-
Die
vorliegende Erfindung betrifft das Inhibieren einer T-Zell-Antwort
auf ein Alloantigen und betrifft weiterhin das Inhibieren und/oder
Verhindern der erneuten Aktivierung zuvor aktivierter T-Zellen.
Spezifischer ausgedrückt,
betrifft die vorliegende Erfindung das Gebiet des Verhinderns, Reduzierens
oder Behandelns einer durch Immuneffektorzellen ausgelösten Immunantwort
gegen fremde(s) Gewebe und/oder Zellen und/oder Organe. Die Erfindung
betrifft weiterhin das Verhindern, Reduzieren oder Behandeln von
Transplantatabstoßung
und/oder Graft-versus-Host-Reaktion.
-
Hintergrund
der Erfindung
-
Toleranz
ist das erworbene Fehlen spezifischer Antwortbereitschaft auf ein
Antigen, auf das normalerweise eine Immunantwort erfolgen würde. Typischerweise
muss zum Induzieren von Toleranz eine Exposition gegenüber einem
Toleranz erzeugenden Antigen stattgefunden haben, die zum Tod oder
einer funktionellen Inaktivierung bestimmter Lymphozyten führt. Vollständige Toleranz
ist charakterisiert durch das Fehlen einer detektierbaren Immunantwort,
entweder Antikörper-
oder Zell-vermittelt, auf die zweite Antigen-Belastung. Partielle
Toleranz ist durch die quantitative Verringerung einer Immunantwort
gekennzeichnet.
-
Die
Funktion des Immunsystems besteht darin, Fremdkörper zu eliminieren, die Pathogene
enthalten könnten,
und die Reaktionslosigkeit oder Toleranz gegenüber Selbstantigenen aufrecht
zu erhalten. T-Zell-Toleranz wird erreicht 1) im Thymus, wo Thymuszellen,
die für
eigene Peptide reaktiv sind, durch klonale Deletion eliminiert werden
(zentrale Toleranz) und 2) in der Peripherie durch Exposition gegenüber Selbstantigenen
unter tolerant machenden Bedingungen (periphere Toleranz). Die klonale
Deletion kann auch aus der Expression von Zelltodmolekülen auf
Antigen-präsentierenden
Zellen resultieren. Klassische Beispiele für Zelltod-Moleküle sind Fas-Ligand
(FasL) und TRAIL-Ligand,
die mit ihren Rezeptoren, Fas bzw. DR4, auf aktivierten T-Zellen
in Verbindung treten, wodurch die Apoptose der T-Zellen induziert
wird. Die Interaktion von CD27, einem Mitglied der TNFR-Superfamilie,
und CD27-Ligand (CD70) induziert ebenfalls T-Zell-Apoptose.
-
Unglücklicherweise
unterscheidet das Immunsystem nicht zwischen nützlichen Eindringlingen, wie
etwa transplantiertem Gewebe, und denen, die schädlich sind, und somit stößt das Immunsystem transplantierte
Gewebe oder Organe ab. Die Abstoßung transplantierter Organe
wird in signifikanter Weise durch alloreaktive T-Zellen vermittelt,
die im Wirt vorhanden sind und die Donor-Alloantigene oder Xenoantigene
erkennen.
-
Derzeit
werden Patienten mit starken immunsuppressiven Arzneimitteln behandelt,
um eine Immunantwort gegen ein Transplantat zu verhindern oder zu
reduzieren. Das bei den Individuen erfolgende Infundieren von Arzneimitteln,
die die T-Zellimmunantwort verhindern oder unterdrücken, hemmt
die Transplantatabstoßung,
kann jedoch auch zu einer allgemeinen Immunsuppression, Toxizität oder gar zum
Tod durch opportunistische Infektionen führen. Aufgrund der Toxizität und der
unvollständigen
Reaktionsrate gegenüber
der konventionellen Behandlung der Donorgewebeabstoßung werden
alternative Ansätze
benötigt,
um Patienten zu behandeln, die auf die derzeitigen Ansätze der
Arzneimitteltherapie nicht ansprechen oder diese nicht vertragen
können.
-
Entsprechend
gibt es einen Bedarf für
die Verhinderung und/oder Reduzierung einer unerwünschten
Immunantwort durch einen Wirt gegenüber einem Transplantat durch
Immuneffektorzellen als ein Verfahren, um die Wirtsabstoßung des
Donorgewebes abzuwenden. Ebenfalls vorteilhaft wäre ein Verfahren, um eine unerwünschte Immunantwort durch
ein Donorgewebe gegen ein Empfängerwebe, bekannt
als Graft-versus-Host-Krankheit,
zu eliminieren oder zu reduzieren.
-
Die
WO 97/41863 offenbart, dass Immuntoleranz gegenüber einem Transplantat in einem
Empfänger-Säuger dadurch
unterstützt
werden kann, dass man hämatopoetische
Stammzellen verabreicht.
-
Die
US 5,486,359 offenbart die
Isolierung, Reinigung und Kulturvermehrung humaner mesenchymaler
Stammzellen, wodurch eine homogene Population mesenchymaler Stammzellen
bereitgestellt wird.
-
Die
WO 96/23058 offenbart, dass die Annahme von Knochenmarktransplantat
bei einem Individuum durch die Verabreichung von mesenchymalen Stammzellen
und Knochenmarktransplantat gefördert
wird.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Es
ist entdeckt worden, dass humane mesenchymale Stammzellen bei Transplantationen
verwendet werden können,
um eine Antwort durch das Immunsystem derart zu verbessern, dass
eine Immunantwort gegen (ein) Antigen(e) reduziert oder eliminiert
wird.
-
Die
Erfindung richtet sich auf ein ex vivo-Verfahren zum Reduzieren
einer Immunantwort gegen ein Alloantigen gemäß Anspruch 1. Die Erfindung richtet
sich weiterhin auf eine Verwendung gereinigter mesenchymaler Stammzellen
für die
Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 4.
Die Erfindung richtet sich außerdem
auf eine Verwendung mesenchymaler Stammzellen für die Herstellung einer Zubereitung
nach Anspruch 29. Darüber
hinaus richtet sich die Erfindung auf ein ex vivo-Verfahren zum
Reduzieren einer durch ein Donor-Transplantat hervorgerufenen Immunantwort nach
Anspruch 31.
-
Die
Erfindung stellt ein ex vivo-Verfahren bereit, um eine durch T-Zellen
in Reaktion auf ein Alloantigen verursachte Immunantwort zu reduzieren oder
zu unterdrücken,
insbesondere gegenüber
einem allogenen Gewebe, Organ oder Zellen, wobei die Immunantwort
durch die Verwendung mesenchymaler Stammzellen reduziert oder supprimiert
wird. Die mesenchymalen Stammzellen können zu den T-Zellen autolog
(vom selben Wirt erhalten) oder allogen zu diesen sein. Im Fall
mesenchymaler Stammzellen, die zu den T-Zellen allogen sind, können die mesenchymalen
Stammzellen autolog zu den Zellen oder dem Gewebe sein, auf das
die T-Zellen reagieren (vom gleichen Wirt erhalten sein), oder die
mesenchymalen Stammzellen können
von einem Wirt erhalten werden, der sowohl gegenüber der Quelle der T-Zellen
als auch gegenüber
der Quelle der Zellen oder Gewebe, auf die die T-Zellen reagieren,
allogen ist.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein ex vivo-Verfahren
bereitgestellt, um die erneute Stimulation aktivierter T-Zellen
(aktiviert gegen ein Alloantigen, insbesondere ein allogenes Organ,
Gewebe oder Zellen) zu verhindern, indem man aktivierte T-Zellen
mit mesenchymalen Stammzellen in einer Menge in Kontakt bringt, die
wirksam ist, eine nachfolgende T-Zell-Antwort auf ein fremdes Antigen
zu verhindern und/oder zu reduzieren. Die mesenchymalen Stammzellen,
die verwendet werden, können
zu den T-Zellen autolog und/oder allogen sein. Wenn allogene mesenchymale
Stammzellen verwendet werden, so können die mesenchymalen Stammzellen
von demselben Wirt erhalten werden wie die Gewebe oder die Zellen,
die die T-Zellen aktiviert haben, oder sie können von einem Wirt erhalten
werden, der allogen ist sowohl gegenüber den T-Zellen als auch dem
Wirt, der die Zellen oder Gewebe bereitgestellt hat, die die T-Zellen aktiviert
haben.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden mesenchymale Stammzellen
für die
Herstellung einer Zubereitung verwendet, um eine Immunantwort gegenüber einem
Transplantat (Gewebe, Organ, Zellen, etc.) zu unterdrücken oder abzumildern,
indem man dem Transplantatempfänger
die Zubereitung mit den mesenchymalen Stammzellen in einer Menge
verabreicht, die wirksam ist, eine Immunantwort gegen das Transplantat zu
unterdrücken
oder zu verbessern. Die mesenchymalen Stammzellen können für den Transplantatempfänger autolog
oder allogen sein.
-
Dementsprechend
stellt ein ex vivo-Verfahren der vorliegenden Erfindung das In-Kontakt-Bringen des
Empfängers
eines Donorgewebes mit mesenchymalen Stammzellen bereit. Bei einer
Ausführungsform
dieses Aspekts beinhaltet das Verfahren die Verwendung gereinigter
mesenchymaler Stammzellen für
die Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Verabreichung
an den Empfänger von
Donorgewebe. Die pharmazeutische Zubereitung mit den gereinigten
mesenchymalen Stammzellen kann dem Empfänger vor, gleichzeitig mit
oder nach dem Transplantat verabreicht werden. Die mesenchymalen
Stammzellen können
für den
Empfänger
autolog oder allogen sein und können
von dem Donor erhalten werden. Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung
können
die allogenen mesenchymalen Stammzellen auch von einer anderen Quelle
als dem Donor erhalten werden, und eine solche Quelle muss weder
an den Donor- noch an den Empfängertyp
angepasst sein.
-
Bei
einer weiteren Ausführungsform
dieses Verfahrens werden als Teil einer Transplantationsprozedur
die mesenchymalen Stammzellen modifiziert, um ein Molekül zu exprimieren,
das Zelltod induziert. Die mesenchymalen Stammzellen können dafür verwendet
werden, um dem Immunsystem ein Molekül zu liefern, das die Apoptose
aktivierter T-Zellen induziert, die einen Rezeptor für das Molekül tragen.
Dies resultiert in der Deletion aktivierter T-Lymphozyten und in
der Suppression einer unerwünschten
Immunantwort gegen ein Transplantat. In Übereinstimmung mit diesem Aspekt
der Erfindung werden allogene humane mesenchymale Stammzellen modifiziert,
um ein Zelltod-Molekül
zu exprimieren. Das Molekül
kann für
die mesenchymalen Stammzellen exogen oder endogen sein. Bei bevorzugten
Ausführungsformen
der hier beschriebenen Verfahren exprimieren die mesenchymalen Stammzellen
das Zelltod-Molekül
Fas-Ligand oder TRAIL-Ligand.
-
Die
mesenchymalen Stammzellen können auch
in einer pharmazeutischen Zubereitung zur Verabreichung als Teil
des Transplantats an den Empfänger
verwendet werden. Zu diesem Zweck stellt die vorliegende Erfindung
ein ex vivo-Verfahren bereit, um eine Immunantwort zu reduzieren
oder zu verbessern, indem sie dem Empfänger ein Donorgewebe oder -Organ
bereitstellt, das mit mesenchymalen Stammzellen perfundiert ist
oder diese enthält,
wobei die mesenchymalen Stammzellen vom Donor des Gewebes oder Organs
erhalten werden oder mesenchymale Stammzellen einer dritten Partei
sind oder mesenchymale Stammzellen sind, die zu den T-Zellen autolog
sind. Die mesenchymalen Stammzellen mildern eine von den T-Zellen
des Empfängers
gegen das Fremdgewebe gerichtete Immunantwort, wenn dieses in den
Empfänger
transplantiert wird.
-
Bei
einer weiteren Ausführungsform
dieser Erfindung können
die in das Organ oder Gewebe pertundierten mesenchymalen Stammzellen
auch ein Molekül
beinhalten, das den Tod aktivierter T-Zellen induziert.
-
Bei
einer weiteren Ausführungsform
stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Verwendung gereinigter
mesenchymaler Stammzellen zur Herstellung einer pharmazeutischen
Zubereitung zur Behandlung eines Patienten bereit, der ein Transplantat
erhalten hat, um den Schweregrad einer Abstoßungsepisode gegen das Transplantat
zu reduzieren oder diese zu eliminieren, indem dem Empfänger von
Donorgewebe eine pharmazeutische Zusammensetzung mit gereinigten
mesenchymalen Stammzellen verabreicht wird, nachdem das Donorgewebe
in den Empfänger
transplantiert wurde. Die mesenchymalen Stammzellen können für den Empfänger autolog
oder allogen sein. Die allogenen mesenchymalen Stammzellen können von
dem Donor oder aus der Quelle einer dritten Partei erhalten werden.
Die Präsentation
mesenchymaler Stammzellen bei einem Empfänger, der eine nachteilige
Immunantwort gegenüber
einem Transplantat durchmacht, induziert fehlende Antwortbereitschaft
bei T-Zellen gegenüber
weiterer antigener Stimulation, wodurch eine nachteilige Antwort
aktivierter T-Zellen auf ein Donorgewebe oder Organ reduziert oder
eliminiert wird.
-
Bei
einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein ex vivo-Verfahren
bereitgestellt, um eine Immunantwort durch ein Donorgewebe, ein Donororgan
oder Donorzellen gegen einen Empfänger, d.h. eine Graft-versus-Host-Reaktion,
zu reduzieren, umfassend das Behandeln des Donorgewebes, Donororgans
oder der Donorzellen mit allogenen (für den Donor allogenen) mesenchymalen Stammzellen
ex vivo, bevor die Transplantation des Gewebes, Organs oder der
Zellen in den Empfänger erfolgt.
Die mesenchymalen Stammzellen reduzieren die Antwortbereitschaft
von T-Zellen in dem Transplantat, die nachfolgend gegen Antigen-präsentierende
Zellen des Empfängers
aktiviert werden könnten,
sodass das Transplantat in den Körper
des Empfängers
(Wirt) eingeführt
werden kann, ohne dass es zum Auftreten einer nachteiligen Antwort
des Transplantats gegen den Wirt kommt bzw. so, dass diese reduziert
wird. Somit kann das, was als „Graft-versus-Host-Krankheit" bekannt ist, abgewehrt
werden.
