PT2451943T - Métodos e composições para uso em terapias celulares - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA USO EM TERAPIAS CELULARES" ώΛΐ" ί â r>arfíTvA í^ia ay\l 4 λώ Λ j w*Vsv Í><j> V w UiÇÍ» «t* JL» v A presente invenção refere-se a métodos para fornecer terapias celulares, e seus usos terapêuticos.

Antecedentes da Invenção 0 sistema imune nos vertebrados superiores representa a primeira linha de defesa contra vários antigénios que podem entrar no corpo vertebrado, incluindo microorganismos tais como bactérias, fungos, e virus que são agentes causadores de uma variedade de doenças. Além disso, o sistema imune está também envolvido numa variedade de outras doenças ou distúrbios, inclindo doenças autoimunes ou imunopatológicas, sindromes de imunodeficiência, artereoesclerose e várias doenças neoplásicas. Apesar de métodos estarem disponíveis para tratar estas doenças, muitas terapias correntes fornecem menos do que resultados adequados. Entre novas estratégias terapêuticas emergentes, aquelas baseadas em terapia celular parecem constituir uma ferramenta útil potencial para tratar um grande número de doenças. Assim, um grande esforço está correntemente a ser feito pelos investigadores para atingir o referido obj etivo.

DOENÇAS AUTOIMUNES

As doenças autoimunes são causadas quando o sistema imunitário do corpo, o qual é suposto defender o corpo contra bactérias, virus, e qualquer outro produto estranho, funciona defeituosamente e produz uma resposta patológica contra tecido saudável, células e orgãos. Anticorpos, células T e macrófagos fornecem proteção benéfica, mas também podem produzir respostas imunológicas prejudiciais ou mortais.

As doenças autoimunes podem ser específicas de um orgão ou sistémicas e são provocadas por diferentes mecanismos patogénicos. A autoimunização específica de um órgão é caracterizada por expressão aberrante de antigénios do complexo principal de histocompatibilidade (MHC - major-histocompatibility complex), mimetismo antigénico e variações alélicas em genes MHC. As doenças autoimunes sistémicas envolvem ativação da célula B policlonal e anormalidades de células T imunoreguladoras, recetores de células T e genes MHC. Exemplos de doenças autoimunes específicas de orgãos são diabetes, hipertiroidismo, insuficiência supra-renal autoimune, anemia pura dos glóbulos vermelhos, esclerose múltipla e cardite reumática. Doenças auto-imunes sistémicas representativas são o lúpus eritematoso sistémico, inflamação crónica, síndrome de Sjogren, polimiosite, dermatomiosite e esclerodermia. 0 tratamento corrente de doenças autoimunes envolve a administração de agentes imunossupressores tais como cortisona, derivados de aspirina, hidroxicloroquina, metotrexato, azatioprina e ciclofosfamida ou suas combinações. 0 dilema enfrentado quando se administra agentes imunossupressores, no entanto, é que quanto mais eficazmente a doença autoimune é tratada, mais defesas contra infeções o paciente perde, e mais suscetível fica a desenvolver tumores. Assim, existe uma grande necessidade de novas terapias para o tratamento de doenças autoimunes.

DISTÚRBIOS INFLAMATÓRIOS A inflamação é um processo pelo qual os glóbulos brancos do corpo e fatores segregados protegem os nossos corpos contra infeções por substâncias estranhas, tais como bactérias e virus. Os fatores segregados conhecidos como citocinas e prostaglandinas controlam este processo, e são libertados numa cascata auto-limitante e ordenada no sangue ou tecidos afetados.

Doença Inflamatória do Intestino (IBD - Inflammatory Bowel disease) A IBD é uma família de doenças destrutivas de tecido, reincidentes, idiopáticas e crónicas caracterizadas por disfunção de células T das mucosas, produção de citocinas alterada e inflamação celular que por fim conduz a danos do intestino delgado distai e mucosa do cólon. A IBD está clinicamente subdividida em dois fenótipos: doença de Crohn (CD - Crohn's disease) e colite ulcerosa. A CD é presentemente uma doença autoimune incurável com uma prevalência de 0,05% que conduz a inflamação crónica que resulta numa gama de sintomas gastrointestinais e extra-intestinais, incluindo dor abdominal, sangramento retal, diarreia, perda de peso, distúrbios dos olhos e da pele, e crescimento atrasado e maturação sexual em crianças. Estes sintomas podem ter grande impacto no bem-estar dos pacientes, qualidade de vida, e capacidade de função.

Porque a CD é crónica e tipicamente tem um início antes dos 30 anos de idade, os pacientes geralmente necessitam de tratamento ao longo da vida. Apesar da sua etiologia permanecer desconhecida, existe evidência circunstâncial para ligar a CD com uma falha do sistema imune da mucosa para atenuar a resposta imune a antigénios endógenos.

Os agentes terapêuticos atualmente usados para CD, incluindo aminossalicilatos, corticosteróides, azatioprina, 6-mercaptopurina, antibióticos, e metotrexato, não são inteiramente eficazes, são não especificas e têm múltiplos efeitos secundários adversos. Na maioria dos casos, a ressecção cirúrgica é a última alternativa. Assim, a presente estratégia terapêutica é para encontrar fármacos ou agentes que modulam especificamente ambos os componentes da doença, isto é, as respostas conduzidas por células T e inflamatórias.

Recentemente, o fármaco Infliximab foi aprovado para o tratamento da doença de Crohn desde moderada a severa que não responde às terapias convencionais e para o tratamento de fistulas abertas a drenar. Infliximab, o primeiro tratamento aprovado especificamente para a doença de Crohn, é um anticorpo anti-factor de necrose tumoral (TNF - tumour necrosis factor). 0 TNF é uma proteina produzida pelo sistema imune que pode causar a inflamação associada com a doença de Crohn. 0 anti-TNF remove o TNF da corrente sanguínea antes do mesmo atingir os intestinos, evitando assim a inflamação. No entanto, uma vez que tem um efeito sistémico, e o TNF é um fator muito pleiotrópico, efeitos secundários severos são relativamente comuns, e a sua segurança a longo prazo continua ainda por ser determinada. Também, a eficácia é também limitada porque muitos dos processos inflamatórios que ocorrem nos pacientes não são dependentes de sinalização de TNF.

Artrite reumatóide (RA - Rheumatoid arthritis) A artrite reumatóide e artrite reumatóide juvenil são tipos de artrite inflamatória. Artrite é um termo geral que descreve inflamação nas articulações. Alguns, mas não todos, tipos de artrite são o resultado de inflamação mal orientada. A artrite reumatóide afeta cerca de 1% da população mundial e é essencialmente incapacitante. A artrite reumatóide é um distúrbio autoimune pelo qual o sistema imune do corpo identifica incorretamente as membranas sinoviais que secretam o fluido lubrificante nas articulações como estranhas. A inflamação resulta, e a cartilagem e tecidos nas e à volta das articulações são danificados ou destruídos. 0 corpo substitui tecido danificado com tecido cicatrizado, fazendo com que os espaços normais nas articulações se tornem estreitos e os ossos se fundam uns com os outros.

Na artrite reumatóide existe um ciclo autoimune de apresentação de antigénio persistente, estimulação das células T, secreção de citocinas, ativação das células sinoviais, e destruição da articulação.

As terapias atuais para a artrite focam-se em reduzir a inflamação das articulações com medicamentos imonusupressivos ou anti-inflamatórios. A primeira linha de tratamento de qualquer artrite é geralmente baseada em anti-inflamatórios, tais como aspirina, ibuprofeno e inibidores de Cox-2 tais como celecoxib e rofecoxib. Os anticorpos monoclonais humanizados anti-TNF, tais como o infliximab também são usados, no entanto, o mesmo tem muitos efeitos secundários ou efeitos colaterais e a sua eficácia é bastante baixa. "Fármacos de segunda linha" incluem ouro, metotrexato e esteróides. Embora estes sejam tratamentos bem estabelecidos para a artrite, muito poucos pacientes remetem somente a estas linhas de tratamento, e questões de tratamento difícil ainda permanecem em pacientes com artrite reumatóide.

Em geral, os tratamentos atuais para distúrbios inflamatórios crónicos têm uma eficiência muito limitada, e muitos deles têm uma alta incidência de efeitos colaterais ou não podem impedir completamente a progressão da doença. Até agora, nenhum tratamento é ideal, e não existe cura para este tipo de patologias. Assim, existe uma grande necessidade de novas terapias para o tratamento de distúrbios inflamatórios. Gonzalez Manuel e restantes autores (Arthritis &amp; Rheumatism, vol. 60, n° 4, Abril de 2009, págs. 1006-1019) descrevem a administração intraperitoneal ou intrarticular de células estaminais mesenquimais em artrite experimental. Zappia Emanuela e restantes autores (Blood, vol. 106, n° 5, 1 de Setembro de 2005, págs. 1755-1761) e Gerdoni Ezio e restantes autores (Annals of Neurology, vol. 61, n° 3, Março de 2007, págs. 219-227) usam a administração intravenosa de células estaminais mesenquimais em encefalomielite autoimune experimental. Gonzalez Manuel e restantes autores (Gastroenterology, vol. 136, n° 3, Março de 2009, págs. 978-989) descrevem a administração intraperitoneal de células estaminais mesenquimais em colite experimental. Karussis e restantes autores (Journal of Neurological Sciences, vol. 265, n° 1-2, 11 de Janeiro de 2008, págs. 131-135) usam a administração intravenosa e intraventricular de células estaminais mesenquimais em encefalomielite autoimune experimental; os autores também reportam a administração intravenosa e intratecal de células estaminais mesenquimais em esclerose múltipla ou esclerose lateral amiotrópica (ALS - amyotrophic lateral sclerosis). De Vries Jolanda e restantes autores (Nature Biotechnology, vol. 23, n° 11, Novembro de 2005, págs. 1407-1413) descrevem a administração intra-nodal de células dendriticas em sujeitos humanos com melanoma. Figdor Cari e restantes autores (Nature Medicine, vol.10, n°5, Maio de 2004, págs. 475-480) reportam várias abordagens para a administração de vacinas de células dendriticas em sujeitos humanos e mencionam a administração intravenosa, intra-nodal e intradérmica.

