilitis anquilosante, sfndrome antifosfolfpido, enfermedad de Addison autoinmune, enfermedades autoinmunes de la glandula suprarrenal, anemia hemolftica autoinmune, hepatitis autoinmune, ooforitis y orquitis autoinmunes, trombocitopenia autoinmune, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatfa, dermatitis celfaca, sfndrome de disfuncion inmune de fatiga cronica (CFlDS), polineuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica, Sfndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, sfndrome de CREST, enfermedad de aglutinina frfa, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopatica, purpura de trombocitopenia idiopatica (ITP), neuropatfa de IgA artritis juvenil, liquen plano, enfermedad de Meniere, enfermedad del tejido conectivo mixto,, esclerosis multiple, diabetes mellitus de tipo 1 o inmunomediada, miastenia gravis, pemphigus vulgaris, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, sfndromes poliglandulares, polimialgia reumatica, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriasica, sfndrome de Raynauld, sfndrome de Reiter, sarcoidosis, escleroderma, esclerosis sistemica progresiva, sfndrome de Sjogren, sfndrome de Good pasture, sfndrome de hombre tieso, lupus eritematoso sistemico, lupus eritematoso, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de celulas gigantes, colitis ulcerosa, uveitis , vasculitis como vasculitis de dermatitis herpetiforme, vitiligo, granulomatosis de Wegener, Enfermedad de Membrana Basal Anti-Glomerular, sfndrome de antifosfolfpido, enfermedades autoinmunes del sistema nervioso, Fiebre mediterranea familiar, Sfndrome miastenico de Lambert-Eaton, Oftalmfa simpatica, Poliendocrinopatfas, Psoriasis, etc.

El termino "Enfermedad inflamatoria inmuno-mediada" debe entenderse que significa cualquier enfermedad caracterizada por inflamacion cronica o aguda, resultante de, asociada con o activada por, una desregulacion de la respuesta inmune normal, por ejemplo enfermedad de Crohn, diabetes mellitus tipo 1, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, artritis psoriasica, espondilitis anquilosante, lupus eritematoso sistemico, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de injerto contra huesped, sfndrome de Sjogren, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, esclerodermia, sfndrome de Goodpasture , Colitis ulcerativa, anemia hemolftica

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

autoinmune, esterilidad, miastenia gravis, esclerosis multiple, enfermedad de Basedow, purpura de trombopenia, sindrome de Guillain-Barre, alergia, asma, enfermedad atopica, arteriosclerosis, miocarditis, cardiomiopatfa, nefritis glomerular, anemia hipoplasica y rechazo despues de trasplante de organo.

A "Enfermedad celiaca" se hace referencia alternativamente como enfermedad celiaca, esprue celiaco, esprue no tropical, esprue endemico, enteropatfa por gluten, o enteropatfa sensible al gluten, e intolerancia al gluten.

Para los propositos de la invencion descrita en la presente, "trastornos inmunes" incluyen enfermedades autoinmunes y enfermedades mediadas inmunologicamente.

El termino "enfermedad inflamatoria" se refiere a una condicion en un sujeto caracterizada por inflamacion, por ejemplo, inflamadon cronica. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de trastornos inflamatorios incluyen, pero no estan limitados a, enfermedad celiaca, artritis reumatoide (RA), enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), asma, encefalitis, enfermedad pulmonar obstructive cronica (COPD), osteolisis inflamatoria, trastornos alergicos, choque septico, fibrosis pulmonar (por ejemplo, fibrosis pulmonar idiopatica), vacunas inflamatorias (por ejemplo, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegner, arteritis de Takayasu, arteritis temporal y granulomatosus linfomatoide), angioplastia vascular postraumatica (por ejemplo, restenosis despues de angioplastia), espondiloartropatia indiferenciada, artropatia indiferenaada, artritis, osteolisis inflamatoria, hepatitis cronica e inflamacion cronica resultante de infecciones virales o bacterianas cronicas.

El termino "aislado" aplicado a la poblacion celular se refiere a una poblacion celular, aislada del cuerpo humano o animal, que esta sustancalmente libre de una o mas poblaciones celulares que estan asociadas con dicha poblacion celular in vivo o in vitro. El termino "MHC" (complejo mayor de histocompatibilidad) se refiere a un subconjunto de genes que codifica proteinas que presentan antigenos en la superficie celular. En humanos, estos genes son referidos como genes de antigenos de leucoctos humanos (HLA). En la presente, las abreviaciones MHC o HLA se usan de manera intercambiable. El termino "sujeto" se refiere a un animal, preferiblemente un mamffero incluyendo no primates (por ejemplo, una vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata o raton) y un primate (por ejemplo, un mono, o un humano). En una realizacion preferida, el sujeto es un humano.

El termino "inmunomodulador" se refiere a la inhibicion o reduccion de una o mas actividades biologicas del sistema inmune que incluye, pero no esta limitada a, regulacion hacia abajo de la respuesta inmune y estados inflamatorios asf como cambios en el perfil de citoquina, actividad citotoxica y produccion de anticuerpos. El termino "inmunomodulador especffico de antfgeno" se refiere a la inhibicion o reduccion de una o mas actividades biologicas del sistema inmune asociadas con un antfgeno o antigenos especfficos, incluyendo tanto aloantfgenos como autoantfgenos. El termino "inmunomodulador" debe entenderse que comprende "inmunomodulador especffico de antfgeno".

Como se usa en la presente, "negativo" o "-" como se usan con respecto a los marcadores de superfice celular debe entenderse que significa que, en una poblacion celular, menos del 20%, 10%, preferiblemente menos del 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1 % o ninguna de las celulas expresan dicho marcador. La expresion de los marcadores de superficie celular puede determinarse por ejemplo por medio de citometrfa de flujo para un marcador de superficie celular especffico usando metodos y aparatos convencionales (por ejemplo un sistema Beckman Coulter Epics XL FACS usado con anticuerpos comercialmente disponibles y protocolos estandar conocidos en la tecnica).

Como se usa en la presente, al termino "sistema linfatico" se le da su significado habitual en la tecnica y se refiere al tejido linfoide conectado por un sistema conductor de los vasos linfaticos y los capilares linfaticos. El termino "organo linfatico" se refiere a ganglios linfaticos, mas preferiblemente a un ganglio linfatico axilar o inguinal, o para aquellos individuos que carecen de ganglios linfaticos o que tienen defectos en los mismos, el tejido linfatico o una celula inmune.

Como se usa en la presente el termino "celula madre mesenquimal" (tambien referida en la presente como "MSC") debe entenderse que significa una celula que es capaz de dar lugar a multiples tipos diferentes de celulas, derivadas originalmente de la mesenquima. El termino se refiere a una celula que es capaz de diferenciarse en al menos uno de un osteoblasto, un condrocito, un adipocito, o un miocito. Las MSCs pueden aislarse de cualquier tipo de tejido. Generalmente las MSCs se asilaran de medula osea, tejido adiposo, cordon umbilical o sangre periferica. Las MSCs usadas en la invencion pueden en algunas realizaciones aislarse de la medula osea (BM-MSCs) o tejido adiposo (ASCs). En un aspecto preferido de la invencion, las MSCs se obtienen de lipoaspiratos, obtenidos los mismos de tejido adiposo.