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform kann
das Donor-Transplantat zunächst
ex vivo Geweben oder Zellen des Empfängers oder einer dritten Partei
ausgesetzt werden, um die T-Zellen in dem Donor-Transplantat zu
aktivieren. Das Donor-Transplantat wird dann mit mesenchymalen Stammzellen in
Kontakt gebracht, die für
den Donor autolog oder allogen sind. Dabei können die mesenchymalen Stammzellen
von dem Empfänger
oder von einer dritten Partei stammen. Die mesenchymalen Stammzellen
werden eine nachteilige sekundäre
Immunantwort durch T-Zellen in dem Donor-Transplantat gegen antigene
Stimulation durch den Empfänger
reduzieren oder inhibieren, wenn das Donortransplantat nachfolgend
in den Empfänger
eingesetzt wird.
-
Dementsprechend
können
die mesenchymalen Stammzellen z.B. vor der Transplantation von dem
Empfänger
erhalten werden. Die mesenchymalen Stammzellen können isoliert und gefroren
gelagert werden, bis sie benötigt
werden. Die mesenchymalen Stammzellen können auch in Kultur auf gewünschte Mengen
vermehrt und gelagert werden, bis sie benötigt werden. Die gereinigten
mesenchymalen Stammzellen werden dem Empfänger in einer pharmazeutischen
Zubereitung in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um eine
vom Donor-Transplantat gegen den Empfänger (Wirt) verursachte ablaufende
nachteilige Immunantwort zu reduzieren oder zu eliminieren. Die
Präsentation
der mesenchymalen Stammzellen gegenüber dem Empfänger, der eine
vom Transplantat verursachte negative Immunantwort durchmacht, inhibiert
die ablaufende Antwort und verhindert die erneute Stimulation der
T-Zellen, wodurch eine nachteilige Antwort durch aktivierte T-Zellen
gegen Empfängergewebe
reduziert oder eliminiert wird.
-
Eine
weitere Ausführungsform
beinhaltet das Modifizieren der mesenchymalen Stammzellen des Empfängers mit
einem Molekül,
das den Tod aktivierter T-Zellen induziert.
-
Somit
werden in Übereinstimmung
mit bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung humane mesenchymale Stammzellen verwendet,
um Transplantatabstoßung
und/oder Graft-versus-Host-Krankheit als Ergebnis eines Transplantats
zu behandeln, und/oder um die Transplantatabstoßung und/oder Graft-versus-Host-Krankheit zu
verhindern oder zu reduzieren. Humane mesenchymale Stammzellen können auch
verwendet werden, um die Verwendung von xenogenen Transplantaten
bzw. „Grafts" zu erleichtern.
-
Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
-
1.
Allogene mesenchymale Stammzellen induzieren keine Immunantwort.
T-Zellen von A proliferierten
in einer Dosis-abhängigen
Weise, wenn sie mit verschiedenen Mengen an PBMCs von B gemischt
wurden. T-Zellen von A zeigten keine Proliferation in Antwort auf
den Kontakt mit mesenchymalen Stammzellen von B, selbst wenn die
mesenchymalen Stammzellen manipuliert wurden, um eine volle T-Zell-Aktivierung
bereitzustellen (die mesenchymalen Stammzellen wurden mit IFN-γ behandelt
und mit den co-stimulierenden Molekülen B7-1 oder B7-2 transduziert).
-
2.
Mesenchymale Stammzellen unterdrückten
aktiv die „Reaktion
gemischter Lymphozyten" (MLR)
zwischen Lymphozyten zweier verschiedener Individuen. hMSCs, die
allogen für
einen Empfänger
sind (dritte Partei oder Donor), waren bei der MLR entweder sowohl
zu den Stimulator- als auch zu den Antwortgeber-Zellen nicht passend
(offene Balken) oder die hMSCs waren passend zu den Stimulator-Zellen
in der MLR (Donor) ausgewählt
(schraffierte Balken). Somit supprimierten die mesenchymalen Stammzellen
die MLR ohne Spezifität
im Bezug auf den MHC-Typ. Die mesenchymalen Stammzellen supprimierten
die MLR in einer dosisabhängigen Weise.
-
3 zeigt
die sekundäre
Antwort von Responder-T-Zellen (Antwort-gebende T-Zellen), die durch
Stimulator-PBMCs (allogen) instruiert wurden, keiner Exposition
gegenüber
MSCs ausgesetzt waren, und dann autologen PBMCs, allogenen PBMCs (Stimulator
oder dritte Partei) oder keinen Zellen ausgesetzt wurden.
-
4 zeigt
die sekundäre
Antwort von Responder-T-Zellen, die durch Stimulator-PBMCs (allogen) aktiviert
wurden, nachfolgend mit allogenen MSCs (Stimulator) kultiviert wurden
und dann autologen PBMCs, allogenen PBMCs (Stimulator oder dritte
Partei) oder keinen Zellen ausgesetzt wurden.
-
5 (5A–5D)
zeigt, dass die sekundäre
Antwort von Responder-T-Zellen supprimiert wurde, wenn diese zuvor
durch allogene Stimulator-PBMCs aktiviert wurden, nach der Aktivierung
mit allogenen MSCs (gleicher Donor (5B) oder
dritte Partei ( 5D)) oder mit autologen MSCs
(5C) kultiviert und dann autologen oder allogenen
(gleicher Donor oder dritte Partei) Stimulatorzellen ausgesetzt
wurden.
-
6 (6A–6D)
zeigt die Suppression einer primären
MLR im Hundemodell durch MSCs. autol = autolog; ident = DLA-identische
Geschwistertiere; unrel = nicht verwandt.
-
7 zeigt
die Suppression einer primären MLR
durch nicht-anhaftende MSCs.
-
8 zeigt
eine schematische Karte des EGFP pOT24-Plasmids, das in Beispiel
8 verwendet wird.
-
Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
Wie
hier definiert, wird eine allogene mesenchymale Stammzelle von einem
anderen Individuum derselben Spezies wie der Empfänger erhalten. „Donor-Antigen" bezieht sich auf
Antigene, die durch das in den Empfänger zu transplantierende Donorgewebe
exprimiert werden. Alloantigene sind Antigene, die sich von den
vom Empfänger
exprimierten Antigenen unterscheiden. Donorgewebe, Donororgane oder Donorzellen
stellen das zu transplantierende Transplantat. Als Beispiele für Transplantate
können
Haut, Knochenmark und solide Organe, wie etwa Herz, Pankreas, Niere,
Lunge und Leber einbezogen werden.
-
Die
Erfinder haben entdeckt, dass allogene T-Zellen (T-Lymphozyten)
nicht proliferieren, wenn diese in vitro mit humanen mesenchymalen
Stammzellen in Kontakt gebracht werden. Normalerweise resultiert
das Co-Kultivieren von Zellen aus verschiedenen Individuen in einer
T-Zell-Antwort, manifestiert durch die Aktivierung und Proliferation
der T-Zellen, bekannt
als gemischte Lymphozyten-Reaktion (MLR).
-
Diese
unerwarteten Ergebnisse zeigen, dass T-Zellen auf nicht passende
mesenchymale Stammzellen nicht reagieren. Das Fehlen einer proliferativen
Antwort allogener T-Zellen auf humane mesenchymale Stammzellen war
unerwartet, da humane mesenchymale Stammzellen Oberflächenmoleküle exprimieren,
die sie immunogen machen sollten, d.h. sie exprimieren allogene
Klasse I MHC-Moleküle. Diese
Entdeckung zeigt, dass die mesenchymalen Stammzellen für das Immunsystem
nicht immunogen sind.
-
Die
Erfinder haben auch entdeckt, dass mesenchymale Stammzellen eine
MLR zwischen allogenen Zellen supprimieren können. Mesenchymale Stammzellen
reduzierten aktiv die allogene T-Zell-Antwort bei gemischten Lymphozytenreaktionen
in einer dosisabhängigen
Weise. Zusätzlich
zeigten mesenchymale Stammzellen von verschiedenen Spendern keine
Spezifität
oder reduzierte Antwort im Hinblick auf den MHC-Typ. Somit ist es nicht
erforderlich, dass die mesenchymalen Stammzellen im Hinblick auf
den MHC passend zur Zielzellpopulation bei der gemischten Lymphozytenreaktion
sind, um die proliferative Antwort der alloreaktiven T-Zellen gegenüber mesenchymalen
Stammzellen zu reduzieren.
-
Demzufolge
stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung gereinigter mesenchymaler Stammzellen
für die
Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zum Reduzieren, Inhibieren
oder Eliminieren einer Immunantwort durch Verabreichung allogener
mesenchymaler Stammzellen an den Empfänger eines Donorgewebes, Donororgans oder
von Donorzellen bereit. Bei einer Ausführungsform werden die mesenchymalen
Stammzellen dem Empfänger
gleichzeitig mit dem Transplantat verabreicht. Alternativ können die
humanen mesenchymalen Stammzellen vor der Verabreichung des Transplantats
appliziert werden. Beispielsweise können die humanen mesenchymalen
Stammzellen dem Empfänger
etwa 3 bis 7 Tage vor der Transplantation des Donorgewebes verabreicht
werden.
-
Somit
können
mesenchymale Stammzellen für
die Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zum Konditionieren
des Immunsystems eines Empfängers
gegenüber
Donor- oder Fremdgewebe verwendet
werden, indem man dem Empfänger
vor oder zur gleichen Zeit mit der Transplantation des Donorgewebes
mesenchymale Stammzellen in einer Menge verabreicht, die wirksam
ist, um eine von den Empfänger-T-Zellen
ausgelöste
Immunantwort gegen das Transplantat zu reduzieren oder zu eliminieren.
Die mesenchymalen Stammzellen beeinflussen die T-Zellen des Empfängers derart,
dass die T-Zell-Antwort reduziert oder eliminiert wird, wenn eine
Präsentation
gegenüber
Donor- oder Fremdgewebe erfolgt. Somit kann die Wirtsabstoßung des Transplantats
vermieden oder deren Schweregrad reduziert werden.
-
Die
Erfinder haben weiterhin entdeckt, dass, wenn T-Lymphozyten, die
bereits einer antigenen Stimulation ausgesetzt, d.h. aktiviert wurden,
nachfolgend mesenchymalen Stammzellen ausgesetzt werden, die T-Zellen
keine oder eine reduzierte Immunantwort auf die nachfolgende antigene
Stimulation durch allogene Zellen erzeugen. Somit induzieren mesenchymale
Stammzellen einen Zustand der herabgesetzten Antwortbereitschaft
bei den T-Zellen.
-
Diese
unerwarteten Ergebnisse zeigen, dass aktivierte T-Zellen durch die
Exposition prä-aktivierter T-Zellen
gegenüber
humanen mesenchymalen Stammzellen gegenüber weiterer allogener Stimulation
antwortlos gemacht wurden. Die mesenchymalen Stammzellen können für die T-Zellen
autolog oder allogen sein.
-
Dementsprechend
stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung gereinigter mesenchymaler Stammzellen
für die
Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung eines
Patienten, der eine schädliche
Immunantwort gegen ein Transplantat durchmacht, bereit, indem man
einem solchen Patienten mesenchymale Stammzellen in einer Menge
verabreicht, die wirksam ist, um die Immunantwort zu reduzieren
oder zu unterdrücken.
Die mesenchymalen Stammzellen werden von dem Gewebedonor, dem Transplantatempfänger oder
einer dritten Partei erhalten.
-
Die
mesenchymalen Stammzellen können weiter
modifiziert werden, um ein Zelltod-Molekül zu exprimieren, um die Eliminierung
aktivierter T-Zellen zu steigern. Beispielsweise kann das Zelltod-Molekül durch
die mesenchymalen Stammzellen exprimiert werden, die hergestellt
wurden, um das exogene Zelltod-Molekül zu exprimieren.
-
Bei
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein ex vivo-Verfahren
bereit, um eine Immunantwort durch ein Donortransplantat gegen einen
Empfänger
hiervon (Graft-versus-Host)
zu reduzieren oder zu inhibieren oder zu eliminieren.
-
Demzufolge
stellt die Erfindung das Inkontaktbringen eines Donororgans oder – Gewebes
mit mesenchymalen Stammzellen vor der Transplantation bereit. Die
mesenchymalen Stammzellen verbessern, inhibieren oder reduzieren
eine nachteilige Antwort durch das Donor-Transplantat gegen den
Empfänger.
-
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform,
vor der Transplantation, wird das Donor-Transplantat mit allogenem (Empfänger)-Gewebe
oder -Zellen behandelt, die die T-Zellen in dem Donor-Transplantat
aktivieren. Das Donor-Transplantat wird dann mit mesenchymalen Stammzellen
(autolog oder allogen) behandelt, bevor die Transplantation stattfindet.
Die mesenchymalen Stammzellen verhindern eine erneute Stimulierung
oder Induzieren eine herabgesetzte Antwortbereitschaft der T-Zellen
gegenüber nachfolgender
antigener Stimulation.
-
Für die Prä-Konditionierung
eines Donor-Transplantats können
die mesenchymalen Stammzellen weiter modifiziert werden, um ein
Zelltod-Molekül
zu exprimieren, so dass aktivierte T-Zellen, die mit den mesenchymalen
Stammzellen in Kontakt kommen, eliminiert werden.
-
Somit
kann im Zusammenhang einer Transplantation von Knochenmark (hämatopoetischen Stammzellen)
der Angriff des Wirts durch das Transplantat reduziert oder eliminiert
werden. Das Donor-Knochenmark kann vor der Implantation von Knochenmark
oder peripheren Blutstammzellen in den Empfänger mit mesenchymalen Stammzellen des
Empfängers
vorbehandelt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Donor-Knochenmark zunächst Empfängergewebe
bzw. Empfängerzellen
ausgesetzt und dann mit mesenchymalen Stammzellen behandelt. Ohne
diesbezüglich
eingeschränkt
zu sein, wird angenommen, dass der erste Kontakt mit Empfängergewebe
oder Empfängerzellen
die Funktion hat, die T-Zellen in dem Mark zu aktivieren. Die nachfolgende
Behandlung mit den mesenchymalen Stammzellen inhibiert oder eliminiert
eine weitere Aktivierung der T-Zellen in dem Mark, wodurch eine
schädigende
Wirkung durch das Donorgewebe reduziert oder eliminiert wird, d.h.
die Therapie reduziert oder eliminiert eine Graft-versus-Host-Antwort.