Sumário da invenção A presente invenção fornece métodos melhorados para a terapia celular de pacientes com necessidade dos mesmos. A invenção fornece uma célula estaminal mesenquimal para uso num método para tratar, modular, melhorar e/ou profilaxia de um distúrbio imune e/ou inflamatório, em que a célula estaminal mesenquimal é administrada para o sistema linfático por injeção intralinfática. A invenção também proporciona o uso de uma célula estaminal mesenquimal no fabrico de um medicamento para o tratamento, modulação, profilaxia, e/ou melhoria de um distúrbio imune e/ou inflamatório, por administração da célula estaminal mesenquimal no sistema linfático por injeção intralinfática. Também é fornecida uma composição farmacêutica para uso num método para tratar, melhorar, e/ou profilaxia de um distúrbio imune e/ou inflamatório, em que a composição farmacêutica é administrada para o sistema linfático por injeção intralinfática e compreende uma célula estaminal mesenquimal e um veiculo farmacêutico. Outros aspetos da divulgação fornecem kits e composições para uso em terapia celular administrada intralinfaticamente.

Num aspeto da divulgação, um método para tratar ou reparar tecido danificado, e/ou para o tratamento, modulação, profilaxia e/ou melhoria de um ou mais sintomas associados com distúrbios imunes e/ou inflamatórios, que tenham danificado tecido e/ou um ou mais sintomas associados com distúrbios imunes e/ou inflamatórios, é descrito, o qual compreende a administração para o sistema linfático do referido sujeito de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de uma composição que compreende células estaminais, células T reguladoras e/ou células fibroblásticas. Numa forma de realização, a presente invenção fornece um método para prevenir, tratar, ou melhorar uma doença inflamatória e/ou imune num indivíduo, compreendendo a administração direta de uma terapia celular num órgão linfático. Numa forma de realização da invenção, a terapia celular é administrada em combinação com um antigénio.

Num outro aspeto da divulgação, uma célula estaminal, célula T reguladora e/ou célula fibroblástica é descrita, para uso num método de: i. tratar ou reparar tecido danificado; e/ou ii. tratar, modular, melhorar e/ou profilaxia de um ou mais sintomas associados com distúrbios imunes e/ou inflamatórios; em que a célula é administrada para o sistema linfático.

Num outro aspeto ainda da divulgação, um kit é descrito, compreendendo o referido kit: i) um medicamento que compreende uma célula estaminal, célula T reguladora e/ou população de fibroblastos e ii) instruções para um método para tratar ou reparar tecido danificado, e/ou para o tratamento, modulação, profilaxia e/ou melhoria de um ou mais sintomas associados com distúrbios imunes e/ou inflamatórios, num sujeito com necessidade de tal tratamento é descrito, o qual compreende a administração para o sistema linfático do referido sujeito de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de uma composição que compreende células estaminais, células T reguladoras e/ou células fibroblásticas.

Ainda noutro aspeto da divulgação, o uso de uma célula estaminal, célula T reguladora e/ou uma célula fibroblástica no fabrico de um medicamento para tratar ou reparar tecido danificado, e/ou para o tratamento, modulação, profilaxia, e/ou melhoria de um ou mais sintomas associados com distúrbios imunes e/ou inflamatórios é descrito, compreendendo o referido uso a administração de células estaminais, células T reguladoras e/ou células fibroblásticas no sistema linfático.

Outro aspeto da divulgação refere-se a uma célula estaminal, célula T reguladora ou fibroblasto para administração ao sistema linfático. Um outro aspeto ainda refere-se a essa célula para uso em terapia.

Ainda um outro aspeto da divulgação refere-se a uma composição farmacêutica para administração ao sistema linfático compreendendo uma célula estaminal, célula T reguladora e/ou um fibroblasto, e um antigénio.

Outros aspetos, caracteristicas e vantagens serão mais integralmente percetíveis a partir da divulgação que se segue e reivindicações anexas.

Definições

De forma a facilitar a compreensão da presente descrição, o significado de alguns termos e expressões no contexto da invenção serão explicados abaixo. Definições adicionais serão incluídas ao longo da descrição à medida que necessário.

Os termos "adaptado para injeção intralinfática" ou "adaptado para injeção intra-nodal" ou "adaptado para injeção direta no nódulo linfático axilar e/ou inguinal" de acordo com a invenção significa que a terapia celular, que compreende preferencialmente células imunomoduladores, compreendendo mais preferencialmente células estaminais, células T reguladoras e/ou células fibroblásticas, bem como medicamentos e composições farmacêuticas compreendendo a mesma coisa, adaptada para injeção intra-nodal ou intralinfática tem caracteristicas biológicas, quimicas e físicas e outras necessárias ou benéficas para injetar a mesma coisa como um tratamento médico no tecido linfático de um indivíduo, especialmente um humano, ainda mais preferencialmente um paciente humano para o tratamento ou reparação de tecido danificado (preferencialmente tecido mesenquimal), e/ou para o tratamento, modulação, profilaxia e/ou melhoria de um ou mais sintomas associados com distúrbios imunes e/ou inflamatórios num sujeito com necessidade de tal tratamento. Além disso, células imunomoduladoras, bem como medicamentos e composições farmacêuticas, compreendendo o mesmo "adaptado para injeção intralinfática" ou "adaptado para injeção intra-nodal" de acordo com a invenção contêm concentrações de todos os constituintes da composição permitindo a aplicação de quantidades apropriadas de todos os constituintes num volume apropriado no tecido linfático, preferencialmente um volume até 0,01, preferencialmente até 0,05, preferencialmente até 0,1, preferencialmente até 0,2, preferencialmente até 0,3, preferencialmente até 0,4, preferencialmente até 0,6, preferencialmente até 0,8, preferencialmente até a 1,0, preferencialmente até 2 mL. Além disso, composições "adaptadas para injecção intra-nodal ou intralinfática" devem conter nenhuma ou apenas quantidades limitadas de substâncias potencialmente prejudiciais, tais como solventes e adjuvantes, que podem danificar tecido linfático, se aplicados em quantidades muito grandes. Com dano de tecido linfático quer-se dizer dano direto devido a efeitos tóxicos nas células, devido à destruição química das células, devido a danos indiretos para as células, por exemplo por indução de reações inflamatórias, necrose, etc.

Além disso, uma composição "adaptada para injeção intra-nodal ou intralinfática" de acordo com a invenção tem idealmente algum tipo de mecanismo de segurança, que previne a aplicação sistémica acidental das células imunomoduladoras, bem como de medicamentos e composições farmacêuticas compreendendo o mesmo, no caso da injeção falhar o tecido linfático e no pior dos casos resultar na injeção direta das células imunomoduladoras, bem como de medicamentos e composições farmacêuticas compreendendo o mesmo, na circulação sanguínea. Tal mecanismo de segurança inclui uma meia-vida extracelular curta das substâncias ativas biológicas.

Ao termo "injeção" tal como usado aqui é para lhe ser dado o seu significado habitual na técnica, referindo-se à administração de um agente no corpo por perfuração de parte do corpo, geralmente a pele. 0 termo inclui o uso de seringas ocas e dispositivos de injeção a jato de alta pressão. 0 termo "alogénico" tal como usado aqui deve ser tomado para significar a partir de diferentes indivíduos da mesma espécie. Dois ou mais indivíduos são referidos como sendo alogénicos um ao outro quando os genes num ou mais loci não são idênticos. 0 termo "autólogo" tal como usado aqui deve ser tomado para significar a partir do mesmo indivíduo. 0 termo "doença imune" refere-se a uma condição num sujeito caracterizada por lesão celular, de tecido e/ou de órgão causada por uma reacção imunológica do sujeito. 0 termo "doença autoimune" refere-se a uma condição num sujeito caracterizada por lesão celular, de tecido e/ou de órgão causada por uma reacção imunológica do sujeito celular, tecido e/ou lesão de órgão causada por uma reacção imunológica do sujeito às suas próprias células, tecidos e/ou órgãos. Exemplos ilustrativos, não limitativos, de doenças autoimunes que podem ser tratadas com as células imunomoduladoras da invenção incluem alopecia areata, espondilite anquilosante, síndrome antifosfolípido, doença de Addison autoimune, doenças autoimunes da glândula supra-renal, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, ooforite e orquite autoimune, trombocitopenia autoimune, doença de Behcet, penfigoide bolhoso, cardiomiopatia, dermatite sprue celíaca, síndrome de disfunção imune de fadiga crónica (CF1DS - chronic fatigue immune dysfunction syndrome), polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, doença aglutinina fria, lúpus discóide, crioglobulinemia mista essecial, fibromialgia-fibromiosite, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barre, tiroidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP - idiopathic thrombocytopenia purpura), neuropatia por IgA, artrite juvenil, líquen plano, doença de Ménière, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, diabetes mellitus imunomediada ou tipo 1, miastenia grave, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, policondrite, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoriática, fenômeno de Raynauld, síndrome de Reiter, sarcoidose, esclerodermia, esclerose sistémica progressiva, síndrome de Sjogren, síndrome de Goodpasture, síndrome do homem rígido, lúpus eritematoso sistémico, lúpus eritematoso, arterite de Takayasu, arterite de células gigantes/arterite temporal, colite ulcerosa, uveíte, vasculites tais como vasculite de dermatite herpetiforme, vitiligo, granulomatose de Wegener, doença anti-membrana basal glomerular, síndrome antifosfolipídica, doenças autoimunes do sistema nervoso, febre mediterrânica familiar, síndrome miastênica de

Lambert-Eaton, oftalmia simpática, poliendocrinopatias, psoriase, etc. 0 termo "doença inflamatória imunomediada" deve ser tomado para representar qualquer doença caracterizada por inflamação aguda ou crónica, que resulta de, associada com ou desencadeada por, uma desregulação da resposta imune normal, por exemplo, doença de Crohn, diabetes mellitus tipo 1, artrite reumatóide, doença inflamatória do intestino, psoriase, artrite psoriática, espondilite anquilosante, lúpus eritematoso sistémico, doença de Hashimoto, doença do enxerto contra hospedeiro, sindrome de Sjogren, anemia perniciosa, doença de Addison, esclerodermia, sindrome de Goodpasture, colite ulcerosa, anemia hemolitica auto-imune, esterilidade, a miastenia grave, esclerose múltipla, doença de Basedow, púrpura trombocitopénica, sindrome de Guillain-Barre, alergia, asma, doença atópica, arteriosclerose, miocardite, cardiomiopatia, glomerulonefrite, anemia hipoplástica, e rejeição após transplantação de órgãos. "A doença celiaca" é alternativamente referida como doença coeliaca, sprue c(o)eliaco, sprue não tropical, sprue endémico, enteropatia por glúten ou enteropatia sensivel ao glúten, e intolerância ao glúten.

