KR101578591B1

KR101578591B1 - 간엽줄기세포 및 면역조절 t 세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물

Info

Publication number: KR101578591B1
Application number: KR1020137021403A
Authority: KR
Inventors: 조미라; 조석구; 임정연; 박현실; 박민정
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2011-02-18
Filing date: 2012-02-17
Publication date: 2015-12-17
Also published as: US10792309B2; KR20120095022A; WO2012111997A2; KR20140040696A; WO2012111997A3; US20170239295A1

Abstract

본 발명은 간엽줄기세포 및 면역조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 세포치료제인 간엽줄기세포와 면역조절 T 세포를 골수 이식 동물에게 적용하는 경우, 이식된 골수가 생착된 후 숙주에 대한 거부반응이 억제됨으로써 면역질환, 예컨대 이식편대숙주질환을 감소시키는 효과를 갖는다. 또한 이러한 면역질환 증상의 감소 수치는, 간엽줄기세포를 단독을 처리한 경우와 비교하여 월등히 향상된 효과를 가진다. 따라서 상기와 같은 효과를 갖는 본 발명의 세포치료제 조성물은 면역질환의 예방 또는 치료에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

간엽줄기세포 및 면역조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물{Cell Therapy Composition for Preventing or Treating Immune Disease Comprising Mesenchymal Stem Cells and Immunoregulatory T-cells as active ingredient}

본 발명은 면역질환을 예방 또는 치료하기 위한 세포치료제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 간엽줄기세포 및 면역조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물에 관한 것이다.

이식편대숙주질환(graft-versus-host disease, GVHD)은 동종이식 때 주입되는 공여자(供與者)의 말초 혈액이나 골수 내의 T림프구를 환자의 몸에서 남의 것으로 인식하여 면역 반응이 일어나는 질환을 말한다. 즉, 수혈된 살아 있는 림프구에 의해 유발되며 면역 반응으로 인해 간 기능 이상, 피부 병변, 황달, 설사, 발열, 범혈구감소증 등의 증상이 나타나는 질환으로 심한 경우 환자가 사망할 수 있다.

이식편대숙주질환은 크게 급성 이식편대숙주질환(acute graft-versus-host disease, aGVHD)과 만성 이식편대숙주질환(chronic graft-versus-host disease, cGVHD)로 구분된다.

만성 이식편대숙주질환은 동종이식의 경우 이식 후 보통 4~6개월이 지나서 발생하며, 이식 80일 이전이나 1년 이후 발생하는 경우는 드물다. 따라서 동종반응이 만성 이식편대숙주질환을 일으키는 주요한 전제조건이며, 만성 이식편대숙주질환의 발명과정은 긴 잠복기를 거치거나, 표적 장기에 미치는 영향이 느리게 나타난다는 것을 알 수 있다.

또한 급성 이식편대숙주질환은 동종조혈세포이식의 중요한 합병증으로, 동종조혈모세포 이식 후 대게 30~40일 이내에 발생하게 되며, 피부, 간 그리고 위장관을 침범하게 된다. 이러한 급성 이식편대숙주질환은 3단계로 발생하게 되는데, 1단계에서는 골수를 이식하기 이전에 발생하는 것으로 환자의 조직이 손상되고 경우에 따라서는 박테리아 감염 등에 의해 항원제시세포(antigen presenting cell)가 활성화되는 단계이며, 2단계에서는 이식되는 골수세포 중의 T 세포가 활성화되는 단계이다. 이미 활성화된 환자의 항원제시세포가 T 세포를 Th1 세포로 분화시키며, 궁극적으로 IL-2, IFN-gamma 등의 사이토카인 분비를 증가시킨다. 3단계에서는 환자의 장기가 파괴된다. 활성화된 Th1 세포에서 분비되는 사이토카인에 의해 사이토톡식 T 세포 (cytotoxic T cell) 및 자연살해세포 (naturall killer cell)등이 활성화되면 이들 세포는 환자의 장기를 공격하게 되어 이식편대숙주질환이 발생하게 된다.

