ES2711278T3 - Poblaciones de células madre placentarias - Google Patents

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ES2711278T3 ES12150919T ES12150919T ES2711278T3 ES 2711278 T3 ES2711278 T3 ES 2711278T3 ES 12150919 T ES12150919 T ES 12150919T ES 12150919 T ES12150919 T ES 12150919T ES 2711278 T3 ES2711278 T3 ES 2711278T3
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James W Edinger
Herbert Faleck
Robert J Hariri
Kristen S Labazzo
Marian Pereira
Jia-Lun Wang
Qian Ye
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Abstract

Una población de células madre de amnios-corion adherentes aisladas, en donde dichas células madre de amnios-corion expresan el gen SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mayor que un número equivalente de células madre mesenquimatosas obtenidas a partir de médula ósea (BM-MSC) que se han cultivado en condiciones equivalentes y se han sometido al mismo número de pases en cultivo que dichas células madre de amnios-corion, en donde dichas células madre de amnios-corion son CD10+, CD34-, CD105+, y CD200+.

Description

DESCRIPCION
Poblaciones de celulas madre placentarias
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos N° 60/754.968, presentada el 29 de diciembre de 2005; y reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos N° 60/846.641, presentada el 22 de septiembre de 2006.
1. Campo de la invencion
La presente invencion se refiere, en general, a celulas madre placentarias aisladas, poblaciones de celulas madre placentarias, composiciones que comprenden las celulas madre y metodos de obtencion de las celulas madre.
2. Antecedentes de la invencion
Las celulas madre humanas son celulas precursoras totipotentes o pluripotentes capaces de generar diversos linajes de celulas humanas maduras. Existen pruebas que demuestran que las celulas madre pueden emplearse para repoblar muchos, si no todos, los tejidos y restaurar la funcionalidad fisiologica y anatomica.
Se han caracterizado muchos tipos diferentes de celulas madre de mairnfero. Vease, p. ej., Caplan et al., patente de Estados Unidos N° 5.486.359 (celulas madre mesenquimatosas humanas); Boyse et al., patente de Estados Unidos N° 5.004.681 (celulas madre y progenitoras hematopoyeticas fetales y neonatales); Boyse et al., U.S. 5.192.553 (lo mismo); Beltrami et al., Cell 1l4(6): 763-766 (2003) (celulas madre cardiacas); Forbes et al., J. Pathol. 197(4): 510­ 518 (2002) (celulas madre hepaticas). Sangre del cordon umbilical, y celulas nucleadas totales obtenidas a partir de sangre del cordon umbilical, se han usado en trasplantes para restaurar, parcial o completamente, la funcion hematopoyetica en pacientes que han sido sometidos a terapia de ablacion.
In'tAnker PS et al. (2004) examina la expresion de ciertos marcadores en la superficie de las celulas de la medula osea, la sangre del cordon umbilical, el lfquido amniotico y tejidos del amnios placentario, decidua parietal y decidua basal. La solicitud internacional WO 2005/001076 describe celulas derivadas de placenta posparto caracterizadas, entre otras cosas, por ciertos marcadores y metodos para su aislamiento y usos potenciales de esas celulas derivadas de placenta.
3. Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere, en general, a celulas madre placentarias aisladas, poblaciones de celulas madre placentarias, composiciones que comprenden las celulas madre, y metodos de obtencion de las celulas madre. Espedficamente, la presente invencion proporciona una poblacion de celulas madre de amnios-corion adherentes aisladas, en donde dichas celulas madre de amnios-corion expresan el gen SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mayor que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea (BM-MSC) que se han cultivado en condiciones equivalentes y se han sometido al mismo numero de pases en cultivo que dichas celulas madre de amnios-corion, y en donde dichas celulas madre de amnios-corion son: CD10+, CD34‘, CD105+ y CD200+.
Segun una realizacion, las celulas madre de amnios-corion dentro de la poblacion de celulas son ademas CD90+ y CD45‘. En una realizacion adicional las celulas madre de amnios-corion tienen la capacidad de diferenciarse en celulas que tienen caractensticas de celulas neuronales.
Segun otra realizacion, las celulas madre de amnios-corion expresan SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mas elevado que un numero equivalente de BM-MSC durante 3, durante 11-14 o durante 24-38 duplicaciones de la poblacion. En una realizacion, las celulas expresan SLC12A8 a un nivel al menos tres veces mas elevado que un numero equivalente de BM-MSC.
Segun una realizacion adicional, la poblacion de celulas de la invencion comprende 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5x 1010, o 1 x 1011 celulas madre de amnios-corion.
Segun una realizacion adicional, la poblacion de celulas se ha sometido a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40, o mas, duplicaciones de la poblacion.
Segun una realizacion adicional, las celulas madre de amnios-corion expresan SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mas elevado que un numero equivalente de BM-MSC cuando dichas celulas madres de amnios-corion y dichas celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea se cultivan en un medio que comprende DMEM-LG 60 % y MCDB-201 40 %; suero fetal de ternero 2 %, 1x insulina-transferrina-selenio, 1x acido linolenico-albumina de suero bovino, dexametasona 10‘9 M, acido 2-fosfato ascorbico 10‘4 M, factor de crecimiento epidermico 10 ng/ml, y factor de crecimiento derivado de plaquetas 10 ng/ml.
Segun una realizacion adicional, las celulas madre de amnios-corion tienen la capacidad de replicarse de 10 a 40 veces en cultivo.
Segun una realizacion adicional, las celulas madre de amnios-corion se han sometido a un pase de 5 a 10 veces. Segun una realizacion adicional, las celulas madre de amnios-corion se diferencian en celulas que tienen una caractenstica de celulas condrogenicas cuando se cultivan en DMEM que comprende 15 % de suero de sangre del cordon y 0,01 |ig/ml de factor de crecimiento transformante beta (TGFp); y en donde dicha caractenstica de celulas condrogenicas es tincion positiva con colorante azul alcian.