Para os propósitos da invenção aqui descrita, "distúrbios imunes" incluem doenças autoimunes e doenças mediadas imunologicamente. 0 termo "doença inflamatória" refere-se a uma condição num sujeito caracterizada por inflamação, por exemplo, inflamação crónica. Exemplos ilustrativos, não-limitativos, de distúrbios inflamatórios incluem, mas não estão limitados a, doença celiaca, artrite reumatóide (RA), doença inflamatória do intestino (IBD), asma, encefalite, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD - chronic obstructive pulmonary disease), osteólise inflamatória, doenças alérgicas, choque séptico, fibrose pulmonar (por exemplo, fibrose pulmonar idiopática), vasculites inflamatórias (por exemplo, poliarterite nodosa, granulomatose de Wegener, arterite de Takayasu, arterite temporal, e granulomatose linfomatóide), angioplastia vascular pós-traumática (por exemplo, reestenose após angioplastia) , espondiloartropatia indiferenciada, artropatia indiferenciada, artrite, osteólise inflamatória, hepatite crónica e inflamação crónica resultante de infeções bacterianas ou virais crónicas. 0 termo "isolado" aplicado a uma população de células refere-se a uma população de células, isolada a partir do corpo humano ou animal, o qual é substancialmente livre de uma ou mais populações de células que estão associadas com a referida população de células in vivo ou in vitro. 0 termo "MHC" (complexo principal de histocompatibilidade) refere-se a um subconjunto de genes que codifica proteínas de apresentação de antigénio de superfície celular. Em humanos, estes genes são referidos como genes de antigénio de leucócitos humanos (HLA - human leukocyte antigen). Aqui, as abreviaturas de MHC ou HLA são usadas de forma intercambiável. 0 termo "sujeito" refere-se a um animal, preferencialmente um mamifero incluindo um não primata (por exemplo, uma vaca, porco, cavalo, gato, cão, rato, ou ratinho) e um primata (por exemplo, um macaco, ou um humano). Numa forma de realização preferida, o sujeito é um humano. 0 termo "imunomodulador" refere-se à inibição ou redução de uma ou mais atividades biológicas do sistema imunitário que inclui, mas não está limitado a, regulação negativa da resposta imune e estados inflamatórios bem como alterações no perfil de citocinas, atividade citotóxica e produção de anticorpos. 0 termo "antigénio especifico imunomodulador" refere-se à inibição ou redução de uma ou mais atividades biológicas do sistema imune associadas com um antigénio ou antigénios específicos, incluindo ambos os aloantigénios e autoantigénios. 0 termo "imunomodulador" deve ser tomado para compreender "antigeno especifico imunomodulador".

Tal como usado aqui, "negativo" ou tal como usado em respeito a marcadores de superfície celular deve ser tomado para significar que se quer dizer que, numa população de células, menos do que 20%, 10%, preferencialmente menos do que 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou nenhuma das células expressam o referido marcador. A expressão de marcadores de superfície celular pode ser determinada por exemplo por meio de citometria de fluxo para um marcador de superfície celular especifico usando métodos e aparelhos convencionais (por exemplo um sistema Beckman Coulter Epics XL FACS usado com anticorpos comercialmente disponíveis e protocolos padrão conhecidos na técnica).

Tal como usado aqui, ao termo "sistema linfático" é para ser dado o seu significado habitual na técnica e refere-se ao tecido linfóide ligado por um sistema condutor de vasos linfáticos e capilares linfáticos. O termo "órgão linfático" refere-se a nódulos linfáticos, mais preferencialmente um nódulo linfático axilar ou inguinal, ou para aqueles indivíduos que não têm nódulos linfáticos ou que têm defeitos nos mesmos, tecido linfático ou uma célula imune.

Tal como usado aqui, o termo "célula estaminal mesenquimal" (também aqui referido como "MSC (mesenchymal stem cell)") deve ser tomado para representar uma célula que é capaz de dar origem a múltiplos tipos diferentes de células, derivadas originalmente a partir do mesênquima. 0 termo refere-se a uma célula que é capaz de se diferenciar em pelo menos um de um osteoblasto, um condrócito, um adipócitos, ou um miócitos. As MSCs podem ser isoladas a partir de qualquer tipo de tecido. Geralmente as MSC serão isoladas a partir de medula óssea, tecido adiposo, cordão umbilical, ou sangue periférico. As MSCs usadas na invenção podem em algumas formas de realização ser isoladas a partir de medula óssea (BM-MSCs) ou tecido adiposo (ASCs). Num aspeto preferido da invenção, as MSCs são obtidas a partir de lipoaspirações, os mesmos obtidos a partir de tecido adiposo.

Tal como usado aqui, a expressão "expressão significativa" ou os seus termos equivalentes "positivo" e "+" quando usada em relação a um marcador de superfície celular deve ser tomada para significar que, numa população celular, mais do que 20%, preferencialmente mais do que, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mesmo todas as células das células expressam o referido marcador. A expressão de marcadores de superfície celular pode ser determinada por exemplo por meio de citometria de fluxo para um marcador da superfície celular especifico utilizando métodos e aparelhos convencionais (por exemplo, um sistema Beckman Coulter Epics XL FACS usado com anticorpos comercialmente disponíveis e protocolos padrão conhecidos técnica) que mostram um sinal para um marcador da superfície celular especifico em citometria de fluxo acima do sinal de base usando métodos e aparelhos convencionais (por exemplo, um sistema Beckman Coulter Epics XL FACS usado com anticorpos comercialmente disponíveis e protocolos padrão conhecidos na técnica). O sinal de base é definido como a intensidade de sinal dada por um anticorpo não específico do mesmo isótipo que o anticorpo específico usado para detetar cada marcador de superfície na análise FACS convencional. Para um marcador ser considerado positivo o sinal específico observado é mais forte do que 20%, preferencialmente mais forte do que, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 500%, 1000%, 5000%, 10000% ou acima, do que a intensidade do sinal de base usando métodos e aparelhos convencionais (por exemplo, um sistema Beckman Coulter Epics XL FACS usado com anticorpos comercialmente disponíveis e protocolos padrão conhecidos na técnica).

Além disso, os anticorpos monoclonais conhecidos e comercialmente disponíveis contra os referidos marcadores de superfície celular (por exemplo, recetores celulares e proteínas transmembranares) podem ser usados para identificar células relevantes. O termo "tecido conjuntivo" refere-se a tecidos derivados de mesênquima e inclui vários tecidos que são caracterizados pelo facto das suas células estarem incluídas dentro da matriz extracelular. Exemplos de tecidos conjuntivos incluem, mas não estão limitados a, tecido cartilaginoso e adiposo. O termo "fibroblasto" como aqui usado deve ser tomado para incluir células sinoviais como fibroblastos. O termo "célula T" refere-se a células do sistema imunitário que são um subconjunto de linfócitos que expressam o receptor de células T (TCR - T cell receptor). O termo "células T reguladoras" (também aqui referidas como células T-reg) refere-se a subconjuntos de células T que suprimem ativamente a ativação do sistema imunitário e previnem auto-reatividade patológica, ou seja uma doença autoimune. 0 termo "células T reguladoras" ou "células T-reg" deve ser tomado para incluir ambas as células T que ocorrem naturalmente (células FoxP3+ T-reg) e células T adaptativas (também conhecidas como células Trl ou células Th3) que não expressam a molécula FoxP3. 0 termo "glúten" deve ser tomado para significar uma proteína que compreende os componentes glutenina e gliadina.

Tal como aqui usados, os termos "tratar", "tratamento" e "tratando" quando usados diretamente em referência a um paciente ou sujeito devem ser tomados para significar a melhoria de um ou mais sintomas associados com um distúrbio incluindo, mas não limitado a, um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença mediada imunologicamente incluindo rejeição de órgãos e tecidos transplantados, em que a referida melhoria resulta da administração de células imunomoduladoras da invenção, ou uma composição farmacêutica compreendendo a mesma coisa, a um sujeito com necessidade do referido tratamento.

Tal como aqui usados, os termos "reparar" e "reparação" quando usados diretamente em referência a tecidos danificados devem ser tomados para significar a melhoria de tal dano por ambos os mecanismos diretos tais como a regeneração de tecidos danificados, bem como através de mecanismos indiretos, por exemplo, reduzindo a inflamação permitindo assim a formação de tecido. 0 termo "terapia de combinação" refere-se ao uso de células imunomoduladoras da presente invenção ou composições farmacêuticas compreendendo o mesmo em conjunto com outros agentes ativos ou modalidades de tratamento, na forma da presente invenção para a melhoria de um ou mais sintomas associados com um distúrbio incluindo, mas não limitado a, um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença mediada imunologicamente incluindo rejeição de órgãos e tecidos transplantados. Estes outros agentes ou tratamentos podem incluir fármacos e terapias conhecidos para o tratamento de tais distúrbios, tais como, mas não limitado a, corticosteróides e compostos anti-inflamatórios não-esteróides.