Como se usa en la presente, la expresion "expresion significativa" o sus terminos equivalentes "positivo" y "+" cuando se usan respecto a marcador de superficie celular debe entenderse que significan que, en una poblacion celular, mas del 20%, preferiblemente mas del 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 95%, 98%, 99% o incluso todas las celulas de las celulas expresan dicho marcador.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

La expresion de marcadores de superficie celular puede determinarse por ejemplo por medio de citometrfa de flujo para un marcador de superficie celular especffico usando metodos y aparatos convencionales (por ejemplo un sistema Beckman Coulter Epics XL FACS usado con anticuerpos comercialmente disponibles y protocolos estandar conocidos en la tecnica) que muestran una senal para un marcador de superficie celular especffico en citometrfa de flujo sobre la senal de fondo usando metodos y aparatos convencionales por ejemplo un sistema Beckman Coulter Epics XL FACS usado con anticuerpos comercialmente disponibles y protocolos estandar conocidos en la tecnica). La senal de fondo se define como la intensidad de senal dada por un anticuerpo no especffico del mismo isotipo que el anticuerpo especffico usado para detectar cada marcador de superficie en analisis FACS convencional. Para que un marcador se considere positivo la senal especffica observada es mas fuerte del 20%, preferiblemente mas fuerte del 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 500%, 1000%, 5000%, 10000% o superior, que la intensidad de la senal de fondo usando metodos y aparatos convencionales por ejemplo un sistema Beckman Coulter Epics XL FACS usado con anticuerpos comercialmente disponibles y protocolos estandar conocidos en la tecnica).

Ademas, pueden usarse anticuerpos monoclonales comercialmente disponibles y conocidos contra dichos marcadores de superficie celular (por ejemplo, receptores celulares y protefnas de transmembrana) para identificar celulas relevantes.

El termino "tejido conector" se refiere a tejido derivado de la mesenquima e incluye varios tejidos que se caracterizan en que sus celulas se incluyen dentro de la matriz extracelular. Ejemplos de tejidos conectores incluyen, pero no estan limitados a, tejidos adiposo y cartilaginoso.

El termino "fibroblasto" como se usa en la presente debe entenderse que incluye fibroblastos como celulas sinoviales.

El termino celula T" se refiere a celulas del sistema inmune que son un subconjunto de los linfocitos y expresan el receptor de celulas T (TCR). El termino "celulas T reguladoras" (tambien referidas en la presente como celulas T-reg) se refiere a subconjuntos de celulas T que suprimen activamente la activacion del sistema inmune y evitan la auto-reactividad patologica, es decir, una enfermedad autoinmune. El termino "celulas T reguladoras" o "celulas T-reg" debe entenderse que incluye tanto las celulas t de origen natural (celulas T-reg FoxP3+) como celulas T adaptativas (tambien conocidas como celulas Tr1 o celulas Th3) que no expresan la molecula Fox P3.

El termino "gluten" deben entenderse que significa una protefna que comprende componentes de gliadina y glutenina.

Como se usa en la presente, los terminos "tratar", "tratamiento" y "tratando" cuando se usan directamente en referencia a un paciente o sujeto debe entenderse que significa la mejora de uno o mas sfntomas asociados con un trastorno incluyendo, pero no limitado a, un trastorno inflamatorio, una enfermedad autoinmune o una enfermedad mediada inmunologicamente incluyendo rechazo de organos y tejidos trasplantados, en donde dicha mejora resulta de la administracion de celulas inmunomoduladoras de la invencion, o una composicion farmaceutica que comprende las mismas, a un sujeto con necesidad de dicho tratamiento.

Como se usa en la presente los termino "reparar" y "reparacion" cuando se usan directamente en referencia a tejidos danados debe entenderse que significan la mejora de dicho dano tanto por mecanismos directos como la regeneracion de tejidos danados, como a traves de mecanismos indirectos, por ejemplo reduciendo la inflamacion permitiendo de este modo la formacion de tejido.

El termino "terapia de combinacion" se refiere al uso de celulas inmunomoduladoras de la presente invencion o composiciones farmaceuticas que comprenden las mismas junto con otros agentes activos o modalidades de tratamiento, de la manera de la presente invencion para la mejora de uno o mas sfntomas asociados con un trastorno incluyendo, pero no limitado a, un trastorno inflamatorio, una enfermedad autoinmune o una enfermedad mediada inmunologicamente incluyendo el rechazo de organos o tejidos trasplantados. Estos otros agentes o tratamientos pueden incluir farmacos y terapias conocidas para el tratamiento de dichos trastornos como, pero no limitado a, corticoesteroides y compuestos antiinflamatorios no esteroideos.

Las celulas inmunomoduladoras de la invencion, o las composiciones farmaceuticas que comprende las mismas pueden combinarse tambien con otras modalidades de tratamiento, por ejemplo, corticoesteroides, compuestos antiinflamatorios no esteroideos, u otros agentes utiles en el tratamiento de la inflamacion. El uso combinado de los agentes de la presente invencion con estas otras terapias o modalidades de tratamiento puede ser concurrente, o dado secuencialmente, es decir, los dos tratamientos pueden dividirse de tal manera que dichas celulas inmunomoduladoras o una composicion farmaceutica que comprende las mismas puede darse antes o despues de la otra terapia o modalidad de tratamiento. El medico asistente puede decidir la secuencia apropiada de administracion de las celulas inmunomoduladoras, o una composicion farmaceutica que comprende las mismas, en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

combinacion con otros agentes, terapias o modalidades de tratamiento.

Breve Descripcion de las Figuras

La Figura 1 ilustra que la administracion de celulas madre derivadas de tejido adiposo expandido disminuye la puntuacion de artritis en un modelo de raton de artritis inducida por colageno y que la administracion intralinfatica es mas terapeuticamente efectiva que la via intravenosa. Grupo A control sin tratar; Grupo C: 1 millon de ASCs administradas IV en 5 dfas consecutivos; Grupo C 1 millon de ASCs administradas IV en 5 dfas consecutivos; Grupo D: 3 millones de ASCs administradas el primer dfa y 1 millon de ASCs administradas en los dfas 3 y 5; Grupo E: 320.000 ASCs administradas intralinfaticamente en los dfas 1 y 7; Grupo F; vehfculo administrado intralinfaticamente en los dfas 1 y 7.

Descripcion de la Invencion

En un aspecto la presente invencion proporciona una terapia celular que comprende celulas madre mesenquimales para su uso en el tratamiento, modulacion, profilaxis y/o mejora de un trastorno inflamatorio y/o inmune, en el que la terapia celular se administra al sistema linfatico. La administracion intralinfatica se lleva a cabo por inyeccion intralinfatica. La terapia celular esta adaptada para la inyeccion intralinfatica.

La administracion de celulas madre directamente en el sistema linfatico tiene varias ventajas sobre el estado de la tecnica, concretamente sobre la inyeccion subcutanea convencional de dichas celulas madre, por ejemplo, es suficiente una cantidad inferior de celulas inmunomoduladoras; la terapia no es mas dolorosa para el paciente que las inyecciones subcutaneas regulares, y hay menos efectos secundarios adversos. Ademas, por aplicacion directa al tejido linfatico, por ejemplo por inyeccion intranodal, las celulas inmunomoduladoras se administran mas cerca al sitio de tratamiento o reparacion del tejido danado.

Las celulas inmunomoduladoras, asf como los medicamentos y composiciones farmaceuticas que comprenden las mismas, de acuerdo con la presente invencion pueden, simultaneamente con la administracion intralinfatica, administrate por vfas convencionales, como administracion subcutanea o administracion sublingual, oral, transcutanea (vacunacion topica), intradermica, intramedular, intratecal, intraventricular, intranasal, conjuntival, intrabronquial, transdermica, intrarectal, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal o intraocularmente.

La terapia celular de acuerdo con la presente invencion comprende celulas madre mesenquimales (referidas en lo sucesivo tambien como MSC), mas preferiblemente celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (referidas en la presente tambien como ASC), que son MSCs que se originan de tejido adiposo, generalmente de tejido adiposo humano (hASCs).

Los fibroblastos de la presente divulgacion son tejido conector derivado de la mesenquima que estan asociados con la sfntesis y mantenimiento de la matriz extracelular y debe entenderse que incluyen fibroblastos como celulas sinoviales. Los fibroblastos pueden obtenerse de cualquier animal adecuado, mas preferiblemente un humano.