Segun una realizacion adicional, las celulas madre de amnios-corion se diferencian en celulas que tienen una caractenstica de celulas osteogenicas cuando se cultivan en DMEM que comprende 15 % de suero de sangre del cordon, dexametasona 0,1 |iM, 2-fosfato de acido ascorbico 0,05 mM, y beta glicerofosfato 10 mM; y en donde dicha caractenstica de celulas osteogenicas se demuestra mediante tincion con colorante de von Kossa o produccion de ARNm para fosfatasa alcalina segun lo determinado por RT-PCR.
Segun una realizacion adicional, al menos el 90% o al menos el 99% de las celulas madre de amnios-corion son de origen no materno.
La invencion proporciona ademas una composicion que comprende las celulas madre de amnios-corion adherentes aisladas de la invencion, en donde la composicion esta en una forma adecuada para la administracion intravenosa. En aun un aspecto adicional, la invencion proporciona un metodo de produccion de una poblacion de celulas madre de amnios-corion de la invencion, que comprende identificar celulas madre de amnios-corion adherentes que expresan SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mayor que un numero equivalente de BM-MSC que se han cultivado en condiciones equivalentes y se han sometido al mismo numero de pases en cultivo que dichas celulas madre de amnios-corion, y aislar dichas celulas madre de amnios-corion, en donde dichas celulas madre de amnioscorion son CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+.
Dentro de los lfmites de la presente invencion, la referencia a celulas madre de amnios-corion de la invencion en la siguiente descripcion implica que dichas celulas expresan el gen SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mas elevado que un numero equivalente de BM-MSC, tal como se define en las reivindicaciones.
Por lo tanto, en la presente memoria se describen celulas madre aisladas, y poblaciones de celulas que comprenden dichas celulas madre, en donde las celulas madre estan presentes, y aislables a partir de tejido placentario (p. ej., amnios, corion, cotiledones placentarios, etc.). Las celulas madre placentarias muestran una o mas caractensticas de una celula madre (p. ej., muestran marcadores asociados con celulas madre, se replican al menos 10-20 veces en cultivo en un estado indiferenciado, se diferencian en celulas adultas representativas de las tres capas germinales, etc.), y se pueden adherir a un sustrato para cultivo tisular (p. ej., plastico para cultivo tisular tal como la superficie de una placa para cultivo tisular o una placa de multiples pocillos).
Un aspecto descrito en la presente memoria es una celula madre placentaria aislada que es CD200+ o HLA-G+. En otro aspecto, dicha celula es CD200+ y HLA-G+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' y CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' y c D45‘. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38', CD45- CD73+ y CD105+. En otro aspecto descrito en la presente memoria, dicha celula madre facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide a partir de una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas madre placentarias, cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
Otro aspecto descrito en la presente memoria es una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende, p. ej., que esta enriquecida en, celulas madre CD200+, HLA-G+. En diversos aspectos, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 % al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 % o mas de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre CD200+, HLA-G+. En un aspecto de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dichas celulas madre son Cd34‘, CD38' o CD45'. En aun otro aspecto, dichas celulas madre son CD34', Cd38‘, CD45', CD73+ y CD105+. En otros aspectos, dicha poblacion ha sido expandida, p. ej., se ha sometido a un pase al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces o al menos 20 veces. En otro aspecto, dicha poblacion forma uno o mas cuerpos de tipo embrioide cuando se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
Otro aspecto descrito en la presente memoria es una celula madre aislada que es CD73+, CD105+ y CD200+. En otro aspecto, dicha celula madre es HLA-G+. En otro aspecto dicha celula madre es CD34- CD38' o CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' y CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34- CD38- CD45' y HLA-G+. En otro aspecto, dicha celula madre facilita el desarrollo de uno o mas cuerpos de tipo embrioide a partir de una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende la celula madre cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
Otro aspecto descrito en la presente memoria es una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende, p. ej., que esta enriquecida en, celulas madre CD73+, CD105+, CD200+. En diversos aspectos, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 % al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre CD73+, CD105+, CD200+.
En un aspecto de dichas poblaciones, dichas celulas madre son HLA-G+. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34-, CD38- o CD45-. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34-, CD38- y CD45-. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34-, CD38-, CD45- y HLA-G+. En otros aspectos, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, se ha sometido a un pase al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces o al menos 20 veces. En otro aspecto, dicha poblacion forma uno o mas cuerpos de tipo embrioide en cultivo en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
Tambien se describe en la presente memoria una celula madre aislada que es CD200+ y OCT-4+. En un aspecto, la celula madre es CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha celula madre es HLA-G+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34-, CD38- o CD45-. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34-, CD38- y CD45-. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otro aspecto, dicha celula madre facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide a partir de una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas madre placentarias, cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una poblacion de celulas aisladas que comprende, p. ej., que esta enriquecida en, celulas madre CD200+, OCT-4+. En diversos aspectos, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 % al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre CD200+, OCT-4+. En un aspecto de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dichas celulas madre son HLA-G+. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34', CD38' y CD45'. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34', CD38', CD45', CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otros aspectos, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, se ha sometido a un pase al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces o al menos 20 veces. En otro aspecto, dicha poblacion forma uno o mas cuerpos de tipo embrioide cuando se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una celula madre aislada que es CD73+ y CD105+ y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende dicha celula madre, cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En un aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' o CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' y CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es OCT4+. En aun otro aspecto, dicha celula madre es OCT4+, CD34', CD38' y CD45'.