As células imunomoduladoras da invenção, ou composições farmacêuticas que compreendem o mesmo também podem ser combinadas com outras modalidades de tratamento, por exemplo, corticosteróides, compostos anti-inflamatórios não-esteróides, ou outros agentes úteis no tratamento de inflamação. 0 uso combinado dos agentes da presente invenção com estas outras terapias ou modalidades de tratamento pode ser simultâneo, ou sequencial, isto é, os dois tratamentos podem ser divididos de tal modo que as referidas células imunomoduladores ou uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo pode ser dada antes ou depois da outra terapia ou modalidade de tratamento. 0 médico presente pode decidir sobre a sequência apropriada de administrar as células imunomoduladoras, ou uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo, em combinação com outros agentes, terapias ou modalidades de tratamento.

Breve descrição das Figuras A Figura 1 ilustra que a administração de células estaminais expandidas derivadas de tecido adiposo diminui o indice de artrite num modelo de ratinho de artrite induzida por colagénio e que essa administração intralinfática é terapeuticamente mais eficaz do que a via intravenosa. Grupo A: controlo não tratado; Grupo C: 1 milhão de ASCs administradas IV em 5 dias consecutivos; Grupo D: 3 milhões de ASCs administradas no primeiro dia e 1 milhão de ASCs administradas nos dias 3 e 5; Grupo E: 320.000 de ASCs administradas intralinfaticamente nos dias 1 e 7; Grupo F: veiculo administrado intralinfaticamente nos dias 1 e 7.

Descrição da Invenção

Em um aspeto a presente invenção fornece uma terapia celular que compreende células estaminais mesenquimais para uso no tratamento, modulação, profilaxia, e/ou melhoria de uma inflamação e/ou distúrbio imune, em que a terapia celular é administrada ao sistema linfático. A administração intralinfática é realizada por injeção intralinfática. A terapia celular é adaptada para injeção intralinfática. A administração de células estaminais diretamente no sistema linfático tem várias vantagens relativamente técnica anterior, moneadamente relativamente à injeção subcutânea convencional das referidas células estaminais, por exemplo, uma quantidade menor de células imunomoduladoras é suficiente; a terapia não é mais dolorosa para o paciente do que no caso das injeções subcutâneas habituais; e há menos efeitos secundários adversos. Além disso, por aplicação direta ao tecido linfático, por exemplo por injeção intra-nodal, as células imunomoduladoras são libertadas mais próximo do local de tratamento ou reparação do tecido danificado.

As células imunomoduladoras, bem como medicamentos e composições farmacêuticas compreendendo o mesmo, de acordo com a presente invenção podem, simultaneamente com a administração intralinfática, ser administradas por vias convencionais, como a administração subcutânea ou administração sublingual, oralmente, transcutaneamente (vacinação tópica) , intradermicamente, intramedularmente, intratecal, intraventricular, intranasalmente, conjuntival, intrabronquial, transdermicamente, intra-retalmente, intraperitonealmente, intramuscularmente, intrapulmonarmente, vaginalmente, retalmente ou intraocularmente. A terapia celular de acordo com a presente invenção compreende células estaminais mesenquimais (daqui para a frente também referidas como MSC), mais preferencialmente células estaminais derivadas de tecido adiposo (daqui para a frente também referidas como ASC), as quais são MSCs originadas a partir de tecido adiposo, geralmente a partir de tecido adiposo humano (hASCs).

Os fibroblastos da presente divulgação são derivados de tecido conjuntivo de mesênquima que estão associados com a sintese e manutenção da matriz extracelular e devem ser tomados para incluir fibroblastos como células sinoviais. Os fibroblastos podem ser obtidos a partir de qualquer animal adequado, mais preferencialmente humano.

As células T reguladoras (por vezes conhecidas como células T supressoras) da presente divulgação podem ser derivadas a partir de qualquer fonte adequada, tal como sangue ou baço. As células T reguladoras podem ser de células CD4+Foxp3+ de ocorrência natural, ou elas podem ser isoladas ex-vivo e/ou células T reguladoras expandidas. Métodos para a expansão ex-vivo de células T reguladoras são conhecidos na arte e incluem o isolamento a partir de sangue total (por exemplo, como parte da fração PBMC) seguido por expansão usando por exemplo, células estaminais mesenquimais ou rapamicina.

As MSC usadas no método da presente invenção são preferencialmente derivadas a partir de tecido conjuntivo. Numa forma de realização preferida as referidas MSC são derivadas a partir de tecido adiposo e numa forma de realização ainda mais preferida a partir da fração estromal de tecido adiposo. Numa forma de realização alternativa, as referidas MSC são obtidas a partir de condrócitos de cartilagem hialina. Numa outra forma de realização, as referidas MSC são obtidas a partir de pele. Numa outra forma de realização, as referidas MSC são obtidas a partir de medula óssea.

As MSC podem ser obtidas a partir de qualquer fonte adequada de tecido conjuntivo a partir de qualquer animal adequado, mais preferencialmente humanos. É preferido que as referidas células sejam obtidas a partir de fontes mamíferas não patológicas, preferencialmente fontes pós-natal (por exemplo, roedor ou primata) . Numa forma de realização preferida, as MSC são obtidas a partir de uma fonte de tecido conjuntivo, tais como, mas não limitado a, a fração estromal de tecido adiposo, cartilagem hialina, medula óssea ou pele. Mais preferivelmente as MSC dos métodos da presente invenção são obtidas a partir de estroma de tecido adiposo humano, pós-natal não patológico.

No que diz respeito ao recetor pretendido das células imunomoduladoras como administrado de acordo com o método da presente invenção, as MSC usads no referido método descrito em cima podem ser de origem quer alogénica (dador) quer ou autóloga (sujeito) . Em uma forma de realização do método as referidas MSC são de origem alogénica. Em uma forma de realização do método as referidas MSC são de origem autóloga.

As MSC usadas no método da presente invenção são preferencialmente caracterizadas pelo facto de (i) elas não expressam marcadores específicos para células

apresentadoras de antigénio, (ii) elas não expressam IDO (indoleamina 2,3-dioxigenase) constitutivamente, (iii) elas expressam IDO quando estimuladas com IFN-gama, e no caso de MSC (iv) elas apresentam a capacidade de se diferenciar em pelo menos duas linhagens celulares.

As células estaminais de acordo com a presente invenção são preferencialmente administradas num veiculo fisiologicamente aceitável adequado para injeção. No geral, qualquer veiculo fisiologicamente aceitável conhecido para uso conhecido pode ser usado na prática desta invenção. A escolha de tais veiculos inclui, sem limitação, a solução de Ringer, água, soluções salinas padrão, soluções de dextrose e água de albumina, e está facilmente dentro da pericia na técnica.

Opcionalmente, o sistema linfático ou uma parte do mesmo, por exemplo uma área localizada de um vaso linfático ou um órgão linfático, preferencialmente um nódulo linfático, podem ser visualizados durante o processo de injeção. Visualização por ultrassom, radiológica, ou outros meios de visualização tais como tomografia axial computadorizada (exame de CAT (computerized axial tomography)) , podem ser usados para visualizar o nódulo linfático e monitorizar a localização da agulha e alterações no nódulo linfático, tais como inchaço. A injeção nos nódulos linfáticos axilares e inguinais é preferida devido à facilidade de localização e injeção guiada por ultrassom. A técnica usada para a injeção está dentro da pericia da técnica. Um método é usar uma seringa de câmara única contendo as células em formulação liquida.

Num outro aspeto, a presente invenção fornece uma célula estaminal mesenquimal para uso num método para tratamento, modulação, profilaxia e/ou melhoria de um distúrbio imune e/ou inflamatório, num sujeito com necessidade de tal tratamento, compreendendo a administração para o sistema linfático do referido sujeito de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de uma composição que compreende uma terapia celular compreendendo MSC e ainda a administração de um antigénio diretamente para o sistema linfático do referido sujeito. 0 referido antigénio pode ser administrado antes, simultaneamente com ou subsequentemente à administração da terapia celular. 0 antigénio pode ser administrado pelo menos 1,2,3,5 ou 10 horas antes ou depois da administração da terapia celular. O antigénio usado nos referidos métodos pode ser um antigénio escolhido, grupo de antigénios ou tipos de células que expressam e/ou apresentam o referido antigénio ou antigénios. Numa forma de realização o antigénio é selecionado a partir de um grupo que compreende: uma mistura de auto-antigénios derivados a partir de um paciente que sofre de autoimunidade, um antigénio de péptido, um ácido nucleico, um ligando de péptido alterado, uma proteina recombinante ou seus fragmentos. Numa forma de realização os referidos antigénios estão associados com artrite (tais como, mas não limitados a, antigénios de colagénio). Numa forma de realização alternativa os referidos antigénios estão associados com doença celiaca. Os antigénios associados com doença celiaca são membros da familia de glúten incluindo algumas formas de prolaminas (tais como, mas não limitados, antigénios de gliadinas, hordeinas, e/ou secalinas). Ainda numa forma de realização os referidos antigénios estão associados com esclerose múltipla (tais como, mas não limitados a, antigénios de mielina). Os métodos para o isolamento, purificação e preparação de tais antigénios são conhecidos para o perito na área. É particularmente preferido que a terapia celular de todos os aspetos da presente invenção é administrada diretamente para um órgão linfático, mais preferencialmente um órgão linfático periférico, incluindo mas não se limitando aos nódulos linfáticos, mais preferencialmente um nódulo linfático axilar ou inguinal. Em indivíduos em que os nódulos linfáticos estão em falta ou que têm defeitos do mesmos, a terapia celular pode ser entregue para o tecido linfático ou para uma célula imune.