이러한 이식편대숙주질환을 치료하기 위해서 여러 가지 방법이 제안되고 있다. 이식되는 골수세포 중에서 T 세포를 제거하는 방법, T 세포와 항원제시세포의 반응을 억제하기 위해 CD80, CD86 등에 대한 항체를 투여하는 방법, IL-2, IFN-gamma 등의 사이토카인에 대한 항체를 투여하는 방법 등이 제시되고 있다. 이와 더불어 사이클로스포린 에이, 라파마이신, FK-506 스테로이드제제 등의 화합물 면역억제제를 투여하는 방법도 사용되고 있다. 이들 방법 중에서 T 세포의 활성화를 억제하는 화합물 면역억제제 투여법이 가장 널리 사용되고 있다.

현재까지 많은 화합물 면역억제제가 개발되어 있으나 사이클로스포린에이가 가장 우수한 임상효과를 나타내고 있으며 급성 이식편대숙주병을 포함하여 자가면역질환, 장기이식거부반응, 다양한 염증질환에 널리 쓰이고 있다. 사이클로스포린에이는 고용량으로 사용할 경우 T 세포의 활성화를 완벽하게 억제하여 질병을 치료할 수 있으나 신장독성을 포함하여 상당한 부작용을 나타내는 단점을 가지고 있어, 저용량으로 사용하는 것을 권장하고 있다.

한편, 간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSC)는 지방세포, 뼈세포 및 연골세포와 같은 여러 세포계통으로 분화할 수 있는 골수를 포함하는 전신에 존재하는 줄기세포이다. 간엽줄기세포는 인간, 마우스, 쥐, 개, 염소, 토끼 및 고양이를 포함하는 다수의 종으로부터 분리되었다. 최근 간엽줄기세포가 인 비트로 및 인 비보에서 여러 T 림프구 활성을 억제하여 면역조절능력을 발휘한다는 보고가 있으나, T 림프구에 대한 간엽줄기세포의 면역조절 활성에 관련된 작용기전은 완전하게 규명되어 있지는 않은 상태이다.

또한 이러한 간엽줄기세포를 다른 세포와 함께 사용하는 경우, 간엽줄기세포만을 사용하는 경우와 비교하여, 이식편대숙주질환의 치료에 월등한 효과를 가진다는 내용에 대해서는 전혀 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 간엽줄기세포와 면역조절 T 세포를 골수 이식 동물에게 함께 주입하였을 때에, 이식된 골수가 생착된 후 숙주에 대한 거부반응이 억제됨으로써 이식편대숙주질환을 감소시키는 효과가 있으며, 이러한 효과는 간엽줄기세포만을 주입한 경우보다 월등히 향상된 효과임을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

한국공개특허 10-2008-0078204

따라서 본 발명의 목적은 면역억제제의 사용 없이도 효과적으로 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 세포치료제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 간엽줄기세포 및 면역조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간엽줄기세포는 인간유래 간엽줄기세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역조절 T 세포는 레티날에 의해 유도된 면역조절 T 세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 레티날에 의해 유도된 면역조절 T 세포는 CD4+ T 세포에 항-CD3, TGF-b, 항-CD28 및 레티날을 처리하여 유도된 CD4+CD25+ 면역조절 T 세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 세포치료제를 1×10⁴ cell/kg 내지 1×10⁸ cell/kg로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 류머티스관절염, 루프스병, 베체트병 및 쇼그렌병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 간엽줄기세포 및 면역조절 T세포를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역조절 T 세포는 레티날에 의해 유도된 면역조절 T 세포이고, 레티날에 의해 유도된 면역조절 T 세포는 CD4+ T 세포에 항-CD3, TGF-b, 항-CD28 및 레티날을 처리하여 유도된 CD4+CD25+ 면역조절 T 세포일 수 있다.