Ademas, en la presente memoria se describe una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende, p. ej., que esta enriquecida en, celulas madre CD73+, CD105+, en donde dicha poblacion forma uno o mas cuerpos de tipo embrioide en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En diversas realizaciones, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 % al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre CD73+, CD 105+. En un aspecto de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son CD34', CD38' o CD45'. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34- CD38' y CD45- En otro aspecto, dichas celulas madre son OCT-4+. En otro aspecto, dichas celulas madre son OCT-4+, CD34', CD38' y CD45'. En otros aspectos, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, se ha sometido a un pase al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces o al menos 20 veces.
En la presente memoria tambien se describe una celula madre aislada que es CD73+, CD105+ y HLA-G+. En un aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' o CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34- CD38' y CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es OCT-4+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD200+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38- CD45', OCT-4+ y CD200+. En otro aspecto, dicha celula madre facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide a partir de una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende celulas madre placentarias en cultivo en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
En la presente memoria tambien se describe una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende, p. ej., que esta enriquecida en, celulas madre CD73+, CD105+ y HLA-G+. En diversos aspectos, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 % al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otro aspecto de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son CD34- CD38' o CD45'. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34- CD38' y CD45'. En otro aspecto, dichas celulas madre son OCT-4+. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD200+. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34', CD38- CD45+, OCT-4+ y CD200+. En otro aspecto, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, se ha sometido a un pase al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces o al menos 20 veces. En otro aspecto, dicha poblacion forma cuerpos de tipo embrioide cuando se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
Ademas, en la presente memoria se describe una celula madre aislada que es OCT-4+ y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende dicha celula madre cuando se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En un aspecto, dicha celula madre es CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34-, CD38- o CD45-. En otro aspecto, dicha celula madre es CD200+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38- y CD45-.
En la presente memoria tambien se describe una poblacion de celulas aisladas que comprende, p. ej., que esta enriquecida en, celulas madre placentarias OCT-4+, en donde dicha poblacion forma uno o mas cuerpos de tipo embrioide, cuando se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En diversos aspectos, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 % al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre placentarias OCT4+. En un aspecto de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34-, CD38- o CD45-. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD200+. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38- y CD45-. En otro aspecto, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, se ha sometido a un pase al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces o al menos 20 veces.
En la presente memoria tambien se describe una poblacion aislada de las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria que se produce de acuerdo con un metodo que comprende perfundir una placenta de mairnfero a la que se le ha drenado la sangre del cordon umbilical y ha sido perfundida para eliminar la sangre residual; perfundir dicha placenta con una solucion de perfusion; y recoger dicha solucion de perfusion, en donde dicha solucion de perfusion despues de la perfusion comprende una poblacion de celulas placentarias que comprende celulas madre placentarias; y aislar una pluralidad de dichas celulas madre placentarias a partir de dicha poblacion de celulas. En un aspecto, se hace pasar a la solucion de perfusion a traves de tanto la vena umbilical como de arterias umbilicales y es recogida despues de que exuda de la placenta. En otro aspecto, se hace pasar a la solucion de perfusion a traves de la vena umbilical y se recoge a partir de las arterias umbilicales, o se le hace pasar a traves de las arterias umbilicales y se recoge a partir de la vena umbilical.
Ademas se describe en la presente memoria una poblacion aislada de las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria que se produce de acuerdo con un metodo que comprende digerir tejido placentario con una enzima de ruptura de tejidos para obtener una poblacion de celulas placentarias que comprende celulas madre placentarias, y aislar una pluralidad de celulas madre placentarias a partir del resto de dichas celulas placentarias. En ciertos casos, dicho tejido placentario es una placenta completa, una membrana amniotica, corion, una combinacion de amnios y corion, o una combinacion de cualquiera de las anteriores. En otro aspecto, la enzima de ruptura de tejidos es tripsina o colagenasa.
En algunos casos, las celulas madre aisladas anteriores expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas elevado que una celula madre mesenquimatosa obtenida a partir de medula osea, en los que dichos uno o mas genes se seleccionan del grupo que consiste en ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4gAlT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A, y en donde dicha celula madre obtenida a partir de medula osea se ha sometido a un numero de pases en cultivo equivalente al numero de pases que ha experimentado dicha celula madre placentaria. Secuencias correspondientes a estos genes se encuentran en matrices multigenicas (“arrays") GENECHlP® de Affymetrix. Estos genes tambien pueden encontrarse en los numeros de acceso del GenBank NM_001615 (AcTg2), BC065545 (ADARB1), (NM_181847 (AMIGO2), AY358590 (ARTS-1), BC074884 (B4GALT6), BC008396 (BCHE), BC020196 (C11orf9), BC031103 (CD200), NM_001845 (COL4A1), NM_001846 (COL4A2), BC052289 (CPA4), BC094758 (DMD), AF293359 (DSC3), NM_001943 (DSG2), AF338241 (ELOVL2), AY336105 (F2RL1), NM_018215 (FLJ10781), AY416799 (GATA6), BC075798 (GPR126), NM_016235 (GPRC5B), AF340038 (ICAM1), BC000844 (IER3), BC066339 (IGFBP7), BC013142 (IL1A), BT019749 (IL6), BC007461 (IL18), (BC072017) KRT18, BC075839 (KRT8), BC060825 (LIPG), BC065240 (LRAP), BC010444 (MATN2), BC011908 (MEST), BC068455 (NFE2L3), NM_014840 (NUAK1), AB006755 (PCDH7), NM_014476 (PDLIM3), BC126199 (PKP-2), BC090862 (RTN1), BC002538 (SERPINB9), BC023312 (ST3GAL6), BC001201 (ST6GALNAC5), BC126160 o BC065328 (SLC12A8), BC025697 (TCF21), BC096235 (TGFB2), BC005046 (VTN), y BC005001 (ZC3H12A) a partir de diciembre de 2006.
