JP5550235B2 - 胎盤幹細胞集団 - Google Patents
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Description
本発明は、単離された胎盤幹細胞、胎盤幹細胞の集団、該幹細胞を含む組成物、及び該幹細胞を得る方法を提供するものである。
ヒト幹細胞は、多様な成熟したヒト細胞系統を生成することのできる、全能性又は多能性前駆細胞である。幹細胞を、全部ではないが、多くの組織を再増殖して、生理学的かつ解剖学的な機能性を回復するために採用することができることを示す証拠が存在している。
数多くの異なる型の哺乳類の幹細胞が、特徴付けられている。例えば、Caplanらの米国特許第5,486,359号(ヒト間葉系幹細胞);Boyseらの米国特許第5,004,681号(胎児と新生児の造血幹細胞及び前駆細胞);Boyseらの米国特許第5,192,553号(胎児と新生児の造血幹細胞及び前駆細胞);Cell 114(6):第763〜766頁(2003)に掲載された、Beltramiらの論文(心臓幹細胞);J.Pathol.197(4):第510〜518頁(2002)に掲載された、Forbesらの論文(肝幹細胞)を参照。臍帯血及び、臍帯血由来の全体の有核細胞は、切除治療を受けた患者に対して、造血機能を部分的に或いは全体的に回復させるために、移植されて用いられてきた。
本発明は、単離された胎盤幹細胞、胎盤幹細胞の集団、該幹細胞を含む組成物、及び該幹細胞を得る方法を提供する。
本明細書において使用する用語「SH2」とは、遺伝標識のCD105上に、エピトープに結合されている抗体を意味する。したがって、SH2+と称される細胞は、CD105+である。
本明細書において使用する用語「SH3」及び「SH4」とは、遺伝標識のCD73上に、エピトープに結合されている抗体を意味する。したがって、SH3+及び/又はSH4+と称される細胞は、CD73+である。
(5.1 胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞集団)
胎盤幹細胞は、胎盤又はその一部から得られる幹細胞であり、これは、組織培養基材に付着されて、非胎盤細胞型に分化する能力を有する。胎盤幹細胞は、由来において胎児又は母親であってもよい(すなわち、それぞれ胎児又は母親の遺伝子型を有することができる)。好ましくは、本発明の胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞集団は、由来において胎児系である。胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、由来において単独で胎児又は母親である胎盤幹細胞を含むか、又は胎児と母親由来の両方共の胎盤幹細胞が混合された集団を含むことができる。胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、以下において説明される形態学的、遺伝標識及び培養特性によって選択され、確認することができる。
本発明の胎盤幹細胞は、初代培養中に又は細胞培養中に培養されるとき、組織培養基材、例えば、組織培養容器の表面(例えば、組織培養プラスチック)に付着される。培養において胎盤幹細胞は、一般に、中心細胞本体から拡張される多くの細胞質の突起とともに、星型のような外観の、線維芽細胞型と推定される。しかし、胎盤幹細胞が線維芽細胞よりも非常に多い数のそのような突起を示すように、胎盤幹細胞は、同一の条件下において培養される線維芽細胞から形態学的に区別することができる。形態学的に、胎盤幹細胞は、さらに造血幹細胞から分化することができ、この際、一般に、培養状態で、より丸いか又は敷石形態と推定される。
本発明の胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞の集団は、幹細胞を含む細胞の集団又は幹細胞を同定及び/又は単離するために使用することができる、多数の標識を発現する。本発明の胎盤幹細胞及び幹細胞集団(すなわち、2つ以上の胎盤幹細胞)は、胎盤又はその任意の部位(すなわち、羊膜、絨毛膜、胎盤葉など)から直接得られる、幹細胞及び幹細胞を含む細胞集団を含む。また、胎盤幹細胞の集団は、培養状態で(すなわち、2つ以上の)胎盤幹細胞の集団と、例えばバッグのような容器内で集団を含む。しかし、胎盤幹細胞は、トロホブラストではない。
他の具体的な実施態様において、本発明は、潅流により回収した、単離された胎盤幹細胞の集団を含む組成物を提供するが、ここで、前記組成物は、少なくとも、前記胎盤幹細胞を回収するために使用される潅流液の一部分を含む。
上記胎盤幹細胞の単離された集団、及び一般的に胎盤幹細胞の集団は、約、少なくとも、又は1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011以下又はそれ以上、胎盤幹細胞を含むことができる。
本明細書に記述された胎盤幹細胞の成長は、部分的に、任意の哺乳類細胞に関する限り、成長のために選択された特殊な培地に依存している。最適の条件下において、胎盤幹細胞は、典型的に、3〜5日で数値的には2倍となる。培養の間に、本発明の胎盤幹細胞は、培養基内の基材、例えば、組織培養容器の表面(例えば、組織培養皿プラスチック、フィブロネクチンがコーティングされたプラスチックなど)に付着して、単分子層を形成する。
(5.2.1 幹細胞回収した組成物)
本発明は、さらに、胎盤幹細胞を回収して、単離する方法を提供する。一般的に、幹細胞は、生理的に許容し得る溶液、例えば、幹細胞回収した組成物を使用して、哺乳類の胎盤から得られる。幹細胞回収した組成物は、2005年12月29日付で出願された、「胎盤幹細胞を回収して器官臓器を保護するための改善された培地」と題された米国仮出願第60/754,969号に詳しく説明されている。
幹細胞回収した組成物は、幹細胞の回収及び/又は培養に適した、どのような生理的に許容し得る溶液でも含むことができる。例えば、食塩水(例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス溶液、又は改質されたクレブス溶液、イーグル溶液(0.9%NaClなど)、培養培地(例えば、DMEM、H.DMEMなど)のようなものが挙げられる。
一般に、ヒトの胎盤は、誕生後の胎盤の放出後に直ぐ回収される。好ましい例では、胎盤と関連した患者の全病歴を記録した後、そして患者からのインフォームドコンセントを得た後に、胎盤は、患者から回収される。好ましくは、このような病歴は放出後にも続く。その病歴は、採取された胎盤や幹細胞の後続的使用を調整することに用いることができる。例えば、ヒト胎盤幹細胞は、その病歴を踏まえて、該胎盤と関連した幼児のための、親や兄弟姉妹、又は幼児の他の血縁者のための個体用薬として使用することができる。
一般的に上記のように調製されて一度回収された哺乳類の胎盤又はその一部は、いずれかの当業者における周知の方法で処理することができ、例えば、潅流させ、又は崩壊させることができ、例えば、幹細胞を得るために、1つ以上の組織崩壊酵素で消化させることができる。
一実施態様において、幹細胞は、器官全体部分の物理的な崩壊により哺乳類の胎盤から回収される。例えば、胎盤又はその一部は、例えば、圧搾されたり、せん断されたり、細かく切り刻まれたり、さいの目状にに切られたり、刻んだり、液体に浸して柔らかくなるようにしたりすることができる。組織は、その後培養されて、幹細胞の集団が得られる。典型的に、胎盤組織は、例えば、幹細胞回収した組成物(5.2.1節と以下を参照)を用いて崩壊される。
具体的な実施態様において、崩壊された組織は、胎盤幹細胞の分芽に好適である組織培養培地中において培養される(例えば、以下の、胎盤幹細胞の培養について説明する5.3節を参照)。
幹細胞は、分化されたトリプシン処理(以下の5.2.5節を参照)によって崩壊された組織から単離することができ、その後に、新しい増殖培地における1個以上の新しい培養容器中で培養し、その後、選択的に、第2の分化トリプシン処理ステップを伴う。
さらに、胎盤幹細胞は、哺乳類の胎盤の潅流によって得ることができる。幹細胞を得るために哺乳類の胎盤を潅流させる方法は、例えば、2005年12月29日付で出願された、「胎盤幹細胞を回収して器官を保護する改善した培地」と題された、Haririの米国仮出願第60/754,969号と、米国出願公開第2002/0123141号に開示されている。
他の実施態様において、潅流液は、臍帯静脈を通過して臍帯動脈から回収されるか、臍帯動脈を通過して臍帯静脈から回収される。「閉鎖回路」方法と呼ばれることがあるこの方法で回収された胎盤細胞は、典型的にほ、ほぼ例外なく胎児係である。
放血過程の間、哺乳類の胎盤からの潅流流体の第一の回収物は、一般的に、臍帯血及び/又は胎盤血液の残りの赤い血液細胞に染色される。潅流が進行して、残りの臍帯血細胞が胎盤の外に洗い流されることで、潅流流体は、より一層無色に変わる。一般に、30〜100ml(ミリリットル)の潅流流体が、胎盤を初期に放血するために好適であるが、それ以上又はそれ以下の潅流流体は、観察結果によって使用することができる。
潅流や酵素による消化によって得られた、哺乳類の胎盤から採取した幹細胞は、Ficoll勾配遠心分離により、初期に他の細胞から精製(すなわち、単離)することができる。そのような遠心分離は、遠心分離速度等に対する任意の標準的なプロトコルに従うことができる。一実施態様において、例えば、胎盤から回収された細胞は、15分間、室温、5000 × gで遠心分離により潅流液から回収され、この遠心分離は、細胞を例えば、汚染された組織片と血小板から分離する。他の実施態様において、胎盤潅流液は、約200mlに濃縮され、Ficoll上で穏やかに層を形成し、そして、22℃で、20分間、1100 × gで遠心分離をし、該細胞の低密度の界面層は、さらに処理に供するために回収される。
使用することのできる他の抗体/ラベルの組み合わせは、以下のようなものを含むが、これに限定されるものではない:CD45-PerCP(peridin chlorophyll protein);CD44-PE;CD19-PE;CDlO-F(fluorescein);HLA-G-F及び7-アミノ-アクチノマイシン-D(7-AAD);HLA-ABC−F;など。
胎盤幹細胞は、単一標識に対する抗体とともにラベリングされて、検出され、及び/又は分類されることができる。胎盤幹細胞は、また、同時に、他の標識に対する複合抗体とともにラベリングすることができる。
(5.3.1 培養培地)
単離された胎盤幹細胞、又は胎盤幹細胞の集団、又は細胞若しくは胎盤幹細胞が成長した胎盤組織は、細胞培養を開始するか、播種するために使用することができる。細胞は、一般的に、ラミニン、コラーゲン(例えば、自己由来又は変性された)、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン及び細胞外膜タンパク質(例えば、MATRIGEL(登録商標、BD Discovery Labware社、ベッドフォード、マサチューセッツ州))などの細胞外マトリックス又はリガンドでコーティングされているか或いはコーティングされていない無菌の組織培養管に移送される。