Las celulas T reguladoras (conocidas algunas veces como celulas T supresoras) de la presente divulgacion pueden derivarse de cualquier fuente adecuada, como sangre o bazo. Las celulas T reguladoras pueden ser celulas CD4+Foxp3+ de origen natural, o pueden ser celulas T reguladoras aisladas ex-vivo y/o expandidas. Los metodos para la expansion ex-vivo de celulas T reguladoras son conocidos en la tecnica e incluyen el aislamiento de sangre completa (por ejemplo, como parte de la fraccion PBMC) seguido por expansion usando, por ejemplo celulas madre mesenquimales o Rapamicina.

Las MSC usadas en el metodo de la presente invencion se derivan preferiblemente de tejido conector. En una realizacion preferida dichas MSC se derivan de tejido adiposo y en una realizacion preferida adicional de la fraccion estromal del tejido adiposo. En una realizacion alternative, dichas MSC se obtienen de condrocitos del cartflago hialino. En una realizacion adicional, dichas MSC se obtienen de la piel. En otra realizacion, dichas MSC se obtienen de medula osea.

Las MSC pueden obtenerse de cualquier fuente adecuada de tejido conector de cualquier animal adecuado, mas preferiblemente humanos. Se prefiere que dichas celulas se obtengan de fuentes mamfferas no patologicas, preferiblemente fuentes post-natales (por ejemplo roedor o primate). En una realizacion preferida, las MSC se obtienen de una fuente de tejido conector como, pero no limitado a, la fraccion estromal del tejido adiposo, cartflago hialino, medula osea o piel. Mas preferiblemente las MSC de los metodos de la presente invencion se obtienen de tejido adiposo no patologico, post natal, humano estromal.

Con respecto al recipiente pretendido de las celulas inmunomoduladoras se administran de acuerdo con el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

metodo de la presente invencion, las MSC usadas en dicho metodo anteriormente descrito puede ser de origen o alogenico (donante) o autologo (sujeto). En una realizacion del metodo dichas MSC son de origen alogenico. En una realizacion del metodo dichas MSC son de origen autologo.

Las MSC usadas en el metodo de la presente invencion se caracterizan preferiblemente en que (i) no expresan marcadores especfficos para celulas que presentan antfgenos, (ii) no expresan IDO (Indoleamina 2,3- dioxigenasa) constitutivamente, (iii) expresan IDO tras la estimulacion con IFN-gamma, y en el cado de MSC (iv) presentan la capacidad de diferenciarse en al menos dos linajes celulares.

Las celulas madre de acuerdo con la presente invencion se administran preferiblemente en un portador fisiologicamente aceptable adecuado para inyeccion. En general, puede usarse en la practica de esta invencion cualquier portador fisiologicamente aceptable conocido para el uso. La eleccion de dichos portadores incluye, sin limitacion, solucion de Ringer, agua, soluciones salinas estandar, soluciones de dextrosa y agua de albumina, y esta facilmente dentro del conocimiento de la tecnica.

Opcionalmente, el sistema linfatico o una parte del mismo, por ejemplo un area localizada de un vaso linfatico o un organo linfatico, preferiblemente un ganglio linfatico, puede visualizarse durante el procedimiento de inyeccion. Pueden usarse medios de visualizacion por ultrasonidos, radiologicos u otros medios de visualizacion como tomograffa axial computarizada (escaneo CAT) para visualizar el ganglio linfatico y monitorizar la localizacion de la aguja y cambios en el ganglio linfatico, como hinchazon. Se prefiere la inyeccion en los ganglios linfaticos axilares e inguinales debido a la facilidad de la localizacion e inyeccion guiados por ultrasonidos.

La tecnica usada para las inyecciones esta dentro del conocimiento de la tecnica. Un metodo es usar una jeringuilla de camara unica que contiene las celulas en formulacion lfquida.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona una celula madre mesenquimal para su uso en un metodo para el tratamiento, modulacion, profilaxis y/o mejora de un trastorno inflamatorio y/o inmune, en un sujeto con necesidad de dicho tratamiento, que comprende administrar al sistema linfatico de dicho sujeto una cantidad profilactica o terapeuticamente efectiva de una composicion que comprende una terapia celular que comprende MSC y que comprende ademas la administracion de un antfgeno directamente al sistema linfatico de dicho sujeto. Dicho antfgeno puede administrate antes, concurrentemente con o posteriormente a la administracion de la terapia celular. El antfgeno puede administrate al menos 1,2, 3, 5 o 10 horas antes o posteriormente a la administracion de la terapia celular.

El antfgeno usado en dichos metodos puede ser un antfgeno elegido, grupo de antfgenos o tipos de celulas que expresan y/o presentan dicho antfgeno o antfgenos. En una realizacion el antfgeno se selecciona de un grupo que comprende: una mezcla de autoantfgenos derivados de un paciente que padece de autoinmunidad, un antfgeno peptfdico, un acido nucleico, un ligando peptfdico alterado, una protefna recombinante o fragmentos de los mismos. En una realizacion dichos antfgenos se asocian con artritis (como pero no limitado a antfgenos de colageno). En una realizacion alternativa dichos antfgenos se asocian con enfermedad celiaca. Los antfgenos asociados con enfermedad celiaca son miembros de la familia del gluten incluyendo algunas formas de prolaminas (como pero no limitado a antfgenos de gliadinas, hordefnas y/o secalinas). En una realizacion adicional dichos antfgenos se asocian con la esclerosis multiples (como perno limitado a antfgenos de mielina). Los metodos para el aislamiento, purificacion y preparacion de dichos antfgenos son conocidos por el experto en la tecnica.

Se prefiere particularmente que la terapia celular de todos los aspectos de la presente invencion se administre directamente a un organo linfatico, mas preferiblemente un organo linfatico periferico, incluyendo pero no limitado a ganglios linfaticos, mas preferiblemente un ganglio linfatico axilar o inguinal. En individuos que carecen de ganglios linfaticos o que tienen defectos en los mismos, la terapia celular puede administrate al tejido linfatico o a una celula inmune.

Los metodos para la administracion intralinfatica son conocidos en la tecnica y se llevan a cabo comunmente por medio de un dispositivo de inyeccion (por ejemplo una jeringuilla). La administracion puede ayudarse y observarse por medio de un dispositivo de formacion de imagenes como, pero no limitado a, radiologico, ultrasonidos y tomograffa axial computarizada (escaneo CAT). Esto permite la administracion precisa de la terapia celular y tambien la monitorizacion de los organos linfaticos para eventos adversos. En un aspecto del metodo el sujeto se trata con una pluralidad de dosis de la terapia celular administrada intralinfaticamente. Preferiblemente se administran al menos 2, 3, 4, 5, 10 o 15 dosis en intervalos. En un aspecto adicional del metodo cada una de dichas dosis comprende entre 10.000 y 5.000.000 celulas. en una realizacion adicional cada una de dichas dosis comprende entre 10.000 y 100.000 celulas; 100.000 y 500.000 celulas; 500.000 y 1.000.000 de celulas o entre 1.000.000 y 5.000.000 de celulas.

Tambien se divulgan celulas madre, celulas T reguladoras y/o celulas de fibroblastos para la administracion al sistema linfatico.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

La divulgacion tambien abarca el uso de una celula madre, celula T reguladora y/o celula de fibroblasto como un medicamento para tratar o reparar tejido danado (preferiblemente tejido mesenquimal), y/o para el tratamiento, modulacion, profilaxis y/o mejora de uno o mas sfntomas asociados con trastornos inflamatorios y/o inmunes, por la administracion de una celula madre, celula T reguladora y/o celula de fibroblasto al sistema linfatico.

Un aspecto alternativo de la presente invencion proporciona el uso de una celula madre mesenquimal en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento, modulacion, profilaxis y/o mejora de un trastorno inflamatorio y/o inmune, por la administracion de la celula madre al sistema linfatico.