-
Bei
einer weiteren Ausführungsform
kann ein Transplantatempfänger,
der an der Graft-versus-Host-Krankheit
leidet, behandelt werden, um den Schweregrad hiervon zu reduzieren
oder zu eliminieren, indem man einem solchen Empfänger eine
pharmazeutische Zubereitung mit gereinigten mesenchymalen Stammzellen
verabreicht, die für
den Donor autolog oder allogen sind, wobei die allogenen Zellen mesenchymale
Stammzellen sein können,
die für den
Empfänger
oder eine dritte Partei autolog sind, in einer Menge, die wirksam
ist, eine Transplantatabstoßung
in dem Wirt zu reduzieren oder zu eliminieren. Die mesenchymalen
Stammzellen inhibieren oder unterdrücken die aktivierten T-Zellen
in dem Donorgewebe dabei, eine Immunantwort gegen den Empfänger zu
erzeugen, wodurch eine Graft-versus-Host-Antwort reduziert oder
eliminiert wird.
-
Die
mesenchymalen Stammzellen des Empfängers können vor der Transplantation
von dem Empfänger
erhalten werden und können
gelagert und/oder in Kultur vermehrt werden, um eine Reserve an
mesenchymalen Stammzellen in hinreichenden Mengen bereitzustellen,
um einen ablaufenden Angriff des Transplantats gegen den Wirt zu
behandeln.
-
Bei
wiederum einem anderen Verfahren der vorliegenden Erfindung wird
das Donorgewebe den mesenchymalen Stammzellen so ausgesetzt, dass sich
die mesenchymalen Stammzellen in das Organtransplantat selbst integrieren,
bevor die Transplantation stattfindet. In dieser Situation würde eine
Immunantwort gegen das Transplantat, hervorgerufen durch irgendeine
alloreaktive Empfängerzelle,
die der Standardbehandlung zum Verhindern von Transplantatabstoßung, z.B.
einer durch Arzneimittel vermittelten Immunsuppression, entgangen
ist, durch die mesenchymalen Stammzellen, die in dem Transplantat
vorliegen, unterdrückt
werden. Die mesenchymalen Stammzellen sind bevorzugt allogen für den Empfänger und
können
mesenchymale Donor-Stammzellen
oder mesenchymale Stammzellen sein, die aus einer anderen Quelle
als dem Donor oder dem Empfänger
erhalten wurden. In einigen Fällen
können
mesenchymale Stammzellen, die für
den Empfänger
autolog sind, verwendet werden, um eine Immunantwort gegen das Transplantat
zu unterdrücken.
-
Bei
einer weiteren Ausführungsform
dieses Verfahrens werden die mesenchymalen Stammzellen so gestaltet,
dass sie Zelltod-Moleküle
exprimieren, sodass jedwede alloreaktive Wirts-T-Zelle beim Kontakt
mit diesen mesenchymalen Stammzellen eliminiert werden wird.
-
Man
nimmt weiter an, dass, zusätzlich
zum Verhindern oder Verbessern einer anfänglichen Immunantwort, die
mesenchymalen Stammzellen, die an der lokalen Stelle verbleiben,
auch jede nachfolgende T-Zell-Antwort, die auftreten könnte, ebenfalls supprimieren
würden.
-
Wie
hier verwendet ist ein „Zelltod-Molekül" ein Molekül, das mit
seinem zugehörigen
Rezeptor an einer stimulierten T-Zelle interagiert oder an diesen
bindet, wobei T-Zell-Tod oder Apoptose induziert werden. Fas vermittelt
Apoptose bei jüngst
aktivierten T-Zellen, die erneut einer Stimulation ausgesetzt wurden
(van Parijs et al., Immunity 4: 321–328 (1996)). Fas ist ein Typ
I-Membranrezeptor, der, wenn er durch seinen zugehörigen Liganden „vernetzt" wird, Apoptose bei
einer breiten Vielzahl von Zellen induziert. Die Interaktion zwischen
dem Fas-Molekül
(CD95) auf den Ziel-T-Zellen und seinem Liganden FasL auf mesenchymalen
Stammzellen resultiert in einer Rezeptor-Aggregation, die Signale
transduziert, die zur Apoptose der Zielzelle führen. Es ist für das Fas-System
gezeigt worden, dass es an einer Anzahl von Zellfunktionen in vivo
beteiligt ist, einschließlich
der negativen Selektion von Thymuszellen, der Aufrechterhaltung
immun-privilegierter Stellen im Körper und der zytotoxischen,
von T-Lymphozyten (CTL)-vermittelten Zytotoxizität (Green und Ware, Proc Natl
Acad Sci, 94(12).5986-90 (1997)).
-
Andere
Mitglieder der Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNFR)-Familie besitzen
Rollen im programmierten Zelltod. TRAIL-Ligand, der mit seinem Rezeptor
DR4 interagiert, kann Apoptose bei einer Vielzahl transformierter
Zelllinien induzieren (G. Pan et al., Science, 277: 815–818 (1997)),
und die Expression von CD27 und seinem Liganden CD70 (Prasad et
al., Proc Natl Acad Sci, 94: 6346–6351 (1997)) induziert ebenfalls
Apoptose. Die Expression von Fas ist auf stimulierte T-Zellen und
Stellen mit Immunprivileg beschränkt.
TRAIL wird in vielen normalen Geweben detektiert.
-
Sowohl
TRAIL-Ligand als auch CD27, nicht jedoch Fas-Ligand, werden auf
unmanipulierten humanen mesenchymalen Stammzellen exprimiert. Aktivierte,
nicht jedoch ruhende T-Zellen, exprimieren den TRAIL-Rezeptor und
CD70. Die meisten der im Körper
befindlichen T-Zellen befinden sich im ruhenden Zustand; T-Zellen
werden aktiviert, wenn sie Körperzellen
sowohl im Kontext von MHC als auch einem geeigneten co-stimulierenden
Molekül,
wie etwa B7-1 oder B7-2, begegnen.
-
Somit
resultiert die Interaktion von Zelltod-Rezeptoren auf aktivierten
T-Zellen mit ihren auf mesenchymalen Stammzellen exprimierten Liganden
in T-Zell-Tod über
Apoptose. Liganden und ihre Rezeptoren, auch andere als die oben
spezifisch genannten, die entweder bei der mesenchymalen Stammzelle
vorhanden sind oder in die mesenchymale Stammzelle eingeführt werden,
können
diese Funktion erfüllen.
Daher beseitigen mesenchymale Stammzellen, die einem Individuum
verabreicht werden, aktivierte T-Zellen, reduzieren die Schwere
oder das Auftreten der Transplantat-Abstoßungserkrankung.
-
In Übereinstimmung
mit den hier beschriebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung
wird darüber
nachgedacht, dass die mesenchymalen Stammzellen der vorliegenden
Erfindung zusammen mit derzeitigen Behandlungsweisen von Donorgewebeabstoßung oder
Graft-versus-Host-Erkrankung verwendet werden können. Ein Vorteil einer solchen
Verwendung besteht darin, dass durch die Milderung des Schweregrades
der Immunantwort bei einem Transplantatempfänger die Menge des bei der
Behandlung verwendeten Arzneimittels und/oder die Häufigkeit der
Verabreichung der Arzneimitteltherapie reduziert werden kann, was
in einer Milderung der allgemeinen Immunsuppression und unerwünschter
Nebenwirkungen resultiert.
-
Es
wird weiterhin erwogen, dass nur eine einzige Behandlung mit den
mesenchymalen Stammzellen der vorliegenden Erfindung notwendig sein
kann, was die Notwendigkeit einer anhaltenden immunsuppressiven
Arzneimitteltherapie beseitigt. Alternativ können mehrere Verabreichungen
mesenchymaler Stammzellen verwendet werden.
-
Dementsprechend
stellt die hier beschriebene Erfindung das Verhindern oder Behandeln
von Transplantatabstoßung
bereit, indem man die mesenchymalen Stammzellen in einer prophylaktisch oder
therapeutisch wirksamen Menge zum Verhindern, Behandeln oder Mildern
der Transplantatabstoßung
eines Organs, Gewebes oder von Zellen derselben Spezies oder eines
Xenotransplantat-Organs oder -Gewebetransplantats und/oder einer
Graft-versus-Host-Krankheit verabreicht.
-
Die
Verabreichung einer Einzeldosis mesenchymaler Stammzellen kann wirksam
sein, um die T-Zellantwort gegenüber
Gewebe, das zu den T-Zellen allogen ist bzw. gegenüber „Nicht-selbst"-Gewebe zu reduzieren
oder zu eliminieren, insbesondere in dem Fall, bei dem die T-Lymphozyten
ihren nicht-antwortbereiten Charakter (d.h. Toleranz oder Anergie)
gegenüber
allogenen Zellen beibehalten, nachdem sie von den mesenchymalen
Stammzellen getrennt wurden.
-
Die
Dosierung der mesenchymalen Stammzellen variiert innerhalb weiter
Grenzen und wird natürlich
in jedem speziellen Fall an die individuellen Erfordernisse angepasst
werden. Im allgemeinen, im Fall einer parenteralen Verabreichung,
ist es gebräuchlich,
von etwa 0,01 bis etwa 5 Millionen Zellen pro Kilogramm Körpergewicht
des Empfängers
zu verabreichen. Die Anzahl der verwendeten Zellen wird vom Gewicht
und dem Zustand des Empfängers,
der Anzahl oder Häufigkeit
der Verabreichungen und anderen Variablen abhängen, die Fachleuten bekannt
sind. Die mesenchymalen Stammzellen können über eine Route verabreicht
werden, die für das/die
zu transplantierende(n) Gewebe, Organ oder Zellen geeignet ist.
Sie können
systemisch, d.h. parenteral, durch intravenöse Injektion oder zielgerichtet auf
ein bestimmtes Gewebe oder Organ, wie etwa Knochenmark, verabreicht
werden. Die humanen mesenchymalen Stammzellen können über eine subkutane Implantation
von Zellen oder durch Injektion von Stammzellen in Bindegewebe,
z.B. Muskel, verabreicht werden.
-
Die
Zellen können
mit Konzentrationen von etwa 0,01 bis etwa 5 × 106 Zellen/ml
in einem geeigneten Verdünnungsmittel
suspendiert werden. Geeignete Arzneiträger für Injektionslösungen sind
solche, die mit den Zellen und dem Empfänger biologisch und physiologisch
kompatibel sind, wie etwa gepufferte Salinelösung oder andere geeignete
Arzneiträger.
Die Zusammensetzung für
die Verabreichung muss gemäß Standardverfahren,
die eine korrekte Sterilität
und Stabilität
einhalten, formuliert, produziert und gelagert werden.
-
Mesenchymale
Stammzellen können
isoliert werden, bevorzugt aus Knochenmark, gereinigt und in Kultur,
d.h. in vitro vermehrt werden, um hinreichende Zahlen an Zellen
für die
Verwendung bei den hier beschriebenen Verfahren zu erhalten. Mesenchymale
Stammzellen, die bildenden pluripotenten Vorläuferzellen, die sich im Knochen
finden, sind im Knochenmark (1:100.000) und anderen mesenchymalen
Geweben normalerweise in sehr geringer Häufigkeit vorhanden (siehe Caplan
und Haynesworth, US-Patent Nr. 5,486,359). Die Gen-Transduktion
mesenchymaler Stammzellen wird offenbart in Gerson et al., US-Patent Nr. 5,591,625.
-
Solange
nicht anderweitig vermerkt, werden genetische Manipulationen durchgeführt wie
beschrieben in Sambrook und Maniatis, „Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", 2. Auflage;
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
(1989).
-
Beispiel 1
-
Fehlen der Alloreaktivität mesenchymaler
Stammzellen
-
Die
gemischte Lymphozytenreaktion misst die Kompatibilität der Oberflächenantigene
des Donors und ist ein Indikator für die Wahrscheinlichkeit der
Abstoßung
von Donorgewebe. Zelloberflächenantigene,
die für
das Auslösen
einer Transplantatabstoßung
verantwortlich sind, sind die Klasse I und Klasse II MHC-Antigene.
T-Zellen sind alloreaktiv gegenüber
fremden MHC-Antigenen. Klasse I und II MHC-Moleküle stimulieren die gemischte
Lymphozyten-Reaktion.
-
Normale
freiwillige Testpersonen wurden einer Leukophorese auf einem COBE
SPECTRATM Apherese-System (COBE, Lakewood,
CO) unterzogen. 1 × 105 T-Zellen von Individuum A (TA)
wurden in Flachboden-Mikrotiterwells mit Mitomycin C behandelten
allogenen PBMCs (um die Proliferation der PBMCs zu T-Zellen zu verhindern)
von Individuum B (mPBMCB) für 7 Tage
kultiviert. Die mPBMCB wurden bei 20K und
100K ausgesät.
Die Kulturen erhielten einen Puls mit 3H-Thymidin
für die
letzten 18 Stunden der Kulturphase, um die T-Zell-Proliferation
zu messen. Die in 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass
die TA-Zellen die PBMCB als
fremd erkannten (siehe Balken unter „TA +
mPBMCB").
Je mehr PBMCBs vorhanden waren, umso mehr
proliferierten die T-Zellen.
-
2 × 104 humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs)
von demselben Donor wie die PBMCs wurden mit 1 × 105 T-Zellen
von Individuum A (TA) co-inkubiert. Die
Zellen wurden für
eine Gesamtheit von 7 Tagen in Flachboden-Mikrotiterwells kultiviert. Die
Kulturen erhielten einen Puls mit 3H-Thymidin
für die
letzten 18 Stunden der Kulturphase, um die T-Zell-Proliferation zu messen. Zwei Tage
vor der Co-Kultivierung mit den T-Zellen wurden die humanen mesenchymalen
Stammzellen mit den oben angegebenen Zahlen (konfluent) in Mikrotiter-Wells ausgesät und mit
IFN-γ (50
Units/ml) behandelt, um die Oberflächenantigen-Expression der MSCs zu stimulieren.
Es wurden nicht-transduzierte hMSCs oder hMSCs, die mit den humanen
Co-Stimulationsmolekülen
B7-1 oder B7-2 transduziert worden waren, mit den T-Zellen inkubiert.
Die Kontrollzellen wurden mit Neo transduziert.