또한, 본 발명은 간엽줄기세포 및 면역조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 개인맞춤형 키트를 제공한다.

본 발명의 세포치료제인 간엽줄기세포와 면역조절 T 세포를 골수 이식 동물에게 적용하는 경우, 이식된 골수가 생착된 후 숙주에 대한 거부반응이 억제됨으로써 이식편대숙주질환 등 면역질환의 증상을 감소시키는 효과를 갖는다.

또한 이러한 이식편대숙주질환 감소 수치는, 간엽줄기세포를 단독을 처리한 경우와 비교하여 월등히 향상된 효과를 가진다.

따라서 상기와 같은 효과를 갖는 본 발명의 세포치료제 조성물은 면역질환의 예방 또는 치료에서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 급성 이식편대숙주질환 동물 모델의 세포 치료 스케줄을 간략하게 도식화하여 나타낸 것이다(hMSC : 인간 유래 간엽줄기세포, Treg : 면역 조절 T 세포).
도 2는 급성 이식편대숙주질환 동물 모델에서 간엽줄기세포를 단독으로 처리한 군(1번 실험군)과 간엽줄기세포와 면역조절 T 세포를 함께 넣어준 군(2번 실험군)의 임상 이식편대숙주질환 수치를 나타낸 그래프이다.
도 3은 급성 이식편대숙주질환 동물 모델에서 간엽줄기세포를 단독으로 처리한 군(1번 실험군)과 간엽줄기세포와 면역조절 T 세포를 함께 넣어준 군(2번 실험군)의 마우스 체중을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 급성 이식편대숙주질환 동물 모델에서 간엽줄기세포를 단독으로 처리한 군(1번 실험군)과 간엽줄기세포와 면역조절 T 세포를 함께 넣어준 군(2번 실험군)의 피부, 소장, 대장, 간에서의 병리조직을 헤마토실린/에오신으로 염색하여 분석한 사진이다.
도 5는 자가면역관절염 동물 모델을 대상으로 간엽줄기세포를 단독 처리한 군, 간엽줄기세포와 면역조절 T세포를 함께 처리한 군 및 아무것도 처리하지 않은 군에서 관절염의 증상정도를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 자가면역관절염 동물 모델을 대상으로 간엽줄기세포를 단독 처리한 군, 간엽줄기세포와 면역조절 T세포를 함께 처리한 군 및 아무것도 처리하지 않은 군에서 관절과 연골의 파괴정도 및 염증세포의 침윤정도를 면역조직염색화학법을 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 자가면역관절염 동물 모델을 대상으로 간엽줄기세포를 단독 처리한 군, 간엽줄기세포와 면역조절 T세포를 함께 처리한 군 및 아무것도 처리하지 않은 군에서 IgG, IgG1 및 IgG2a의 발현 정도를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 간엽줄기세포 및 면역조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 제공함을 그 특징으로 한다.

본 발명에서 상기 '간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSC)'는 골수(bone marrow), 혈액, 진피 및 골막에서 분리되는 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포, 연골세포 및 뼈세포 등으로 분화할 수 있는 전능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포를 의미한다.

본 발명에서 상기 면역조절 T 세포는 T 세포의 일종으로, 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있는 세포이며, Regulatory T cells (Treg)로 표시한다. 이러한 면역조절 T 세포는 크게 자연성(natural) Treg와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5~10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어 인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한 말초 자연성 T 세포는 특정 환경 하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성 Treg 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-β를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts 등이 여기에 해당한다.

본 발명에서 상기 '레티날(retinal)'은 레티놀(retinol 또는 비타민 A)의 환원체로 다양한 생물학적 기능을 나타내는 필수적인 영양소이며, 화학명은 3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2,4,6,8-nonatetraenal이다.