一度単離された胎盤幹細胞、又は幹細胞の単離された集団(例えば、幹細胞又は幹細胞の集団が、生体内で正常に関連する胎盤細胞の少なくとも50%から単離された幹細胞の集団又は幹細胞)が得られる場合、該幹細胞又は幹細胞の集団は、生体外で、分芽されて、増殖することができる。例えば、胎盤幹細胞の集団は、例えば、皿、フラスコ、マルチウェルプレート又はその他のものなどの組織培養容器の中で、該幹細胞が70〜90%密集度に分芽するのに十分な時間培養されることができ、それは、該幹細胞及びそれらの子孫が、組織培養容器の培養表面エリアの70〜90%を占有するまでである。
本発明は、胎盤幹細胞の集団を提供する。胎盤幹細胞の集団は、1個以上の胎盤から直接単離することができる;すなわち、胎盤幹細胞の集団は、潅流液から得られるか、潅流液中に含まれた、又は崩壊された胎盤組織、例えば、胎盤組織消化物(すなわち、胎盤やその一部の酵素による消化によって得られる細胞の回収)から得られるか、その中に含まれた胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団であってもよい。本発明の単離された胎盤幹細胞は、さらに、培養されて、増殖され、胎盤幹細胞集団を作成することができる。胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団は、また、培養されて、増殖され、胎盤幹細胞集団を作成することができる。
そのような細胞集団は、以下に挙げられた疾患や条件のうちのいずれかを治療するために使用することができる。そのような細胞集団は、また、例えば、品質制御方法の一部分として、胎盤幹細胞の集団を検査することに使用することができる。
単離された胎盤幹細胞の集団は、1個以上の非幹細胞又は非胎盤細胞の集団、例えば、胎盤幹細胞の単離された集団は、血液(例えば、胎盤血液又は臍帯血)、血液由来の幹細胞(例えば、胎盤血液又は臍帯血由来の幹細胞)、臍帯幹細胞、血液由来の核細胞の集団、骨髄由来の間葉系幹細胞、骨由来の幹細胞集団、生骨髄(crude bone marrow)、成体(体性)幹細胞、組織内に含まれた幹細胞の集団、培養された幹細胞、完全に分化された細胞の集団(例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓細胞等)などと結合することができる。具体的な実施態様において、本発明は、胎盤幹細胞と臍帯幹細胞を含む幹細胞の集団を提供する。単離された胎盤幹細胞集団における細胞は、それぞれの集団において全有核細胞の数を比較して、約100,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5,000,000:1、2,000,000:1、1,000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000:1、5,000:1、2,000:1、1,000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1;1:2;1:5;1:10;1:100;1:200;1:500;1:1,000;1:2,000;1:5,000;1:10,000;1:20,000;1:50,000;1:100,000;1:500,000;1:1,000,000;1:2,000,000;1:5,000,000;1:10,000,000;1:20,000,000;1:50,000,000;又は約1:100,000,000の割合で、他の種類の多数の細胞と結合することができる。単離された胎盤幹細胞集団内における細胞は、また、多数の細胞型の多数の細胞と結合することができる。
分娩後の胎盤から採取した幹細胞は、多くの異なる方式で培養されて、例えば、それぞれを管理できる用量のセット、胎盤幹細胞のセットのようなロット(lot)のセットを作成することができる。そのようなロットは、例えば、胎盤潅流液からの、又は酵素で消化された胎盤組織からの幹細胞から得ることができる。多数の胎盤から得られる胎盤幹細胞のロットのセットは、例えば、長期間の保存に備えて、胎盤幹細胞のバンクの中に配置されることがある。一般的に、付着性幹細胞は、胎盤物質の初代培養から得られ、シード培養を形成し、制御された条件下において増殖されて、約同等の数の倍加から細胞の集団を形成する。ロットは、好ましくは、単一の胎盤組織由来であるが、多数の胎盤組織由来であることもできる。
それぞれの用量にて使用される細胞は、冷凍されるべき数、例えば、後続使用のために凍結保存することができる。それぞれの量は、例えば、ml当たり、約100万から1億個の細胞を含むことができ、全体として約106から約109までの細胞を含むことができる。
(5.5.1 神経又は神経原性細胞への分化誘導)
胎盤幹細胞のニューロン分化は、例えば、胎盤幹細胞を、ニューロンへの分化を誘導する細胞培養条件下に置くことにより達成することができる。方法の一例において、神経性培地は、DMEM/20%FBSと1mM β-メルカプトエタノールを含み;そのような培地は、培養後の約24時間は、DMEMと1-10mM β-メルカプトエタノールを含む培地と取りかえることができる。他の実施態様において、細胞は、DMEM/2% DMSO/200μMブチル化ヒドロキシアニソールと接触する。具体的な実施態様において、分化培地は、無血清DMEMIF-12、ブチル化ヒドロキシアニソール、塩化カリウム、インスリン、ホルスコリン、バルプロ酸、及びハイドロコルチゾンを含む。他の具体的な実施態様において、ニューロン分化は、B27補充及びL-グルタミンを含み、選択的にbFGF及び/又はEGFで補充された神経細胞培養用基礎培地(Neurobasal-A medium)(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)において、ラミニンがコーティングされたプレート上に胎盤幹細胞を平板培養することにより達成される。胎盤幹細胞は、さらに、神経細胞とともに共同培養によって、又はニューロン調節された培地内での培養によってニューロン分化を誘導することができる。
胎盤幹細胞の脂肪細胞分化は、例えば、胎盤幹細胞を、脂肪細胞への分化を誘導する細胞培養条件下に置くことにより達成することができる。好ましい脂質生成培地は、MSCGM(Cambrex社)又は15%臍帯血清で補充されたDMEMを含む。一実施態様において、胎盤幹細胞は、脂肪組織生成誘導培地(Cambrex社)に供給されて、3日間(37℃、5%二酸化炭素)培養されて、脂肪組織生成維持培地(Cambrex社)の中で1〜3日間培養される。誘導/維持の完全な3サイクル後に、脂肪組織生成維持培地の中で、2〜3日おきに培地を交換しながら、細胞は、さらに7日間培養される。
胎盤幹細胞の軟骨形成分化は、例えば、胎盤幹細胞を、軟骨細胞への分化を誘導する細胞培地条件下に置くことにより達成することができる。好ましい軟骨形成培地は、MSCGM(Cambrex社)又は15%臍帯血清が補充されたDMEMを含む。一実施態様において、胎盤幹細胞は、無菌のポリプロピレンチューブ内に等分されて、遠心分離を行い(例えば、5分間150×gで)、さらに不完全軟骨形成培地(Cambrex社)の中で2回洗浄される。細胞は、0.01μg/mlのTGF-β-3を、約1-20×105細胞/mlの濃度で含む完全軟骨形成培地(Cambrex社)中で再懸濁される。他の実施態様において、胎盤幹細胞は、アスコルビン酸塩の有無に関係なく、外因性成長因子、例えば、GDF-5又は形質転換成長因子β3(TGF-beta3)と接触される。軟骨形成培地は、プロリンとグルタミン、ピルビン酸ナトリウム、デキサメタゾン、アスコルビン酸、及びインスリン/トランスペリン/セルレニウムを含むアミノ酸で補充することができる。軟骨形成培地は、水酸化ナトリウム及び/又はコラーゲンで補充することができる。胎盤幹細胞は、高密度又は低密度で培養されていてもよい。細胞は、好ましくは、血清の存在下で培養される。
胎盤幹細胞の骨形成分化は、例えば、胎盤幹細胞を、骨細胞への分化を誘導する細胞培養条件下に置くことにより達成することができる。好ましい骨形成培地は、MSCGM(Cambrex社)又は15%臍帯血清が補充されたDMEMを含み、0.1μMデキサメタゾン、0.05mMアスコルビン酸-2-リン酸塩、10mMベータグリセロリン酸塩を含む骨形成誘導培地(Cambrex社)が続けられる。他の実施態様において、胎盤幹細胞は、約10-7〜約10-9Mデキサメタゾン、約10-50μMアスコルビン酸塩リン酸塩(例えば、アスコルビン酸塩-2-リン酸塩)及び約10nM〜約10mM β-グリセロリン酸塩を含む培地(例えば、DMEM-低グルコース)の中で培養される。骨形成培地は、また、血清、1個以上の抗生剤/抗真菌剤、形質転換成長因子-ベータ(例えば、TGF-β1)及び/又は骨形態形成タンパク質(例えば、BMP-2、BMP-4、又はそれらの組み合わせ)を含むことができる。
分化は、カルシウムに特異的な染料、例えば、von Kossa染色、及び、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、オステオカルシン、骨シアロタンパク質及び/又はオステオポンチン遺伝子発現のRT/PCRによる探知を使用して評価することができる。
胎盤幹細胞のインスリン生成膵臓細胞への分化は、例えば、胎盤幹細胞を、膵臓細胞への分化を誘導する細胞培養条件下に置くことにより達成することができる。
膵臓細胞を形成する培地の一例は、塩基性線維芽細胞成長因子、10ng/ml;及び、形質転換成長因子β-1、2ng/mlで補充されたDMEM/20%CBSを含む。この培地は、50/50v/vでネスチン陽性のニューロン細胞培養からのならし倍地と結合される。ノックアウト血清代替は、CBSの代わりに使用することができる。細胞は、14〜28日間、3〜4日おきに供給しながら培養される。
分化は、例えば、インスリンタンパク質生成、又はRT/PCRによるインスリン遺伝子の発現に対して評価することにより確認することができる。胎盤幹細胞は、細胞がこのような特徴を1個以上示すとき、膵臓細胞に分化したものと考えられる。
胎盤幹細胞の筋肉組織で発生する(心原性)分化は、例えば、胎盤幹細胞を、心筋細胞に分化を誘導する細胞培養条件下に置くことにより達成することができる。好ましい心臓細胞培地は、レチノイン酸で補充されたDMEM/20%CBS、1μM;塩基性線維芽細胞成長因子、10ng/ml;及び、形質転換成長因子ベータ-1、2ng/ml;及び、内皮成長因子、100ng/mlを含む。ノックアウト血清代替(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)は、CBSの代わりに使用することができる。あるいは、胎盤幹細胞は、50ng/mlカルディオトロピン-1で補充されたDMEM/20%CBSの中で、24時間培養することができる。他の実施態様において、胎盤幹細胞は、10〜14日間培養することができる。タンパク質の無い培地中において5〜7日間、その後、例えば、1%臍帯血清で補充される1%HEPES緩衝液内においてヒトの心筋を均質化することで生成される、ヒト心筋抽出物で刺激される。
分化は、例えば、RT/PCRにより、又は細胞の目に見える拍動により心臓アクチン遺伝子の発現を示すことで確認することができる。胎盤幹細胞は、細胞がこのような特徴を1個以上示すとき、心臓細胞に分化したものと考えられる。
胎盤幹細胞は、保存することができる。すなわち、長期間の保存が可能となる条件、又は、例えばアポトーシス若しくは壊死などの細胞死を抑制する条件下に置くことができる。