En un aspecto adicional la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para su administracion al sistema linfatico que comprende celulas madre mesenquimales. Dichas composiciones farmaceuticas son de uso en el tratamiento, modulacion, profilaxis y/o mejora de un trastorno inflamatorio y/o inmune como, pero no limitado a, enfermedades autoinmunes, trastornos inflamatorios y enfermedades mediadas inmunologicamente incluyendo el rechazo de organos y tejidos trasplantados. En una realizacion de la invencion la composicion farmaceutica puede comprender ademas un antfgeno, grupo de antfgenos o tipos celulares que expresan y/o presentan dicho antfgeno o antfgenos. En una realizacion el antfgeno se selecciona de un grupo que comprende: una mezcla de autoantfgenos derivados de un paciente que sufre de autoinmunidad, un antfgeno peptfdico, un acido nucleico, un ligando peptfdico alterado, una protefna recombinante o fragmentos de los mismos. En una realizacion dichos antfgenos estan asociados con artritis, como pero no limitados a antfgenos de colageno. En una realizacion alternativa dichos antfgenos estan asociados con Enfermedad Celiaca. Los antfgenos asociados con enfermedad celiaca son miembros de la familia del gluten incluyendo formas de prolaminas (como pero no limitado a antfgenos de gliadinas, hordefnas y/o secalinas). El gluten y sus componentes, glutanina y gliadina, son los antfgenos preferidos asociados con enfermedad celiaca. En una realizacion adicional dichos antfgenos estan asociados con la esclerosis multiple, como pero no limitados a antfgenos de mielina y antfgenos de componentes de mielina como protefna basica de mielina (MBP), glicoprotefna de oligodendrocitos de mielina (MOG), protefna proteolfpida (PLP) y glicolipidos de mielina, por ejemplo galactocerebrosido. Los metodos para el aislamiento, purificacion y preparacion de dichos antfgenos son conocidos por el experto en la tecnica.

La composicion farmaceutica de la invencion comprende una cantidad profilactica o terapeuticamente efectiva de celulas madre mesenquimales, opcionalmente antfgeno, y un portador farmaceuticamente aceptable. Ejemplos de dosificaciones y regfmenes de dosificacion para cada uno de estos tipos celulares se dan mas arriba. Los portadores farmaceuticos adecuados son conocidos en la tecnica y son preferiblemente los aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal de US o un gobierno estatal o enumerados en la Farmacopea US o la Farmacopea Europea, u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y mas particularmente en humanos. El termino "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehfculo con el que se administra el agente terapeutico. La composicion, si se desea, puede tambien contener cantidades menores de agentes de tamponamiento del pH. Ejemplos de portadores farmaceuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E W Martin. Tales composiciones contendran una cantidad profilactica o terapeuticamente efectiva de un agente profilactico o terapeutico preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de un portador para proporciona la forma para la administracion apropiada al sujeto. La formulacion debe adecuarse al modo de administracion. En una realizacion preferida, las composiciones farmaceuticas son esteriles y en forma adecuada para la administracion a un sujeto, preferiblemente un sujeto animal, mas preferiblemente un sujeto mamffero, y lo mas preferido a un sujeto humano.

La composicion farmaceutica de la invencion puede estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas semisolidas y lfquidas, como preparaciones liofilizadas, soluciones o suspensiones lfquidas, soluciones inyectables o infusibles, etc. Como se ha indicado anteriormente, la composicion farmaceutica es preferiblemente inyectable.

Se prefiere que los metodos, medicamentos, composiciones y celulas de la invencion se usen para el tratamiento, modulacion, profilaxis y/o mejora de uno o mas sfntomas asociados con trastornos inflamatorios y/o inmunes. Por consiguiente los metodos y celulas de la invencion son para el uso en el tratamiento de cualquier trastorno caracterizado por alguno o todos de los sfntomas mencionados, como se define en las reivindicaciones. Una lista no exhaustiva representative de tales trastornos se proporciona en la seccion de definiciones. Se prefiere particularmente el uso de los metodos, medicamentos, composiciones y celulas de la invencion en el tratamiento de enfermedades inflamatorias inmunomediadas. Se prefiere mas el uso de los metodos, medicamentos, composiciones y celulas de la invencion en el tratamiento de diabetes mellitus, artritis reumatoide (RA), enfermedad inflamatoria intestinal (IBD, incluyendo enfermedad de Crohn y/o colitis ulcerosa) y esclerosis multiple (MS). Incluso se prefiere mas particularmente el uso de los metodos, medicamentos, composiciones y celulas de la invencion en el tratamiento de artritis reumatoide.

En donde el metodo o composicion de la invencion comprende uno o mas antfgenos se prefiere que el metodo o composicion se use en el tratamiento del trastorno asociado con o inducido por dicho antfgeno, por

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

ejemplo en donde el antfgeno es colageno el metodo o composicion puede usarse en el tratamiento de artritis, en donde el antfgeno es un componente del gluten los metodos o composiciones pueden usarse en el tratamiento de enfermedad celiaca, en donde el antfgeno es un componente de mielina los metodos o composiciones pueden usarse para tratar la esclerosis multiple. Las composiciones preferidas comprenden por lo tanto: MSC, preferiblemente ASC, y colageno, para el tratamiento de artritis; MSC, preferiblemente ASC, y gluten y/o un componente del gluten, para el tratamiento de enfermedad celiaca; MSC, preferiblemente ASC, y mielina y/o un componente de mielina, para el tratamiento de esclerosis multiple.

En un aspecto adicional la presente divulgacion proporciona un kit que comprende i) un medicamento que comprende una celula madre, celula T reguladora y/o poblacion de fibroblastos y ii) instrucciones para el uso de los mismos de acuerdo con los metodos de la presente invencion.

En una realizacion adicional de la divulgacion dicho kit puede comprender ademas iii) uno o mas antfgenos. MARCADORES DEL FENOTIPO DE MSC

Las MSC usadas en un metodo preferido de la presente invencion son preferiblemente negatives para marcadores asociados con fenotipos APC (Celulas que presentan antfgenos). Por lo tanto se prefiere que dichas MSC sean negativas para al menos uno, dos, tres, cuatro o preferiblemente todos los marcadores siguientes: CD 11b; CD 11c; CD14; CD45; HLAI1. Ademas, las MSC son preferiblemente negativas para al menos uno, dos o preferiblemente todos los marcadores de superficie celular siguientes: CD31; CD34; CD 133.

En una realizacion particular, las MSC como se usan en el presente metodo se caracterizan preferiblemente en que expresan (es decir, son positivas para) al menos uno, dos, tres, cuatro o preferiblemente todos los marcadores de superficie celular siguientes CD9, CD44, CD54, CD90 y CD 105. Preferiblemente las MSC se caracterizan en que tienen niveles de expresion significativos de al menos uno, dos, tras, cuatro y preferiblemente todos de los marcadores de superficie mencionados CD9, CD44, CD54, CD90 y CD 105.

Opcionalmente, las MSC pueden ser tambien negativas para el marcador de superficie celular CD 106 (VCAM-1). Ejemplo de MSC adecuadas para su uso en el metodo de la presente invencion se describen en la tecnica, por ejemplo en la WO2007039150.

DIFERENCIACION

Las MSC adecuadas para el uso en el metodo de la presente invencion son preferiblemente celulas madre multipotentes o pluripotentes y pueden presentar la capacidad de proliferar y diferenciarse en al menos dos, mas preferiblemente tres, cuatro, cinco, seis, siete o mas linajes celulares. Ejemplos ilustrativos no limitativos de linajes celulares en los que dichas MSC pueden diferenciarse incluyen osteocitos, adipocitos, condrocitos, tenocitos, miocitos, cardiomiocitos, celulas estromales de soporte hematopoyetico, celulas endoteliales, neuronas, astrocitos y hepatocitos. Las MSC pueden proliferar y diferenciarse en celulas de otros linajes por metodos convencionales. Los metodos para identificar y posteriormente aislar las celulas diferenciadas de sus contra parti das sin diferenciar pueden llevarse a cabo tambien por metodos bien conocidos en la tecnica.