본 발명에서 상기 '세포치료제'란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식ㆍ선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 "줄기세포 치료제"이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 면역세포 치료제로 분류할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 간엽줄기세포는, 동물의 간엽줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 간엽줄기세포일 수 있다. 또한 본 발명의 간엽줄기세포는 골수, 지방조직, 말초혈액, 간, 폐, 양수, 태반의 융모막 또는 제대혈로부터 유래된 것일 수 있으며, 인간 지방세포로부터 유래한 것이 특히 바람직하다.

간엽줄기세포는 골수 등에 매우 적은 양으로 존재하지만, 이를 분리 및 배양하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있으며(예컨대, 미국특허 제5,486,359호에 개시되어 있으며), 또한, 상기 간엽줄기세포는 공지된 방법에 따라 골수의 조혈모세포로부터 부착특성에 의해 분리한 후 분화능력을 잃지 않은 상태에서 증식시켜 얻을 수 있다.

간엽줄기세포를 얻는 과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다: (1) 인간 또는 마우스를 포함하는 포유동물, 바람직하게는, 인간의 간엽줄기세포 소스, 예컨대, 혈액 또는 골수로부터 간엽줄기세포를 분리하는 단계(상기 골수는 경골, 대퇴골, 척수 또는 장골로부터 추출할 수 있다.); (2) 분리된 세포를 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및 (3) 배양과정에서 부유 세포를 제거하고 배양 플레이트에 부착된 세포들을 계대 배양하여, 최종적으로 구축된 간엽줄기세포를 수득하는 단계를 통하여 얻을 수 있다.

상기 과정에서 이용되는 배지로는, 줄기세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다.

간엽줄기세포의 확인은 유세포 분석을 통하여 할 수 있다. 이러한 유세포 분석은, 간엽줄기세포의 특이한 표면 마커를 이용하여 실시된다. 예컨대, 간엽줄기세포는 CD44, CD29 및/또는 MHC 클래스 I에 대하여 양성 반응을 나타내므로, 이를 통해 간엽줄기세포를 검증할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 면역조절 T 세포는, 그 종류를 제한하는 것은 아니나, 바람직하게는 레티날에 의해 유도된 면역조절 T 세포일 수 있다.

레티날에 의해 유도된 면역조절 T 세포를 얻는 과정을 구체적으로 설명하면 다음과 같다: (1) CD4+ T 세포를 준비하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 준비된 CD4+ T 세포 및 방사선을 조사한 항원공여세포(antigen presenting cell, APC)를 항-CD3로 코팅 처리된 웰 플레이트에 분주한 후, 항-CD28 항체와 TGF-β를 처리하여 분화 환경을 조성하는 단계; 및 (3) 상기 (2) 단계를 거친 세포에 레티날 화합물을 처리하는 단계를 통하여 CD4+CD25+ 면역조절 T 세포를 얻을 수 있다.

상기 (1) 단계에서 CD4+ T 세포는 비장의 세포에서 분리된 CD4+ T 세포일 수 있다.

상기 (2) 단계에서 분주되는 CD4+ T세포 및 방사선을 조사한 항원공여세포는 각각 5×10⁵세포일 수 있다.

상기 (2) 단계에서 항원공여세포에 조사되는 방사선의 세기는 5000rad일 수 있다.

상기 (2) 단계에서 코팅 처리되는 항-CD3의 농도는 1㎍/mL일 수 있다.

상기 (2) 단계에서 처리되는 항-CD28 항체의 농도는 1㎍/mL 일 수 있으며, 처리되는 TGF-β농도는 5ng/mL일 수 있다.

상기 (3) 단계에서 처리되는 레티날의 농도는 0.1μM 내지 1μM일 수 있다.

상기 (3) 단계에서 레티날 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다.

상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산에 의해 형성된 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로에세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔 술폰산, 글루탐산 및 아세파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다. 이러한 레티날 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에서 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 세포치료제 조성물은 간엽줄기세포와 면역조절 T 세포가 혼합된 형태이다. 즉, 간엽줄기세포 또는 면역조절 T 세포를 각각을 단독으로 사용하는 것이 아니라, 이들을 동시에 함께 사용하는 것이다.