Os métodos para administração intralinfática são conhecidos na área e são vulgarmente realizadas por intermédio de um dispositivo de injeção (por exemplo, seringa). A administração pode ser auxiliada e observada por meio de um dispositivo de imagem tais como, mas não limitados a, radiológico, ultrassom e tomografia axial computadorizada (exame de CAT). Isto permite a administração precisa da terapia celular e também a monitorização dos órgãos linfáticos para eventos adversos. Num aspeto do método o sujeito é tratado com uma pluralidade de doses da terapia celular intralinfaticamente administrada. Preferencialmente pelo menos 2, 3, 4, 5, 10 ou 15 doses são administradas em intervalos. Num outro aspeto do método cada uma das doses referidas compreende entre 10.000 e 5.000.000 células. Numa outra forma de realização cada uma das doses referidas compreende entre 10.000 e 100.000 células; 100.000 e 500.000 células; 500.000 e 1.000.000 células ou entre 1.000.000 e 5.000.000 células. São também divulgados uma célula estaminal, células T reguladoras e/ou células fibroblásticas para administração ao sistema linfático. A divulgação também engloba o uso de uma célula estaminal, célula T reguladora e/ou uma célula fibroblástica como um medicamento para tratar ou reparar tecido danificado (preferencialmente tecido mesenquimal), e/ou para o tratamento, modulação, profilaxia e/ou melhoria de um ou mais sintomas associados com distúrbios imunes e/ou inflamatórios, por administração da célula estaminal, célula T reguladora e/ou de célula fibroblástica no sistema linfático.

Um aspeto alternativo da presente invenção fornece o uso de uma célula estaminal mesenquimal no fabrico de um medicamento para o tratamento, modulação, profilaxia e/ou melhoria de um distúrbio imune e/ou inflamatório, por administração da células estaminal no sistema linfático.

Num aspeto adicional a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para administração ao sistema linfático compreendendo células estaminais mesenquimais. As referidas composições farmacêuticas são de uso no tratamento, profilaxia, e/ou melhoria de um distúrbio imune e/ou inflamatório tais como, mas não limitados a, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios, e doenças mediadas imunologicamente incluindo rejeição de órgãos e tecidos transplantados. Numa forma de realização da invenção a composição farmacêutica pode ainda compreender um antigénio, grupo de antigénios ou tipos de células que expressam e/ou apresentam o referido antigénio ou antigénios. Numa forma de realização o antigénio é selecionado a partir de um grupo compreendendo: uma mistura de auto-antigénios derivados de um paciente que sofre de autoimunidade, um antigénio de péptido, um ácido nucleico, um ligando de péptido alterado, uma proteína recombinante ou seus fragmentos. Numa forma de realização os referidos antigénios estão associados com artrite, tal como, mas não se limitando a, antigénios de colagénio. Numa forma de realização alternativa os referidos antigénios estão associados com doença celíaca. Os antigénios associados com doença celíaca são membros da família de glúten incluindo algumas formas de prolaminas (tais como, mas não se limitadas a, antigénios de gliadinas, hordeínas, e/ou secalinas). 0 glúten e seus componentes, glutanina e gliadina, são antigénios preferidos associados com doença celíaca. Numa outra forma de realização, os referidos antigénios estão associados com a esclerose múltipla, tais como, mas não limitados a, antigénios de mielina e antigénios de componentes de mielina tais como proteína básica de mielina (MBP - myelin basic protein), glicoproteína oligodendrócita de mielina (MOG - myelin oligodendrocyte glycoprotein), proteína proteolipídica (PLP proteolipid protein) e glicolípidos de mielina por exemplo, galactocerebrosídeo. Os métodos para o isolamento, purificação e preparação de tais antigénios são conhecidos para o perito na área. A composição farmacêutica da invenção compreende uma quantidade de células estaminais mesenquimais terapeuticamente ou profilaticamente eficaz, opcionalmente antigénio, e um veículo farmacêutico. Exemplos de dosagens e regimes de dosagem para cada um destes tipos de células são dados em cima. Os veículos farmacêuticos adequados são conhecidos na área e são preferencialmente aqueles aprovados por uma agência reguladora da Federal dos EUA ou um governo estatal ou listado na Farmacopeia dos EUA, ou Farmacopeia da Europa, ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em humanos. 0 termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com o qual o agente terapêutico é administrado. A composição, se desejável, pode também conter quantidades menores de agentes de tamponamento de pH. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical

Sciences" por E W Martin. Tais composições irão conter uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um agente terapêutico ou profilático preferencialmente numa forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada de veiculo de modo a proporcionar a forma para administração apropriada ao sujeito. A formulação deve adequar-se ao modo de administração. Numa forma de realização preferida, as composições farmacêuticas estão estéreis e em forma adequada para administração a um sujeito, preferencialmente um sujeito animal, mais preferencialmente um sujeito mamifero, e mais preferencialmente um sujeito humano. A composição farmacêutica da invenção pode estar numa variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem liquidas e semi-sólidas, tais como preparações liofilizadas, soluções liquidas ou suspensões, soluções para infusão e injetáveis, etc. Como referido em cima, a composição farmacêutica é preferencialmente injetável. É preferível que os métodos, medicamentos, composições e células da invenção sejam usados para o tratamento, modulação, profilaxia e/ou melhoria de um ou mais sintomas associados com distúrbios imunes e/ou inflamatórios. De acordo com isto, os métodos e células da invenção são de uso no tratamento de qualquer distúrbio caracterizado quer por um quer por todos os referidos sintomas, como definido nas reivindicações. Uma lista representativa não exaustiva de tais distúrbios é fornecida na secção de definições. É particularmente preferido o uso dos métodos, medicamentos, composições e células da invenção no tratamento de doenças inflamatórias imunomediadas. É ainda mais preferido o uso dos métodos, medicamentos, composições e células da invenção no tratamento de diabetes mellitus, artrite reumatóide (RA), doença inflamatória do intestino (IBD, incluindo a doença de Crohn e/ou a colite ulcerosa) e esclerose múltipla (MS - multiple sclerosis). Ainda mais particularmente é preferido o uso dos métodos, medicamentos, composições e células da invenção no tratamento de artrite reumatóide.

Nos que o método ou composição da invenção compreende um ou mais antigénios é preferido que o método ou composição seja usado no tratamento do distúrbio associado com ou induzido pelo referido antigénio, por exemplo nos que o antigénio é colagénio o método ou composição podem ser usados no tratamento de artrite, nos que o antigénio é um componente de glúten os métodos ou composições podem ser usados no tratamento de doença celíaca, nos que o antigénio é um componente de mielina os métodos ou composições podem ser usados para tratar esclerose múltipla. Assim, as composições preferidas compreendem: MSC, preferencialmente ASC, e colagénio, para o tratamento de artrite; MSC, preferencialmente ASC, e glúten e/ou um componente de glúten, para o tratamento de doença celíaca; MSC, preferencialmente ASC, e mielina e/ou um componente de mielina, para o tratamento de esclerose múltipla.

Num outro aspeto a presente divulgação fornece um kit que compreende i) um medicamento compreendendo uma célula estaminal, célula T reguladora e/ou população de fibroblastos e ii) instruções para o uso do mesmo de acordo com os métodos da presente invenção.

Numa outra forma de realização da divulgação o referido kit pode ainda compreender iii) um ou mais antigénios. MARCADORES DE FENÓTIPO MSC.

As MSC usadas num método preferido da presente invenção são preferencialmente negativas para os marcadores associados com fenótipos APC (Antigen Presenting Cell) (célula que apresenta antigénio). De acordo com isto, é preferido que as referidas MSC sejam negativas para pelo menos um, dois, três, quatro ou preferencialmente todos os marcadores seguintes: CD 11b; CD 11c; CD14; CD45; HLAI1. Além disso, as MSC são preferencialmente negativas para pelo menos um, dois, ou preferencialmente todos os seguintes marcadores de superfície celular: CD31; CD34; CD 133.

Numa forma de realização particular, as MSC como usadas no presente método são preferencialmente caracterizadas pelo facto de expressarem (isto é, são positivas para) pelo menos um, dois, três, quatro ou preferencialmente todos dos seguintes marcadores de superfície celular CD9, CD44, CD54, CD90 e CD 105. Preferencialmente, as MSC são caracterizadas pelo facto de terem niveis de expressão significativos de pelo menos um, dois, três, quatro e preferencialmente de todos os referidos marcadores de superfície celular CD9, CD44, CD54, CD90 e CD 105.

Opcionalmente, as MSC podem também ser negativas para o marcador de superfície celular CD 106 (VCAM-1). Exemplos de MSC adequadas para uso no método da presente invenção estão descritos na literatura, por exemplo na W02007039150.

DIFERENCIAÇÃO

As MSC adequadas para uso no método da presente invenção são de preferência células estaminais pluripotentes ou multipotentes e podem apresentar a capacidade de proliferar e diferenciarem-se em pelo menos duas, mais preferencialmente três, quatro, cinco, seis, sete ou mais linhagens celulares. Exemplos ilustrativos não limitativos de linhagens celulares nas quais as referidas MSC se podem diferenciar incluem osteócitos, adipócitos, condrócitos, tenócitos, miócitos, cardiomiócitos, células estromais de apoio hematopoiético, células endoteliais, neurónios, astrócitos, e hepatócitos. As MSC podem proliferar e diferenciarem-se em células de outras linhagens por métodos convencionais. Os métodos para identificar e subsequentemente isolar as células diferenciadas das suas homólogas indiferenciadas podem também ser realizados por métodos bem conhecidos na área.

ISOLAMENTO de MSC

Os métodos para o isolamento de MSC são conhecidos na área de trabalho, e qualquer método adequado pode ser usado. Numa forma de realização de isolamento de ASC esta pode compreender os passos de: (i) preparar uma suspensão celular a partir de uma amostra de tecido adiposo; (ii) recuperar as células a partir da referida suspensão de celular; (iii) incubar as referidas células num meio de cultura de células adequado sobre uma superfície sólida sob condições que permitam que as células adiram à superfície sólida e proliferem; (iv) lavar a referida superfície sólida após incubação para remover células não aderentes; (V) selecionar as células que após terem sido passadas pelo menos duas vezes em tal meio permanecem aderidas à referida superfície sólida; e (Vi) confirmar que a população celular selecionada apresenta o fenótipo de interesse.

Tal como usado aqui, o termo "superfície sólida" refere-se a qualquer material sobre o qual a ASC pode aderir. Numa forma de realização particular o referido material é um material plástico tratado para promover a adesão de células mamíferas na sua superfície, por exemplo placas de poliestireno comercialmente disponíveis opcionalmente revestidas com poli-D-lisina ou outros reagentes.