AISLAMIENTO DE MSC

Los metodos para el aislamiento de MSC son conocidos en la tecnica, y puede usarse cualquier metodo adecuado. En una realizacion el aislamiento de ASC puede comprender los pasos de:

(i) preparar una suspension celular a partir de una muestra de tejido adiposo;

(ii) recuperar las celulas de dicha suspension celular;

(iii) incubar dichas celulas en un medio de cultivo celular adecuado en una superficie solida bajo condiciones

que permiten a las celulas adherirse a la superficie solida y proliferar;

(iv) lavar dicha superficie solida despues de la incubacion para eliminar celulas no adheridas;

(v) seleccionar las celulas que despues de haber sido pasadas al menos dos veces en dicho medio

permanecen adheridas a dicha superficie solida; y

(vi) confirmar que la poblacion celular seleccionada presenta el fenotipo de interes.

Como se usa en la presente, el termino "superficie solida" se refiere a cualquier material sobre el que pueden adherirse las ASC. En una realizacion particular dicho material es un material plastico tratado para promover

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

la adhesion de celulas mamfferas a su superficie, por ejemplo placas de poliestireno comercialmente disponibles recubiertas opcionalmente con poli-D-Lisina u otros reactivos.

Los pasos (i)-(vi) pueden llevarse a cabo por tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica. Brevemente, la ASC puede obtenerse por medios convencionales de cualquier fuente adecuada de tejido conector de cualquier animal adecuado como se ha tratado anteriormente. Tfpicamente, las celulas adiposas humanas se obtienen de donantes vivos, usando protocolos bien reconocidos como lipectomfa quirurgica o de succion. De hecho, como los procedimientos de liposuccion son tan comunes, el efluente de liposuccion es una fuente particularmente preferida de la que se puede derivar la ASC. Asf, en una realizacion particular, las ASC son de la fraccion estromal de tejido adiposo humano obtenido por liposuccion.

El tejido se lava, preferiblemente, antes de ser procesado para separar las ASC del resto del material. En un protocolo comunmente usado, la muestra de tejido se lava con solucion salina fisiologicamente compatible (por ejemplo solucion salina tamponada con fosfato (PBS)) y despues se agita vigorosamente y se deja que se asiente, un paso que elimina materia suelta (por ejemplo tejido danado, sangre, eritrocitos, etc.) del tejido. Por lo tanto, los pasos de lavado y asentamiento se repiten generalmente hasta que el sobrenadante esta relativamente claro de desechos. Las celulas restantes estaran generalmente presentes en grumos de varios tamanos, y el protocolo procede usando pasos calibrados para degradar la estructura bruta a la vez que se minimiza el dano a las mismas celulas. Un metodo de logar este fin es tratar los grumos lacados de celulas con un enzima que debilita o destruye los enlaces entre las celulas (por ejemplo, colagenasa, dispasa, tripsina, etc.). La cantidad y duracion de dicho tratamiento enzimatico variara, dependiendo de las condiciones empleadas, pero el uso de dichos enzimas es conocido generalmente en la tecnica. Alternativamente, o en conjuncion con dicho tratamiento enzimatico, los grumos de celulas pueden degradarse usando otros tratamientos, como agitacion mecanica, energfa sonica, energfa termica, etc. Si la degradacion se logra por metodos enzimaticos, es deseable neutralizar el enzima tras un periodo adecuado, para minimizar efectos perjudiciales en las celulas.

El paso de degradacion produce tfpicamente un lodo o suspension de celulas agregadas y una fraccion fluida que contiene celulas estromales generalmente libres (por ejemplo, globulos rojos, celulas de musculo blando, celulas endoteliales, celulas de fibroblastos y celulas madre). La siguiente etapa en el proceso de separacion es separar las celulas agregadas de las ASC. Esto puede conseguirse por centrifugacion, que fuerza a las celulas a un pellet recubierto por un sobrenadante. El sobrenadante puede desecharse y el pellet suspenderse en un fluido fisiologicamente compatible. Ademas, las celulas suspendidas comprenden tfpicamente eritrocitos, y en la mayorfa de los protocolos es deseable lisarlas. Los metodos para lisar selectivamente eritrocitos se conocen en la tecnica, y puede emplearse cualquier protocolo adecuado (por ejemplo incubacion en un medio hiper- o hipotonico, por lisis usando cloruro de amonio, etc.). Por supuesto, si se lisan los eritrocitos, las celulas restantes deberfan entonces separarse del lisado, por ejemplo por fi ltracion, sedimentacion o fraccionamiento de la densidad.

Independientemente de si se lisan los eritrocitos, las celulas suspendidas pueden lavarse, recentrifugarse, y resuspenderse una o mas veces sucesivas para lograra pureza mas alta. Alternativamente, las celulas pueden separarse en base al perfil del marcador de superficie celular o en base al tamano de la celula y granularidad.

Despues del aislamiento final y la re-suspension, las celulas pueden cultivarse y , si se desea, ensayarse para numero y viabilidad para evaluar el rendimiento. Preferiblemente, las celulas se cultivaran sin diferenciacion, en una superficie solida, usando un medio de cultivo celular adecuado, a las densidades celulares y condiciones de cultivo apropiadas. Asf, en una realizacion particular, las celulas se cultivan sin diferenciacion en una superficie solida, hecha habitualmente de un material plastico como placas de Petri o frascos de cultivo celular, en presencia de un medio de cultivo celular adecuado [por ejemplo, DMEM, suplementado tfpicamente con 5-15% (por ejemplo 10%) de un suero adecuado, como suero bovino fetal o suero humano], y se incuban bajo condiciones que permiten a las celulas adherirse a la superficie solida y proliferar. Tras la incubacion, las celulas se lavan para eliminar las celulas no adheridas y fragmentos celulares. Las celulas se mantienen en cultivo en el mismo medio y bajo las mismas condiciones hasta que alcanzan la confluencia adecuada, tfpicamente, alrededor del 70%, alrededor del 80% o alrededor del 90% de confluencia celular, con el reemplazo del medio de cultivo celular cuando sea necesario. Despues de alcanzar la confluencia celular deseada, las celulas pueden expandirse por medio de pases consecutivos usando un agente de separacion como tripsina y sembrandolas en una nueva superficie de cultivo celular a una densidad celular apropiada (habitualmente 2.000-10.000 celulas/cm2). Asf, las celulas se pasan despues al menos dos veces en dicho medio sin diferenciacion, mientras mantienen todavfa su fenotipo de desarrollo, y mas preferiblemente, las celulas pueden pasarse al menos 10 veces (por ejemplo al menos 15 veces o incluso al menos 20 veces) sin perder el fenotipo de desarrollo. Tfpicamente, las celulas se colocan en placas a una densidad deseada como entre alrededor de 100 celulas/cm2 a alrededor de 100.000 celulas/cm2 (como alrededor de 500 celulas/cm2 a alrededor de 50.000 celulas/cm2, o mas particularmente entre alrededor de 1.000 celulas/cm2 a alrededor de 20.000 celulas /cm2). Si se colocan en placas a densidades mas bajas (por ejemplo alrededor de 300 celulas/cm2), las celulas pueden ser mas facilmente aisladas clonalmente. Por ejemplo, despues de unos pocos dfas, las celulas colocadas en placas a tales densidades, proliferaran en una poblacion homogenea. En una realizacion particular, la densidad celular esta entre 2.000-10.000 celulas/cm2.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Se seleccionan las celulas que permanecen adheridas a la superficie solida tras dicho tratamiento que comprende al menos dos pases y el fenotipo de interes se analiza por metodos convencionales para confirmar la identidad de las ASC como se mencionara a continuacion. Las celulas que permanecen adheridas a la superficie solida despues del primer pase don de origen heterogeneo; por lo tanto, dichas celulas deben someterse a al menos otro pase. Como resultado del metodo anterior, se obtiene una poblacion celular homogenea que tiene el fenotipo de interes. La adhesion de las celulas a la superficie solida despues de al menos dos pases constituye una realizacion preferida de la invencion para seleccionar las ASC. La confirmacion del fenotipo de interes puede llevarse a cabo usando medios convencionales.