胎盤幹細胞は、例えば、2005年12月25日付で出願された「胎盤幹細胞を回収して器官を保護する改良培地」と題された米国仮出願第60/754,969号に記述されたように、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤及び/又は酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む組成物を使用して保存することができる。一実施態様において、本発明は、幹細胞の集団を保全する方法を提供するが、該方法は、アポトーシス阻害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む幹細胞回収した組成物と前記幹細胞の集団とを接触させることを含み、ここで前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触しない幹細胞の集団と比較して、幹細胞の集団においてアポトーシスを低減させるか、防止するのに十分な時間、かつ十分な量で存在する。具体的な実施態様において、前記アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。他の具体的な実施態様において、前記アポトーシス阻害剤は、JNK阻害剤である。より具体的な実施態様において、前記JNK阻害剤は、前記幹細胞の分化又は分芽を調節しない。他の実施態様において、前記幹細胞回収した組成物は、分離された相で前記アポトーシス阻害剤及び前記酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む。他の実施態様において、幹細胞回収した該組成物は、前記アポトーシス阻害剤及び前記酸素運搬ペルフルオロカーボンをエマルジョン状で含む。他の実施態様において、該幹細胞回収した組成物は、追加に、レシチンなどの乳化剤を含む。他の実施態様において、前記アポトーシス阻害剤及び前記ペルフルオロカーボンは、幹細胞と接触するとき、約0℃〜約25℃の間にある。他のより具体的な実施態様において、前記アポトーシス阻害剤及び前記ペルフルオロカーボンは、幹細胞と接触するとき、約2℃〜約10℃の間、又は約2℃〜約5℃の間にある。他のより具体的な実施態様において、前記接触は、前記幹細胞の集団を運搬する間に達成される。他のより具体的な実施態様において、前記接触は、前記幹細胞の集団を冷凍及び解凍する間に達成される。
(5.7.1 胎盤幹細胞集団)
胎盤幹細胞の集団は、幹細胞集団の投与で治療を受けることが可能な任意の疾患、障害又は状態を治療することに使用される。本明細書において使用されているような「治療」とは、病気、障害又は状態、或るいはそれらの症侯やどのようなパラメーターに対する、治療、矯正、改善、痛症の節減、又は経時変化の低減をを含む。
胎盤幹細胞の単離された集団は、具体的な実施態様において、特異的な疾患や健康状態を治療するために自己又は異種酵素代替治療に使用することができ、特異的な疾患や健康状態は、テイサックス病、ニーマンピック病、ファブリー病、ゴーシェ病(例えば、グルコセルブロシダーゼ欠損症)、ハンター及びハーラー症候群、マロトーラミー症候群、フコシドーシス(フコシダーゼ欠損症))、バッテン病(CLN3)などのリソソーム蓄積症だけではなく、ガングリオシドーシス、ムコ多糖症、及び糖原病を含むが、これらに限定されるものではない。
また、胎盤幹細胞は重度の兔疫不全疾患を治療するために使用することができ、重度の複合免疫不全疾患には、免疫不全疾患(例えば、ウィスコットアルドリッチ症候群、重度ディジョージ症候群など)が含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、胎盤幹細胞を含む組成物又はそれからの生体分子を提供する。本発明の胎盤幹細胞は、任意の生理学的に許容し得る或いは医学的に許容し得る化合物、組成物又は研究や治療において使用するための装置と組み合わせることができる。
本発明の胎盤幹細胞の集団は、保存、例えば、後続の使用のために凍結保存することができる。幹細胞のなどの細胞の凍結保存方法は、当分野において周知である。胎盤幹細胞の集団は、個体に容易に投与可能な形態で調製される。例えば、本発明は、医療用として適切な容器内に収容されている胎盤幹細胞を提供する。そのような容器は、例えば、無菌のプラスチック製バッグ、フラスコ、瓶又は胎盤幹細胞の集団が容易に分注されることのできるその他の容器であってもよい。例えば、該容器は、血液バッグ又は他のプラスチック、受容体への液体の静脈投与に適した、医療用途において許容可能なバッグであってもよい。容器は、好ましくは、結合された幹細胞集団の凍結保存を可能とするものである。
凍結保存した胎盤幹細胞の集団は、単一ドナー由来の、又は多数のドナー由来の胎盤幹細胞を含むことができる。胎盤幹細胞の集団は、意図された受容体に完全にHLAがマッチングすることができ、又は部分的に若しくは完全にHLAがミスマッチングすることもある。
胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、生体内での使用のための医薬組成物に調製することができる。そのような医薬組成物は、生体内への投与のために医薬品として許容可能な運搬体、例えば、食塩水又は他の許可された生理的に許容可能な溶液中に胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団を含む。本発明の医薬組成物は、本明細書に記述された胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞類型のいずれでも含むことができる。該医薬組成物は、胎児、母親、又は胎児と母親の両方である胎盤幹細胞を含むことができる。本発明の医薬組成物は、さらに、単一個体又は単一胎盤から得た胎盤幹細胞、又は多数の個体又は胎盤から得た胎盤幹細胞を含むことができる。
注射剤として調製するとき、一実施態様において、本発明の医薬組成物は、約1.25%HSA及び約2.5%デキストランとを含む。細胞製品の投与に適した、他の注射製剤を使用することもできる。
本発明の胎盤幹細胞は、ならし倍地、すなわち幹細胞によって分泌されるか排泄された1個以上の生体分子を含む培地を生成するのに使用することができる。多様な実施態様において、ならし倍地は、胎盤幹細胞が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14以上の日数の間成長した培地を含むことができる。他の実施態様において、ならし倍地は、胎盤幹細胞がある少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%密集度、又は最大100%までの密集度まで成長した培地を含むことができる。そのようなならし倍地は、胎盤幹細胞又は他の種類の幹細胞の分離された集団の培養を維持させるために使用される。他の実施態様において、該ならし倍地は、胎盤幹細胞が成体細胞型に分化されてきた培地を含む。他の実施態様において、本発明のならし倍地は、胎盤幹細胞と非胎盤幹細胞が培養されてきた培地を含む。
本発明は、さらにまた、胎盤幹細胞又は胎盤幹細胞の集団を含む細胞間マトリックス、ハイドロゲル、骨格等を含む。
本発明の胎盤幹細胞は、天然細胞間マトリックス、例えば、羊膜物質などの胎盤生体材料上に播種することができる。そのような羊膜物質は、例えば、哺乳類の胎盤から直接切除された羊膜;固定されたり、又は熱処理された羊膜、実質的に乾燥した(すなわち<20%H2O)羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜及び絨毛膜などであり得る。その上に胎盤幹細胞を播種することのできる好ましい胎盤生体材料は、Haririによる米国特許出願第2004/0048796号に記載されている。
本発明の一部の実施態様において、製剤は、その場で重合反応を起こすことができるゲルを含む(例えば、米国特許出願第2002/0022676;Ansetheらの文献、J.Control Release,78(1-3):199-209(2002);Wangらの文献、Biomaterials、24(22):3969-80(2003)を参照)。
本発明の胎盤幹細胞又はそれらの共培養は、生体内で移植された3次元の骨組み又は骨格上に播種することができる。そのような骨組みは、1個以上の成長因子、細胞、薬又は組織形成を促進するか強化する、或いは本発明の実施を改善する他の成分のうちのいずれかと結合して、移植することができる。
他の実施態様において、胎盤幹細胞は、例えば、PGA、PLA、PCL共重合体若しくは混合物、又はヒアルロン酸などの生体に吸収される物質からなるマルチフィラメント糸で構成可能なフェルト上に播種したり、又はフェルトと接触することができる。
哺乳類の胎盤細胞は、成長促進遺伝子、すなわち、適切な条件下で、形質転換された細胞の成長を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む、任意の適切なベクターとともにトランスフェクションによって条件付きで不死化することができる。この結果、成長促進タンパク質の生成及び/又は活性は、外部因子によって調節可能である。好ましい実施態様において、成長促進遺伝子は、v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40ラージT抗原、ポリオーマラージT抗原、EIaアデノウイルス、又はヒトパピローマウイルスE7タンパク質などであるが、これらに限定されない、癌遺伝子である。
本発明の胎盤幹細胞は、アッセイにおいて使用され、培養条件、環境要因、分子(例えば、生体分子、小さな無機分子等)等の幹細胞分芽、増殖、及び/又は分化に対する影響を、そのような条件に曝露しない胎盤幹細胞と比較して測定することができる。
好ましい実施態様において、本発明の胎盤幹細胞は、分子と接触して、分芽、増殖又は分化における変化に対してアッセイされる。一実施態様において、例えば、本発明は、多数の胎盤幹細胞の分芽を調節する化合物を同定する方法を提供するが、該方法は、分芽を可能にする条件下において前記化合物と前記多数の幹細胞を付着させることを含み、ここで前記化合物と接触しない多数の幹細胞と比較して、前記化合物が、前記多数の幹細胞の分芽において検出できるほどの変化を惹起すれば、前記化合物は、胎盤幹細胞の分芽を調節する化合物として同定される。具体的な実施態様において、前記化合物は、分芽抑制剤として同定される。他の具体的な実施態様において、前記化合物は、分芽促進剤として同定される。
(6.1. 実施例1:胎盤幹細胞の培養)
胎盤幹細胞は、潅流によるか又は物理的崩壊、例えば、酵素による消化によって、分娩後の哺乳類の胎盤から得られる。該細胞は、以下を含む培養培地内で培養される:60%DMEM-LG(Gibco社)、40%MCDB-201(Sigma社)、2%ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone Laboratories)、1×インスリン-トランスフェリン-セレニウム(ITS)、1×リノール酸-ウシ血清-アルブミン(LA-BSA)、10-9Mデキサメタゾン(Sigma社)、10-4Mアスコルビン酸2-リン酸塩(Sigma社)、上皮成長因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems社)、血小板由来の成長因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems社)、及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシン。