-
Die
in 1 dargestellten Ergebnisse (siehe 1 „TA + transduzierte hMSCs") zeigen, dass die T-Lymphozyten gegenüber den
humanen mesenchymalen Stammzellen nicht antwortbereit waren (nicht proliferierten),
d.h. diese wurden nicht als fremd erkannt.
-
Die
Ergebnisse zeigen auch, dass das Fehlen einer Antwort auf die mesenchymalen
Stammzellen nicht durch genetische Kompatibilität zwischen den Individuen bedingt
war, da die T-Zellen periphere einkernige Blutzellen (PBMCB) des hMSC-Donors als fremd erkannten.
-
Beispiel 2
-
Suppression der gemischten
Lymphozyten-Reaktion
-
Um
zu bestimmen, ob mesenchymale Stammzellen die allogene Antwort aktiv
unterdrückten,
wurden gemischte Lymphozytenreaktionen (MLR) in Gewebekulturplatten
angesetzt, und zwar mit oder ohne anhaftende mesenchymale Stammzellen,
die von 2 verschiedenen Spendern erhalten wurden: ein Spender stimmte
mit den Stimulatorzellen in der MLR überein, und der andere Spender
war sowohl zu den Stimulator-Zellen als auch zu den Responder-Zellen
(Antwort-gebenden Zellen) unverwandt.
-
105 PBMCs von Individuum A (PBMCA)
wurden mit 105 PBMCs von Ziel-Individuum
B (PBMCB) gemischt. Die PBMCBs
wurden mit 3000 rad Röntgen-Bestrahlung
bestrahlt, um ihre Proliferation aufgrund einer Aktivierung durch
die PBMCAs zu verhindern. Somit würden nur
die PBMCAs proliferieren. Wenn die PBMCAs und die PBMCBs
gemischt wurden, fand eine gemischte Lymphozytenreaktion statt, bei
der die PBMCA-Zellen (Responder-Zellen)
durch die Oberflächenantigene
auf den PBMCBs (Stimulator-Zellen) aktiviert
wurden. Die Kulturen wurden über
eine Zeitspanne von 7 Tagen inkubiert und erhielten während der
letzten 18 Stunden einen Puls von 3H-Thymidin.
In Gegenwart der PBMCBs proliferierten die
PBMCAs und ergaben Zahlenwerte von 40.000
(siehe 2, 1. Balken; „KEINE" bezieht sich darauf, dass keine mesenchymalen
Stammzellen vorliegen).
-
Wenn
jedoch die PBMCAs und die PBMCBs in
Gegenwart mesenchymaler Stammzellen gemischt wurden, so wurde die
gemischte Lymphozytenreaktion unterdrückt. 105 PBMCAs wurden mit 105 PBMCBs in Mikrotiterplatten-Wells gemischt, die
mit einer anhaftenden Einfachschicht (Monolayer) aus humanen mesenchymalen
Stammzellen beschichtet waren. Die mesenchymalen Stammzellen waren
in den Wells in Mengen ausplattiert worden, die von 7500 bis 22.500
mesenchymalen Stammzellen pro Well reichten. Es wurden zwei mesenchymale Stammzellpopulationen
getestet: es wurden humane mesenchymale Stammzellen von einem Individuum B
erhalten, und es wurden humane mesenchymale Stammzellen von einem
Individuum erhalten, das weder mit dem MHC-Typ von Individuum A
noch von Individuum B übereinstimmte
(eine dritte Partei). Die Kulturen wurden über eine Zeitspanne von 7 Tagen inkubiert
und wurden während
der letzten 18 Stunden einem 3H-Thymidinpuls
unterzogen. In Gegenwart der humanen mesenchymalen Stammzellen wurde die
MLR unterdrückt
(siehe 2). Somit unterdrückten die mesenchymalen Stammzellen
die gemischte Lymphozytenreaktion unabhängig von der MHC-Beschaffenheit
der mesenchymalen Stammzellen.
-
Die
in 2 dargestellten Ergebnisse zeigen auch an, dass
die humanen mesenchymalen Stammzellen die gemischte Lymphozytenreaktion
in einer dosisabhängigen
Weise herabsetzten. Die mesenchymalen Stammzellen von beiden Spendern
unterdrückten
die Proliferation gleich gut, was anzeigt, dass es keine Spezifität der Suppression
im Hinblick auf den MHC-Typ gab. Diese Ergebnisse zeigen, dass mesenchymale
Stammzellen die gemischte Lymphozyten-Reaktion aktiv supprimierten,
wenn die Zellen zusammen kultiviert wurden.
-
Beispiel 3
-
Fehlende Antwortbereitschaft
bei der sekundären
gemischten Lymphozytenreaktion
-
Diese
Versuche wurden durchgeführt,
um zu bestimmen, ob die Suppression präaktivierter T-Zellen durch
MSCs zu einer spezifischen Antwortlosigkeit bei sekundärer Stimulation
führen
würde.
-
A.
T-Zellen von Donor 248 (d248) wurden durch allogene PBMCs von Donor
273 (d273) für
7 Tage instruiert und dann für
weitere 3 Tage alleine oder in Gegenwart von IFN-γ-behandelten MSCs
aus dem gleichen Spender (d273) kultiviert. Die Zellen wurden dann
durch PBMCs aus demselben Spender (d273), durch autologe PBMCs (d248)
oder durch PBMCs einer „dritten
Partei" (d244) erneut
stimuliert.
-
Lymphozyten-Präparation
-
Periphere
einkernige Blutzellen (PBMC) wurden durch Dichtegradienten-Zentrifugation
auf Ficoll-Paque (Pharmacia) präpariert.
Aliquots der Zellen wurden in 90% FCS mit 10% DMSO eingefroren und
in flüssigem
Stickstoff gelagert. Nach dem Auftauen wurden die Zellen zweimal
mit MSC-Medium (DMEM mit wenig Glukose und 10% FCS) gewaschen und
in Testmedium (ISCOVES'S
mit 25 mM Hepes, 1 mM Natriumpyruvat, 100 μM nicht essentielle Aminosäuren, 100
U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin,
0,25 μg/ml
Amphotericin B, 5,5 × 10–5 M
2-Mercaptoethanol (alle Reagenzien von GIBCOBLR) und 5% humanem
AB-Serum (Sigma, MLR-getestet)) resuspendiert.
-
Um
die für
T-Zellen angereicherte Fraktion herzustellen, wurden die PBMCs durch
immunomagnetische negative Selektion von den Monozyten und B-Zellen
befreit. Man inkubierte die PBMCs mit Maus-anti-Mensch monoklonalen
CD19- und CD14-Antikörpern
(Format ohne Azid, mit wenig Endotoxin (NA/LE)), gefolgt von Biotin-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG (multiple
Adsorption)-Antikörper
(alle Reagenzien von Pharmingen) und Streptavidin Microbeads (Miltenyi
Biotec). Die Zellen wurden dann unter Verwendung eines magnetischen Zell-Sortierer
(MACS, Miltenyi Biotech) abgetrennt. Die für T-Zellen angereicherte Fraktion
enthielt etwa 70–90%
CD3+-Zellen.
-
MSC-Kultur
-
Humane
MSCs wurden aus Knochenmark isoliert, wie im US-Patent 5,486,359
beschrieben, wurden mit MSC-Medium in Kultur gehalten und wurden
bei Passage 3 bis 6 verwendet. Die Zellen wurden unter Verwendung
von 0,05% Trypsin/EDTA-Lösung
abgelöst,
einmal mit MSC-Medium gewaschen und bei 70–80% konfluenter Dichte ausplattiert,
was 1 × 106/Platte für 10 cm Gewebekulturschalen
entsprach. Am Tag nach dem Ausplattieren wurde IFN-γ (Boehringer
Mannheim) bei 500 U/ml hinzugegeben, und die Zellen wurden für weitere
3 Tage inkubiert. Vor dem Transfer der T-Zellen wurden die MSC-Platten
4-mal mit HBSS und 1-mal mit ISCOVES gewaschen, und es wurde Testmedium
mit 10 ml/Well in 10 cm Gewebekulturschalen hinzugegeben.
-
Primäre (1.) MLR
-
T-Zellen
(d248) wurden durch bestrahlte PBMCs (d273) aktiviert. Die für die Stimulierung
verwendeten PBMCs wurden mit 3000 rad unter Verwendung eines Cabinet
Röntgenstrahlen-Systems (Faxitron
X ray, Buffalo, Grove, IL) röntgenbestrahlt. Für die primäre Stimulation
wurden 2 × 107 Responder mit 2 × 107 Stimulatoren
in 20 ml Assay-Medium in
10 cm Gewebekulturschalen gemischt. Die Zellen wurden bei 37°C in 5% CO2-Atmosphäre für 7 Tage inkubiert.
-
Aktivierte T-Zell/MSC-Kulturen
-
T-Zellen,
die bei der 1. MLR aktiviert worden waren, wurden gesammelt, einmal
mit MSC-Medium gewaschen und in Testmedium bei 106/ml
in 10 ml resuspendiert und in 10 cm-Gewebekulturschalen gegeben,
die autologe oder allogene MSCs oder Medium alleine enthielten,
und wurden für
weitere 3 Tage inkubiert.
-
Test mit erneuter
Stimulierung
-
T-Zellen,
die mit MSCs oder Medium kultiviert worden waren, wurden gesammelt,
einmal mit MSC-Medium gewaschen und mit bestrahlten PBMCs des ursprünglichen
Donors, eines nicht verwandten Donors oder mit autologen PBMCs erneut stimuliert.
Für den
Test wurden 5 × 104 instruierte Responder und 5 × 104 bestrahlte Stimulatoren in 96-Well-Platten inkubiert.
Die Assays wurden im Dreifachansatz durchgeführt. Die Kulturen wurden für 18 Stunden
vor der Ernte einem Puls mit 1 μCi
an [3H]-Thymidin (Amersham) unterzogen.
Die Kulturen wurden unter Verwendung des Harvesters 96 (Tomtec)
gesammelt, und die Filter wurden unter Verwendung des Microbeta
Trilux Flüssigszintillations- und
Lumineszenz-Zählers (E.G. & G. Wallac) analysiert.
Die Daten sind als mittlere cpm ± Standardabweichung von drei
Wiederholungen dargestellt.
-
Alleine
kultivierte T-Zellen (Positivkontrolle) zeigten eine beschleunigte
Antwort auf die erneute Stimulation mit „demselben" Donor mit einem Spitzenwert an Tag
2. Die Antwort auf die „dritte
Partei" war ebenfalls
beschleunigt, praktisch mit derselben Kinetik wie bei „demselben
Donor", jedoch mit
einem geringeren Maximalwert und einem leicht verzögerten Start
(3). Auf allogenen MSCs kultivierte T-Zellen zeigten
nachfolgend sowohl bei PBMCs von „demselben Donor" als auch von der „dritten
Partei" keine Antwort
während
6 Tagen der Kultur (4).
-
Beispiel 4
-
Fehlende Antwortbereitschaft
bei der sekundären
gemischten Lymphozyten-Reaktion
-
T-Zellen
von Donor 413 wurden für
7 Tage mit bestrahlten PBMCs von Donor 273 stimuliert (jeweils 1,5 × 106/ml, Kulturgröße von 20 ml). Die MSCs der
verschiedenen Donoren 413, 418 und 273 wurden mit 1 × 106/Schale in 10 cm-Gewebekulturschalen ausplattiert,
für 3 Tage
mit IFN-γ vorbehandelt und
gewaschen, bevor das Mischen mit den prä-aktivierten T-Zellen erfolgte.
-
Die
bei der MLR für
7 Tage prä-aktivierten T-Zellen
wurden alleine oder mit MSCs für
weitere 3 Tage inkubiert (1,0 × 106/ml an T-Zellen, 10 ml/Schale). Nach 3 Tagen
der Inkubation mit den MSCs wurden die T-Zellen gesammelt und mit
bestrahlten PBMC 273 (Originalspender), 413 (autolog), PBMC10 (dritte
Partei) oder PHA (5 μg/ml)
in Gegenwart oder Abwesenheit autologer (d413) PBMC erneut stimuliert.
Die Zellen wurden mit 5 × 104/Well zugegeben, und die Kulturen wurden
an den angegebenen Zeitpunkten für
weitere 18 Stunden einem Puls mit [3H]-Thymidin
unterzogen.
-
Die
Ergebnisse zeigen an, dass die Behandlung der aktivierten T-Zellen
mit autologen MSCs (d413) (5C), vom
selben Spender stammenden MSCs (d273) (5B) und
MSCs einer dritten Partei (d418) (5D) bei
den T-Zellen eine fehlende Antwortbereitschaft gegen antigene Stimulation
induzierte. Die Kontrollkultur (5A) ohne
MSC-Behandlung zeigte eine erneute Stimulierung der Zellen bei Exposition
gegenüber
allogenen PBMCs.
-
Beispiel 5
-
Suppression
der primären
MLR durch canine MSCs
-
Canine
PBMCs wurden aus dem peripheren Blut durch Zentrifugation auf einem
Ficoll-Paque-Gradienten
(1,077) gereinigt. Die Stimulator-PBMCs wurden bei 2200 rad (7 min,
70 kV) röntgenbestrahlt.
105 bestrahlte Stimulatoren wurden mit 105 Responder-PBMCs in 96-Well-Platten gemischt, dieses in Anwesenheit
oder Abwesenheit zuvor plattierter caniner MSCs (E647, 2 × 104/Well). Die Kulturen wurden für 6 Tage
inkubiert und für
weitere 16 Stunden einem Puls mit [3H]TdR
(5 Ci/mmol, 1 μCi/Well)
unterzogen. Die Ergebnisse sind in den 6A–6D gezeigt.
E647 und E645 waren Geschwistertiere (DLA-identisch). Die Ergebnisse
zeigten, dass autologe ebenso wie allogene MSCs die primäre MLR supprimierten.
-
Beispiel 6
-
Suppression
der primären
MLR durch nicht-anhaftende MSCs
-
T-Zellen
von d273 (2 × 105/Well) wurden mit bestrahlten PBMCs von
d244 (2 × 105/Well) und verschiedenen Anzahlen an MSCs
gemischt. Die MSCs von d244 oder d273 wurden mit IFN-γ (900 U/ml
für 3 Tage)
vorbehandelt oder unbehandelt gelassen, am Tag des Versuchs trypsinisiert
und zur selben Zeit zugegeben wie T-Zellen und PBMCs. Die Kulturen wurden
für 7 Tage
inkubiert, und es wurde für
weitere 16–18
Stunden [3H]TdR (5 Ci/mmol, 1 μCi/Well)
hinzugegeben. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt und
zeigen, dass nicht-anhaftende MSCs eine primäre MLR ebenfalls supprimierten.