Os passos (i)-(vi) podem ser realizados por técnicas convencionais conhecidas pelos peritos na área. Resumidamente, a ASC pode ser obtida por meios convencionais a partir de qualquer fonte adequada de tecido conjuntivo a partir de qualquer animal adequado, como discutido em cima. Tipicamente, as células adiposas humanas são obtidas a partir de dadores vivos, usando protocolos bem reconhecidos tais como lipectomia por aspiração ou cirúrgica. De facto, como os procedimentos de lipoaspiração são tão comuns, o efluente de lipoaspiração é uma fonte particularmente preferida a partir da qual a ASC pode ser derivada. Assim, numa forma de realização particular, as ASC são obtidas a partir da fração estromal de tecido adiposo humano obtido por lipoaspiração. 0 tecido é, preferencialmente, lavado antes de ser processado para separar as ASC do restante do material. Num protocolo vulgarmente usado, a amostra de tecido é lavada com solução salina fisiologicamente compatível (por exemplo, salina tamponada de fosfato (PBS - phosphate buffered saline)) e depois é vigorosamente agitada e deixada em repouso, um passo que remove matéria solta (por exemplo, tecido danificado, sangue, eritrócitos, etc) do tecido. Assim, os passos de lavagem e repouso são geralmente repetidos até que o sobrenadante esteja relativamente livre de detritos. As células remanescentes estarão geralmente presente em aglomerados de vários tamanhos, e o protocolo prossegue usando os passos calibrados para degradar a estrutura grosseira enquanto se minimiza o dano às próprias células. Um método para atingir este fim é tratar os aglomerados de células lavados com uma enzima que enfraquece ou destrói ligações entre células (por exemplo, colagenase, dispase, tripsina, etc) . A quantidade e duração de tal tratamento enzimático irá variar, dependendo das condições empregues, mas o uso de tais enzimas é vulgarmente conhecido na área. Alternativamente, ou em conjugação com tal tratamento enzimático, os aglomerados de células podem ser degradados usando outros tratamentos, tais como agitação mecânica, energia sónica, energia térmica, etc. Se a degradação é conseguida por métodos enzimáticos, é desejável neutralizar a enzima após um periodo adequado, para minimizar efeitos prejudiciais nas células. 0 passo de degradação tipicamente produz uma pasta ou suspensão de células agregadas e uma fração de fluido que contém células estromais geralmente livres (por exemplo, glóbulos vermelhos, células musculares lisas, células endoteliais, células fibroblásticas, e células estaminais). 0 estágio seguinte no processo de separação é separar as células agregadas a partir da ASC. Isto pode ser conseguido por centrifugação, o que compele as células num sedimento coberto por um sobrenadante. Depois, o sobrenadante pode ser eliminado e o sedimento suspenso num fluido fisiologicamente compatível. Além disso, as células suspensas tipicamente incluem eritrócitos, e na maioria dos protocolos é desejável lisá-los. Os métodos para lisar seletivamente eritrócitos são conhecidos na área, e qualquer protocolo adequado pode ser aplicado (por exemplo, incubação num meio hipotónico ou hipertónico, por lise usando cloreto de amónio, etc) . Claro que, se os eritrócitos são lisados, as células remanescentes devem depois ser separadas a partir do lisado, por exemplo por filtração, sedimentação, ou fracionamento de densidade.

Independentemente se os eritrócitos estão lisados, as células em suspensão podem ser lavadas, centrifugadas novamente, e ressuspensas uma ou mais vezes sucessivas para atingir maior pureza. Alternativamente, as células podem ser separadas com base no perfil de marcador de superfície celular ou com base no tamanho celular e granularidade. A seguir ao isolamento final e ressuspensão, as células podem ser cultivadas e, se desejado, analisadas quanto ao número e viabilidade para avaliar o rendimento. Preferencialmente, as células serão cultivadas sem diferenciação, sobre uma superfície sólida, usando um meio de cultura celular adequado, com as densidades celulares e condições de cultura apropriadas. Assim, numa forma de realização particular, as células são cultivadas sem diferenciação sobre uma superfície sólida, geralmente feita de um material plástico, tais como placas de Petri ou frascos de cultura de células, na presença de um meio de cultura celular adequado [por exemplo, DMEM, tipicamente suplementado com 5-15% (por exemplo, 10%) de um soro adequado, tal como soro fetal bovino ou soro humano], e incubadas em condições que permitem que as células adiram à superfície sólida e proliferem. Após incubação, as células são lavadas com o objetivo de remover células não aderidas e fragmentos celulares. As células são mantidas em cultura no mesmo meio e sob as mesmas condições até elas atingirem a confluência adequada, tipicamente, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% de confluência celular, com substituição do meio de cultura celular quando necessário. Depois de atingir a confluência celular desejada, as células podem ser expandidas por meio de passagens consecutivas usando um agente de destacamento tal como tripsina e a semeadura sobre uma nova superfície de cultura celular a uma densidade celular apropriada (usualmente 2.000-10.000 células/cm2) . Assim, as células são depois passadas pelo menos duas vezes em tal meio sem diferenciação enquanto continuam a reter o seu fenótipo de desenvolvimento, e mais preferencialmente, as células podem ser passadas pelo menos 10 vezes (por exemplo, pelo menos 15 vezes ou mesmo pelo menos 20 vezes) sem perder o fenótipo de desenvolvimento. Tipicamente, as células são plaqueadas a uma densidade desejada tal como entre aproximadamente 100 células/cm2 até aproximadamente 100.000 células/cm2 (tal como cerca de 500 células/cm2 até cerca de 50.000 células/cm2, ou, mais particularmente, entre cerca de 1.000 células/cm2 até cerca de 20.000 células/cm2). Se plaqueadas a densidades mais baixas (por exemplo, cerca de 300 células/cm2), as células podem ser mais facilmente clonalmente isoladas. Por exemplo, após poucos dias, as células plaqueadas a tais densidades irão proliferar numa população homogénea. Numa forma de realização particular, a densidade celular é entre 2.000-10.000 células/cm2.

As células que permanecem aderidas à superfície sólida após tal tratamento que compreende pelo menos duas passagens são selecionadas e o fenótipo de interesse é analisado por métodos convencionais com o objetivo de confirmar a identidade da ASC como será mencionado em baixo. As células que permanecem aderidas à superfície sólida após a primeira passagem são de origem heterogénea; assim, as referidas células devem ser submetidas a pelo menos outra passagem. Como um resultado do método em cima, uma população de células homogénea, que possui o fenótipo de interesse, é obtida. A adesão das células à superfície sólida depois de pelo menos duas passagens constitui uma forma de realização preferida da invenção para selecionar a ASC. A confirmação do fenótipo de interesse pode ser realizada usando meios convencionais.

Preferencialmente a referida expansão é realizada por duplicação ou triplicação da referida população pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15 ou pelo menos 20 vezes. Numa forma de realização adicional a referida expansão é realizada ao longo de pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15 ou pelo menos 20 passagens.

Os marcadores de superfície celular podem ser identificados por qualquer técnica convencional adequada, usualmente baseada numa seleção positiva/negativa; por exemplo, anticorpos monoclonais contra marcadores da superfície celular, cuja presença/ausência nas células é para ser confirmada, podem ser usados; contudo outras técnicas podem também ser usadas. Assim, numa forma de realização particular, anticorpos monoclonais contra uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete de ou preferencialmente todos de CDllb, CDllc, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34 e CD133 são usados a fim de confirmar a ausência dos referidos marcadores nas células seleccionadas; e anticorpos monoclonais contra um, dois, três, quatro, de ou preferencialmente todos de CD9, CD44, CD54, CD90 e CD105 são usados a fim de confirmar a sua presença ou níveis de expressão detetáveis de, pelo menos um de e preferencialmente de todos os referidos marcadores. Os referidos anticorpos monoclonais são conhecidos, comercialmente disponíveis ou podem ser obtidos por um perito na área por métodos convencionais. A atividade de IDO IFN-y induzivel nas células selecionadas pode ser determinada por qualquer ensaio convencional adequado. Por exemplo, as células selecionadas podem ser estimuladas com IFN-γ e ensaiadas para expressão IDO; depois, a análise convencional de Western-blot para expressão da proteina de IDO pode ser realizada e a atividade da enzima IDO após estimulação de IFN-γ das células selecionadas pode ser medida pela conversão triptofano-para-quinurenina com por exemplo via análise de cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC - high performance liquid chromatography) e determinação fotométrica da concentração de quinurenina no sobrenadante como a leitura. Uma vez que as ASC expressam IDO sob certas condições, qualquer técnica adequada que permita a deteção da atividade de IDO após estimulação de IFN-γ pode ser usada para selecionar as ASC. A quantidade de IDO produzida depende do número de células por centímetro quadrado, o qual é de preferência um nivel de 5.000 cells/cm2 ou mais, mas não limitado a, esta concentração e a concentração de IFN-gama, que idealmente é 3 ng/ml ou mais, mas não limitada a esta concentração. A atividade da IDO produzida sob as condições descritas irá resultar numa produção detectável de quinurenina na gama de micro M após 24 horas ou mais. A capacidade das células selecionadas para se diferenciarem em pelo menos duas linhagens celulares pode ser analisada por métodos convencionais tal como conhecidos na área.

As ASC podem ser clonalmente expandidas, se desejado, usando um método adequado para clonar populações celulares. Por exemplo, uma população de células proliferada pode ser fisicamente colhida e semeada numa superfície separada (ou o poço de uma placa multipoço). Alternativamente, as células podem ser subclonados para uma placa multipoços numa proporção estatística para facilitar colocar uma única célula em cada poço (por exemplo, desde aproximadamente 0,1 até aproximadamente 1 célula/poço ou ainda aproximadamente 0,25 até aproximadamente 0,5 células/poço, tal como 0,5 células/poço). Claro que, as células podem ser clonadas plaqueando-as a uma densidade baixa (por exemplo, numa placa de Petri ou outro substrato adequado) e isolando-as de outras células usando dispositivos tais como anéis de clonagem. A produção de uma população clonal pode ser expandida em qualquer meio de cultura adequado. Em qualquer caso, as células isoladas podem ser cultivadas até um ponto adequado em que o seu fenótipo de desenvolvimento possa ser avaliado.