En un aspecto, dicha celula madre expresa ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A a un nivel notoriamente mas elevado que una celula madre mesenquimatosa obtenida a partir de medula osea.
Otro aspecto descrito en la presente memoria es cualquiera de las poblaciones de celulas madre aisladas anteriores, en donde dichas celulas madre expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas elevado que una poblacion de celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea, en donde dichos uno o mas genes se seleccionan del grupo que consiste en ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A, y en donde dicha poblacion de celulas madre obtenidas a partir de medula osea se ha sometido a un numero de pases en cultivo equivalente al numero de pases que ha experimentado dicha celula madre placentaria, y en donde dicha poblacion de celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea tiene un numero de celulas equivalente a dicha poblacion de celulas madre aisladas. En un aspecto, la poblacion de celulas madre aisladas expresa ACTG2, ADARB 1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A a un nivel notoriamente mas elevado que dicha poblacion de celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea aisladas.
En algunos aspectos de los metodos de seleccion de poblaciones de celulas, en la presente memoria se describen metodos de seleccion de una de las poblaciones de celulas mencionadas anteriormente, que comprende seleccionar celulas que expresan uno o mas genes a un nivel notoriamente mas elevado que una celula madre mesenquimatosa obtenida a partir de medula osea, en donde uno o mas genes se seleccionan del grupo que consiste en ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A, y en donde dicha celula madre obtenida a partir de medula osea se ha sometido a un numero de pases en cultivo equivalente al numero de pases que ha experimentado dicha celula madre placentaria. En un aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar celulas que expresan ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A a un nivel notoriamente mas elevado que una celula madre mesenquimatosa obtenida a partir de medula osea.
La invencion tambien proporciona composiciones que comprenden una o mas de las celulas madre de la invencion, en donde la celula madre ha sido aislada a partir de la placenta. En la presente memoria tambien se describe una composicion que comprende una celula madre, en donde dicha celula madre es CD200+ y HLA-G+. En un aspecto, dicha celula madre es CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' o CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34- CD38' y CD45'. En un aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38', CD45', CD73+, CD105+, CD200+ y HLA-G+.
En la presente memoria tambien se describe una composicion que comprende una celula madre, en donde dicha celula madre es CD73+, CD105+ y CD200+. En un aspecto, dicha celula madre es HLA-G+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' o CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' y CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38', CD45' y HLA-G+.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una composicion que comprende una celula madre, en donde dicha celula madre es CD200+ y OCT-4+. En un aspecto, dicha celula madre es CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha celula madre es HLA-G+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' o CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' y CD45- En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38', CD45', CD73+, CD105+ y HLA-G+.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una composicion que comprende una celula madre que es CD73+ y CD105+, en donde dicha celula madre facilita la formacion de un cuerpo de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende dicha celula madre en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide. En un aspecto, dicha celula madre es CD34'. CD38' o CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es OCT-4+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD200+. En otro aspecto, dicha celula madre es OCT-4+, CD200+, CD34-, CD38' y CD45'.
En aun otro aspecto, en la presente memoria se describe una composicion que comprende una celula madre que es CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' o CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es OCT-4+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD200+. En otro aspecto, dicha celula madre es OCT-4+, CD200+ CD34-, CD38' y CD45'.
En la presente memoria tambien se describe una composicion que comprende una celula madre que es OCT-4+, en donde dicha celula madre facilita la formacion de un cuerpo de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende dicha celula madre en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide. En una realizacion espedfica, dicha celula madre es CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' y CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD200+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD73+, CD105+, CD200+, CD34', CD38' y CD45'.
En otro aspecto de las composiciones descritas, dicha celula madre expresa uno o mas genes a un nivel notoriamente mas elevado que una celula madre mesenquimatosa obtenida a partir de medula osea, en donde dichos uno o mas genes se seleccionan del grupo que consiste en ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A, y en donde dicha celula madre obtenida a partir de medula osea se ha sometido a un numero de pases en cultivo equivalente al numero de pases que ha experimentado dicha celula madre placentaria. En otro aspecto de las composiciones anteriores, dichas celulas madre expresan ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A a un nivel notoriamente mas elevado que una poblacion de celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea aisladas, en donde dicha poblacion de celulas madre y dicha poblacion de celulas mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea tienen numeros de celulas equivalentes.
En otra realizacion espedfica, cualquiera de las composiciones anteriores comprende una matriz. En una realizacion mas espedfica, dicha matriz es una matriz de soporte tridimensional. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende colageno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina o vitronectina. En otra realizacion mas espedfica, la matriz es una membrana amniotica o un biomaterial obtenido a partir de una membrana amniotica. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende una protema de la membrana extracelular. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende un compuesto sintetico. En otra realizacion mas espedfica, dicha matriz comprende un compuesto bioactivo. En otra realizacion mas espedfica, dicho compuesto bioactivo es un factor de crecimiento, citoquina, anticuerpo, o molecula organica de menos de 5.000 daltons.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una composicion que comprende un medio condicionado por cualquiera de las celulas madre anteriores, o cualquiera de las poblaciones de celulas madre anteriores. Cualquiera de dichas composiciones puede comprender una celula madre que no se obtiene a partir de una placenta tal como una celula madre mesenquimatosa, una celula madre obtenida a partir de medula osea, una celula progenitora hematopoyetica, una celula madre somatica. En otro aspecto, dicha celula madre somatica es una celula madre neural, una celula madre hepatica, una celula madre pancreatica, una celula madre endotelial, una celula madre cardiaca o una celula madre muscular.