-
Beispiel 7
-
Allogene MSCs
unterstützen
das Überleben
von Haut-Allotransplantat
-
Studienpopulation
-
Es
wurden junge Paviane (Papio anubis) untersucht. Die männlichen
und nicht schwangeren weiblichen Paviane wogen 7–20 kg und hatten ein Alter
von 3–16
Jahren. Sie wurden auf Tuberkulose-Papillomavirus durchgetestet,
im Bezug auf Cytomegalievirus (CMV) titriert und mit dem Primaten-Virusscreen,
bestehend aus dem Test auf Simianvirus und unter Einschluss fäkaler Flotation
und Abstrichen, getestet. Donor- und Rezipientenpaare wurden über die
Unterschiedlichkeit des Haupt-Histokompatibilitäts-Komplexes (MHC) durch PCR-Typisierung
bestimmt. Während
der Studienphase waren die Paviane in einem individuellen Bereich
neben einem Gesellschaft leistenden Tier untergebracht.
-
Ernte von
Donor-Knochenmark für
die MSC-Isolierung und Kultur-Vermehrung
-
Mit
der Nadel gewonnene Knochenmark-Absaugungen für die Isolierung und Kulturvermehrung der
MSCs wurden aus dem Darmbeinkamm erhalten. Die Knochenmarkabsaugungen
wurden einmal die Woche an einer abwechselnden Stelle für vier aufeinander
folgende Wochen erhalten. Das Volumen der Absaugung wurde über eine
Schätzung
mit 10% des Blutvolumens des Tiers bestimmt. Das Blutvolumen (Liter)
wird mit 7% des Körpergewichts
eingeschätzt. Ein
10 kg schwerer Pavian hätte
folglich ein geschätztes
Blutvolumen von 0,7 Litern. Eine Absaugung von 10% des Blutvolumens
würde dann
70 Milliliter ausmachen.
-
Vor
der Prozedur wurden 500 mg Cefazolin intramuskulär (IM) für die perioperative antibakterielle
Prophylaxe verabreicht. Die Paviane wurden für die Prozedur mit 10 mg/kg
an Ketamin IM und 1 mg/kg an Xylazin IM sediert und betäubt. Die
Stellen der Nadeleinführung
wurden mit Povidon-Iod abgerieben und dann mit Alkohol abgespült. Die
Absaugungen wurden aus dem Darmbeinkamm unter Verwendung einer 16-Eichmaß 2-Inch-Knochenmarknadel
erhalten. Es wurde eine Spritze an die Nadel angeschlossen, und
es wurde Saugwirkung appliziert, um das Mark zu entnehmen. Gegen
den postoperativen Schmerz wurde das Analgetikum Buprenorphin mit
0,03 mg/kg IM Q12 × 2
Dosen verabreicht.
-
Versand der
Donor-Knochenmark-Absaugungen
-
Die
Knochenmarkabsaugungen wurden aus der Spritze in einen sterilen
Vacutainer®,
der Natrium-Heparin enthielt, überführt. Die
Röhrchen
wurden in einen StyrofoamTM-Container eingebracht
und mittels Über-Nacht-Transport
bei Raumtemperatur (RT) zu der die Zellen verarbeitenden Einrichtung
transportiert.
-
Isolierung
und Kultur-Etablierung von MSCs
-
Fünf bis 10
ml-Aliquots von Knochenmark wurden in Dulbeccos Phosphat-gepufferter
Saline (DPBS) in einem Polypropylen-Kulturröhrchen auf 50 ml verdünnt. Die
Zellsuspensionen wurden bei 2200 rpm für 10 Minuten bei Raumtemperatur
(RT) zentrifugiert. Die Auszählung
der kernhaltigen Zellen wurde in 4% Essigsäure bestimmt. Die Zellen wurden dann
in DPBS auf eine Endkonzentration von 20 × 106 Zellen/ml
verdünnt.
Zehn Milliliter oder 200 × 106 Zellen wurden auf 20 ml Percoll (sp. gr.
1,073 g/ml) in einem konischen 50 ml-Röhrchen geladen und wurden für 20 Minuten
bei 1300 rpm zentrifugiert. Die Zellgrenzschicht, die die einkernigen
Zellen enthielt, wurde in DPBS gewaschen, in Vollmedium resuspendiert
und ausgezählt,
um einen Ertrag zu erhalten. Die an der Percoll-Grenzschicht erhaltenen, gewaschenen
einkernigen Zellen wurden dann in T-185-Kolben mit 30 ml Vollmedium
und 15–20 × 106 Zellen/Kolben (8,1 × 104 MSC/cm2) etabliert und in einen 37°C Inkubator
bei 5% CO2 eingesetzt.
-
Ernte von
MSC
-
Das
Medium in den Dreifachkolben wurde dekantiert, und die Kolben wurden
mit 50 ml DPBS gespült.
Nach Abdekantieren des DPBS wurden 23 ml an 0,05% Trypsin zu jedem
der Dreifachkolben hinzugegeben. Die Kolben wurden für 3 Minuten
in einen 37°C-Inkubator
gestellt. Nach Ablösen
der Zellen wurden 23 ml Vollmedium zu jedem Kolben hinzugegeben.
Die Zellsuspensionen wurden auf konische 50 ml-Röhrchen überführt, und die Kolben wurden
mit 30 ml HBSS gewaschen. Die Röhrchen
wurden bei 2200 rpm für
5 Minuten bei RT zentrifugiert.
-
Formulierung/Verpackung
-
Die
geernteten MSCs wurden mit etwa 10 × 106 Zellen
pro ml in Gefrierschutzlösung,
bestehend aus 85% Plasma-Lyte A (Baxter IV Therapy), 10% DMSO und
5% MSC-Donorserum,
formuliert, und in Beuteln, die 15 bis 20 ml enthalten, cryo-konserviert.
-
Markierung/Lagerung/Versand
-
Die
Zellen wurden unter Verwendung eines mit kontrollierter Geschwindigkeit
laufenden Gefriergeräts
(Cryomed, Forma Scientific) bei 1–2°C pro Minute bis auf –90°C cryo-konserviert.
Die Proben wurden dann in ein mit flüssigem Stickstoff versehenes Lagergefriergerät in der
Dampfphase (–120°C bis –150°C) überführt.
-
Dosis
-
Um
eine MSC-Dosis von 20 × 106 Zellen/kg zu erreichen, wurde das Endprodukt
am Infusionstag mit 115% der erforderlichen Dosis präpariert.
-
Hauternte
-
Vor
dem chirurgischen Eingriff wurden dem Pavian 500 mg IM Cefazolin
als perioperative antibakterielle Prophylaxe verabreicht. Der Pavian
wurde mit Ketamin (10 mg/kg, IM) sediert und durch intravenöse Verabreichung
von Thiopental, einem 1–2% Isofluoran-Inhalations-Anästhetikum,
betäubt.
Es wurde Haut von der anterioren Unterleibswand geerntet und auf
ein vorab markiertes befeuchtetes Saline-Gaze-Pad gelegt. Die Wundverletzung
wurde dann verschlossen. Der Pavian wurde nach dem Aufwachen zu
seiner Kolonie zurückgebracht.
Gegen den postoperativen Schmerz wurden das Analgetikum Buprenorphin
mit Q12 × 2
Dosen und Ancef täglich
für 2 Tage
verabreicht.
-
Empfänger-Hauttransplantation
und MSC-Infusion
-
Vor
dem chirurgischen Eingriff wurden dem Pavian perioperativ 500 mg
IM Cefazolin als antibakterielle Prophyla×e verabreicht. Der Pavian
wurde mit Ketamin (10 mg/kg, IM) sowie durch intravenöse Verabreichung
von Thiopental, einem 1–2%
Isofluoran-Inhalations-Anästhetikum,
sediert und betäubt. Es
wurde Haut von der anterioren Unterleibswand geerntet und auf ein
vorab markiertes befeuchtetes Saline-Gaze-Pad gelegt. Diese Haut
wurde auf 2 Transplantate aufgeteilt; eines wurde als dritte Partei-Kontrolle
für einen
anderen Empfänger-Pavian verwendet,
und eines wurde als autologe Kontrolle für dasselbe Tier verwendet.
Das Tier wurde dann in eine lang hingestreckte Position gebracht.
Es wurden drei 3 × 2
cm-Schnitte von Haut am Rücken,
entlang des Rückgrats,
zwischen den Schulterblättern,
entnommen. Die zuvor geernteten Hauttransplantate des MSC-Donors,
einem Donor einer dritten Partei und die Selbst-Haut wurden entfettet,
zurechtgeschnitten, um auf die erzeugten Hautdefekte zu passen und
in Position angenäht.
-
Nach
der Transplantation erhielt der Pavian eine intravenöse Infusion
von MSC bei einer Dosis von 20 × 106 Donor-MSC/kg. Periphere Blutproben wurden
erhalten vor den MSC, 1 Stunde und an den Tagen 1–3 nach
den MSC; Knochenmarkabsaugungen wurden an Tag 0 nach den MSC und
den Tagen 3, 14 und 30 gewonnen.
-
Gegen
den postoperativen Schmerz wurden das Analgetikum Buprenorphin mit
Q12 × 2
Dosen und Ancef täglich
für 2 Tage
verabreicht. Das Tier wurde täglich
begutachtet, und die Transplantate wurden jeden zweiten Tag, beginnend
an Tag 7 nach der Transplantation, photographiert.
-
Physikalische
Untersuchungen und diagnostische Tests
-
Jeder
Pavian wurde mit Ketamin (10 mg/kg) IM für die Untersuchung sediert.
Während
des sedierten Zustands wurden zwei – drei Milliliter Mark durch
Nadelabsaugung aus dem Darmbeinkamm gewonnen und an den Tagen 4,
13 und 30, dem Ende der Studie, in Natrium-Heparin gesammelt. An
denselben Tagen, an denen Knochenmarkabsaugungen erhalten wurden,
wurde eine Hautbiopsie geerntet.
-
ERGEBNISSE
-
Wirkungen
der MSC-Infusion auf das Überleben
von Haut-Allotransplantat
-
Unbehandelte
Kontrolltiere (N = 2) besaßen eine
mittlere Haut-Allotransplantat-Überlebenszeit von
8,0 ± 0
Tagen. Die Infusion der von einem nicht-verwandten MSC-Donor stammenden
Donor-MSCs (N = 2) führte
zu einer Verlängerung
der Überlebensdauer
des Hauttransplantats auf eine mittlere Überlebenszeit von 11,5 ± 0,71
Tagen (Mann-Whitney U-Test,
P < 0,05). Die
Infusion der von einem Donor einer unverwandten dritten Partei stammenden
MSCs bei den Donorallotransplantaten (N = 4) führte zu einer signifikanten
Verlängerung
der Überlebenszeit
der Hauttransplantate bis auf eine mittlere Überlebenszeit von 12,3 ± 0,96
Tagen (Mann-Whitney U-Test, P < 0,003).
-
Die
Empfänger
6140 und 6200 erhielten Allotransplantate von dem MSC-Donor 6243,
von einander (Transplantat einer dritten Partei) und von sich selbst
(Auto-Transplantat). 24 Stunden vor der Ernte des Hauttransplantats
bei dem MSC-Donor, 6243, wurden MSCs aus 6243 unter die anteriore
Unterleibshaut injiziert, die für
die Transplantation mit einer Skizzierung versehen worden war. Nach
der Transplantation erhielten die Empfänger eine intravenöse Infusion
von 20 × 106 MSC/kg (6243). Beide Allotransplantate
einer dritten Partei wurden an Tag 13 abgestoßen. Die Allotransplantate
aus dem MSC-Donor (6243) wurden an Tag 4 als hämorrhagisch ermittelt, ein
Befund, der gewöhnlich
einem technischen Fehler zugeschrieben wird. Bei der pathologischen Überprüfung wurde
festgestellt, dass Keratin in einer spurartigen Weise unterhalb
der Dermis eingedrungen war: Die Natur dieser Spuren legt nahe,
dass diese durch die Nadel zum Zeitpunkt der subkutanen MSC-Injektion
erzeugt wurden. Die Anwesenheit dieser Zellen hatte eine heftige
entzündliche
Reaktion ausgelöst.
Diese entzündliche
Reaktion nahm den Hauttransplantaten die Möglichkeit, korrekt anzuhaften/"anzunehmen", und diese Transplantate
waren um Tag 7 herum vollständig
nekrotisiert. Die Autotransplantate wurden nicht abgestoßen.
-
Die
Empfänger
6654 und 6659 erhielten Allotransplantate des MSC-Donors 6593, von
einander (Transplantat einer dritten Partei) und von sich selbst (Auto-Transplantat).
Nach der Transplantation wurden den Empfängern intravenöse Infusionen
von 20 × 106 MSC/kg verabreicht. Die MSC-Donor-Allotransplantate
wurden an Tag 11 und 12 abgestoßen,
und die Donor-Allotransplantate der dritten Partei wurden an den
Tagen 11 und 12 abgestoßen.
Die Autotransplantate wurden nicht abgestoßen.
-
In
entsprechender Weise erhielten die Empfänger 6663 und 6658 Allotransplantate
des MSC-Donors, 6656, voneinander (Transplantat einer dritten Partei)
und von sich selbst (Auto-Transplantat). Nach der Transplantation
wurden den Empfängern
intravenöse
Infusionen von 20 × 106 MSC/kg verabreicht. Die MSC-Donor-Allotransplantate
wurden an Tag 11 abgestoßen,
und die Donor-Allotransplantate der dritten Partei wurden an den
Tagen 10 und 12 abgestoßen.
Die Autotransplantate wurden nicht abgestoßen.
-
Die
Empfänger
6532 und 6720 im Kontrollzweig der Studie erhielten Auto- und Allotransplantate
ohne eine Verabreichung von MSC durch Infusion oder Injektion. Ihre
Allotransplantate wurden an Tag 8 abgestoßen. Die Autotransplantate
wurden nicht abgestoßen.
-
Es
gab keine identifizierbaren Toxizitäten, die mit der allogenen
MSC-Infusion verbunden waren und keine nachteiligen klinischen Krankheitsfolgen im
nachfolgenden 30- tägigen Intervall.