胎盤潅流液からの胎盤幹細胞の培養は、次のようにして成立させることができる。Ficoll勾配遠心分離で得た細胞は、FNがコーティングされたT75フラスコ中に播種され、上記の通り、15mlの培養培地において50〜100×106細胞/フラスコで調製される。典型的に、5〜10フラスコが播種される。フラスコは、37℃で12〜18時間培養され、付着性細胞の付着を許可する。10mlの暖かいPBSは、それぞれのフラスコに添加されて懸濁状態の細胞を除去し、穏やかに混合される。15mLの培地は、その後に除去されて、15mLの新しい培養培地に取り替えられる。すべての培地は、培養開始後3〜4日おきに変えられる。後続の培養培地の交換は、培地の50%又は7.5mlが除去される間に達成される。
胎盤幹細胞の培養は、以下のように消化された胎盤組織から樹立される。潅流された胎盤は、無菌のペーパシート上に母体側が上方に向かうように置かれる。胎盤の母体側上に約0.5cmの表面層がブレードで擦り落とされ、ブレードは、約1×2×1cmの胎盤組織ブロックを除去するために使用される。この胎盤組織は、その後、約lmm3小片に細かく切られる。このような小片は、50mlファルコンチューブ内に回収されて、コラゲナーゼIA(2mg/ml、Sigma社)で30分間消化され、続いて、トリプシン-EDTA(0.25%、GIBCOBRL社)によって10分間、37℃の水槽の中で処理される。その結果溶液は、室温で10分間、400gで遠心分離されて、消化溶液が除去される。ペレットは、約10体積で、PBSとともに再懸濁されて(例えば、5mlペレットが45mlPBSとともに再懸濁される)、さらに、チューブは、室温で、10分間400gが遠心分離される。組織/細胞ペレットは、130mL培養培地の中で再懸濁され、細胞は、フィブロネクチンがコーティングされたT-75フラスコ当たり13mlで播種される。細胞は、5%CO2を含む湿気のある環境において37℃で培養される。胎盤幹細胞は、このステップにおいて選択的に凍結保存される。
凍結保存した細胞は、直ちに37℃の水槽内で解凍される。胎盤幹細胞は、直ちに冷凍容器から10mlの暖かい培地とともに除去され、15mlの無菌管に移動される。細胞は、400gで10分間室温で遠心分離を行う。細胞は、ゆっくりとピペットで移すことにより、10mlの暖かい培養培地内に再懸濁され、生存可能な細胞の総数は、トリパンブルー排除によって測定される。細胞は、その後、cm2当たり6000〜7000個細胞で、FNがコーティングされたフラスコ内に播種されて、上記の通りに調製される(T-75フラスコ当たり約5×105細胞)。細胞は、37℃、5%CO2及び90%湿度で培養される。細胞が75-85%の密集度に到逹したとき、すべての使用済みの培地は、フラスコから無菌状態で除去されて、廃棄される。3mlの0.25%トリプシン/EDTA(w/v)溶液が添加されて、細胞層を覆う。そして細胞は、37℃、5%CO2及び90%湿度で5分間培養される。フラスコは、1、2回軽く叩いて、細胞単離を促進する。細胞の95%より多い細胞が丸くなって分離されると、7mlの暖かい培養培地がそれぞれのT-75フラスコに添加され、溶液は、数回、細胞レイヤ上にピペッティングで分散される。
上記のように細胞を数えて、生存能力を測定した後、細胞は、1000RPMで5分間、室温で遠心分離を行う。細胞は、培養培地と共に1つのT-75フラスコから細胞ペレットをゆっくり再懸濁して、2個のFNがコーティングされたT-75フラスコ上に細胞を平らに平板培養することにより継代される。
(6.2.1 材料及び方法)
(6.2.1.1 胎盤幹細胞を含む胎盤細胞集団の単離)
胎盤細胞の他の集団は、正常な満期妊娠の胎盤から採取された。すべてのドナーは、研究目的のための彼らの胎盤の使用に対して、自筆で書かれた同意書を提供した。胎盤幹細胞は、以下の原料から得られた:(1)胎盤潅流液(胎盤血管系の潅流から);及び、(2)羊膜、(3)絨毛膜、(4)羊膜-絨毛膜プレート、及び(5)臍帯の酵素による消化。多様な胎盤組織は、無菌のPBS(Gibco-Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)において洗浄され、分離された無菌のペトリ皿上に置かれた。多様な組織は、無菌の外科用メスを使用して細かく切り刻まれ、50mLのファルコンコニカルチューブ内に置かれた。細かく切り刻まれた組織は、I×コラゲナーゼ(Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州)で20分間、37℃の水槽中で消化されて、遠心分離し、その後、0.25%トリプシン-EDTA(Gibco-Invitrogen社)で10分間、37℃の水槽中で消化した。多様な組織は、消化後に遠心分離をし、無菌のPBS(Gibco-Invitrogen社)で一回洗浄された。再構成された細胞は、2回ろ過されるが、一回は、100μm細胞フィルタで、もう一回は、30μmの分離フィルタでろ過され、残留細胞外マトリックス又は細胞残屑を除去した。
トリパンブルー排除法のマニュアルは、消化後に細胞数を計算し、細胞の生存能力評価するために採用された。細胞は、トリパンブルー染料(Sigma-Aldrich社)と1:1の比率で混合され、細胞は、血球計で読み取られた。
HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+である細胞が、特徴付けのために選択された。このような表現型を有する細胞は、2つのBecton-Dickinsonフローサイトメトリー、FACS Calibur及びFACS Aria(Becton-Dickinson社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国)によって同定されて、定量されて、特徴付けされた。多様な胎盤細胞は、100万個の細胞当たり約10μLの抗体の比で、30分間、室温で、振盪機上で染色された。以下の抗ヒト抗体が使用された:HLA-G(Serotec社、ローリー、ノースカロライナ州)、CD10(BD Immunocytometry systems、サンノゼ、カリフォルニア州)、CD44(BD Biosciences Pharmingen、サンノゼ、カリフォルニア州)、及びCD105(R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ州) に対するフルオレセインイソチオシアネート(FITC)が結合されたモノクローナル抗体;CD44、CD200、CD117、及びCD13(BD Biosciences Pharmingen)に対するフィコエリトリン(PE)が結合されたモノクローナル抗体;CD117(BD Biosciences Pharmingen)に対するフィコエリトリン-Cy5(PECy5)が結合されたストレプトアビジンとモノクローナル抗体;CD33及びCD10(BD Biosciences社)に対するフィコエリトリン-Cy7(PECy7)が結合されたモノクローナル抗体;CD38(BD Biosciences Pharmingen)に対するアロフィコシアニン(APC)が結合されたストレプトアビジンとモノクローナル抗体;及び、ビオチン化CD90(BD Biosciences Pharmingen)。培養後に、細胞は、一回洗浄され、結合されていない抗体を除去し、4%パラホルムアルデヒド(USB社、クリーブランド、オハイオ州)で、4℃、一晩中、固定した。翌日、細胞は、2回洗い、30μm分離フィルタを通じてろ過され、フローサイトメトリー上で駆動された。
抗マウス兔疫グロブリン抗体(BD Biosciences Pharmingen)で染色された試料は、陰性対照として使用され、光電管(PMTs)を調節するために使用された。抗ヒト抗体で一回染色された試料は、陽性対照として使用され、スペクトルの重複/補償を調節するために使用された。
ある培養に先立って、(潅流液、羊膜、又は絨毛膜から採取した)胎盤細胞の1つのセットは、7-アミノ-アクチノマイシンD(7AAD;BD Biosciences Pharmingen)及び対象とする表現型に対して特異的なモノクローナル抗体で染色された。細胞は、100万個細胞当たり10μLの抗体の割合で染色されて、振盪機上で室温で30分間培養された。次いで、この細胞は、BD FACS Aria上で対象とする表現型を発現する、生きている細胞に対して陽性に分類され、培養基中で平板培養された。分類された(対象とする集団)及び「あらゆる」(分類されていない)胎盤細胞集団は、比較のために平板培養された。細胞は、フィブロネクチン(Sigma-Aldrich社)がコーティングされた96ウェルプレート上で、表1に示された細胞密度(細胞/cm2)で平板培養された。細胞密度、並びに細胞が2倍で或いは3倍で平板培養されたかどうかが判定され、対象とする表現型を発現した細胞の数によって制御された。
FACSCaliburデータは、Flow Jo(Tree star社)で標準的なゲーティング技術を用いて解析された。BD FACSAriaデータは、FACSDivaソフトウェア(Becton-Dickinson社)を用いて解析された。FACS Ariaデータは、標準的なゲーティング技術だけではなく、ダブレット(doublet)を最小化する、ダブレット識別ゲーティング技術を用いて解析された。すべての結果は、マイクロソフトエクセルに収集されており、ここで、すべての値は、平均±標準偏差(数、平均標準誤差)で示されている。
(6.2.2.1 細胞生存能力)
消化後の生存能力は、トリパンブルー排除法のマニュアルを用いて評価された(図1)。多数の(羊膜、絨毛膜又は羊膜-絨毛膜プレートからの)消化された組織から得た細胞の平均生存能力は、約70%であった。羊膜は、74.35%±10.31%(n=6、SEM=4.21)の平均生存能力を有して、絨毛膜は、78.18%±12.65%(n=4、SEM=6.32)の平均生存能力を有して、羊膜-絨毛膜プレートは、69.05%±10.80%(n=4、SEM=5.40)の平均生存能力を有して、臍帯は、63.30%±20.13%(n=4、SEM=10.06)の平均生存能力を有した。消化過程を経ていない潅流からの細胞は、最高の平均生存能力、89.98±6.39%(n=5、SEM=2.86)を保有した。
胎盤細胞及び臍帯細胞の集団は、HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+細胞の数を測定するために解析された。BD FACSCaliburデータの解析から、羊膜、潅流液及び絨毛膜は、最大合計数のこのような細胞、それぞれ30.72±21.80細胞(n=4、SEM=10.90)、26.92±22.56細胞(n=3、SEM=13.02)、及び18.39±6.44細胞(n=2、SEM=4.55)を含むものと観察された(データ図示せず)。羊膜-絨毛膜プレート及び臍帯は、対象とする表現型を発現する、最も少ない合計数の細胞を、それぞれ、4.72±4.16細胞(n=3、SEM=2.40)と3.94±2.58細胞(n=3、SEM=1.49)を含んでいた(データ図示せず)。
HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+細胞は、それぞれの細胞原料から同定されて、定量された後に、細胞は、さらに、細胞表面標識HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200、及びCD105の発現に対して解析され、特徴付けされた。
潅流液由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105、及びCD13に対して陽性であった(図4)。潅流液由来の細胞に対するそれぞれの標識の平均発現は、以下のとおりである:細胞の37.15%±38.55%(n=4、SEM=19.28)は、HLA-Gを発現した;細胞の36.37%±21.98%(n=7、SEM=8.31)は、CD33を発現した;細胞の39.39%±39.91%(n=4、SEM=19.96)は、CD117を発現した;細胞の54.97%±33.08%(n=4、SEM=16.54)は、CD10を発現した;細胞の36.79%±11.42%(n=4、SEM=5.71)は、CD44を発現した;細胞の41.83%±19.42%(n=3、SEM=11.21)は、CD200を発現した;細胞の74.25%±26.74%(n=3、SEM=15.44)は、CD90を発現した;細胞の35.10%±23.10%(n=3、SEM=13.34)は、CD38を発現した;細胞の22.87%±6.87%(n=3、SEM=3.97)は、CD105を発現した;そして、細胞の25.49%±9.84%(n=3、SEM=5.68)は、CD13を発現した。
羊膜由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105、及びCD13に対して陽性であった(図5)。羊膜由来の細胞に対するそれぞれの標識の平均発現は、以下のとおりである:細胞の57.27%±41.11%(n=3、SEM=23.73)は、HLA-Gを発現した;細胞の16.23%±15.81%(n=6、SEM=6.46)は、CD33を発現した;細胞の62.32%±37.89%(n=3、SEM=21.87)は、CD117を発現した;細胞の9.71%±13.73%(n=3、SEM=7.92)は、CD10を発現した;細胞の27.03%±22.65%(n=3、SEM=13.08)は、CD44を発現した;細胞の6.42%±0.88%(n=2、SEM=0.62)は、CD200を発現した;細胞の57.61%±22.10%(n=2、SEM=15.63)は、CD90を発現した;細胞の63.76%±4.40%(n=2、SEM=3.11)は、CD38を発現した;細胞の20.27%±5.88%(n=2、SEM=4.16)は、CD105を発現した;そして、細胞の54.37%±13.29%(n=2、SEM=9.40)は、CD13を発現した。
絨毛膜由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、及びCD13に対して陽性であったが、一方、CD33及びCD105に対する発現は、変化した(図6)。絨毛膜細胞に対するそれぞれの標識の平均発現は、以下のとおりである:細胞の53.25%±32.87%(n=3、SEM=18.98)は、HLA-Gを発現した;細胞の15.44%±11.17%(n=6、SEM=4.56)は、CD33を発現した;細胞の70.76%±11.87%(n=3、SEM=6.86)は、CD117を発現した;細胞の35.84%±25.96%(n=3、SEM=14.99)は、CD10を発現した;細胞の28.76%±6.09%(n=3、SEM=3.52)は、CD44を発現した;細胞の29.20%±9.47%(n=2、SEM=6.70)は、CD200を発現した;細胞の54.88%±0.17%(n=2、SEM=0.12)は、CD90を発現した;細胞の68.63%±44.37%(n=2、SEM=31.37)は、CD38を発現した;細胞の23.81%±33.67%(n=2、SEM=23.81)は、CD105を発現した;そして、細胞の53.16%±62.70%(n=2、SEM=44.34)は、CD13を発現した。
羊膜-絨毛膜プレート由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105、及びCD13に対して陽性であった(図7)。羊膜-絨毛膜プレート由来の細胞に対するそれぞれの標識の平均発現は、以下のとおりである:細胞の78.52%±13.13%(n=2、SEM=9.29)は、HLA-Gを発現した;細胞の38.33%±15.74%(n=5、SEM=7.04)は、CD33を発現した;細胞の69.56%±26.41%(n=2、SEM=I8.67)は、CD117を発現した;細胞の42.44%±53.12%(n=2、SEM=37.56)は、CD10を発現した;細胞の32.47%±31.78%(n=2、SEM=22.47)は、CD44を発現した;細胞の5.56%(n=l)は、CD200を発現した;細胞の83.33%(n=l)は、CD90を発現した;細胞の83.52%(n=l)は、CD38を発現した;細胞の7.25%(n=l)は、CD105を発現した;そして、細胞の81.16%(n=l)は、CD13を発現した。
臍帯由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD33、CD90、CD38、CD105、及びCDl3に対して陽性であったが、一方、CD117、CD10、CD44、及びCD200の発現は、変化した(図8)。臍帯由来の細胞に対するそれぞれの標識の平均発現は、以下のとおりである:細胞の62.50%±53.03%(n=2、SEM=37.50)は、HLA-Gを発現した;細胞の25.67%±11.28%(n=5、SEM=5.04)は、CD33を発現した;細胞の44.45%±62.85%(n=2、SEM=44.45)は、CD117を発現した;細胞の8.33%±11.79%(n=2、SEM=8.33)は、CD10を発現した;細胞の21.43%±30.30%(n=2、SEM=21.43)は、CD44を発現した;細胞の0.0%(n=l)は、CD200を発現した;細胞の81.25%(n=l)は、CD90を発現した;細胞の64.29%(n=l)は、CD38を発現した;細胞の6.25%(n=l)は、CD105を発現した;そして、細胞の50.0%(n=l)は、CDl3を発現した。
すべての標識の発現平均の要約は、図9に示した。
HLA ABC、CD45、CD34、及びCD133のもっとも高い百分率を発現した胎盤細胞の3つの異なる集団(潅流液、羊膜及び絨毛膜由来の細胞)は、このような標識に対する抗体及び7AADで染色された。3つの集団は、対象とする表現型を発現する生きている細胞に対して陽性に分類された。BD FACS Aria分類の結果は、表2に示されている。
この実施例は、胎盤幹細胞の例示的な細胞表面標識プロファイルを示す。
培養培地の内で酵素による消化から得られる胎盤幹細胞又は臍帯幹細胞は、2mL 2%FBS-PBSを添加することにより一回洗浄し、400gで5分間遠心分離を行った。上澄みは移されて、ペレットは、100-200μL 2%FBS-PBS中で再懸濁された。4個のチューブは、BD(商標)CompBeads(触媒番号:Cat#552843)と共に100μlの2%FBS-PBSをそれぞれのチューブに添加して、BD(商標)CompBeads陰性対照の1つの完全な液滴(約60μl)と、BD(商標)CompBeads抗マウスビーズの一滴を、それぞれのチューブに添加し、掻き混ぜて調製した。BD(商標)CompBeadsの4つのチューブには、以下の抗体が添加される:
1つの表現型(CD200+、CD105+、CD10+、CD34-)は、多数のそのような分析において一致するように示された。このような表現型は、付加的に、CD90、CD44、HLA ABC(弱)、β-2-マイクログロブリン(弱)、及びサイトケラチンKに対して陽性であり、HLA DR、DQ、DP、CD117、CD133、及びCD45に対して陰性である。
幹細胞の生着能力の潜在標識である、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)活性は、StemCell Technologies社からのALDEFLUOR(登録商標)アッセイキットを用いて測定することができる。典型的に、より初生の、未分化幹細胞は、さらに分化された幹細胞よりも低いALDH活性を示す。
アッセイは、ALDEFLUOR(登録商標)、蛍光ALDH基材(Aldagen社、ダラム、ノースカロライナ州)を利用する。製造者のプロトコルは、以下のとおりである。乾燥したALDEFLUOR(登録商標)反応物は、安定的でかつ不活性の形態で提供される。ALDEFLUOR(登録商標)は、乾燥した化合物をジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解し、2N HClを添加することで活性化されて、細胞に直ちに添加される。また、対照チューブは、細胞を、ALDHの特定的な抑制剤であるALDEFLUOR(登録商標)plusDEABと結合することで樹立された。
分析された細胞は、羊膜-絨毛膜プレートからの4つの臍帯幹細胞株と3つの胎盤幹細胞株、骨髄由来の間葉系幹細胞株(BM-MSC)、脂肪由来の幹細胞株(ADSC)、ヒトの絨毛を有した栄養膜細胞株(HVT)、及び臍帯血から精製されたCD34+幹細胞を含む。
本実施例は、潅流によって胎盤幹細胞を回収する1つの方法を示す。
分娩後の胎盤は、生まれた後24時間以内に獲得される。臍帯は、胎盤本体の約3から4インチの部位に臍帯クランプで締められ、臍帯は、クランプより上部を切り出される。臍帯は、廃棄されるか、又は、例えば臍帯幹細胞を回収するために、及び/又は生体材料の生成のために臍帯膜を処理に供するために処理することができる。過剰の羊膜と絨毛膜は胎盤から切り出され、胎盤の端部周辺に約1/4インチを残す。トリミングされた材料は、廃棄される。
潅流装置や蠕動ポンプに接続されたプラスチックチューブは、それぞれの胎盤動脈の中に挿入される。250mL回収バッグに接続されたプラスチックチューブは、胎盤静脈の中に挿入される。チューブは、所定の位置にテープで貼り付けられる。
胎盤細胞は、その後に直ぐに培養されて、胎盤幹細胞を単離するか、或いは後続の使用のために凍結保存される。
(6.6.1 ニューロンへの分化誘導)
胎盤幹細胞のニューロン分化は、以下のようにして達成することができる:
1.胎盤幹細胞は、DMEM/20%FBSと1mM β-メルカプトエタノールを含む誘導前の培地の中で、24時間、育てられる。
2.誘導前の培地は除去され、細胞は、PBSで洗浄される。
3.DMEMと1-10mM β-メルカプトエタノールを含むニューロン神経誘導培地が、細胞に添加される。或いは、DMEM/2% DMSO/200μMブチル化ヒドロキシアニソールを含む誘導培地を使用することができる。
4.ある実施態様において、形態及び分子の変化は、無血清培地とβ-メルカプトエタノールに露出されてから60分以内に発生することができる。
RT/PCRは、例えば、神経成長因子レセプタ及びニューロフィラメント重鎖遺伝子の発現を評価するために使用することができる。