Preferiblemente dicha expansion se lleva a cabo por la duplicacion o triplicacion de dicha poblacion al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 15 o al menos 20 veces. En una realizacion adicional dicha expansion se lleva a cabo durante al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 15 o al menos 20 pases.

Los marcadores de superficie celular pueden identificarse por cualquier tecnica convencional adecuada, habitualmente basada en una seleccion positiva/negativa; por ejemplo puede usarse anticuerpos monoclonales ; contra marcadores de superficie celular, cuya presencia/ausencia en las celulas esta por confirmar; aunque tambien pueden usarse otras tecnicas. Asf, en una realizacion particular, se usan anticuerpos monoclonales contra uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o preferiblemente todos de CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34 y CD133 para confirmar la ausencia de dichos marcadores en las celulas seleccionadas; y se usan anticuerpos monoclonales contra uno, dos, tres, cuatro, de o preferiblemente todos de CD9, CD44, CD54, CD90 y CD105 para confirmar la presencia de los mismos o niveles de expresion detectable de, al menos uno de y preferiblemente todos de, dichos marcadores. Dichos anticuerpos monoclonales se conocen, estan disponibles comercialmente o pueden obtenerse por un experto en la tecnica por metodos convencionales.

La actividad IDO inducible con IFN-y en las celulas seleccionadas puede determinarse por cualquier ensayo convencional adecuado. Por ejemplo, las celulas seleccionadas pueden estimularse con IFN-y y ensayarse para la expresion de IDO; despues puede realizarse un analisis Western-blot convencional para la expresion de protefna IDO y puede medirse la activad enzimatica IDO tras estimulacion IFN-y de las celulas seleccionadas por conversion de triptofano a kynurenina con por ejemplo analisis de Cromatograffa Liquida de Alto Rendimiento (HPLC) y determinacion fotometrica de la concentracion de kynurenina en el sobrenadante como lectura. Como las ASC expresan IDO bajo ciertas condiciones, puede usarse cualquier tecnica adecuada que permita la deteccion de actividad de IDO tras la estimulacion de IFN-y para seleccionar las ASC. La cantidad de IDO producida depende del numero de celulas por centfmetro cuadrado, que esta preferiblemente a un nivel de 5000 celulas/cm2 o mas, pero no limitada a esta concentracion y la concentracion de IFN-gamma que idealmente es de 3 ng/ml o mas, pero no limitada a esta concentracion. La actividad de IDO producida bajo las condiciones descritas resultara en una produccion detectable de kynurenina en el intervalo micro M despues de 24 horas o mas.

La capacidad de las celulas seleccionadas de diferenciarse en al menos dos linajes celulares puede ensayarse por metodos convencionales como se conoce en la tecnica.

Las ASC pueden expandirse clonalmente, si se desea usando un metodo adecuado para clonar poblaciones celulares. Por ejemplo, una poblacion proliferada de celulas puede recogerse ffsicamente y sembrarse en una superficie separada (o el pocillo de una placa multi-pocillos). Alternativamente, las celulas pueden subclonarse en una placa multi-pocillos a una proporcion estadfstica para facilitar la colocacion de una unica celula en cada pocillo (por ejemplo, de alrededor de 0,1 a alrededor de 1 celula/pocillo o incluso alrededor de 0,25 a alrededor de 0,5 celulas/pocillo, como 0,5 celulas/pocillo). Por supuesto, las celulas pueden clonarse colocandolas en placas a baja densidad (por ejemplo en una placa de Petri u otro sustrato adecuado) y aislandolas de otras celulas usando dispositivos como un anillo de clonacion. La produccion de una poblacion clonal puede expandirse en cualquier medio de cultivo adecuado. En cualquier caso, las celulas aisladas pueden cultivarse a un punto adecuado cuando se puede evaluar so fenotipo de desarrollo.

Se ha demostrado que la expansion ex vivo de las ASC sin inducir la diferenciacion puede lograrse durante periodos de tiempo extendidos por ejemplo usando lotes especialmente seleccionados de suero adecuado (como suero bovino fetal o suero humano). Los metodos para medir la viabilidad y rendimiento son conocidos en la tecnica (por ejemplo exclusion de azul de tripano).

Cualquiera de estos pasos y procedimientos para aislar las celulas de la poblacion celular de la invencion pueden realizarse manualmente si se desea. Alternativamente, el proceso de aislar dichas celulas puede facilitarse y/o automatizarse a traves de uno o mas dispositivos adecuados, ejemplos de los cuales son conocidos en la tecnica.

CULTIVO CELULAR DE MSC

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Tales MSC pueden ser tambien capaces de expandirse in vivo .Es decir, tras el aislamiento, tales MSC pueden mantenerse y permitirse que proliferen ex vivo en un medio de cultivo celular. dicho medio esta compuesto de, por ejemplo, Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con antibioticos (por ejemplo, 100 unidades/ml de Penicilina y 100 pg/ml de Estreptomicina) o sin antibioticos, y 2mM de glutamina, y suplementarse con 2-20% de suero bovino fetal (FBS). Esta dentro de la experiencia de un experto en la tecnica modificar o modular las concentraciones del medio y/o suplementos del medio como sea necesario para las celulas usadas. Los sueros a menudo contienen factores celulares y no celulares y componentes que son necesarios para la viabilidad y la expansion. Ejemplos de sueros incluyen suero bovino fetal (FBS), suero bovino (BS), suero de ternera (CS), suero de ternera fetal (FCS), suero de ternera recien nacida (NCS), suero de cabra (GS), suero de caballo (HS), suero porcino, suero de oveja, suero de conejo, suero de rata (RS), etc. Tambien esta dentro del alcance de la invencion que si dichas MSC son de origen humano, el medio de cultivo celular se suplemente con un suero humano, preferiblemente de origen autologo. Se entiende que los sueros pueden inactivarse por calor a 55-65° C si se considera necesario para inactivar componentes de la cascada de complementos. La modulacion de concentraciones de suero y/o extraccion del suero del medio de cultivo tambien pueden usarse para promover la supervivencia de uno o mas tipos celulares deseados. Preferiblemente, tales MSC se beneficiaran de concentraciones de FBS de alrededor del 2% a alrededor del 25%. En otra realizacion, las MSC pueden expandirse en un medio de cultivo celular de composicion definida, en el que el suero se reemplaza por una combinacion de albumina de suero, trasnferrina de suero, selenio y protefnas recombinantes incluyendo, pero no limitado a, insulina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), y factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) como se sabe en la tecnica.

Muchos medios de cultivo celular contienen ya aminoacidos, sin embargo algunos requieren suplementacion antes de cultivar las celulas. Tales aminoacidos incluyen, pero no estan limitados a, L-alanina, L- arginina, acido L-aspartico, L-asparagina, L-cistefna, L-cistina, acido L-glutamico, L-glutamina, L-glicina y similares.

Tambien se usan tfpicamente agentes antimicrobianos en el cultivo celular para mitigar la contaminacion bacteriana, micoplasmal y fungica. Tfpicamente, loa antibioticos o compuestos anti-micoticos usados son mezclas de penicilina/estreptomicina, pero tambien pueden incluir, pero no estan limitados a, amfotericina (Fungizona (R)), ampicilina, gentamicina, bleomicina, higromacina, kanamicina, mitomicina, etc.

Tambien pueden usarse ventajosamente hormonas en el cultivo celular e incluyen, pero no estan limitadas a, D-aldosterona, dietilestilbestrol (DES), dexametasona, b-estradiol, hidrocortisona, insulina, prolactina, progesterona, somatostatina/hormona de crecimiento humano (HGH), etc.

CELULAS EXPANDIDAS

En una realizacion las MSC pueden haber sido expandidas antes del uso en el metodo de la presente invencion. Los metodos para la expansion celular son conocidos en la tecnica.

CELULAS DISENADAS GENETICAMENTE

En otra realizacion las MSC pueden ser celulas disenadas geneticamente (por ejemplo transducidas o transfectadas con un acido nucleico exogeno), o derivadas de las mismas.