Blutproben wurden vor den MSC, 1 und 2 Stunden, sowie an den Tagen
1, 2 und 3 nach der Transplantation und MSC-Infusion erhalten. Markabsaugungen
wurden an den Tagen 4 und 13 nach der Transplantation und MSC-Infusion
erhalten.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass eine einzige Infusion allogener Pavian-MSCs
die Abstoßung
allogener Hauttransplantate hinauszögern kann. Es wurde keine andere
immunsuppressive Therapie verabreicht. Eine Dosis an allogenen MSCs
oder MSCs einer dritten Partei erhöhten die Zeit bis zur Abstoßung um
50% (die Standardabstoßungszeit
bei diesem Modell beträgt
8 Tage (siehe Goodman et al., Am Surg 62(6): 435–42 (1996)).
-
Beispiel 8
-
Der
Zweck dieser Studie bestand darin, bei Hunden die Durchführbarkeit
und Sicherheit der Infusion einer mäßig hohen Dosis an caninen
mesenchymalen Stammzellen (cMSC) bei 10 × 106 Zellen/kg bei
der Situation einer allogenen Markübertragung zu zeigen; dabei
stammten die cMSC von Donoren, die im Bezug auf Hundeleukozyten-Antigen
(DLA) identische Geschwistertiere darstellten. Eine zweite Zielsetzung
bestand darin, die Verteilung und Funktion von Donor- neo- und GFP-markierten
cMSC an den Tagen 50 und 100 nach der Transplantation zu untersuchen.
-
MATERIALIEN
UND METHODEN
-
Versuchstiere
-
Es
wurden Beagles für
die Studie verwendet. Es wurden zwei männliche und zwei weibliche DLA-identische
Geschwistertiere, die an Tag 0 der Studie 7 oder 9 Monate alt waren,
bei der Studie verwendet. Das verwendete Typisierungsverfahren beinhaltet
die Nutzung hochgradig polymorpher Mikrosattelitenmarker, um die
Vererbung der Klasse II DRB-Region bei dem Hunde-Leukozyten-Antigen (DLA),
dem Hunde-Äquivalent
des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes,
zu verfolgen. Mikrosatteliten sind kleine, Di-, Tri- oder Tetranukleotid-Wiederholungen,
die bei den Allelen eine hinreichende Variabilität der Länge zeigen, sodass sie verwendet
werden können,
um die Vererbung chromosomaler Segmente über Mehrgenerationen-Kreuzungen
zu verfolgen. Die Segregation von Allelen wird typischerweise unter
Verwendung einer Einzelschritt-Polymerasekettenreaktion mit Primern überwacht,
die von singulären
DNA-Sequenzen abgeleitet sind, die jede Wiederholungssequenz umgeben.
Zusätzlich
wurden gemischte Leukozytenreaktionen bei den für die Studie ausgewählten DLA-identischen
Geschwisterpaaren durchgeführt,
um die Ergebnisse des PCR-gestützten
Mikrosattelitenmarker-Tests zu bestätigen.
-
Aufbau der
Studie
-
Die
Hunde erhielten eine Transplantation von cMSC und Knochenmark von
dem gleichartigen, DLA-identischen Geschwister-Donor. Das Knochenmarktransplantat
wurde von jedem der beiden DLA-identischen Geschwister am Tag 0
vor der Gesamtkörperbestrahlung
(TBI) erhalten und ausgetauscht. Die Myeloablation wurde induziert,
indem man die Hunde am Tag 0 einer einzigen TBI-Dosis von 920 Centigray
(cGy) aussetzte (Mittellinien-Luft-Exposition von zwei gegenüberliegenden 60Co-Quellen, zugeführt mit einer Rate von 7 cGy
(9,3 R)/min). In Kultur vermehrte cMSC, die aus einer Donor-Knochenmarkabsaugung
4 oder mehr Wochen vor der Transplantation isoliert wurden, wurden
mit Papp@OT-24, das die Gene für
Grünes
Fluoreszenzprotein (GFP) und Neomycin-Phosphotransferase (neo) enthält, transduziert.
Die cMSC wurden nach Passage 1 (P1) oder Passage 2 (P2) cryokonserviert.
Nach der TBI wurden die cMSC aufgetaut und über eine tragbare Infusionspumpe über eine
15 Minuten-Zeitspanne intravenös
zugeführt.
Innerhalb von ein bis zwei Stunden nach der cMSC-Infusion wurde
das Knochenmark-Transplantat
mit einer Dosis von ≥ 1 × 108 kernhaltigen Gesamtzellen (TNC)/kg intravenös infundiert.
-
Zur
Prophylaxe gegen die Graft-versus-Host-Erkrankung (GVHD) wurde allen
vier Hunden an den Tagen 0 bis 5 Cyclosporin (Sandimmune® Injektionslösung, Sandoz
Pharmaceuticals Corporation) intravenös mit einer Dosis von 10 mg/kg
BID (20 mg/kg/Tag) verabreicht. An den Tagen 6 bis 50 (Ende der
Studie) für
die Gruppe I.1.a, oder 6 bis 100 für die Gruppe I.1.b wurde Cyclosporin
(Neoral® Weichgelatinekapseln,
Sandoz Pharmaceuticals Corporation) mit 10 mg/kg BID PO (20 mg/kg/Tag)
verabreicht. Die übliche
unterstützende
Betreuung mit oralen Antibiotika für den Empfänger begann an Tag -5, und
systemische Antibiotika begannen an Tag 0 und wurden fortgeführt, bis
ein Anwachsen des Transplantats erreicht war. Wo nötig, wurde
unterstützend
Flüssigkeit verabreicht.
Während
der Erholung wurden bei keinem der vier Hunde Blutplättchen-Transfusionen
benötigt.
Auf Hunde abgestimmte Standardprozeduren fordern, dass eine Gesamtblut-Transfusion
zu verabreichen ist, wenn der Zahlenwert für die Blutplättchen konsistent
unter 10.000/mm3 abfällt, oder wenn das Behandlungsteam
Anzeichen von Bluten beobachtet. Die Blutplättchentransfusionen waren,
wenn nötig, als
50 ml an bestrahltem Gesamtblut (2000 cGy) aus einem zufälligen Spender
zu verabreichen.
-
Das
Anwachsen des Transplantats wurde als Zeit der ersten von drei aufeinander
folgenden Messungen mit > 500, > 1000/mm3 an
neutrophilen Gesamtzellen/mm3 und > 10.000/mm3,
50.000/mm3 und > 100.000/mm3 an
Blutplättchen
bestätigt.
-
Um
die hämatopoetische
Wiederherstellung zu verfolgen, wurden Vollblutauszählungen
(CBCs) von Tag 0 bis Tag 50 erhalten, und danach zwei-wöchentlich
für die
100-Tage-Studiengruppe.
Die Analyse der Serumchemie wurde an den Tagen 0,2 und danach wöchentlich
durchgeführt.
Periphere Blutproben wurden an Tag 0 vor der MSC-Infusion abgenommen,
mit Zeitpunkten von 5 und 15 Minuten, 1 und 2 Stunden und 1, 2,
3 und 4 Tagen für
die DNA-Isolierung. Die DNA wurde durch einen Anti-EGFP-DNA-PCR-ELISA
mit in das Produkt eingebautem Digoxigenin und einen colorimetrischen
Assay auf Anti-Digoxigenin
im zweiten Schritt auf Anwesenheit von GFP-markierten Zellen bewertet.
Eine Markabsaugung wurde vorgenommen, wenn die Bluttplättchenzahlen
konsistent 50.000/mm3 erreichten, und es
wurde unter Verwendung desselben PCR-Verfahrens auf das Vorkommen
GFP-markierter Zellen hin getestet. Es wurden cMSC-Kulturen angelegt,
um auf die Koloniebildenden Einheiten (CFU) hin zu testen und um
die cMSC für
weitere Anti-EGFP PCR-Analysen
zu vermehren. Bei der Nekropsie wurden peripheres Blut, Knochenmarkabsaugungen
und Knochenmarkbiopsien für
die Anti-EGFP PCR-Analyse erhalten. Es wurden CFU-Assays an den
Knochenmarkabsaugungen durchgeführt,
und die Anti-EGFP-PCR-Analyse wurde an in Kultur vermehrten cMSC
durchgeführt.
Es wurde eine histologische Analyse auf Gegenwart von GFP an verschiedenen
Geweben durchgeführt.
-
cMSC-Isolierung, Kulturvermehrung,
Transduktion und Cryokonservierung
-
Beidseitige
Knochenmarkabsaugungen wurden für
die cMSC-Isolierung und Kulturetablierung bei Woche -4 für die Hunde
CAN-07-01 und CAN-07-02 und bei Woche -9 für die Hunde CAN-07-03 und CAN-07-04
erhalten. Fünfzehn
Milliliter Mark (7 ml von jedem Humerus) wurden von jedem Hund erhalten.
Die Hunde wurden betäubt
durch die Injektion von Butorphanol, gefolgt von der Injektion eines
Gemischs von Diazepam und Ketaminhydrochlorid (Aveco Co., Inc.,
Fort Dodge, IA). Die Stellen der Nadeleinführung wurden mit Povidon-Iod
abgerieben und dann mit Alkohol abgespült. Absaugungen wurden von
jedem der humeralen Gelenkköpfe jedes
Hundes unter Verwendung einer 16-Eichmaß-2-Inch-Knochenmarknadel erhalten. Es
wurde eine Spritze auf die Nadel aufgesetzt und Sogwirkung appliziert,
um 8 ml Mark aus jedem Humerus zu entnehmen. Die Knochenmarkabsaugungen
wurden unter Verwendung steriler Technik in konische 15 ml-Polypropylenröhrchen überführt. Nach
der Prozedur wurde der Hund dann auf ein Wärmepolster gesetzt, um sich
zu erholen.
-
Fünf bis 10
ml-Aliquots von Knochenmark wurden in Dulbeccos Phosphat-gepufferter
Saline (DPBS) in einem Polypropylen-Kulturröhrchen auf 50 ml verdünnt. Die
Zellsuspensionen wurden bei 2200 rpm für 10 Minuten bei Raumtemperatur
(RT) zentrifugiert. Die Auszählung
der kernhaltigen Gesamtzellen wurde in 4% Essigsäure bestimmt. Die Zellen wurden
dann in DPBS auf eine Endkonzentration von 20 × 106 Zellen/ml
verdünnt.
Zehn Milliliter oder 200 × 106 Zellen wurden auf 20 ml Percoll (sp. gr.
1,073 g/ml) in einem konischen 50 ml-Röhrchen geladen und wurden für 20 Minuten
bei 1300 rpm zentrifugiert. Die Zellgrenzschicht, die die einkernigen
Zellen enthielt, wurde in DPBS gewaschen, in Vollmedium resuspendiert
und ausgezählt,
um einen prozentualen Ertrag zu erhalten. Die Zellen wurden dann
in Vollmedium verdünnt,
es wurden Kulturen etabliert, wie unten beschrieben, und in einen
37°C Inkubator
bei 5% CO2 eingesetzt.
-
Konstruktion
eines bicistronischen retroviralen MuLV-Vektors
-
Das
Grüne Fluoreszenzprotein
(EGFP)-Retrovirus wurde konstruiert, indem man das EGFP-1-Gen aus
der Qualle Aequorea victoria isolierte (Clontech, CA). Das EGFP-Gen
wurde in den retroviralen Vektor pJM573-neo kloniert (das resultierende
Plasmid wurde pOT-24
genannt). Das Plasmid pJM573-neo wurde von pN2 (Keller et al., 1985,
Nature 318:149) abgeleitet, wobei es die folgenden Modifikationen
gab: Die murine retrovirale gag-Initiationsstelle
wurde durch ein im Leseraster liegendes Stopcodon ersetzt; es wurden
5'-LTR und 3'-LTR in derselben
Kassette konstruiert; ein Neomycin-Phosphotransferase-Gen (neo)
und eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) wurden in pN2 inseriert. Eine
schematische Karte von EGFP pOT24-Plasmid ist in 8 dargestellt.
-
Herstellung
von rekombinantem Retrovirus
-
pOT-24
wurde in ekotrope GP&E86-Produzentenzellen
transfiziert, wobei DOTAP (Boehringer Mannheim), wie vom Hersteller
vorgeschlagen, verwendet wurde. Die Anzucht der transfizierten Zellen erfolgte
in DMEM-Hochglukose-Medium (HG-Medium), das mit 10% hitzeinaktiviertem
FBS, Penicillin-Streptomycin (Life Technologies) und 0,5 mg/ml an
Protaminsulfat-G418 (Sigma) als Selektionsmarker supplementiert
war. Die Kulturen wurden bis zu einer Konfluenz von 70% gehalten,
wobei das Medium zu diesem Zeitpunkt durch frisches retrovirales Medium
(ohne G418) ersetzt wurde, und die Zellen wurden bei 32°C für 2 Tage
gehalten. Das das Retrovirus enthaltende Kulturmedium wurde gesammelt, durch
einen 0,45-Filter filtriert und bei –70°C gelagert. Amphotropes Retrovirus
wurde hergestellt, indem man PA317-Zellen zweimal mit ektotropem
Virus transduzierte, wobei hierfür
ein zentrifugales Transduktionsverfahren, gefolgt von Selektion
mit G418 (0,5 mg/ml) verwendet wurde. Der retrovirale Überstand
wurde gesammelt. Der Titer des vereinten EGFP-Retrovirus auf den 3T3-Zellen betrug
1,2 × 106 CFU/ml. Die GFP-retroviralen Überstände wurden bei –70°C cryokonserviert.
-
CAN-07-01 und CAN-07-02
-
Die
an der Percoll-Grenzschicht erhaltenen, gewaschenen einkernigen
Zellen wurden in 10 T-185-Kolben, die 30 ml Vollmedium und 10 × 106 Zellen/Kolben enthielten, etabliert.
-
An
den Tagen 2, 6 und 9 der Kultur wurde das Medium in den Kolben vollständig durch
frisches Vollmedium ersetzt. An Tag 12 der primären Kultur wurden Photographien
aufgenommen, und die Zellen wurden von Passage 0 (P0) zu Passage
1 (P1) gebracht. Das Medium wurde abgesogen, und die Kolben wurden
zweimal mit 8 ml DPBS gewaschen. Es wurden 8 ml an Trypsin hinzugegeben,
und die Kolben wurden für
3 Minuten bei 37°C
in einen Inkubator gestellt. Nachdem die Zellen abgelöst waren,
wurde die Reaktion durch die Zugabe von 8 ml Vollmedium abgestoppt.