羊膜の酵素による消化由来の胎盤幹細胞のいくつかの培養は、50〜70%密集度で、(1)2%FCSと共にDMEM/MCDB-201、0.5%ハイドロコルチゾン、0.5mMイソブチルメチルキサンチン(IBMX)、60μMインドメタシン;又は、(2)2%FCSと0.5%リノール酸と共に、DMEM/MCDB-201を含む培地内で誘導される。細胞は、形態学的変化に対して検査され;3-7日間後に、油滴が現われた。分化は、脂質生成に関連した特定の遺伝子、すなわちPPAR-γ2、aP-2、リポタンパク質リパーゼ、及びオステオポンチンの発現を調査する、定量的なリアルタイムPCRによって評価された。胎盤幹細胞の2つの培養は、それぞれ、脂肪細胞に特異的な遺伝子の発現において、6.5倍及び24.3倍の増加を示した。4つの他の培養は、脂質生成誘導後、PPAR-γ2の発現において穏やかな増加(1.5〜2.0倍)を示した。
1.胎盤幹細胞は、MSCGM(Cambrex社)又は15%臍帯血清で補充されたDMEMの中で育てられる。
2.3つの誘導/維持サイクルが使用される。それぞれのサイクルは、脂肪組織生成誘導培地(Cambrex社)で胎盤幹細胞を供給することと、細胞を、3日間(37℃、5%CO2で)培養することを含み、脂肪組織生成維持培地(Cambrex社)中での1〜3日間の培養がその後に伴われる。使用可能な他の誘導培地は、1μMデキサメタゾン、0.2mMインドメタシン、0.01mg/mlインスリン、0.5mM IBMX、DMEM-高グルコース、FBS、及び抗生物質を含む。
3.誘導/維持の完全な3サイクル後に、細胞は、脂肪組織生成維持培地中位でさらに7日間培養され、培地は、2〜3日おきに交換される。
4.脂質生成の特徴は、多数の細胞質内脂質小胞の発達であり、これは親油性ステインオイルレッドOを使用して容易に観察されることができる。タンパク質遺伝子と結合するリパーゼ及び/又は脂肪酸の発現はRT/PCRによって脂肪細胞に分化され始める胎盤幹細胞の中で確認される。
骨形成培地は、185mLカムブレキス(Cambrex社)分化基礎培地-骨形成及びSingleQuots(デキサメタゾン、1-グルタミン、アスコルビン酸塩、ペン/ストレフ、MCGS、及びベータグリセロリン酸塩のうちのそれぞれ1つ)から調製された。潅流液からの胎盤幹細胞は、組織培養表面積のcm2当たり約3×103細胞で組織培養面積cm2当たり0.2〜0.3mLのMSCGMの中で平板培養された。典型的に、すべての細胞は、37℃、5%CO2の中のMSCGMにおいて、4〜24時間、培養表面に付着した。骨形成分化は、培地を骨形成分化培地に取り替えることによって誘導された。細胞形態は、付着性胎盤幹細胞の典型的な紡錘状の外観から、無機化によって達成される立方形外観に変化し始めた。一部の細胞は、分化の間、組織培養表面から離層される。
1.胎盤幹細胞の付着性培養は、MSCGM(Cambrex社)又は15%臍帯血清で補充されたDMEMの中で培養される。
2.培養は、組織培養フラスコ内で24時間培養される。
3.骨形成分化は、MSCGMを、0.1μMデキサメタゾン、0.05mMアスコルビン酸-2-リン酸塩、10mMベータグリセロリン酸塩を含む骨形成誘導培地(Cambrex社)で取り替えることで誘導される。
4.細胞は、2〜3週間、骨形成誘導培地で、3〜4日おきに供給される。
5.アルカリ性ホスファターゼ及びオステオポンチン遺伝子の発現に対するRT/PCR及びカルシウムに特異的な染料を用いて、分化はアッセイされる。
膵臓の分化は、以下のようにして達成される:
1.胎盤幹細胞は、形質転換成長因子β-1、2ng/mlと 塩基性線維芽細胞成長因子10ng/mlで補充されたDMEM/20%CBSの中で培養される。ノックアウト血清代替は、CBSの代わりに使用することができる。
2.ネスチン-陽性ニューロン細胞培養からのならし倍地は、50/50濃度で培地に添加される。
3.細胞は、14-28日間培養されて、3〜4日おきに再度供給する。
4.分化は、RT/PCRによってインスリンタンパク質又はインスリン遺伝子発現に対してアッセイすることによって特徴付けされる。
筋肉組織で発生する(心原性)分化は、以下のようにして達成される:
1.胎盤幹細胞は、レチノイン酸1μM;塩基性線維芽細胞成長因子10ng/ml;及び形質転換成長因子ベータ-1、2ng/ml;そして、上皮成長因子100ng/mlで補充されたDMEM/20%CBSの中で培養される。ノックアウト血清代替(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)は、CBSの代わりに使用することができる。
2.或いは、胎盤幹細胞は、50ng/mlカルディオトロピン-1で補充されたDMEM/20%CBSの中で、24時間培養される。
3.或いは、胎盤幹細胞は、タンパク質の無い培地中において5〜7日間培養され、その後、ヒト心筋抽出物で刺激される。心筋抽出物は、1%臍帯血清で補充される1%HEPES緩衝液内において1gmのヒトの心筋を均質化することにより生成される。懸濁液は、60分間培養されて、その後、遠心分離して、上澄みが回収される。
4.細胞は、10-14日間培養され、3〜4日おきに供給する。
5.分化は、RT/PCRによる心臓アクチン遺伝子の発現を示すことによって確認される。
(6.6.6.1 一般的な方法)
胎盤幹細胞の軟骨形成分化は、一般に、以下のようにして達成される:
1.胎盤幹細胞は、15%臍帯血清で補充されたDMEM又はMSCGM(Cambrex社)の中で維持される。
2.胎盤幹細胞は、無菌のポリプロピレンチューブ内に等分される。細胞は、(5分間、150×gで)遠心分離を行い、不完全軟骨形成培地(Cambrex社)の中で2回洗浄される。
3.最後の洗浄後に、細胞は、0.01μ/mlのTGF-β-3を、約5×10(5)細胞/mlの濃度で含む完全軟骨形成培地(Cambrex社)中で再懸濁される。
4.0.5mlの細胞は、15mlのポリプロピレン培養チューブ内に等分される。細胞は、5分間、150×gでペレット化される。ペレットは、培地中にそのまま残される。
5.緩くキャッピングされたチューブは、24時間、5%CO2、37℃で培養される。
6.細胞ペレットは、新しく調製された完全軟骨形成培地で、2〜3日おきに供給される。
7.ペレットは、培地において毎日低速で撹拌されることで、維持されて、再懸濁される。
8.軟骨形成細胞ペレットは、培養状態で14〜28日間後に採取される。
9.軟骨形成は、例えば、アルシアンブルー細胞化学的染色によって確認されるように、コラーゲン2及び/又はコラーゲン9遺伝子の発現及び/又は軟骨マトリックス酸粘液多糖質の生成をRT/PCRで確認することで、かつ/又は細胞形態を評価する、好酸性グラウンド基材の生成有無の観察によって特徴付けされる。
本実施例は、軟骨形成細胞への胎盤幹細胞の分化とそのような細胞から軟骨様組織の増殖を示す。
軟骨は、神経分布のない無血管性、無血性組織である。軟骨は、低い軟骨細胞密度(<5%)を有するが、このような細胞は、それらのまわりに細胞外マトリックスを維持するのに驚くほど効果的である。軟骨の3つの主要形態は、身体において以下のように存在する:(1)関節において関節を滑らかにすることを促進する関節軟骨;(2)例えば、半月板と椎間板において衝撃吸収をする線維軟骨;及び、(3)例えば、鼻や耳などにおける解剖学上の構造を提供する弾性軟骨。3つのすべての類型の軟骨は、生体化学的構造において類似している。
AC61665、P3(継代3)及びAC63919、P5に指定された2つの胎盤幹細胞株と、UC67249、P2及びUC67477、P3に指定された2つの臍帯幹細胞株は、以下に略述された研究に使用された。ヒトの間葉系幹細胞(MSC)は、陽性対照として使用され、骨肉腫細胞株、MC3T3及びヒドの皮膚線維芽細胞(HDF)は、陰性対照として使用された。
(実験1):
軟骨形成研究は、次の3つの主な目標を果たすために計画された:(1)胎盤と臍帯幹細胞が分化して、軟骨組織を形成することができるかどうかを示すこと;(2)胎盤と臍帯幹細胞が、機能的に軟骨細胞へと分化することができるかどうかを示すこと;及び、(3)対照細胞株を評価することにより幹細胞から得られた結果を確認すること。
実験1の結果に基づいて、2つの胎盤幹細胞と2つの臍帯幹細胞株の軟骨形成分化能力を分析するためのより具体的な研究が計画された。アルシアンブルー組織学的検査に加え、細胞は、またサイナスレッドで染色され、これは、類型IIコラーゲンに対して特異的である。誘導培地の有無に関係なく、多数のペレットが、それぞれの細胞株に対して作成された。
28日の期間に、軟骨組織の特性であるマトリックスの生成が増強されたことにより、細胞密度は減少した。
このような研究は、胎盤と臍帯幹細胞が、軟骨形成の経路に沿って分化することができ、軟骨組織を形成するように容易に誘導されることを確認する。初期の観察は、そのような幹細胞は、軟骨組織の形成に対し、MSCにとって好ましいことを示す。
培養状態の胎盤付着性幹細胞は、約5分間、37℃でトリプシン化され、軽く叩いて培養皿から緩くなる。10%FBSは、培養に添加されて、トリプシン化処理を中断する。細胞は、約5mLの培地内で約mL当たり1×104細胞で希釈される。複数チャンネルのマイクロピペットからの滴り(一滴であるか又は滴りである)は、100mLペトリ皿の蓋の内側に位置される。蓋は、注意しながらひっくり返して、皿底の上部に位置され、これは、約25mlの無菌PBSを含んで、皿の雰囲気内で水気含量を維持する。細胞は、6〜7日間育てられる。
本実施例は、酵素消化による胎盤幹細胞の規模が大きくなった単離を示す。
約10グラムの胎盤組織(羊膜と絨毛膜)が得られて、浸軟され、約30mlの全体積の中で、約30分間、37℃で、同じ体積のコラゲナーゼA(1mg/ml)(Sigma社)とトリプシン-EDTA(0.25%)(Gibco-BRL)を用いて消化される。消化によって解放された細胞は、培養培地で3回洗浄され、4つのT-225フラスコ内に分配されて、実施例1に記載されているように培養される。胎盤幹細胞の収率は、10g出発物質当たり約4×108と5×108細胞の間である。継代3で特徴付けされた細胞は、主に、CD10+、CD90+、CD105+、CD200+、CD34+、及びCD45-である。
この実施例は、胎盤幹細胞の単離と冷凍された幹細胞に基づく製品の生成を示す。
要約:胎盤組織は、切除して消化され、初代培養と増殖培養がその後に伴われ、多くの細胞量を生成する増殖された細胞製品を形成する。細胞は、二段重ねの細胞バンク内に保存され、冷凍細胞製品として区分される。単一ドナー胎盤由来のすべての細胞量は、1つのロットと定義され、専用のルーム及びクラス100層流フード(Class100 laminar flow hood)の中で無菌技術を用いて、1つの胎盤ロットを同時に処理した。細胞製品は、CD105+、CD200+、CD10+及びCD34-であると定義され、正常な核型を有し、母親細胞の含量がないか、実質的に含まない。
組織分解と消化:胎盤は、放出後に24時間以内に得られる。胎盤組織は、羊膜、羊膜と絨毛膜の組み合わせ、又は絨毛膜から得られる。組織は、約1mmの大きさの小片に細かく切り刻まれる。細かく切り刻まれた組織は、37℃で1時間、lmg/mlコラゲナーゼIAの中で消化され、その後、37℃で30分間、トリプシン-EDTAで処理される。PBSにおいて5%FBSの中で3回洗浄された後、組織は、培養培地に再懸濁される。