Tem-se demonstrado que a expansão ex vivo de ASC sem induzir diferenciação pode ser conseguida por períodos de tempo prolongados usando por exemplo lotes especialmente rastreados de soro adequado (tal como soro fetal bovino ou soro humano). Os métodos para medir a viabilidade e o rendimento são conhecidas na área (por exemplo, exclusão de azul de tripano).

Qualquer um dos passos e procedimentos para isolar as células da população de células da invenção pode ser realizado manualmente, se desejado. Alternativamente, o processo de isolamento de tais células pode ser facilitado e/ou automatizado através de um ou mais dispositivos adequados, exemplos dos quais são conhecidos na área.

CULTURA DE CÉLULAS MSC

As referidas MSC são também capazes de ser expandidas ex vivo. Isto é, após isolamento, as referidas MSC podem ser mantidas e deixadas proliferar ex vivo num meio de cultura celular. Tal meio é composto de, por exemplo, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM - Dulbecco's modified Eagle's médium), com antibióticos (por exemplo, 100 unidades/ml de penicilina e 100 yg/ml de estreptomicina) ou sem antibióticos, e 2 mM de glutamina, e suplementado com 2-20% de soro fetal de bovino (FBS - fetal bovine serum) . Um perito na área tem a capacidade de modificar ou modular concentrações de meios e/ou suplementos de meios conforme necessário para as células usadas. Os soros contêm muitas vezes componentes e fatores celulares e não celulares que são necessários para a viabilidade e expansão. Exemplos de soros incluem soro fetal de bovino (FBS), soro bovino (BS -bovine serum), soro de vitelo (CS - calf serum), soro fetal de vitelo (FCS - fetal calf serum), soro de vitelo recém-nascido (NCS - newborn calf serum) , soro de cabra (GS -goat serum), soro de cavalo (HS - horse serum), soro porcino, soro de ovelha, soro de coelho, soro de rato (RS -rat serum), etc. Está também dentro do âmbito da invenção que se as referidas MSC são de origem humana, o meio de cultura celular é suplementado com um soro humano, preferencialmente de origem autóloga. É entendido que os soros podem ser inativados por calor a 55-65 °C se se julgar ser necessário para inativar componentes da cascata complemento. A modulação de concentrações de soro e/ou retirada do soro do meio de cultura de soro podem também ser usadas para promover a sobrevivência de um ou mais tipos de células desejados. Preferencialmente, as referidas MSC irão beneficiar de concentrações de FBS de aproximadamente 2% até aproximadamente 25%. Numa outra forma de realização, as MSC podem ser expandidas num meio de cultura celular de composição definida, em que o soro é substituído por uma combinação de albumina do soro, transferrina de soro, selénio, e proteínas recombinantes incluindo, mas não limitadas a, insulina, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF - platelet-derived growth factor), e fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF - basic fibroblast growth factor) como conhecido na área.

Muitos meios de cultura de células já contêm aminoácidos, no entanto alguns requerem suplementação antes da cultura de células. Tais aminoácidos incluem, mas não estão limitados a, L-alanina, L-arginina, ácido L-aspártico, L-asparagina, L-cisteina, L-cistina, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-glicina, e os semelhantes.

Os agentes antimicrobianos são também tipicamente usados em culturas celulares para mitigar contaminação fúngica, micoplásmica e bacteriana. Tipicamente, os antibióticos ou compostos antimicóticos usados são misturas de penicilina/estreptomicina, mas também podem incluir, mas não estão limitados a, anfotericina (Fungizona®), ampicilina, gentamicina, bleomicina, higromicina, canamicina, mitomicina, etc.

Hormonas também poder ser vantajosamente usadas em cultura celular e incluem, mas não estão limitadas a, D-aldosterona, dietilestilbestrol (DES), dexametasona, b-estradiol, hidrocortisona, insulina, prolactina, progesterona, hormona de crescimento humano/somatostatina (HGH - human growth hormonw), etc.

CÉLULAS EXPANDIDAS

Numa forma de realização as MSC podem ter sido expandidas antes de usar no método da presente invenção. Os métodos para expansão celular são conhecidos na área.

CÉLULAS GENETICAMENTE MODIFICADAS

Numa outra forma de realização as MSC podem ser células geneticamente modificadas (por exemplo, transduzidas ou transfectadas com um ácido nucleico exógeno), ou dai derivadas.

Por exemplo as referidas células podem ser geneticamente modificadas para expressar constitutivamente indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), por exemplo, por transfecção com um uma construção de ácido nucleico apropriado que codifica a referida enzima e opcionalmente uma sequência de promotor adequada. A engenharia genética de células é conhecida na área e pode ser realizada por uma pessoa perita na área.

CÉLULAS IRRADIADAS

Ainda noutra forma de realização as MSC podem ter sido irradiadas antes do seu uso no método da presente invenção. A irradiação de células reduz as suas capacidades proliferativas e tempos de sobrevivência. A irradiação pode ser realizada usando uma fonte controlada adequada de radiação ionizante, como um dispositivo irradiador de radiação gama. As condições de irradiação devem ser experimentalmente ajustadas por uma pessoa perita na arte para determinar o tempo de exposição necessário para gerar uma dose de radiação que cause a suspensão de crescimento das MSC a longo prazo. Numa forma de realização a referida dose de radiação está dentro de uma gama selecionada entre o grupo que consiste em 1-100 Gy; 5-85 Gy, 10-70 Gy, 12-60 Gy, no entanto, é particularmente preferido que a referida dose de radiação esteja dentro da gama de 15-45 Gy. CÉLULAS TRATADAS COM ANTAGONISTA CD26

Ainda numa outra forma de realização as MSC podem ser tratadas com um antagonista CD26 ou inibidor antes da utilização no método da presente invenção. Os antagonistas CD26 e inibidores são conhecidos na arte e incluem, mas não estão limitados a, aminometilpiridina; P32/98; NVP DPP728; PSN9301; isoleucina tiazolidina; denagliptina; sitagliptina; vildagliptina; saxagliptina; alogliptina; diprotina A, e tal tratamento pode ser realizado por uma pessoa perita na área.

CÉLULAS ESTIMULADAS POR IFN-GAMA

Numa outra forma de realização as MSC podem ser estimuladas com interferão gama antes do seu uso no método da presente invenção. 0 tratamento com IFN-gama de MSC para sua estimulação é conhecido na área e pode ser realizado por uma pessoa perita na área.

CÉLULAS ESTIMULADAS POR ANTIGÉNIO

Ainda noutra forma de realização as MSC podem ser estimuladas com antigénios antes do seu uso no método da presente invenção. 0 tratamento com antigénio de MSC para sua estimulação é conhecido na área e pode ser realizado por uma pessoa perita na área.

MSC TRATADAS COM MITOMICINA C E ainda noutra forma de realização as MSC podem ser tratadas com mitomicina C antes do seu uso no método da presente invenção. 0 tratamento com mitomicina C de MSC é é conhecido na área e pode ser realizado por uma pessoa perita na área.

Além disso, se desejado, as MSC podem ser submetidas a uma combinação de dois ou três dos tratamentos selecionados a partir do grupo que consiste em irradiação, estimulação por IFN-gama e tratamento com mitomicina C antes do seu uso no método da presente invenção.

As condições de manutenção da referida MSC podem também conter fatores celulares que permitem às células permanecer numa forma indiferenciada. É evidente para os peritos na área que antes da diferenciação, suplementos que inibem a diferenciação celular devem ser removidos do meio de cultura. É também evidente que nem todas as células irão requerer estes fatores. De facto, estes fatores podem implicar efeitos indesejáveis, dependendo do tipo de célula.

As características e vantagens da invenção são mais integralmente ilustradas pelos seguintes exemplos não limitativos, em que todas as partes e percentagens são por peso, a menos que expressamente referido de outra forma.

Exemplo 1: Tratamento de artrite induzida por colagénio (CIA - collagen-induced arthritis) com ASCs

Materiais e Métodos

Modelo em Ratinho de Artrite Induzida por Colagénio (CIA) A artrite experimental foi induzida em ratinhos machos DBA1/(Η-25) (6-8 semanas de idade)) . No dia do início do estudo, cada ratinho foi injetado subcutaneamente na cauda (2-3 cm a partir do corpo) com a primeira dose de uma emulsão de colagénio tipo II (CII) de galinha (concentração final de 1 mg/ml) em adjuvante completo de Freund (concentração final de 1 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis) (CFA) num volume de 0,1 ml/animal. 21 dias depois da primeira injeção de colagénio, uma segunda injeção (reforço) de CII (0,1 ml/animal) foi administrada a cada animal, novamente subcutaneamente na cauda mas num local diferente do da primeira injecção. Nesta ocasião a suspensão de colagénio foi feita usando adjuvante incompleto de Freund (IFA - incomplete Freund's adjuvant).

Quando o índice de pontuação de artrite foi cerca de 2-4 os animais foram tratados com células estaminais derivadas de tecido adiposo expandido ou com o veículo (solução de

Ringer) como controlo. A evolução da CIA foi seguida diariamente (de segunda-feira a sexta-feira) pela medição da inflamação-vermelhidão-ancilose das articulações dos membros inferiores e superiores, de acordo com um sistema de pontuação pré-estabelecido. 0 volume de ambas as patas traseiras de cada animal foi medido diariamente após a administração do item de teste ou veículo e a média para ambas as patas foi calculada. Além disso o volume medido da pata traseira no dia 1 (antes da primeira injeção de colagénio e considerado como volume basal) para cada animal foi subtraído do volume da pata medidio em cada dia para depois obter o aumento líquido no volume da pata (ou edema) para cada animal. Adicionalmente, a gravidade da artrite foi pontuada com a mesma frequência e tempo em ambas as patas dianteiras e traseiras de acordo com o seguinte sistema de pontuação de índice de artrite: 0: Sem sinais de artrite 1: Inchaço e/vermelhidão da pata ou 1 dedo 2: Dois grupos de articulações inflamadas (inchaço e/ou vermelhidão) 3: Mais do que dois grupos de articulações inflamadas (inchaço e/ou vermelhidão) 4: Inflamação de toda a pata. Artrite grave A pontuação final é a soma de pontuações para as quatro patas. A pontuação máxima é 16.