Die Zellen wurden transferiert und in konischen 50 ml-Röhrchen vereint.
Die Kolben wurden mit DPBS gewaschen, und die vereinten Zellen wurden
bei RT bei 2000 rpm für
5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand
wurde entfernt, und die Zellpellets wurden in Vollmedium resuspendiert.
Die Zellen wurden vereint, ausgezählt und auf Lebensfähigkeit
hin getestet. Die Zellen wurden in 15 T80-Kolben, enthaltend 18
ml an Vollmedium und 0,4 × 106 Zellen pro Kolben, plattiert.
-
An
Tag 15 in Kultur wurde die erste Transduktion bei 15 der 18 Kolben
durchgeführt.
Das Medium wurde entfernt. Aliquots des retroviralen Überstands
wurden aufgetaut, und es wurde Polybren bis zu einer Endkonzentration
von 8 μg/ml
hinzugegeben, um einen Transduktionscocktail herzustellen. Das Zellmedium
wurde durch 10 ml des Transduktionscocktails ersetzt, und die Kolben
wurden für
1 Stunde bei 32°C
bei 3000 rpm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden 10 ml
Vollmedium, hergestellt unter Verwendung von hitzeinaktiviertem
fetalem Rinderserum (FBS), zu jedem Kolben (mit dem Transduktionscocktail)
hinzugegeben, und die Kolben wurden in den Inkubator zurückgestellt.
Drei Kolben wurden nicht transduziert, und es erfolgte Ersatz mit
frischem Medium. An Tag 16 der Kultur erfolgte Ersatz des Mediums
durch frisches Vollmedium. An Tag 17 der Kultur wurde die Transduktionsprozedur wiederholt.
-
An
Tag 18 der Kultur wurden die Zellen, wie oben beschrieben, geerntet,
und von P1 zu P2 gebracht. Es wurden 3 × 106 Zellen
zu 100 ml Vollmedium gegeben, und in Dreifachkolben (500 cm2) gegossen. Es wurden 15 Dreifachkolben
mit transduzierten Zellen präpariert,
und drei Kolben wurden mit untransduzierten Zellen präpariert.
Alle verbleibenden Zellen wurden cryokonserviert. Es wurde eine
Gefrierlösung
hergestellt, die 10% DMSO und 90% FBS enthielt. Es wurden 10 × 106 Zellen in 1 ml Gefrierlösung resuspendiert. Die Gefäße wurden
markiert und in einem Nalgene Cryo Container für mindestens 4 Stunden bei –70°C cryokonserviert
und bei –70°C gelagert.
-
An
Tag 22 der P2-Kultur wurden Photographien aufgenommen, um die Zellverteilung
und Morphologie aufzuzeichnen, und die P2-Zellen wurden, wie unten
beschrieben, geerntet und cryokonserviert.
-
CAN-07-03 und CAN-07-04
-
Die
gewaschenen einkernigen Zellen, die an der Percoll-Grenzschicht
erhalten wurden, wurden in 15 T-75-Kolben, enthaltend 20 ml an Vollmedium
und 12 × 106 Zellen/Kolben, etabliert.
-
An
Tag 2 der Kultur wurde das Medium in den Kolben und Schalen vollständig durch
frisches Vollmedium ersetzt. An Tag 6 der Primärkultur für cMSC wurde die erste Transduktion
gemäß obiger Beschreibung
durchgeführt.
Drei Kolben wurden nicht transduziert, und das Medium wurde an Tag
6 durch frisches Medium ersetzt. An Tag 7 der Kultur wurde das Medium
durch frisches Medium ersetzt.
-
An
Tag 8 der Kultur wurde die Transduktionsprozedur wiederholt. An
Tag 9 in der Kultur wurden Photographien aufgenommen, und die Zellen
wurden von P0 zu P1 geleitet, wie oben beschrieben. Es wurden 3 × 106 Zellen zu 100 ml Vollmedium gegeben und
in Dreifachkolben gegossen. Fünfzehn
Dreifachkolben wurden mit den transduzierten Zellen präpariert,
und drei wurden mit untransduzierten Zellen präpariert.
-
Die
15 ml der Knochenmarkabsaugungen erbrachten 910, 1212, 856 und 1948 × 106 kernhaltige Zellen bei den Donoren CAN-07-01,
CAN-07-02, CAN-07-03 bzw. CAN-07-04. Die Auszählungen der einkernigen Zellen,
die an der Percoll-Grenzschicht erhalten wurden, betrugen 612, 666,
588 und 462 × 106, was in Ausbeuten von 67,2; 55; 68,7 und
23,7% resultiert. Bei P1 besaß die
Zelllebensfähigkeit
einen Mittelwert von 97,1 (Bereich 93,3 bis 100%). Bei P2 für die Donoren
CAN-07-01 und CAN-07-02 und den P1-Zellen für die Donoren CAN-07-03 und CAN-07-04
besaß die
Zelllebensfähigkeit
der transduzierten Zellen einen Mittelwert von 96,7 (Bereich 96,3
bis 97,9 %). Die untransduzierten Zellen waren zu 95,4 (Bereich
93,3 bis 96,9%) lebensfähig.
Bei der Ernte der cMSCs für
die Cryokonservierung besaß die
Lebensfähigkeit
der transduzierten Zellen einen Mittelwert von 99,4 (Bereich 97,4
bis 100%), und die untransduzierten Zellen waren zu 99,4 (Bereich
97,6 bis 100%) lebensfähig
(Tabelle 4).
-
Die
Ausbeute an transduzierten cMSC pro Kolben für die Donoren CAN-07-01 und
CAN-07-02, geerntet 4 Tage nach Passage 2 und ausplattiert mit 3 × 106 pro Kolben, betrug 5,9 und 6,7 × 106, und die Ausbeute der untransduzierten
cMSC pro Kolben betrug 8,4 und 7,5 × 106.
Die Ausbeute an transduzierten cMSC pro Kolben für die Donoren CAN-07-03 und
CAN-07-04, geerntet 4 Tage nach Passage 1 (unterschiedliches Design
der Transduktion und Passage) und ausplattiert mit 3 × 106 pro Kolben, betrug 20,0 und 14,0 × 106, und die Ausbeute der untransduzierten
cMSC pro Kolben betrug 25,3 und 18,0 × 106.
-
CFU-Assays an cMSC aus
P0-Kulturen
-
CFU-Kolonie-Assays
wurden zum Zeitpunkt der Etablierung der Primärkultur präpariert, indem man 0,5 × 106 Zellen im Dreifachansatz in 100 mm Schalen,
enthaltend 10 ml Vollmedium, ausplattierte. Die Schalen wurden bei
37°C und
5% CO2 inkubiert. Das Medium wurde alle
2 bis 4 Tage durch frisches Medium ersetzt. An Tag 10 in Kultur
wurden die CFU-Assay-Schalen
zweimal mit HBSS abgespült, für 15 Minuten
mit 1% Glutaraldehyd fixiert, zweimal mit HBSS abgespült und an
der Luft getrocknet. Die cMSC in den Schalen wurden dann mit 0,1%
Kristallviolett angefärbt,
dreimal mit deionisiertem Wasser abgespült und an der Luft getrocknet.
Die Kolonien wurden ausgezählt,
um die Anzahl der sich bildenden Kolonien pro ausplattierten 106 Zellen zu berechnen.
-
Die
CFU-Assays, die am Tag der Isolierung der einkernigen Zellen und
der Kulturetablierung ausplattiert wurden und am Tag 10 geerntet
wurden, ergaben 56; 46,7; 114 und 72 Kolonien pro 106 Zellen für die Hunde
CAN-07-01, CAN-07-02, CAN-07-03 bzw. CAN-07-04.
-
An
Tag 13 der P1-Kultur wurden Photographien aufgenommen, um die Zellverteilung
und Morphologie aufzuzeichnen, und die P1-Zellen wurden gemäß unten
stehender Beschreibung durch Trypsinisierung geerntet und cryokonserviert.
-
Das
Medium in den Dreifachkolben wurde abdekantiert, und die Kolben
wurden mit 50 ml DPBS gespült.
Nach dem Abdekantieren des DPBS wurden 23 ml an 0,25% Trypsin zu
jedem Dreifachkolben hinzugegeben. Die Kolben wurden für 3 Minuten
in einen 37°C-Inkubator eingesetzt.
Nach der Ablösung der
Zellen wurden 23 ml Vollmedium zu jedem Kolben hinzugegeben. Die
Zellsuspensionen wurden auf konische 50 ml-Röhrchen überführt, und die Kolben wurden
mit 30 ml HBSS gewaschen. Die Röhrchen wurden
bei 2200 rpm für 5
Minuten bei RT zentrifugiert. Die Pellets, die die transduzierten
bzw. untransduzierten Zellen enthielten, wurden vereint und ausgezählt. Ein
Aliquot von 1 × 107 Zellen wurde für die Bestimmung des Transduktions-Prozentsatzes
durch einen Anti-EGFP DNA PCR ELISA-Assay zur Seite gestellt.
-
Nach
der Ernte wurden die wiedergewonnenen, aus P1 oder P2 stammenden,
transduzierten und in Kultur vermehrten cMSCs für 5 Minuten bei 1300 rpm zentrifugiert
und in 1 ml-Aliquots mit 1 × 107 cMSC/ml in eiskalter Gefrierschutzlösung, enthaltend 85%
Plasma-Lyte A (Baxter IV Therapy), 10% DMSO und 5% autologes Hundeserum,
resuspendiert. Die Zell-Aliquots wurden in getrennte Cryo-Gefäße abgefüllt, die
jeweils 1 ml enthielten. Die Röhrchen
wurden mit der Hunde-Donornummer und der Gesamtzahl lebensfähiger Zellen
markiert. Die cMSCs wurden cryokonserviert, indem man die Zellgefäße in einen Nalgene
Gefrier-Container einsetzte und diesen dann für 4 Stunden in einen –70°C Gefrierschrank einsetzte
und dann bei –70°C in die
Lagerung verbrachte.
-
Bei
der Zellernte für
die Cryokonservierung des Produkts wurden Aliquots von 1 × 107 Zellen erhalten, um die Transduktionseffizienz
zu bestimmen. Die Analyse der Transduktionseffizienz erfolgte durch
einen Anti-EGFP DNA PCR ELISA mit Digoxigenin-Einbau in das Produkt und einen Anti-Digoxigenin-Colorimetrie-Assay
im zweiten Schritt.
-
cMSC-Infusionsprodukt
-
Eine
bis zwei Stunden vor der Infusion wurden die Gefäße mit den cMSC durch Wirbeln
in einem 37°C
Wasserbad aufgetaut, mit 70% Ethanol besprüht und in einem Biosicherheits-Kabinett
geöffnet.
Das cMSC-Produkt wurde in 50 ml Infusionsmedium, enthaltend DMEM-LG
plus 30% zum Zelldonor autologes Serum, suspendiert. Die Lebensfähigkeit des
cMSC-Produkts wurde durch Ausschluss von Trypan-Blau bestimmt, um
die tatsächliche
lebensfähige
Dosis zu bestimmen. Ein Aliquot jedes cMSC-Produkts wurde für ein Hefe-Isolat,
für aerobes und
nicht-aerobes Wachstum bereitgestellt. Die cMSCs wurden im Hinblick
auf ihre Fähigkeit
zur Anheftung an Gewebekultur-Kunststoff und zur Proliferation in
P2-Kultur (P3 für
CAN-07-01 und CAN-07-02) bewertet. Aliquots von 1 × 106 und 0,16 × 106 cMSCs wurden
in Hundekultur-Vollmedium im Dreifachansatz in T-25-Kunststoffkulturkolben
plattiert. Nach 24 Stunden wurden die mit 1 × 106 cMSCs
plattierten Kolben und an Tag drei die mit 0,16 × 106 cMSCs plattierten
Kolben durch Trypsinisierung geerntet und ausgezählt.
-
Nach
der TBI wurde die cMSC-Suspension über einen in die Kopfvene eingesetzten
Katheter infundiert, wobei ein manuell gehaltener Harvard Bard Mini-Infuser
zur Zufuhr der 50 ml über
eine Zeitspanne von 15–20
Minuten verwendet wurde.
-
Den
Hunden CAN-07-01, CAN-07-02, CAN-07-03 und CAN-07-04 wurden an Tag
0 mäßig hohe
Dosen von 7,49, 7,35, 10,0 bzw. 10,0 (Mittelwert: 8,7) × 106 lebensfähige
cMSC/kg infundiert. Diese Dosen stellen eine 4- bis 10-fache Steigerung gegenüber der
typischen Dosis dar, die ein Patient erhalten würde. Die Gesamtzahl der infundierten
lebensfähigen
cMSC reichte von 67,7 bis 129 (Mittelwert 93,9) × 106 cMSC.
Die Lebensfähigkeit
der Zellen reichte von 92,1 bis 97,6 (Mittelwert 94,9), wie durch
Trypan-Blau-Ausschluss
bestimmt. Die cMSC-Infusionen wurden zwischen 71 und 146 (Mittelwert
110) Minuten nach der TBI gegeben.
-
Blutprobengewinnung
nach der Infusion
-
Es
wurden Blutproben (2 ml) vor (prä)
und während
der cMSC-Infusion bei fünf
und fünfzehn
Minuten nach dem Start der Infusion erhalten, sowie ebenso zu den
Zeitpunkten 1 und 2 Stunden und 1, 2, 3 und 4 Tagen. Zelllysate
wurden unter Verwendung des PuregeneTM (Gentra
Systems, Inc.) DNA-Isolierungskits hergestellt, dies zur Verwendung
in einem Anti-EGFP DNA PCR ELISA mit in das Produkt eingebautem
Digoxigenin und einem zweiten Schritt mit einem Anti-Digoxigenin
colorimetrischen Assay zum Detektieren des Mengenniveaus der GFP-markierten
cMSC im Blutstrom.