En la presente memoria se describen metodos para producir poblaciones de celulas madre obtenidas a partir de placenta de mairnfero. En un aspecto, por ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo de produccion de una poblacion de celulas que comprende seleccionar celulas que (a) se adhieren a un sustrato, y (b) expresan CD20o y HLA-G; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de produccion de una poblacion de celulas, que comprende seleccionar celulas que (a) se adhieren a un sustrato, y (b) expresan CD73, CD105 y CD200; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de produccion de una poblacion de celulas, que comprende seleccionar celulas que (a) se adhieren a un sustrato y (b) expresan CD200 y OCT-4; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En aun otro aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de produccion de una poblacion de celulas, que comprende seleccionar celulas que (a) se adhieren a un sustrato, (b) expresan CD73 y CD105, y (c) facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide, cuando se cultivan con una poblacion de celulas placentarias en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de produccion de una poblacion de celulas, que comprende seleccionar celulas que (a) se adhieren a un sustrato, y (b) expresan CD73, CD105 y HLA-G; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. La descripcion tambien describe un metodo de produccion de una poblacion de celulas, que comprende seleccionar celulas que (a) se adhieren a un sustrato, (b) expresan OCT-4, y (c) facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide, cuando se cultivan con una poblacion de celulas placentarias en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En un aspecto de cualquiera de los metodos anteriores, dicho sustrato comprende fibronectina. Los metodos pueden comprender ademas seleccionar celulas que expresan ABC-p. En otro aspecto, los metodos comprenden seleccionar celulas que muestran al menos una caractenstica espedfica de una celula madre mesenquimatosa. Dicha caractenstica espedfica de una celula madre mesenquimatosa es la expresion de CD29, la expresion de CD44, la expresion de CD90, o la expresion de una combinacion de las anteriores. Como alternativa, dicha seleccion se consigue usando un anticuerpo, o citometna de flujo, o perlas magneticas, o mediante clasificacion de celulas activadas por fluorescencia. Dicha poblacion de celulas tambien puede expandirse.
Puede producirse una lmea de celulas madre mediante un metodo que comprende transformar una celula madre con una secuencia de ADN que codifica una protema promotora del crecimiento; y exponer a dicha celula madre a condiciones que promueven la produccion de dicha protema promotora del crecimiento. Dicha protema promotora del crecimiento puede ser v-myc, N-myc, c-myc, p53, antfgeno T grande de SV40, antfgeno T grande de polioma, protema E1a de adenovirus o protema E7 de papilomavirus humano. Dicha secuencia de ADN puede ser regulable. Mas espedficamente, dicha secuencia de ADN es regulable por tetraciclina. Dicha protema promotora del crecimiento tiene una actividad regulable. Espedficamente, dicha protema promotora del crecimiento puede ser un mutante sensible a temperatura.
En la presente memoria se describen poblaciones de celulas madre crioconservadas. Por ejemplo, en la presente memoria se describe una poblacion de celulas madre CD200+, HLA-G+, en donde dichas celulas madre han sido crioconservadas, y en donde dicha poblacion esta contenida dentro de un recipiente. Ademas, en la presente memoria se describe una poblacion de celulas madre CD73+, CD105+, CD200+, en donde dichas celulas madre han sido crioconservadas, y en donde dicha poblacion esta contenida dentro de un recipiente. En la presente memoria tambien se describe una poblacion de celulas madre CD200+, OCT-4+, en donde dichas celulas madre han sido crioconservadas, y en donde dicha poblacion esta contenida dentro de un recipiente. En la presente memoria se describe una poblacion de celulas madre CD73+, CD105+, en donde dichas celulas han sido crioconservadas, y en donde dicha poblacion esta contenida dentro de un recipiente, y en donde dichas celulas madre facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide, cuando se cultivan con una poblacion de celulas placentarias en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otro aspecto, en la presente memoria se describe una poblacion de celulas madre CD73+, CD105+, HLA-G+, en donde dichas celulas madre han sido crioconservadas, y en donde dicha poblacion esta contenida dentro de un recipiente. En la presente memoria tambien se describe una poblacion de celulas madre OCT-4+, en donde dichas celulas madre han sido crioconservadas, en donde dicha poblacion esta contenida dentro de un recipiente, y en donde dichas celulas madre facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide, cuando se cultivan con una poblacion de celulas placentarias en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En un aspecto de cualquiera de las poblaciones crioconservadas anteriores, dicho recipiente es una bolsa. En diversos aspectos, dicha poblacion comprende aproximadamente, al menos, o como maximo 1 x 106 de dichas celulas madre, 5 x 106 de dichas celulas madre, 1 x l07 de dichas celulas madre, 5 x 107 de dichas celulas madre, 1 x 108 de dichas celulas madre, 5 x 108 de dichas celulas madre, 1 x 109 de dichas celulas madre, 5 x 109 de dichas celulas madre, o 1 x 1010 de dichas celulas madre. En otros aspectos de cualquiera de las poblaciones crioconservadas anteriores, dichas celulas madre se han sometido a un pase aproximadamente, al menos, o no mas de 5 veces, no mas de 10 veces, no mas de 15 veces o no mas de 20 veces. En otro aspecto de cualquiera de las poblaciones crioconservadas anteriores, dichas celulas madre han sido expandidas dentro de dicho recipiente.
3.1 DEFINICIONES
Tal como se usa en la presente memoria, el termino “SH2” se refiere a un anticuerpo que se une a un epftopo en el marcador CD105. Por lo tanto, las celulas que se denominan como SH2+ son CD105+.