본 발명에서는 상기 간엽줄기세포와 면역조절 T 세포를 동시에 사용하는 경우, 간엽줄기세포를 단독으로 사용하는 경우보다 월등한 효과로 면역질환의 증상을 감소시킬 수 있음을 실험을 통해 확인하였다.

보다 구체적으로, 본 발명의 하기 실시예에서는 공여마우스의 대퇴골과 경골에서 조혈모세포를 분리한 후, 전신방사선조사(TBI)를 실시한 수여마우스에 이식을 통해 급성 이식편대숙주질환 동물모델을 제조하였으며, 이렇게 제조된 동물 모델에 인간 간엽줄기세포(2×10⁶)를마우스 복강 내에 주사함과 동시에, 레티날에 의해 유도된 면역조절 T 세포(2×10⁶)를 마우스의 정맥 내에 주사하였다. 그 결과 급성 이식편대숙주질환 동물모델에서 임상적 이식편대숙주질환 수치가 현격히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명의 세포치료제(간엽줄기세포+면역조절 T 세포)를 골수 이식 동물에게 적용하는 경우, 이식된 골수가 생착된 후 숙주에 대한 거부반응이 억제됨으로써 이식편대숙주질환과 같은 면역질환의 증상을 억제시킬 수 있으며, 상기와 같은 효과를 갖는 본 발명의 세포치료제 조성물은 면역질환의 예방 또는 치료에서 유용하게 사용될 수 있다.

참고로 상기 '생착'이란 임플란트되거나 이식된 치료용 세포 (세포치료제)가 일정 시간이 경과한 후에도 목표 장기 (골수, 손상된 장기, 말초림프절, 종양조직 등)에 머무르면서 치료용 세포의 수가 지속되거나 증식되는 현상을 의미한다.

상기와 같은 효과를 갖는 본 발명의 세포치료제 조성물은 면역질환을 예방 또는 치료하는데 효과가 있으며, 상기 면역질환으로는 이에 제한되지는 않지만, 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 류머티스관절염, 루프스병, 베체트병 및 쇼그렌병으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 세포치료제 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.

본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 용어 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 조성물에는 1×10⁴ cell/kg 내지 1×10⁸ cell/kg의 세포치료제가 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 면역질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 세포치료제(간엽줄기세포+면역조절 T 세포)를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 세포치료제(간엽줄기세포+면역조절 T 세포)를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 면역질환의 예방 또는 치료용 의약품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 간엽줄기세포 및 면역조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 개인맞춤형 키트를 제공할 수 있으며, 상기 키트는 당업계에서 사용되고 있는 키트 제조방법에 따라 제조할 수 있고 다만 치료효과를 유도할 수 있는 유효성분으로서 간엽줄기세포 및 면역조절 T 세포를 유효성분을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제(간엽줄기세포+면역조절 T 세포)를 투여하는 것을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 '포유동물'은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 세포치료제 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 조성물에 포함되는 세포치료제(간엽줄기세포+면역조절 T 세포)는 1×10⁴ cell/kg 내지 1×10⁸ cell/kg의 양을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제(간엽줄기세포+면역조절 T 세포)를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

급성 이식편대숙주질환 동물 모델 제작

급성 이식편대숙주질환(Acute Graft versus host disease: aGVHD) 모델을 제작하기 위하여 수여마우스 Balb/c (H-2k/d)를 전신방사선조사(TBI) 750cGy를 하고 공여마우스 C57BL/6 (H-2k/b)의 대퇴골과 경골에서 조혈모세포를 분리하여 조혈모세포 2x10⁷을 수여마우스 Balb/c(H-2k/d)에 이식하여 급성 이식편대숙주질환 동물 모델을 제작하였다.