Por ejemplo dichas celulas pueden ser disenadas geneticamente para expresar constitutivamente indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), por ejemplo, por transfeccion con un constructo de acido nucleico apropiado que codifica dicho enzima y opcionalmente una secuencia promotora adecuada. El diseno genetico de celulas se conoce en la tecnica y puede llevarse a cabo por un experto en la tecnica.

CELULAS IRRADIADAS.

En otra realizacion las MSC pueden haber sido irradiadas antes de su uso en el metodo de la presente invencion. La irradiacion de celulas reduce las capacidades proliferativas y tiempos de supervivencia.

La irradiacion puede llevarse a cabo usando una fuente controlada adecuada de radiacion ionizantes, como un dispositivo de irradiacion gamma. Las condiciones de irradiacion deben ajustarse experimentalmente por un experto en la tecnica para determinar el tiempo de exposicion requerido para impartir una dosis de radiacion que provoque la detencion del crecimiento a largo plazo de las MSC. En otra realizacion dicha dosis de radiacion esta dentro de un intervalo seleccionado del grupo consistente de 1-100 Gy; 5-85 Gy, 10-70 Gy, 12-60 Gy, sin embargo, se prefiere particularmente que dicha dosis de radiacion este dentro del intervalo de 15-45 Gy.

CELULAS TRATADAS CON ANTAGONISTA DE CD26

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

En otra realizacion las MSC pueden tratarse con antagonista o inhibidor de CD26 antes del uso en el metodo de la presente invencion Los antagonistas e inhibidores de CD26 con conocidos en la tecnica e incluyen, pero no estan limitados a, Aminometilpiridina; P32/98; NVP DPP728; PSN9301; Isoleucina tiazolidida; Denagliptina; Sitagliptina; Vildagliptina; Saxagliptina; Alogliptina; Diprotin A y dicho tratamiento puede llevarse a cabo por un experto en la tecnica.

CELULAS ESTIMULADAS CON IFN-GAMMA

En otra realizacion las MSC pueden estimularse con interferon gama antes del uso en el metodo de la presente invencion. El tratamiento con IFN-gamma de las MSC para la estimulacion de las mismas se conoce en la tecnica y puede llevarse a cabo por un experto en la tecnica.

CELULAS ESTIMULADAS CON ANTIGENOS

En otra realizacion las MSC pueden estimularse con antfgenos antes del uso en el metodo de la presente invencion. El tratamiento con antfgenos de las MSC para la estimulacion de las mismas se conoce en la tecnica y puede llevarse a cabo por un experto en la tecnica.

MSC TRATADAS CON MITOMICINA C

En otra realizacion las MSC pueden tratarse con Mitomicina C antes del uso en el metodo de la presente invencion. El tratamiento con Mitomicina C de las MSC para la estimulacion de las mismas se conoce en la tecnica y puede llevarse a cabo por un experto en la tecnica.

Ademas, si se desea, las MSC pueden someterse a una combinacion de dos o tres tratamientos seleccionados del grupo consistente de irradiacion, estimulacion con IFN-gamma y tratamiento con Mitomicina C antes del uso en el metodo de la presente invencion.

Las condiciones de mantenimiento de dichas MSC pueden contener tambien factores celulares que permiten que las celulas permanezcan de forma indiferenciada. Es aparente para los expertos en la tecnica que antes de la diferenciacion, deben eliminarse los suplementos que inhiben la diferenciacion celular del medio de cultivo. Tambien es aparente que no todas las celulas requeriran estos factores. De hecho, estos factores pueden provocar efectos no deseados, dependiendo del tipo de celula.

Las caracterfstica y ventajas de la invencion se ilustran mas completamente con los siguientes ejemplos no limitativos, en donde todas las partes y porcentajes son por peso, a menos que se indique expresamente lo contrario.

Ejemplo 1: Tratamiento de artritis inducida por colageno (CIA) con ASCs Metodos y Materiales

Modelo de Raton de Artritis Inducida por Colagenos (CIA)

Se indujo artritis experimental en ratones macho DBA1/(H-2q) (6-8 semanas de edad). En el dfa del comienzo del estudio, se inyecto a cada raton subcutaneamente en la cola) (2-3 cm desde el cuerpo) con la primera dosis de una emulsion de colageno tipo II (CII) de pollo (1 mg/ml de concentracion final) en adyuvante completo de Freund (Concentracion final de 1 mg/ml de Tuberculosis Bacteriana) en un volumen de 0,1 ml/animal. 21 dfas despues de la primera inyeccion de colageno, se administro una segunda inyeccion (refuerzo) de CII (0,1 ml/animal) a cada animal, de nuevo subcutaneamente en la cola pero en una localizacion diferente a la de la primera inyeccion. En esta ocasion la suspension de colageno se hico usando adyuvante incompleto de Freund (IFA).

Cuando el fndice de puntuacion de artritis fue de alrededor de 2-4 los animales se trataron con celulas madre derivadas de tejido adiposo expandido o con el vehfculo (solucion de Ringer) como control. La evolucion del CIA se siguio diariamente (Lunes a Viernes) midiendo la inflamacion-rojez-anquilosis de las articulaciones de las extremidades superiores e inferiores, de acuerdo con un sistema de puntuacion preestablecido.

Se midio diariamente el volumen de ambas patas traseras de cada animal despues de la administracion del artfculo o vehfculo de prueba y se calculo la media para ambas patas. Ademas se sustrajo el volumen de patas traseras medido en el dfa 1 (antes de la primera inyeccion de colageno y se tomo como volumen basal) para cada animal del volumen de patas medido en cada dfa despues para obtener el aumento neto en el volumen de las patas (o edema) para cada animal. Adicionalmente, se puntuo la severidad de la artritis con la misma frecuencia y distribucion en tanto las patas delanteras como traseras de acuerdo con el siguiente sistema de puntuacion de fndice

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

de artritis:

0. Sin signos de artritis

1. Hinchazon y/o rojez de la pata a 1 dfgito

2. Dos grupos de articulaciones inflamadas (hinchazon y/o rojez)

3. Mas de dos grupos de articulaciones inflamadas (hinchazon y/o rojez)

4. Inflamacion de la pata entera. Artritis severa

La puntuacion final es la suma de estas puntuaciones para las cuatro patas. La puntuacion maxima es 16. Diseno Experimental Control

Grupo A = Sin tratamiento Administracion intravenosa

Grupo C = Inyeccion intravenosa de 1 millon de celulas por dosis, una dosis por dfa consecutivo. 5 dosis en total.

Grupo D = Inyeccion intravenosa de 3 millones de celulas en la primera dosis y 1 millon de celulas en la segunda y la tercera dosis, una dosis por dfa alterno. 3 dosis en total.

Administracion intralinfatica

Grupo E = Inyeccion intralinfatica de 320.000 celulas por dosis (160.000 ganglio inguinal derecho, 160.000 el izquierdo). 2 dosis en total, segunda dosis 7 dfas antes de la primera.

Control de Vehfculo

Grupo F = Inyeccion intralinfatica de solucion de Ringer. 2 dosis en total, segunda dosis 7 dfas antes de la

primera.

N=12 ratones/grupo.

Administracion Intravenosa

El artfculo de prueba se administro intravenosamente a traves de la vena de la cola mediante el uso de una aguja de mariposa esteril (25G). Los animales recibieron 5 dosis consecutivas o 3 dfas alternos (una por dfa). Los animales recibieron 0,2 ml de artfculo de prueba como una infusion a una tasa de 0,05 ml/min intravenosamente a traves de la vena de la cola.