Tal como se usan en la presente memoria, los terminos “SH3” y “SH4” se refieren a anticuerpos que se unen a epftopos presentes en el marcador CD73. Por lo tanto, las celulas que se denominan como SH3+ y/o SH4+ son CD73+.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresion “celula madre aislada” significa una celula madre que esta sustancialmente separada de otras, celulas no madre del tejido, p. ej., placenta, del que procede la celula madre. Una celula madre esta “aislada” si al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o al menos 99 % de las celulas no madre con las que la celula madre esta asociada de forma natural, o celulas madre que presentan un perfil de marcador diferente, se retiran de la celula madre, p. ej., durante la recogida y/o el cultivo de la celula madre.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresion “poblacion de celulas aisladas” significa una poblacion de celulas que esta sustancialmente separada de otras celulas del tejido, p. ej., placenta, del que procede la poblacion de celulas. Una celula madre esta “aislada” si al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o al menos 99 % de las celulas con las que la poblacion de celulas, o las celulas de que procede la poblacion de celulas, estan asociadas de forma natural, es decir, celulas madre que presentan un perfil de marcador diferente, se retiran de la celula madre, p. ej., durante la recogida y/o el cultivo de la celula madre.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresion “celula madre placentaria” se refiere a una celula madre o celula progenitora que se obtiene a partir de una placenta de mairnfero, independientemente de la morfologfa, los marcadores de la superficie celular, o el numero de pases despues de un cultivo primario. La expresion “celula madre placentaria” tal como se usa en la presente memoria, no se refiere, sin embargo, a un trofoblasto. Una celula se considera una “celula madre” si la celula conserva al menos un atributo de una celula madre, p. ej., un perfil de marcador o de expresion genica asociado con uno o mas tipos de celulas madre; la capacidad de replicarse al menos 10-40 veces en cultivo, la capacidad de diferenciarse en celulas de las tres capas germinales; la falta de caractensticas de celulas adultas (es decir, diferenciadas), o similares. Las expresiones “celula madre placentaria” y “celula madre obtenida a partir de la placenta” pueden usarse de forma intercambiable.
Tal como se usa en la presente memoria, una celula madre es “positiva” para un marcador particular cuando ese marcador es detectable por encima del fondo. Por ejemplo, una celula madre placentaria es positiva para, p. ej., CD73 porque CD73 es detectable en celulas madre placentarias en una cantidad notoriamente mayor que el fondo (en comparacion con, p. ej., un control de isotipo). Una celula es tambien positiva para un marcador cuando ese marcador puede usarse para distinguir la celula de al menos otro tipo de celula, o puede usarse para seleccionar o aislar la celula cuando esta presente o es expresada por la celula. En el contexto de, p. ej., la deteccion mediada por anticuerpo, “positivo/a”, como una indicacion de que un marcador de la superficie celular particular esta presente, significa que el marcador es detectable usando un anticuerpo, p. ej., un anticuerpo marcado de forma fluorescente, espedfico para ese marcador; “positivo/a” tambien significa que una celula porta ese marcador en una cantidad que produce una senal, p. ej., en un citometro, que esta notoriamente por encima del fondo. Por ejemplo, una celula es “CD200+” cuando la celula esta marcada notoriamente con un anticuerpo espedfico para CD200, y la senal procedente del anticuerpo es notoriamente mas elevada que un control (p. ej., fondo). A la inversa, “negativo/a” en el mismo contexto significa que el marcador de la superficie celular no es detectable usando un anticuerpo espedfico para ese marcador en comparacion con el fondo. Por ejemplo, una celula es “CD34-” cuando la celula no esta marcada notoriamente con un anticuerpo espedfico para CD34. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, los marcadores de grupo de diferenciacion (“CD” por sus siglas en ingles) se detectan usando anticuerpos. Se determina que OCT-4 esta presente, y una celula es “OCT-4+” si OCT-4 es detectable usando RT-PCR.
4. Breve descripcion de las figuras
Figura 1: viabilidad de celulas madre placentarias procedentes de perfusion (A), amnios (B), corion (C), amniosplaca corionica (D) o cordon umbilical (E). Los numeros en el eje X designan la placenta a partir de la cual se obtuvieron las celulas madre.
Figura 2: porcentaje de celulas HLA ABCVCD45VCD34YCD133+ procedentes de perfusion (A), amnios (B), corion (C), amnios-placa corionica (D) o cordon umbilical (E) segun lo determinado por FACSCalibur. Los numeros en el eje X designan la placenta a partir de la cual se obtuvieron las celulas madre.
Figura 3: porcentaje de celulas HLA ABCVCD45VCD34YCD133+ procedentes de perfusion (A), amnios (B), corion (C), amnios-placa corionica (D) o cordon umbilical (E), segun lo determinado por FACS Aria. Los numeros en el eje X designan placenta a partir de la cual se obtuvieron las celulas madre.
Figura 4: expresion de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 en celulas madre obtenidas a partir de perfundido placentario.
Figura 5: expresion de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 en celulas madre obtenidas a partir del amnios.
Figura 6: expresion de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 en celulas madre obtenidas a partir del corion.
Figura 7: expresion de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 en celulas madre obtenidas a partir de amnios-placa corionica.
Figura 8: expresion de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 en celulas madre obtenidas a partir de cordon umbilical.
Figura 9: expresion promedio de la expresion de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 en celulas madre obtenidas a partir de perfusion (A), amnios (B), corion (C), amnios-placa corionica (D) o cordon umbilical (E).