< 실시예 2>

본 발명의 세포치료제인 간엽줄기세포 및 면역조절 T 세포의 준비

<2-1> 지방조직으로부터 간엽줄기세포 분리 및 배양

지방 흡입수술로 얻어진 지방 조직이나, 외과적 수술 후에 얻어진 지방 조직을 10% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 PBS로 10회 이상 세척하여 혈액과 이물질을 제거한 후, 조직을 0.2-0.3 g이 되도록 잘게 절단하였다. 0.2% 콜라게나아제 (Roche, Sandhofer Strasse, Mannheim, Germany) 용액에 넣어서 37℃의 수욕, 100 rpm에서 1시간 동안 반응시켰다. 100㎛ 메쉬를 이용하여 콜라게나아제에 의해서 분해된 용액층과 분해 되지 않은 조각을 분리한 후, 분리된 콜라게나아제 용액에 동량의 PBS를 첨가하였다. 이어, 4℃, 1200 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액인 지질과 지방층을 제거하고, 콜라게나아제 상층액을 제거하였다. 가라앉은 MSC로부터 남은 콜라게나아제 용액을 제거하기 위해서 MSCGM [mesenchymal stem cell growth media: MSC 기본 배지 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 간엽세포 성장 보조물 (Cambrex, Walkersville, MD, 미국), 4 mM L-글루타민 및 페니실린(0.025 unit/500 ㎖)/스트렙토마이신(0.025 mg/500 ㎖)]를 넣어 다시 4℃, 1200 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. MSCGM은 우태아혈청을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)에 기초한 배지이다. 이어, 상층액을 제거하고, 얻어진 MSC는 배양접시에 접종하여 MSCGM로 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였다. 이틀에 한번 씩 배양액을 교체하면서 배양하였다.

<2-2> 면역조절 T 세포 준비

C57BL/6 의 비장(spleen) 세포에서 분리된 CD4+ T세포 5×10⁵와 5000rad에서 조사한 항원공여세포(APC) 5×10⁵를 항-CD3가 1㎍/mL로 코팅(coating) 처리된 24웰 플레이트(well plate)에 분주하고, 항-CD28 항체 1㎍/mL과 TGF-β 5ng/mL의 농도로 처리하여 3일 동안 조절 T 세포 분화를 유도하였다. 레티날(retinal)은 조절 T세포 분화시키기 전에 0.1μM 과 1μM의 농도로 처리되었다. 유세포 분석을 위해 항-마우스 CD4 PerCP, CD25 APC와 FoxP3 PE형광이 라벨된 Abs를 넣고 4℃에서 30분간 반응시켰다. PBS로 씻어준 후 유세포 분석기(FACs Calibur)로 측정하였다.

< 실시예 3>

본 발명의 세포치료제가 급성 이식편대숙주질환 동물 모델에 미치는 영향

<3-1> clinical GVDH score 측정

본 발명의 세포치료제가 급성 이식편대숙주질환에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 급성 이식편대숙주질환 동물 모델(이하, 간단하게 'aGVHD' 모델이라고 함)에 실시예<2-1>에서 준비한 인간 지방으로부터 유래한 간엽줄기세포(2x10⁶,복강 내 주사)만을 주입한 1번 실험군과; 실시예<2-1>에서 준비한 인간 지방으로부터 유래한 간엽줄기세포(2x10⁶,복강 내 주사) 및 실시예<2-2>에서 준비한 면역조절 T 세포(2x10⁶,정맥 내 주사)를 함께 주입한 2번 실험군에서 임상 이식편대숙주질환 수치(clinical GVDH score)를 측정하였다. 세포 주입은 일주일에 한 번씩 4회를 진행하였다 (도 1 참조). 또한 실시예 1에서 제조된 급성 이식편대숙주질환 동물 모델에 어떤 치료도 시행하지 않은 것을 대조군으로 사용하였다.

상기 임상 이식편대숙주질환 수치(clinical GVDH score)는 이식편대숙주질환의 진행 정도를 매일 마우스를 관찰하여 체중감소, 털의 상태, 자세, 활동 정도, 발이나 꼬리 부위의 피부 변화에 대한 각각의 점수를 매기는 임상점수체계를 사용하여 평가하였다.