Design Experimental

Controlo

Grupo A = Sem tratamento.

Administração intravenosa

Grupo C = Injeção intravenosa de 1 milhão de células por dose, uma dose por dia consecutivo. 5 doses no total.

Grupo D = Injeção intravenosa de primeira dose de 3 milhões de células e 1 milhão de células na segunda e terceira dose, uma dose por dia alternado. 3 doses no total.

Administração intralinfática

Grupo E = Injeção intralinfática de 320.000 células por dose (160.000 no nódulo inguinal direito, 160.000 no esquerdo) . 2 doses no total, segunda dose 7 dias antes da primeira.

Controlo de Veículos

Grupo F = Injeção intralinfática de solução de Ringer. 2 doses no total, segunda dose 7 dias antes da primeira. N = 12 ratinhos/grupo.

Administração intravenosa O item de teste foi administrado intravenosamente através da veia da cauda com o uso de uma agulha de borboleta estéril (25G). Os animais receberam 5 doses consecutivas ou 3 em dias alternativos (uma por dia). Os animais receberam 0,2 mL de item de teste como uma infusão a uma taxa de 0,05 ml/min intravenosamente através da veia da cauda.

Administração intralinfática nos nódulos linfáticos inguinais

Os ratinhos DBA1 foram anestesiados por inalação de 2,0 até 2,5% de isoflurano via máscara de nariz e deitados numa placa de aquecimento a 37 °C. Após depilação (creme depilatório Veet delicado) e desinfecção da região inguinal com 70% de etanol, uma incisão entre 6 e 8 mm foi feita na região inguinal. Os nódulos linfáticos contidos na gordura inguinal foram localizados e 8 μΐ de veiculo ou veiculo com ASCs (a uma densidade de 20 milhões de células/ml) foram injetados no nódulo linfático usando uma seringa Hamilton com uma agulha de 30 gauge. A incisão foi suturada por um ou dois nós e o procedimento foi repetido no nódulo linfático inguinal no outro lado. Os ratinhos foram deixados a recuperar da anestesia. Após sete dias, o procedimento foi repetido.

Preparação de Células Estaminais Derivadas de Tecido Adiposo Expandido O tecido adiposo humano foi obtido por lipoaspiração, sob anestesia local e sedação geral. Uma cânula de ponta romba oca foi introduzida no espaço subcutâneo através de uma pequena incisão (menor que 0,5 cm em diâmetro). Com sucção suave, a cânula foi movida através do compartimento da parede abdominal de tecido adiposo para disrupção mecânica do tecido gordo. Uma solução salina e o vasoconstritor epinefrina foram injetados no compartimento de tecido adiposo para minimizar perda de sangue. Desta forma, 80 a 100 ml de lipoaspirado em bruto foram obtidos a partir de cada paciente a ser tratado. O lipoaspirado em bruto foi extensivamente lavado com solução salina tamponada de fosfato estéril (PBS; Gibco BRL, Paisley, Escócia, Reino Unido) para remover células sanguíneas, anestésico local e salino. A matriz extracelular foi digerida com uma solução de colagenase tipo II (0,075%; Gibco BRL) em solução salina balanceada (5 mg/ml; Sigma, St. Louis, EUA) por 30 minutos a 37 °C para libertar a fração celular. Depois, a colagenase foi inativada por adição de um volume igual de meio de cultura celular (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco BRL) que continha 10% de soro fetal bovino (FBS; Gibco BRL). A suspensão de células foi centrifugada a 250 x g por 10 minutos. As células foram ressuspensas em 0,16 M NH4CI e deixadas repousar por 5 minutos à temperatura ambiente (RT - room temperature) para lise de eritrócitos. A mistura foi centrifugada a 250 x g, e as células foram ressuspensas em DMEM mais 10% de FBS e 1% de mistura de ampicilina/estreptomicina (Gibco BRL) e depois elas foram filtradas através de uma malha de 40 ym e foram plaqueadas em frascos de cultura de tecido a uma concentração de 10-30 x 103 células/cm2.

As células foram cultivadas durante 24 horas a 37 °C numa atmosfera de 5% de CO2 no ar. Depois, os frascos de cultura foram lavados com PBS para remover células não aderidas e fragmentos celulares. As células foram mantidas em cultura no mesmo meio e sob as mesmas condições até atingirem aproximadamente 80% de confluência, com substituição do meio de cultura a cada 3 a 4 dias. As células foram depois passadas com tripsina-EDTA (Gibco BRL) a uma diluição de 1:3 que corresponde a uma densidade celular de aproximadamente cerca de 5-6 x 103 células/cm2.

Para as experiências, células numa duplicação a dobrar de 12-16 foram tripsinizadas e ressuspensas com a densidade celular desejada no veículo (solução de Ringer) . Depois transferidas para a seringa e injetadas nos ratinhos.

Análise Estatística A significância estatística dos resultados foi avaliada usando o programa de estatística GraphPad Instat 3. Os resultados são expressos como a média ± erro padrão da média, onde (n) é o número de animais. A Figura 1 é anotada para ilustrar os valores-p de uma comparação do Grupo A versus Grupo E. As diferenças significativas estão indicadas como: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. A diferença entre os grupos foi avaliada pelo teste de Kruskal-Wallis para dados não emparelhados com o pós-teste de Dunn para comparações múltiplas. Um valor de P<0,05 foi considerado como significativo.

Resultados A artrite foi induzida em ratinhos DBA1 por injeção de colagénio II de galinha. Quando os ratos mostraram uma pontuação de artrite entre 2-4 eles foram tratados com ASCs expandids por via intralinfática ou intravenosa. Como um controlo para a administração intralinfática, os ratinhos foram tratados com o veiculo. O indice de artrite foi monitorizado diariamente (ver Tabela 1) . Enquanto que os ratinhos não tratados ou ratinhos tratados com veiculo mostraram alta inflamação das patas que aumentou de forma dependente com o tempo, os ratinhos tratados com ASCs expandidas entregues intralinfaticamente mostraram inflamação significativamente reduzida. Além disso, o efeito terapêutico de administração intralinfática foi maior do que no caso de administração intravenosa (ver Figura 1).

Conclusão O presente estudo mostra que administração intralinfática da ASCs humanas em ratinhos DBA1 resulta numa redução estatisticamente significativa da gravidade da artrite (como indicado pela pontuação do indice de artrite).

Além disso, o efeito terapêutico da administração intralinfática de um total de 640.000 ASCs (em duas doses) foi significativamente maior do que no caso de administração intravenosa de um total de 5 milhões de células. Estes resultados indicam que a via intralinfática de administração é mais eficaz uma vez que um maior efeito terapêutico é alcançado com um número inferior de células.

De acordo com isto, embora a invenção tenha sido aqui descrita em referência a aspetos específicos, caracteristicas e formas de realização ilustrativas da invenção, será apreciado que a utilidade da invenção não seja assim limitada, mas sim que se estenda e abranja numerosos outros aspetos, caracteristicas, e formas de realização.

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uma célula estaminal mesenquimal para uso num método para tratar, modular, melhorar e/ou profilaxia de distúrbio imune e/ou inflamatório; em que a célula estaminal mesenquimal é administrada para o sistema linfático por injeção intralinfática.
2. 2. A célula estaminal mesenquimal para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida célula estaminal mesenquimal é uma célula estaminal mesenquimal derivada de tecido adiposo.
3. 3. A célula estaminal mesenquimal para uso de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o método compreende ainda a administração de um antigénio para o sistema linfático de um sujeito.
4. 4. A célula estaminal mesenquimal para uso de acordo com a reivindicação 3, em que o referido antigénio é administrado antes de, simultaneamente com ou subsequentemente à administração da célula estaminal mesenquimal.
5. 5. A célula estaminal mesenquimal para uso de acordo com a reivindicação 3, em que o referido antigénio é administrado pelo menos, 1,2,3,5 ou 10 horas antes ou depois da administração da célula estaminal mesenquimal.
6. 6. A célula estaminal mesenquimal para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, em que a célula estaminal mesenquimal é administrada para o orgão linfático, opcionalmente um órgão linfático periférico, opcionalmente um nódulo linfático, opcionalmente um nódulo linfático axilar ou inguinal.
7. 7. A célula estaminal mesenquimal para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, em que a referida administração é realizada por meio de uma seringa, compreendendo ainda opcionalmente o passo de usar um dispositivo radiológico, de ultrassom ou imagem para monitorizar a localização de uma agulha de inj eção. 8. 0 uso de uma célula estaminal mesenquimal no fabrico de um medicamento para tratamento, modulação, profilaxia, e/ou melhoria de um distúrbio imune e/ou inflamatório, em que o medicamento é para ser administrado no sistema linfático por injeção intralinfática.
8. 9. A célula estaminal mesenquimal para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, ou o uso de reivindicação 8, em que o distúrbio é selecionado de um grupo que consiste em doença celiaca, artrite reumatóide, doença inflamatória do intestino e esclerose múltipla.
9. 10. Uma composição farmacêutica para uso num método de tratamento, melhoria e/ou profilaxia de um distúrbio imune e/ou inflamatório, em que a composição farmacêutica é para ser administrada para o sistema linfático por injeção intralinfática e compreende uma célula estaminal mesenquimal e um veiculo farmacêutico.
10. 11. A composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 10, em que a composição farmacêutica compreende ainda um antigénio e o antigénio é colagénio, glúten, um componente de glúten, mielina ou um componente de mielina.