Figura 10: evoluciones temporales de cultivo para lmeas celulares de amnios/corion (AC), cordon umbilical (UC), celula madre obtenida a partir de medula osea (BM-MSC) y fibroblasto dermico humano (NHDF) usadas en este estudio. Todos los cultivos se hicieron crecer y se propagaron usando las mismas densidades de siembra y pase. Los drculos indican que cultivos se usaron para aislamiento de ARN. Los cultivos tardms se recogieron justo antes de la senescencia. Dos cultivos de UC se recogieron a las 38 duplicaciones (UC-38) para comparar el efecto de la tripsinizacion sobre la expresion genica. Todos los demas cultivos se lisaron directamente en sus matraces de cultivo antes del aislamiento de ARN.
Figura 11: grafico de lmeas de los niveles de expresion relativa de 8215 genes en celulas de amnios/corion (AC), cordon umbilical (UC), celula madre obtenida a partir de medula osea (BM-MSC) y fibroblasto dermico humano (DF). El numero asociado con cada designacion de lmea celular en el eje X indica el numero de dfas que la lmea celular se cultivo antes de la evaluacion de los niveles de expresion genica. El grafico se genero a partir de datos de expresion de ARN analizados mediante el software GeneSpring. Se uso AC-03 como condicion seleccionada.
Figura 12: subconjunto de toda la lista de genes que muestra genes sobreexpresados > 6 veces en AC-03 para celulas de amnios/corion (AC), cordon umbilical (UC), celula madre obtenida a partir de medula osea (BM-MSC) y fibroblasto dermico humano (DF). El numero asociado con cada designacion de lmea celular en el eje X indica el numero de dfas que se cultivo la lmea celular antes de la evaluacion de los niveles de expresion genica. El diagrama se genero a partir de datos de expresion de ARN analizados mediante el software GeneSpring. Se uso AC-03 como condicion seleccionada.
Figura 13: genes espedficos de celula madre placentaria o espedficos de celula madre del cordon umbilical descubiertos mediante filtracion por nivel de cambio para celulas de amnios/corion (AC), cordon umbilical (UC), celula madre obtenida a partir de medula osea (BM-MSC) y fibroblasto dermico humano (DF). El numero asociado con cada designacion de lmea celular en el eje X indica el numero de dfas que se cultivo la lmea celular antes de la evaluacion de los niveles de expresion genica. El diagrama se genero a partir de datos de expresion de ARN analizados mediante el software GeneSpring. Se uso AC-03 como condicion seleccionada.
5. Descripcion detallada de la invencion
Espedficamente, la presente invencion proporciona una poblacion de celulas madre de amnios-corion adherentes aisladas, en donde dichas celulas madre de amnios-corion expresan el gen SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mayor que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea (BM-MSC) que se han cultivado en condiciones equivalentes y se han sometido al mismo numero de pases en cultivo que dichas celulas madre de amnios-corion, y en donde dichas celulas madre de amnios-corion son: CD10+, CD34', CD105+ y CD200+.
Segun una realizacion, las celulas madre de amnios-corion dentro de la poblacion de celulas son ademas CD90+ y CD45'. En una realizacion adicional las celulas madre de amnios-corion tienen la capacidad de diferenciarse en celulas que tienen caractensticas de celulas neuronales.
Segun otra realizacion, las celulas madre de amnios-corion expresan SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mas elevado que un numero equivalente de BM-MSC durante 3, durante 11-14 o durante 24-38 duplicaciones de la poblacion. En una realizacion, las celulas expresan SLC12A8 a un nivel al menos tres veces mas elevado que un numero equivalente de BM-MSC.
Segun una realizacion adicional, la poblacion de celulas de la invencion comprende 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5x 1010, o 1 x 1011 celulas madre de amnios-corion.
Segun una realizacion adicional, la poblacion de celulas se ha sometido a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40, o mas, duplicaciones de la poblacion.
Segun una realizacion adicional, las celulas madre de amnios-corion expresan SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mas elevado que un numero equivalente de BM-MSC cuando dichas celulas madres de amnios-corion y dichas celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea se cultivan en un medio que comprende DMEM-LG 60 % y MCDB-201 40 %; suero fetal de ternero 2 %, 1x insulina-transferrina-selenio, 1x acido linolenico-albumina de suero bovino, dexametasona 10'9 M, acido 2-fosfato ascorbico 10'4 M, factor de crecimiento epidermico 10 ng/ml, y factor de crecimiento derivado de plaquetas 10 ng/ml.
Segun una realizacion adicional, las celulas madre de amnios-corion tienen la capacidad de replicarse de 10 a 40 veces en cultivo.
Segun una realizacion adicional, las celulas madre de amnios-corion se han sometido a un pase de 5 a 10 veces. Segun una realizacion adicional, las celulas madre de amnios-corion se diferencian en celulas que tienen una caractenstica de celulas condrogenicas cuando se cultivan en DMEM que comprende 15 % de suero de sangre del cordon y 0,01 |ig/ml de factor de crecimiento transformante beta (TGFp); y en donde dicha caractenstica de celulas condrogenicas es tincion positiva con colorante azul alcian.
Segun una realizacion adicional, las celulas madre de amnios-corion se diferencian en celulas que tienen una caractenstica de celulas osteogenicas cuando se cultivan en DMEM que comprende 15 % de suero de sangre del cordon, dexametasona 0,1 |iM, 2-fosfato de acido ascorbico 0,05 mM, y beta glicerofosfato 10 mM; y en donde dicha caractenstica de celulas osteogenicas se demuestra mediante tincion con colorante de von Kossa o produccion de ARNm para fosfatasa alcalina segun lo determinado por RT-PCR.
Segun una realizacion adicional, al menos el 90% o al menos el 99% de las celulas madre de amnios-corion son de origen no materno.