그 결과 도 2에서 나타난 바와 같이, aGVHD 모델에서 간엽줄기세포를 단독으로 처리한 군(1번 실험군) 보다는 간엽줄기세포와 면역조절 T 세포와 함께 넣어준 군(2번 실험군)에서의 임상 이식편대숙주질환 수치가 현저하게 낮은 것으로 나타났다. 이를 통해, 2번 실험군에서 이식편대숙주질환이 거의 일어나지 않음을 증명할 수 있었다. 대조군에서는 임상점수체계가 가장 높게 점수가 나와 aGVHD 모델로 적합함을 증명하였다.

또한 도 3에서는 마우스의 체중을 측정하여 그 결과를 수치로 나타내었는데, 2번 실험군에서 체중이 가장 높게 측정되었으며, 이를 통해 이식편대숙주질환 극복을 보여주는 단면적인 결과의 예로 볼 수 있었다.

<3-2> 피부, 소장, 대장, 간에서의 병리조직 분석

또한 본 발명의 세포치료제가 급성 이식편대숙주질환에 미치는 영향을 조직 병리학적 관점에서 살펴보기 위하여, 1번 실험군, 2번 실험군 및 대조군 각각의 마우스의 피부 조직, 소장 조직, 대장 조직 및 간 조직을 절편으로 분리한 후 헤마톡실린/에오신 (hematoxylin/eosin) 염색을 수행하였다 (조혈모세포 이식 후 50일에 희생시킴).

그 결과 도 4에서 나타난 바와 같이, 대조군에서는 각 장기로의 증가된 림프구의 침윤과 상피와 점막층의 파괴를 보여 이식편대숙주질환에 합당한 소견을 보였으며, 1번 실험군(간엽줄기세포 주입 군)과 비교하여 2번 실험군(간엽줄기세포+면역조절 T 세포 주입 군)에서 림프군의 침윤과 상피와 점막층의 파괴가 현저히 덜 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 세포치료제(간엽줄기세포+면역조절 T 세포)가 이식편대숙주질환을 극복할 수 있는 세포 치료법이라는 것을 증명하였다.

< 실시예 4>

자가면역관절염 동물모델 제작

Y. Iwakura팀이 발표한 방법에 따라 IL-1 수용체 유전자를 결손시킨 마우스(IL-1Ra knockout mouse)를 제작하였는데, 이는 인터루킨1 수용체억제인자(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)가 IL-1수용체에 직접 작용하여, IL-1α, IL-1β가 수용체에 작용하지 못하도록 함으로써 자연적으로 자가면역관절염 질환이 유발되도록 하였다.

< 실시예 5>

간엽줄기세포와 Treg 세포처리에 따른 자가면역관절염 치료효과

상기 실시예 4에서 제조된 자가면역관절염 동물모델을 대상으로 상기 실시예 2에서 준비된 간엽줄기세포와 면역조절 T 세포인 treg 세포 처리에 의해 자가면역관절염의 치료효과가 있는지 조사하기 위해 먼저, 정상 Balb/c(H-2k/d)를 치사시킨 후, 비장에서 단일 세포를 분리한 다음 MACs Bead를 사용하여 CD4 T 세포를 분리하였고, CD4 T 세포에 Anti-CD3 1ug/ml, TGF-b 5ng/ml, Retinal 1uM, Anti-CD28 1ug/ml로 자극한 다음 3일 배양하여 CD4+CD25+ T(Treg) 세포만을 분리하였다.