Administracion intralinfatica en ganglios linfaticos inguinales

Se anestesiaron ratones DBA1 por inhalacion de 2,0 a 2,5% de isofloran por medio de una mascara nasal y se acostaron en una placa de calentamiento a 37°C. Despues de la depilacion (crema depilatoria sensible Veet) y la desinfeccion de la region inguinal con 70% de etanol, se hizo una incision de 6 a 8 mm en la region inguinal. Se localizaron los ganglios linfaticos dentro de la grasa inguinal y se inyectaron 8pl de vehfculo o vehfculo con ASCs (a una densidad de 20 millones de celulas/ml) en el ganglio linfatico usando una jeringuilla Hamilton con una aguja de calibre 30. La incision se suturo con uno o dos nudos y el procedimiento se repitio en el ganglio linfatico inguinal en el otro lado. Se permitio que los ratones se recuperasen de la anestesia. Despues de siete dfas, se repitio el procedimiento.

Preparacion de Celulas Madre Derivadas de Tejido Adiposo Expandido

Se obtuvo tejido adiposo humano por liposuccion, bajo anestesia local y sedacion general. Se introdujo una canula de punta roma hueca en el espacio subcutaneo a traves de una incision pequena (menos de 0,5 cm de diametro). Con succion suave, la canula se movio a traves del compartimento de la pared abdominal de tejido adiposo para disrupcion mecanica del tejido graso. Se inyectaron una solucion salina y la epinefrina vasoconstrictora en el compartimento de tejido adiposo para minimizar la perdida de sangre. De este modo, se obtuvieron de 80 a 100 ml de lipoaspiracion bruta de cada paciente a tratar.

La lipoaspiracion bruta se lavo extensivamente con solucion salina tamponada con fosfato esteril (PBS; Gibco BRL, Paisley, Scotland, UK) para eliminar las celulas sangufneas, la solucion salina y la anestesia local. La

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

matriz extracelular se digirio con una solucion de colagenasa tipo II (0,075%; Gibco BRL) en solucion salina equilibrada (5 mg/ml; Sigma, St. Louis, USA) durante 30 minutos a 37° C para liberar la fraccion celular. Despues la colagenasa se inactive por la adicion de un volumen igual de medio de cultivo celular (medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco BRL) que contenfa 10& de suero bovino fetal (FBS; Gibco BRL). La suspension de celulas se centrifugo a 250 x g durante 10 minutos. Las celulas se resuspendieron en 0,16 M NHUCl y se dejo reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT) para lisis de eiritrocitos. La mezcla se centrifugo a 250 x g, y las celulas se resuspendieron en DMEM mas 10% de FBS y 1% de mezcla de ampicilina/estreptomicina (Gibco bRl) y despues se filtraron a traves de una malla de 40 pm y se colocaron en placas en matraces de cultivo de tejido a una concentracion de 10-30 x 103 celulas/cm2.

Las celulas se cultivaron durante 24 horas a 37° C en una atmosfera de 5% de CO2 en aire. Despues los matraces de cultivo se lavaron con PBS para eliminar celulas no adheridas y fragmentos celulares. Las celulas se mantuvieron en cultivo en el mismo medio y bajo las mismas condiciones hasta que alcanzaron aproximadamente un 80% de confluencia, con el reemplazo del medio de cultivo cada 3 a 4 dfas. Las celulas se pasaron entonces con tripsina-EDTA (Gibco BRL) a una dilucion de 1:3 que corresponde con una densidad celular de aproximadamente alrededor de 5-6 x 103 celulas/cm2.

Para los experimentos, las celulas a una duplicacion de 12-16 fueron tripsinizadas y resuspendidas a una densidad celular deseada en el vehfculo (solucion de Ringer). Despues se transfirieron a la jeringuilla y se inyectaron en los ratones.

Analisis Estadistico

Se evaluo la significancia estadfstica de los resultados usando el programa estadistico GraphPad Instat 3. Los resultados se expresan como la media±error estandar de la media, conde (n) es el numero de animales.

La Figura 1 esta anotada para ilustrar los valores de p de una comparacion del Grupo A frente al Grupo E. Las diferencias significativas se denotan como : *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. La diferencia entre los grupos se evaluo por la prueba de Kruskal-Wallis para datos desemparejados con post-test de Dunn de comparaciones multiples. Se tomo un valor de P<0,05 como significativo.

Resultados

La artritis se indujo en ratones DBA1 por inyeccion de colageno II de pollo. Cuando los ratones mostraron un valor de artritis de 2-4 se trataron con ASCs expandidas por via intravenosa o intralinfatica. Como un control para la administracion intralinfatica, los ratones se trataron con el vehfculo. La puntuacion de artritis se monitorizo diariamente (ver Tabla 1). Mientras que los ratones sin tratar o los ratones tratados con vehfculo mostraron inflamacion alta de las patas que aumento de una manera dependiente del tiempo, los ratones tratados con ASCs expandidas administradas intralinfaticamente mostraron inflamacion significativamente reducida. Ademas, el efecto terapeutico de la administracion intralinfatica fue mas alta que la administracion intravenosa (ver Figura 1).

Conclusion

El presente estudio muestra que la administracion intralinfatica de ASCs humanas a ratones DBA1 da como resultado una reduccion estadfsticamente significativa de la severidad de la artritis (como se indica por la puntuacion de fndice de artritis).

Ademas, el efecto terapeutico de la administracion intralinfatica de un total de 640.000 ASCs (en dos dosis) fue significativamente mas alta que la administracion intravenosa de un total de 5 millones de celulas. Estos resultados indican que la via intralinfatica de administracion es mas eficaz ya que se alcanza un efecto terapeutico mas alto con un menor numero de celulas.

Por consiguiente, aunque la invencion se ha descrito en la presente en referencia a aspectos, caracterfsticas y realizaciones ilustrativas especfficos de la invencion, se apreciara que la utilidad de la invencion no esta asf limitada, sino que se extiende y abarca numerosos otros aspectos, caracterfsticas y realizaciones.

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACI ONES

   1. Una celula madre mesenquimal para su uso en un metodo para tratar, modular, mejorar y/o la profilaxis de un trastorno inflamatorio y/o inmune; en el que la celula madre mesenquimal se administra al sistema linfatico por inyeccion intral infatica.
2. 2. La celula madre mesenquimal para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha celula madre mesenquimal es una celula madre mesenquimal derivada de tejido adiposo.
3. 3. La celula madre mesenquimal para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el metodo comprende ademas la administracion de un antfgeno al sistema linfatico de un sujeto.
4. 4. La celula madre mesenquimal para su uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde dicho antfgeno se administra antes que, concurrentemente con o posteriormente a la administracion de la celula madre mesenquimal.
5. 5. La celula madre mesenquimal para su uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde dicho antfgeno se administra al menos 1, 2, 3, 5 o 10 horas antes o posteriormente a la administracion de la celula madre mesenquimal.
6. 6. La celula madre mesenquimal para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la celula madre mesenquimal se administra a un organo linfatico, opcionalmente un organo linfatico periferico, opcionalmente un ganglio linfatico, opcionalmente un ganglio linfatico axilar o inguinal.
7. 7. La celula madre mesenquimal para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha administracion se lleva a cabo por medio de una jeringuilla, opcionalmente comprendiendo ademas el paso de usar un dispositivo radiologico, de ultrasonidos o de formacion de imagenes para monitorizar la localizacion de una aguja de inyeccion.
8. 8. El uso de una celula madre mesenquimal en la fabricacion de un medicamente para el tratamiento, modulacion, profilaxis y/o mejora de un trastorno inflamatorio y/o inmune, en donde el medicamento se va a administrar en el sistema linfatico por inyeccion intralinfatica.
9. 9. La celula madre mesenquimal para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o el uso de la reivindicacion 8, en donde el trastorno se selecciona del grupo consistente de enfermedad celiaca, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal y esclerosis multiple.
10. 10. Una composicion farmaceutica para su uso en un metodo para tratar, mejorar y/o la profilaxs de un trastorno inflamatorio y/o inmune, en donde la composicion farmaceutica se va a administrar al sistema linfatico por inyeccion intralinfatica y comprende una celula madre mesenquimal y un portador farmaceutico.
11. 11. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde la composicion farmaceutica comprende ademas un antfgeno y el antfgeno es colageno, gluten, un componente del gluten, mielina o un componente de la mielina.