セルファクトリ(NUNC(商標))は、10分間、5%CO2を含む空気の中において50ml/分/トレイで、無菌のフィルタを通じて処理され、37℃に維持されかつ5%CO2を含む加湿インキュベーター内で暖かくなる。細胞シードは、トリパンブルーと共に血球計で計算されて、細胞数、生存能力、継代回数、及び倍加の累積数が記録される。細胞は、培養培地中において約2.3×lO4細胞/mlで懸濁され、110ml/トレイは、セルファクトリにおいて播種される。培養後3〜4日目に、そしてまた5〜6日目に、培養培地は除去されて、新たな培地と交換されて、空気中の5%CO2と共にまた他の処置が伴われる。細胞が、約105細胞/cm2に逹するとき、細胞は、トリプシン-EDTAで採取され、PBSの中で2%FBSと共に不活化される。細胞は、その後、遠心分離して、培養培地中に再懸濁される。
単一ドナーの胎盤由来のすべての細胞量を「ロット」と定義する。細胞は、増殖培養の間に8継代と30倍加に対して、正常な成長、核型、及び細胞表面標識表現型を維持した。このような限界が与えられた状態で、用量は、5継代及び約20倍加からの細胞を含む。同量の細胞の供給を生成するため、単一ロットは、培養状態で増殖され、2段重ねの細胞バンクと冷凍量内に貯蔵される。特に、0(ゼロ)倍加を経った継代0細胞と定義される、初代培養から採取された細胞は、増殖培養を開始するために使用される。最初継代の後、約4つの倍加が起き、細胞は、マスタセルバンク(MCB)中で冷凍される。MCBからのバイアルは、追加的な増殖培養を播種するために使用される。MCBから解凍された細胞の2つの追加的な継代の後、約12回の累積する倍加の間、細胞は、ワーキングセルバンク(WCB)において冷凍される。WCBからのバイアルは、他の2つの継代に対して増殖培養を播種するために使用され、その結果として、それぞれの量で冷凍された、約20個の倍加で継代5細胞が形成される。
細胞の冷凍された容器は、封止されたビニールバッグの中に仕込まれ、37℃の水浴中に入れられる。容器は、内容物が小さな氷小片を除いてすべて溶解するまで穏やかに回転される。容器は、封止されたビニールバッグから除去されて、約10倍の体積の培養培地を、穏やかに混合しながら、ゆっくり細胞に添加される。試料は、血球計で計算され、増殖培養に播種される。
細胞の冷凍容器は、乾燥窒素容器において投与サイトに移動される。投与の前に、容器は、封止されたビニールバッグ中に仕込まれ、37℃で水浴に供する。容器は、内容物が小さな氷小片を除いて溶解するまでに穏やかに回転されている。容器は、封止されたビニールバッグから除去されて、同じ体積の2.5%HSA/5%デキストランが添加される。細胞は、これ以上の洗浄することなく、注入される。
母体血液試料は、すべてのドナー胎盤を同伴する。試料は、B型肝炎コア抗体と表面抗原、C型肝炎ウイルス抗体と核酸、そしてHIV I及びII抗体と核酸に対してスクリーニングされる。胎盤処理と初代培養は、テスト結果を受領する前に始まるが、すべてのウイルスに対して陰性とテストされた母体血液試料と関連の胎盤に対してのみ続けられる。もし、ドナーがどのような病原体に対して1つでも陽性である場合、ロットは、拒絶される。また、表3に示されたテストは、MCB、WCB及びWCBのバイアル由来の細胞量の物質の試料に対して達成される。ロットは、すべての条件が満足されるときにだけ、放出される。
細胞は、PBS内の1%パラホルムアルデヒド(PFA)の中で20分間放置されて、染色されるまでに(最長1週間)冷蔵庫内に貯蔵される。細胞は、PBS(染色緩衝物)中の2%FBS、0.05%アジド化ナトリウムで洗浄され、その後、染色緩衝物内に再懸濁される。細胞は、次の抗体結合体で染色される:CD105-FITC、CD200-PE、CD34-PECy7、CD10-APC。細胞は、また、アイソタイプ対照で染色される。30分間の培養後、細胞は、洗浄されて、染色緩衝物で再懸濁され、フローサイトメトリーにて分析される。アイソタイプ対照に比較して、増加された蛍光性を有する細胞は、標識に対して陽性と判定される。
羊膜-絨毛膜(AC)と臍帯由来(UC)の胎盤幹細胞からの遺伝子発現パターンは、最終的に分化されるものと思われる多能性骨髄由来の間葉系幹細胞(BM)および皮膚線維芽細胞(DF)の遺伝子発現パターンに比較される。細胞は、1回のみの継代、中程度の回数の継代及び複数回の継代(老衰期時まで含んで)で成長させられた。結果は、集団倍加の数は、遺伝子発現において主な影響を持つことが示された。遺伝子の一セットは、ACとUCにおいて上方調節されて、またBMとDFでは下方調節されるか或いは調節されず、継代の回数に関係なく、発現するものと確認された。胎盤幹細胞又は臍帯幹細胞に特異的な遺伝子のこのようなセットは、母系-胎仔免疫耐性に関連するCD200である兔疫グロブリン様表面タンパク質と上皮細胞に関する細胞―細胞付着タンパク質と細胞骨格の数をコードする。胎盤幹細胞と臍帯幹細胞は、以下、本実施例において集合的にAU/UC幹細胞に言及され、分析された。
(6.10.1.1 細胞と細胞培養)
BM(Cat#PT-2501)とDF(Cat#CC-2511)は、Cambrex社から購入された。AC及びUCは、継代0組織の培養フラスコに由来したものである。フラスコの中のAC及びUCは、2063919に設計されたドナー胎盤から消化によって得られた。T-75培養フラスコは、6000細胞/cm2で播種され、細胞は、融合されるとき、継代された。集団倍加は、トリパンブルー細胞数から推定された。培養は、3,11-14、及び24-38集団倍加の後に遺伝子発現に対して分析された。
細胞溶解(単離)前にトリプシン化された1つの培養を除いて、細胞は、それらの組織培養フラスコから直接溶解(単離)される。全体RNAは、QIAGEN社のRneasy キットで単離した。RNA強度と濃度は、Agilent2100 Bioanalyzerで測定された。それぞれの培養から全体RNAの10グラムは、Affymetrix GENECHIP(登録商標)platform上で交配された。全体RNAはラベリングされたcRNAに転換され、製造者方法に従ってオリゴヘキサン塩ヒトゲノムUl33A 2.0配列にハイブリダイズされた。映像ファイルはAffymetrix MAS5.0ソフトウェアの処理に供し、Agilent GeneSpring7.3ソフトウェアに標準化され、分析された。
(6.10.2. BM-MSC、AC/UC幹細胞及びDFの選択、マイクロアレイ分析における培養時間-点数)
AC/UC幹細胞に唯一の遺伝子発現パターンを樹立するために、2つの幹細胞株であるAC(6)とUC(6)がBM-MSCとDFと平行に培養された。細胞起源に起因する遺伝子発現プロファイルを確認することを極大化するために、そして、外因性影響を最小化するために、すべての細胞は、同じ培地内において生育されて、播種され、同じ基準で第2次培養された。いずれが最初になるか関係なく、細胞は、3つの集団倍加、11-14の倍加、又は35の倍加或いは老衰期の後に採取された。AC/UC幹細胞の中で発現が培養時間によって変わらなく、BMとDFに関して上方調節される遺伝子は、AC/UC幹細胞に特異的な遺伝子に対する候補である。
マイクロアレイ分析は、遺伝子発現のパターンを同定し、階層的クラスタリング(hierarchical clustering)(HC)は、第1の次元で遺伝子と、第2の次元で他の条件(他のRNA試料)である2つの次元の関係において類似点を見つけることを試みる。本実験で使用されたジーンチップは、22,000より多い(「すべての遺伝子リスト」と見なされる)プローブセットを含んだが、このようなセットの多数は、どのような条件下でも発現しない遺伝子に信号を送る。すべての遺伝子リストを縮小するために、すべての試料において低いレベル(250未満の未処理数値)で発現したり発現しない遺伝子は除去されて、8,215個の遺伝子のリストを得た。
8215個の遺伝子の遺伝子発現パターンは、GeneSpringにおいて株グラフの調査を使用して現われた(図11)。x軸は12個の実験条件を示し、y軸は標準化されたプロブセットの発現数値をログスケールで表した。y軸は10,000倍に及んで、非常に低いレベルで発現したり発現しない遺伝子は、0.01値に決定される。基本的に、平準化された数値は、1と決定される。それぞれの株は、単一遺伝子(実際、遺伝子セット、いくつかの遺伝子は、多数のプロブセットを有する)を示し、単一色としてすべての12個の条件を捜し出す。熱地図(heatmap)に対して記載されるように、色は相対的な発現レベルを表現するが、、カラーリングパターンは、1つの条件を選択することで測定される。AC-03は、図11における選択された条件である。標準化された数値に関連して上方調節された遺伝子は、ソフトウェアにより赤い色で現われて、下方調節されたものは、青色で現われる。AC-03からUC-11の間で明白な上向きであって、下向きで向けるスパイクは多くの遺伝子がこのような条件にかけてお互いに違うように発現されるということを表す。AC-03とUC-03間で色パターンにおける顕著な類似性は、これらの2つの試料で多くの同じ遺伝子が上向き又は下方調節されることを示す。平行した線部分は、遺伝子の発現レベルが、多数の条件にわたって変わらないということを表す。これは、UC-36、UC-38、及びUC-38-Tを比較することにより、もっとも注目すべきことである。UC-36とUC-38-Tとの間には明白なスパイクはないものの、多数の赤い株が、標準化数値1よりも低いという微妙な傾向がある。これは、AC-03とUC-03で上方調節されたこのような遺伝子が、後続の培養において下方調節されることを示す。UC-38とUC-38-Tとの間で発現パターンが類似するという事実は、RNA単離の直前にトリプシン化する細胞が、ただ遺伝子発現にほとんど影響を与えないということを示す。
すべてのAC/UC試料を通して一定して残り、かつBM及びDFで下方調節される遺伝子は、AC/UC幹細胞に特異的なものと考えられる。2つのフィルタリング方法は、結合されて、58個のAC/UC幹細胞に特異的な遺伝子を創造した(表4)。
胎盤幹細胞に特異的であり、骨髄由来の間葉細胞と区別可能な発現パターンが確認された。作用的に、このパターンは、すべてのBMとDF試料に関連のすべての胎盤幹細胞試料で過量発現される、46個の遺伝子を含む。
実験計画は、培養状態で短い、培地そして長時間の期間に培養された細胞を比較した。AC及びUC細胞に対して、それぞれの培養期間は、差分的に発現された遺伝子の特徴的なセットを有する。短い期間又は初期時期(AC-03及びUC-03)の間の200個の上方調節された遺伝子が8回の集団倍加後に平均に戻る。理論に係わらず、このような初期状態の遺伝子の発現パターンは、自然胎盤環境の中にいる限り、AC及びUCの発現プロファイルに似ているようである。このような細胞が活動的に分裂しない胎盤では、それらは栄養素を代謝し、それらの間で信号を伝達し、それらの位置を細胞外の環境をリモデリングすることで確保している。