이후 실시예 4에서 제작한 자가면역관절염 질환 모델인 IL-1RaKO 마우스 모델에 간엽줄기세포(Human MSCs 2x10⁶i.p)와 상기 수득한 Treg(2x10⁶i.v) 세포를 함께 일주일 간격으로 총 3회 주입하였다. 또한, 이때 비교 대조군으로는 간엽줄기세포만을 주입한 군과 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였으며, 관절염 증상정도를 수치화하여 측정하였고, 상기 각 실험 마우스로부터 관절과 연골의 파괴정도를 면역조직염색화학법을 통해 관찰하였고, 나아가 Th2 타입의 IgG1과 Th1 타입의 IgG2a의 생성 정도를 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 자가면역관절염이 발생된 마우스를 대상으로 간엽줄기세포만을 단독 처리한 경우 아무것도 처리하지 않은 관절염 마우스에 비해 관절염 증상 정도는 감소한 것으로 나타났으며, 간엽줄기세포와 treg 세포를 동시에 처리한 군의 경우는 간엽줄기세포를 단독처리한 군에 비해 월등히 질환의 증상 정도가 개선된 것으로 나타났다.

또한, 면역조직염색화학법 분석결과, 관절과 연골의 파괴 정도가 간엽줄기세포와 treg 세포를 동시에 처리한 군의 경우는 간엽줄기세포를 단독처리한 군에 비해 현저히 감소되어 있는 것으로 나타났으며, 염증세포의 침윤 또한 감소된 것으로 나타났다(도 6 참조).

나아가 Th1 및 Th2 반응에 미치는 영향을 분석 결과, 간엽줄기세포와 면역조절세포를 동시 주입한 군의 경우, Th2 타입의 IgG1 레벨은 증가된 것으로 나타난 반면, Th1 타입의 IgG2a 레벨은 감소된 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 간엽줄기세포와 면역조절 세포를 동시에 처리하는 경우, 면역세포의 염증반응 또한 감소시키는 작용이 우수함을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

간엽줄기세포; 및 CD4+ T 세포에 항-CD3, TGF-b, 항-CD28 및 레티날을 처리하여 유도된 CD4+CD25+ 면역조절 T 세포를 모두 유효성분으로 포함하고,
상기 간엽줄기세포는 인간 유래 간엽줄기세포이며,
상기 간엽줄기세포 및 CD4+CD25+ 면역조절 T 세포는 세포수들의 총 합이 1×10⁴ cell/kg 내지 1×10⁸ cell/kg의 세포수로 조성물 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 면역질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
삭제
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제1항에 있어서,
상기 면역질환은 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 류머티스관절염, 루프스병, 베체트병 및 쇼그렌병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물.
간엽줄기세포; 및 CD4+ T 세포에 항-CD3, TGF-b, 항-CD28 및 레티날을 처리하여 유도된 CD4+CD25+ 면역조절 T 세포를 모두 유효성분으로 포함하고,
상기 간엽줄기세포는 인간 유래 간엽줄기세포이며,
상기 간엽줄기세포 및 CD4+CD25+ 면역조절 T 세포는 세포수들의 총 합이 1×10⁴ cell/kg 내지 1×10⁸ cell/kg의 세포수로 조성물 내에 포함되어 있는 면역질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 면역질환의 예방 또는 치료 방법.
삭제
제7항에 있어서,
상기 면역질환은 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 류머티스관절염, 루프스병, 베체트병 및 쇼그렌병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역질환 예방 또는 치료 방법.
간엽줄기세포; 및 CD4+ T 세포에 항-CD3, TGF-b, 항-CD28 및 레티날을 처리하여 유도된 CD4+CD25+ 면역조절 T 세포를 모두 유효성분으로 포함하고,
상기 간엽줄기세포는 인간 유래 간엽줄기세포이며,
상기 간엽줄기세포 및 CD4+CD25+ 면역조절 T 세포는 세포수들의 총 합이 1×10⁴ cell/kg 내지 1×10⁸ cell/kg의 세포수로 조성물 내에 포함되어 있는 면역질환 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물을 포함하는, 면역질환 예방 또는 치료용 개인맞춤형 키트.
삭제
제10항에 있어서,
상기 면역질환은 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 류머티스관절염, 루프스병, 베체트병 및 쇼그렌병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역질환 예방 또는 치료용 개인맞춤형 키트.