-
Knochenmarkernte
und Transplantat-Infusion
-
Knochenmark,
das als Transplantat verwendet werden soll, wurde vor der TBI aus
dem DLA-identischen Geschwister gewonnen. Die Absaugungen wurden
aus jedem Humerus unter Verwendung einer 11 Eichmaß 4–6 Inch
großen,
mit Kugelspitze versehenen Markgewinnungsnadel aus rostfreiem Stahl
gewonnen, wobei die Nadel an einen Polyvinylschlauch, hervorgehend
aus einem Vakuumkolben mit 100 ml Gewebekulturmedium 199 und 4 ml
(4000 U) an Heparin, angeschlossen ist. Das Mark wird durch eine
Porengröße von 300
und 200 μm
geleitet und wird bei 4°C
in einem Transfer-Verpackungsbehälter, markiert
mit dem Donor und dem Empfänger,
gelagert, bis die Infusion später
am Tag stattfindet. Die Gesamtzahl der kernhaltigen Knochenmarkzellen
(BM-TNC) des Marks wird korrigiert, um jedwede kernhaltige Zelle
auszuschließen,
die im Volumen des peripheren Bluts, erhalten während der Markernte, vorhanden
sein könnte.
-
Die
Gesamtzahl der kernhaltigen Zellen (TNC) des Knochenmarks wird korrigiert,
um jedwede TNC auszuschließen,
die im Volumen des peripheren Bluts, erhalten während der Markernte, vorhanden
sein könnte.
Die korrigierten Dosen für
das Mark waren 4,3, 3,5, 3,1 und 2,0 (Mittelwert 3,2) × 108 TNC/kg bei den Hunden CAN-07-01, CAN-07-02, CAN-07-03
bzw. CAN-07-04. Die unkorrigierten Knochenmarkdosen betrugen 5,6,
4,2, 4,5 und 2,7 (Mittelwert 4,3) × 108 TNC/kg.
-
Zwanzig
Minuten vor der Infusion wurde das Mark auf Raumtemperatur gebracht.
Eine Stunde nach der cMSC-Infusion wurde das Mark intravenös über eine
in die Kopfvene eingesetzte Schmetterlingsnadel infundiert, indem über 1 bis
2 Minuten ein Druck auf den Beutel ausgeübt wurde.
-
Unterstützende Pflege
-
An
Tag -5 wurden orale Antibiotika (Neomycinsulfat und Polymyxinsulfat)
dreimal täglich
verabreicht. Diese oralen Antibiotika wurden verabreicht, bis die
absolute Neutrophilen-Anzahl 500/mm3 erreichte.
An Tag 0 wurde das systemische Antibiotikum Baytril zweimal täglich intravenös verabreicht, und
dies wurde fortgesetzt, bis die absolute Neutrophilen-Anzahl konsistent
1.000/mm3 erreichte. Flüssigkeits- und Elektrolytverluste
als Ergebnis der vorübergehenden
Bestrahlungstoxizität
wurden durch eine subkutane Zufuhr von 500 ml Ringer-Lösung, zweimal
täglich,
ersetzt, bis Nahrung und Wasser angenommen wurden.
-
Differentielle
Blutzell-Zählungen
-
Blutproben
(2 ml) wurden entweder aus der Drosselvene oder aus der Kopfvene
gesammelt, und zwar am Morgen der Markabsaugung für die Isolierung
der cMSC, an den Tagen 0 bis 50 und danach zweiwöchentlich bis zum Ende der
Studie. Das Blut wurde in einen Vacutainer mit EDTA überführt. Die Gesamtzahlen
der weißen
Blutzellen (WBC) und der Blutplättchen
pro mm3 werden unter Verwendung eines Sysmex
E2500 bestimmt, und differenzielle Zellzahlen wurden manuell bestimmt,
nachdem eine Fixierung und Anfärbung
mit dem Wrights-Stamm erfolgt war.
-
Nekropsie
-
Es
wurden Blutproben für
die CBC, die Chemie-23-Analyse und die PCR-Bewertung erhalten. Die
Hunde wurden mit Butorphanol, gefolgt von einem Gemisch aus Diazepam
und Ketaminhydrochlorid, sediert. Nach der Sedierung wurden Biopsien
und zweiseitige Knochenmarkabsaugungen von den Humeri, den Femora
und den Darmbeinkämmen
erhalten. Die Euthanasie wurde dann mit einer Überdosis des Beruhigungsmittels
Natrium-Pentobarbital
abgeschlossen. Die Tag-50-Gruppe der Hunde (CAN-07-01 und CAN-07-02)
wurde an Tag 43 der Studie getötet;
die Tag-100-Gruppe der Hunde (CAN-07-03 und CAN-07-04) wurden an Tag 100 der Studie
getötet.
Bei der Nekropsie der Tiere wurden vollständige Gewebesätze gesammelt.
-
Das
Sammeln von Gewebe für
die histologische Untersuchung folgte unmittelbar. Eine Untergruppe
von Geweben wurde für
die Anti-EGFP DNA PCR ELISA-Analyse verwendet. Die Knochenmarkabsaugungen
und Biopsien wurden für
die Anti-EGFP DNA PCR ELISA-Analyse
verwendet, die Kulturvermehrung für weitere PCR-Analyse und CFU-Assays.
-
Die
Gewebe wurden auf Stücke
von etwa 1 Inch-Quadrat zurechtgeschnitten und in getrennte, markierte,
konische 50 ml-Röhrchen,
die mit 10% neutral gepuffertem Formalin (pH 6,8–7,2) gefüllt waren, eingebracht. Die
Gewebe wurden in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin
und Eosin gefärbt.
Die Knochenmarkproben wurden mittels Period-Schiffsäure-Färbung angefärbt.
-
Vor
der Nekropsie erhaltene Knochenmarkabsaugungen wurden in markierten
15 ml-Röhrchen aus
den linken und rechten Humeri, den Femora und den Darmbeinkämmen jedes
Hundes gewonnen. Eine Untergruppe der Gewebeproben wurde bei der Nekropsie
erhalten und auf Stücke
von etwa 1/4 Inch-Quadrat zurechtgeschnitten, in mit PBS voll gesogener
Gaze verpackt und separat in einen markierten „Reißverschlussbeutel" eingebracht. Die
Knochenmarkabsaugungen wurden auf Eis gehalten.
-
Präparation
von Knochenmarkabsaugungen für
den CFU-Assay
-
Aliquots
der Knochenmark-Absaugungen aus dem linken und rechten Humerus,
dem Femur und dem Darmbeinkamm jedes Hundes, die für die PCR-Analyse
erhalten wurden, wurden in getrennte markierte 15 ml-Röhrchen allquotiert.
Die Knochenmark-Proben wurden auf Eis gehalten.
-
CFU-Assay
bei cMSC aus bei der Nekropsie erhaltenem Knochenmark
-
Die
CFU-Kolonie-Tests, die an cMSC, erhalten aus Knochenmark bei der
Nekropsie, durchgeführt
wurden, wurden vorbereitet, indem man 0,5 × 106 Zellen
im Dreifachansatz in 100 mm-Schalen mit 10 ml Vollmedium ausplattierte.
Die Schalen wurden bei 37°C
und 5% CO2 gehalten. Das Medium wurde alle
2–4 Tage
durch frisches Medium ersetzt. An Tag 10 in Kultur wurden die CFU-Assay-Platten
zweimal mit HBSS abgespült,
mit 1% Glutaraldehyd für
15 Minuten fixiert, zweimal mit HBSS abgespült und an der Luft getrocknet.
Die cMSC in den Schalen wurden dann mit 0,1% Kristallviolett angefärbt, dreimal
mit deionisiertem Wasser abgespült
und an der Luft getrocknet. Die Kolonien wurden gezählt, um
die Anzahl an Kolonien pro 106 plattierte
Zellen zu berechnen.
-
Isolierung
und Reinigung von DNA
-
DNA
wurde aus einem Teil jedes der Gewebe isoliert. Das verbleibende
Stück der
Probe wurde cryokonserviert und bei –70°C in einem Gefrierschrank gelagert.
DNA wurde dadurch isoliert, dass man Proben in Phosphat-gepufferte
Saline (PBS) brachte, Proteinase K-Lösung hinzugab und bei 55°C für 3 Stunden
bzw. bis zu einer Auflösung
des Gewebes inkubierte. Die Proben wurden nachfolgend bei 37°C für 60 min
mit RNase behandelt. Die Proben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt, und
das Protein wurde präzipitiert.
Die Proben wurden zentrifugiert, und die wässrige Phase wurde vorsichtig
in 100% Isopropanol gesammelt. Die Proben wurden gemischt und zentrifugiert,
und das Pellet in 70% Ethanol gewaschen. Die Röhrchen wurden zentrifugiert,
wonach man den Überstand
abtropfen ließ und die
Pellets für
etwa 1 bis 6 Stunden trocknen ließ. Man ließ die DNA über Nacht bei Raumtemperatur hydratisieren
und lagerte diese nachfolgend bei 4°C.
-
Proben
aus peripherem Blut und Knochenmark wurden zunächst mit RBC-Lyse-Lösung (Ammoniumchlorid-Puffer)
lysiert. Die DNA wurde dann gemäß obiger
Beschreibung aus den Lysaten isoliert. Die DNA wurde durch die Zugabe
von 998 μl
deionisiertem Wasser und 2 μl
DNA der Probe in eine Küvette
und Vortexen quantifiziert. Es wurde ein Spektrophotometer verwendet,
um die optische Dichte (OD) zu bestimmen. Die OD wurde bei 260 und
280 nm abgelesen, und die Konzentration von DNA wurde in μg/ml berechnet.
Die DNA-Konzentration
wurde unter Verwendung von deionisiertem Wasser auf 1 μg/ml eingestellt.
-
Anti-EGFP
DNA PCR ELISA
-
Der
Anti-EGFP DNA PCR ELISA-Assay, der für diese Studien verwendet wird,
detektiert infundierte cMSCs unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern,
die für
GFP spezifisch sind. Für
die Analyse der Genexpression verwendeten wir ein PCR-ELISA-Kit
(DIG-Markierung/Detektion) (Boehringer Mannheim). Kurz dargestellt,
wurde die PCR in Gegenwart Digoxigenin-markierter Nukleotide durchgeführt, um
das amplifizierte Produkt zu markieren. Danach wurden 25 μl des PCR-Produkts
denaturiert, und man ließ dieses
in Lösung
bei 37°C
in einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatte an eine 5'-biotinylierte Oligonukleotid-Sonde
hybridisieren. Das gebundene Sonde-PCR-Produkt wurde durch ein Anti-Digoxigenin-Peroxidase-Konjugat
und durch die Verwendung des colorimetrischen Substrats 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazolin-Sulfonsäure) (ABTS)
detektiert. Unter Verwendung transfizierter Kontroll-cMSCs wurden
Titrationsstandardkurven erstellt, um die Konzentration an DNA pro
in dem Test verwendeter DNA-Menge näherungsweise zu bestimmen.
Eine Schätzung
der Zellzahl kann erhalten werden, indem man zunächst eine Korrelation mit einem
internen Standard für
die PCR der DLA Klasse II genomischen DNA herstellt, dann die DNA-Konzentration
mit den Zell-Äquivalenten
korreliert und ein Retrovirus-Integrations-Ereignis pro transduzierter
Zelle annimmt.
-
Quantitative
Messungen der DNA für
GFP wurden bei allen Knochenmark-Proben/Biopsien
beobachtet.
-
Blutzell-Wiederherstellung
nach der Transplantation
-
Die
mittlere Frist bis zu einem Schwellenwert (3 aufeinander folgende
Werte) der Blutplättchen
von 10.000/mm3 war 12,8 (Bereich: 11–17), von 50.000/mm3 war 19,8 (Bereich: 16–25) und von 100.000/mm3 war 23,0 (Bereich: 20–27). Die mittlere Frist bis
zu einem Schwellenwert (3 aufeinander folgende Werte) der gesamten
neutrophilen Zellen von 500/mm3 war 9,3
(Bereich: 8–11),
und von 1000/mm3 war 10,5 (Bereich: 9–13).
-
Knochenmarkabsaugungen
in der Übergangsphase
-
Als
sich die Blutplättchen
konsistent auf Werte von über
50.000 pro mm3 erholt hatten, wurde eine Interims-Knochenmark-Absaugung
aus dem Darmbeinkamm gewonnen. Diese Prozedur erfolgte bei der Studie
für CAN-07-01
und CAN-07-02 an Tag 27 und für
CAN-07-03 und CAN-07-04
an Tag 29.
-
ERGEBNISSE
-
Bei
der histopathologischen Bewertung aller Gewebe von CAN-07-01 und
CAN-07-02, getötet an Tag
43, waren die Befunde für
ektopisches Bindegewebe und für
subakute GVHD negativ.
-
Ein
detektierbares DNA-Signal konnte innerhalb 1 Stunde der Infusion
und wiederum an Tag 2 gefunden werden. Eine Probe konnte an Tag
3 nach der Infusion für
GFP-DNA quantitativ gemessen werden. Dieser Zeitpunkt stimmt überein mit
vorherigen Beobachtungen bei der Untersuchung autologer Hundetransplantate,
bei denen sich das Signal an den Tagen 2 und 3 findet.
-
Tag
100-Nekropsie-Daten für
CAN-07-03 und CAN-07-04 für
GFP+-Zellen zeigten GFP-Signal (1 GFP+ Zell-Äquivalent pro 10 Mikrogramm
PCR Zugabe-DNA) im Femur und Humerus von CAN-07-03 und im Humerus
von CAN-07-04.
-
Bei
diesem Modell war es möglich,
eine Hautgraft (Hauttransplantat)-versus-Host-Erkrankung (GVHD) durch das Beobachten
der Rötung
der Augen und der Ohren der Tiere festzustellen. Unter Verwendung
dieses Indikators wurde bestimmt, dass die Tiere, die mesenchymale
Stammzellen erhalten hatten, eine niedrigere Häufigkeit von und/oder einen geringeren
Schweregrad der GVHD im Vergleich zu den Kontrolltieren aufwiesen,
die nicht mit mesenchymalen Stammzellen behandelt worden waren.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass allogene MSCs die rasche Transplantatannahme
von hämatopoetischen
Knochenmarkzellen unterstützen
können.
Es wurde keine Transfusionsunterstützung benötigt. Es gab keine klinischen
Anzeichen von GVHD. Die Wiederherstellung der Blutplättchen war
schneller als bei den historischen Kontrollen. Es gab Anzeichen
von chimärem
Charakter bei den Stromazellen nach der allogenen Transplantation.
Die Option der Transplantatetablierung von allogenem Gewebe mittels
Verwendung allogener MSCs verbreitert das Spektrum von Transplantatmaterial,
das in klinischen Transplantationsszenarien verwendbar ist.