8個の遺伝子は、細胞と細胞との間の接触に係わるタンパク質をコードし、この中の3個(DSC3、DSG2、及びPKP2)は、ケラチン18とケラチン8などの細胞中間フィラメント細胞骨格タンパク質に付着した細胞内接合付着斑で局部化される。細胞間の固い接合は、上皮と内皮成長細胞の特徴であり、線維芽細胞と典型的に関連されてはいない。表3は、全体46個のうち、特徴的な上皮細胞を有する16個の遺伝子について記載している。胎盤幹細胞は、一般的に線維芽細胞のような小さな紡錘模様の細胞で描写される。このような形態は、典型的に、特により低い細胞密度でBMとDFとは異なる。また、注目すべき点は、CD200の発現パターンであり、これは、すべてのBMとDF試料にはないが、AC/UC幹細胞にはある。さらに、CD200は、胎児発達の間、胎盤で免疫耐性と関連されているものと示される(例えば、Clarkらの文献、Am.J.Reprod.Immunol.50(3):l87-195(2003)を参照)。
46個の遺伝子のうちこれら遺伝子の部分集合は、AC/UC幹細胞を骨髄由来の間葉系幹細胞又は線維芽細胞と区別する、分子生物標識の集合を構成する。
Claims (61)
- 単離された付着性胎盤幹細胞の集団であって、前記胎盤幹細胞は:
同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞(BM-MSC)と比較して検出可能なより高い水準で、遺伝子を発現し、ここで、前記遺伝子は、ELOVL2、ST3GAL6、ST6GALNAC5、又はSLC12A8を含み;前記胎盤幹細胞の少なくとも70%が、由来において非母系であり;かつ
前記胎盤幹細胞が、少なくとも3回継代された、前記集団。 - 単離された付着性胎盤幹細胞の集団であって、前記胎盤幹細胞は:
同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞(BM-MSC)と比較して検出可能なより高い水準で、遺伝子を発現し、ここで、前記遺伝子は、CPA4、TCF21、VTN、B4GALT6、FLJ10781、又はNUAK1を含み;前記胎盤幹細胞の少なくとも70%が、由来において非母系であり;かつ
前記胎盤幹細胞が、少なくとも3回継代された、前記集団。 - 前記胎盤幹細胞が、成長条件下で培養された、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞の少なくとも90%が、由来において非母系である、請求項1又は2記載の集団。
- 前記遺伝子が、さらにCD200を含む、請求項1又は2記載の集団。
- 前記遺伝子が、さらにCD200及びNUAK1を含む、請求項1記載の集団。
- 前記遺伝子が、さらにARTS-1、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3、又はTGFB2を含む、請求項5記載の集団。
- 前記遺伝子の前記発現が、3集団倍加に渡って、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞と比較して検出可能なより高い水準である、請求項1又は2記載の集団。
- 前記遺伝子の前記発現が、11〜14集団倍加に渡って、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞と比較して検出可能なより高い水準である、請求項1又は2記載の集団。
- 前記遺伝子の前記発現が、24〜38集団倍加に渡って、同等数の骨髄由来の間葉系幹細胞と比較して検出可能なより高い水準である、請求項1又は2記載の集団。
- 少なくとも5集団倍加を経た、請求項1又は2記載の集団。
- 15〜30集団倍加を経た、請求項11記載の集団。
- 18〜26集団倍加を経た、請求項12記載の集団。
- 約20集団倍加を経た、請求項11記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、3〜5日の倍加時間を有する、請求項1又は2記載の集団。
- 胎盤組織から採取されない幹細胞をさらに含む、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤組織から採取されない幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項16記載の集団。
- 前記胎盤組織から採取されない幹細胞が、造血前駆細胞である、請求項16記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、凍結保存された、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、15%の臍帯血清及び0.01μg/mlの形質転換成長因子(TGFβ)を含む、Dulbeccoの変性必須培地(DMEM)で培養した場合に、軟骨形成細胞の特徴を有する細胞に分化し;かつ前記軟骨形成細胞の特徴が、アルシアンブルー染色での染色に陽性であることである、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、15%の臍帯血清、0.1μMデキサメタゾン、0.05mMアスコルビン酸-2-リン酸塩、及び10mMベータグリセロリン酸塩を含む、DMEMで培養した場合に、骨形成細胞の特徴を有する細胞に分化し;かつ前記骨形成細胞の特徴が、von Kossa染色で染色すること、又はRT-PCRにより決定される、アルカリ性ホスファターゼに対するmRNAの産生である、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、神経細胞の特徴を有する細胞に分化する能力を有する、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、DMEM、低グルコース(DMEM-LG)及びMCDB-201(ニワトリ線維芽細胞基礎培地);2%ウシ胎仔血清、1xインスリン-トランスフェリン-セレニウム、1xリノレン酸ウシ血清アルブミン、10 -9 Mデキサメタゾン、10 -4 Mアスコルビン酸2-リン酸塩、10ng/ml上皮細胞成長因子、及び10ng/ml血小板由来の成長因子を含む培地中において、同等数のBM-MSCと比較して検出可能なより高い水準で、1個以上の遺伝子を発現する、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、培養中に、10〜40回複製する能力を有する、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、DMEM及びウシ胎仔血清において、培養中に、10〜40回複製する能力を有する、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、トリプシンを用いる消化によりヒトの分娩後の胎盤から単離されるか、又はトリプシンを用いる消化によりヒトの分娩後の胎盤から単離された細胞から培養される、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、該胎盤幹細胞が単離される胎盤の少なくとも90%の細胞のから分離された、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、該胎盤幹細胞が単離される胎盤の少なくとも95%の細胞のから分離された、請求項27記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、該胎盤幹細胞が単離される胎盤の少なくとも99%の細胞のから分離された、請求項28記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、3〜10回継代された、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、4〜8回継代された、請求項30記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、6回継代された、請求項30記載の集団。
- 前記集団における少なくとも90%の細胞が、前記胎盤幹細胞である、請求項1又は2記載の集団。
- 前記集団における少なくとも95%の細胞が、前記胎盤幹細胞である、請求項1又は2記載の集団。
- 前記集団における少なくとも99%の細胞が、前記胎盤幹細胞である、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、同等数のBM-MSCと比較して少なくとも3倍高い水準で、前記遺伝子を発現する、請求項1又は2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞により発現される前記遺伝子がELOVL2、ST3GAL6、ST6GALNAC5、及びSLC12A8を含む、請求項1記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞により発現される前記遺伝子がCPA4、TCF21、VTN、B4GALT6、FLJ10781、及びNUAK1を含む、請求項2記載の集団。
- 前記胎盤幹細胞が、DMEM-LG及びMCDB-201;2%ウシ胎仔血清、1xインスリン-トランスフェリン-セレニウム、1xリノレン酸ウシ血清アルブミン、10 -9 Mデキサメタゾン、10 -4 Mアスコルビン酸2-リン酸塩、10ng/ml上皮細胞成長因子、及び10ng/ml血小板由来の成長因子を含む培地中において、同等数のBM-MSCと比較して検出可能なより高い水準で、前記遺伝子を発現する、請求項37又は38記載の集団。
- 10 6 〜10 7 個の胎盤幹細胞を含む、請求項1、2、37、38又は39記載の集団。
- 10 7 〜10 8 個の胎盤幹細胞を含む、請求項1、2、37、38又は39記載の集団。
- 少なくとも10 9 個の胎盤幹細胞を含む、請求項1、2、37、38又は39記載の集団。
- 1 x 10 8 〜5 x 10 8 個の胎盤幹細胞を含む、請求項1、2、37、38又は39記載の集団。
- 5 x 10 8 〜1 x 10 9 個の胎盤幹細胞を含む、請求項1、2、37、38又は39記載の集団。
- 1 x 10 9 〜5 x 10 9 個の胎盤幹細胞を含む、請求項1、2、37、38又は39記載の集団。
- 前記遺伝子が、ELOVL2を含む、請求項1記載の集団。
- 前記遺伝子が、ST3GAL6を含む、請求項1記載の集団。
- 前記遺伝子が、ST6GALNAC5を含む、請求項1記載の集団。
- 前記遺伝子が、SLC12A8を含む、請求項1記載の集団。
- 前記遺伝子が、CPA4を含む、請求項2記載の集団。
- 前記遺伝子が、TCF21を含む、請求項2記載の集団。
- 前記遺伝子が、VTNを含む、請求項2記載の集団。
- 前記遺伝子が、B4GALT6を含む、請求項2記載の集団。
- 前記遺伝子が、FLJ10781を含む、請求項2記載の集団。
- 前記遺伝子が、NUAK1を含む、請求項2記載の集団。
- ジメチルスルホキシド(DMSO)、ヒト血清アルブミン(HSA)、又はデキストランを含む組成物中に存在する、請求項1、2、37、38又は39記載の集団。
- 医薬品として許容可能な運搬体中に、請求項1、2、37、38又は39記載の集団を含む、医薬組成物。
- 前記集団が、10 6 〜10 7 個の胎盤幹細胞を含む、請求項57記載の医薬組成物。
- 前記集団が、10 7 〜10 8 個の胎盤幹細胞を含む、請求項57記載の医薬組成物。
- 注射剤である、請求項57記載の医薬組成物。
- 静脈内投与に適した形態である、請求項57記載の医薬組成物。
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