La invencion proporciona ademas una composicion que comprende las celulas madre de amnios-corion adherentes aisladas de la invencion, en donde la composicion esta en una forma adecuada para la administracion intravenosa. En aun un aspecto adicional, la invencion, proporciona un metodo de produccion de una poblacion de celulas madre de amnios-corion de la invencion, que comprende identificar celulas madre de amnios-corion adherentes que expresan SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mayor que un numero equivalente de BM-MSCs que se han cultivado en condiciones equivalentes y se han sometido al mismo numero de pases en cultivo que dichas celulas madre de amnios-corion, y aislar dichas celulas madre de amnios-corion, en donde dichas celulas madre de amnioscorion son CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+.
Dentro de los lfmites de la presente invencion, la referencia a celulas madre de amnios-corion de la invencion en la siguiente descripcion implica que dichas celulas expresan el gen SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mas elevado que un numero equivalente de BM-MSC, tal como se define en las reivindicaciones.
5.1 CELULAS MADRE PLACENTARIAS Y POBLACIONES DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS
Las celulas madre placentarias son celulas madre, obtenibles de una placenta o parte de la misma, que se adhieren a un sustrato para cultivo tisular y tienen la capacidad de diferenciarse en tipos de celulas no placentarias. Las celulas madre placentarias pueden ser de origen fetal o materno (es decir, pueden tener el genotipo del feto o de la madre, respectivamente). Preferiblemente, las celulas madre placentarias y las poblaciones de celulas madre placentarias de la invencion son de origen fetal. Las poblaciones de celulas madre placentarias, o poblaciones de celulas que comprenden celulas madre placentarias, pueden comprender celulas madre placentarias que son exclusivamente de origen fetal o materno, o pueden comprender una poblacion mixta de celulas madre placentarias de origen tanto fetal como materno. Las celulas madre placentarias, y poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre placentarias, pueden identificarse y seleccionarse mediante las caractensticas morfologicas, de marcador y de cultivo descritas a continuacion.
5.1.1 Caractensticas fisicas y morfologicas
Las celulas madre placentarias de la presente invencion, cuando se cultivan en cultivos primarios o en cultivo celular, se adhieren al sustrato para cultivo tisular, p. ej., la superficie de un recipiente para cultivo tisular (p. ej., plastico para cultivo tisular). Las celulas madre placentarias en cultivo asumen un aspecto estrellado generalmente fibroblastoide, con una serie de procesos citoplasmaticos que se extienden desde el cuerpo celular central. Las celulas madre placentarias son, sin embargo, morfologicamente diferenciables de fibroblastos cultivados en las mismas condiciones, dado que las celulas madre placentarias muestran un mayor numero de dichos procesos que los fibroblastos. Morfologicamente, las celulas madre placentarias tambien son diferenciables de celulas madre hematopoyeticas, que generalmente asumen una morfologfa mas redondeada o de adoqum en cultivo.
5.1.2 Marcadores moleculares y geneticos de la superficie celular
Las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, y poblaciones de celulas madre placentarias, expresan una pluralidad de marcadores que pueden usarse para identificar y/o aislar las celulas madre, o poblaciones de celulas que comprenden las celulas madre. Las celulas madre placentarias, y poblaciones de celulas madre descritas en la presente memoria (es decir, dos o mas celulas madre placentarias) incluyen celulas madre y poblaciones de celulas que contienen celulas madre obtenidas directamente de la placenta, o cualquier parte de la misma (p. ej., amnios, corion, cotiledones placentarios, y similares). Poblaciones de celulas madre placentarias tambien incluyen poblaciones de (es decir, dos o mas) celulas madre placentarias en cultivo, y una poblacion en un recipiente, p. ej., una bolsa. Las celulas madre placentarias no son, sin embargo, trofoblastos.
Las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria generalmente expresan los marcadores CD73, CD105, CD200, HLA-G y/o OCT-4, y no expresan CD34, CD38 o CD45. Las celulas madre placentarias tambien pueden expresar HLA-ABC (MHC-1) y HLA-DR. Estos marcadores pueden usarse para identificar celulas madre placentarias, y para distinguir celulas madre placentarias de otros tipos de celulas madre. Dado que las celulas madre placentarias pueden expresar CD73 y CD105, pueden tener caractensticas similares a celulas madre mesenquimatosas. Sin embargo, dado que las celulas madre placentarias pueden expresar CD200 y HLA-G, un marcador espedfico fetal, pueden distinguirse de las celulas madre mesenquimatosas, p. ej., celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea, que no expresan CD200 ni HLA-G. De la misma manera, la falta de expresion de CD34, CD38 y/o CD45 identifica las celulas madre placentarias como celulas madre no hematopoyeticas.
Por lo tanto, en un aspecto, en la presente memoria se describe una celula madre aislada que es CD200+ o HLA-G+. En otro aspecto, dicha celula madre es una celula madre placentaria. En un aspecto la celula madre es CD200+ y HLA-G+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' o CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' y CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38', CD45', CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha celula madre CD200+ o HLA-G+ facilita la formacion de cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende las celulas madre, en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria es aislada de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria es aislada de celulas madre placentarias que no presentan estos marcadores.
En la presente memoria tambien se describe un metodo de seleccion de una celula madre placentaria entre una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una celula placentaria CD200+ o HLA-G+, con lo que dicha celula es una celula madre placentaria. En un aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tanto CD200+ como HLA-G+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD34', CD38' o CD45'. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD34', CD38' y CD45'. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD34', CD38', CD45', CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien facilita la formacion de cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende las celulas madre, en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una poblacion aislada de celulas que comprende, p. ej., que esta enriquecida en, celulas madre CD200+, HLA-G+. En un aspecto, dicha poblacion es una poblacion de celulas placentarias. En diversos aspectos, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 % o al menos aproximadamente 60 % de dichas celulas son celulas madre CD200+, HLA-G+. Preferiblemente, al menos aproximadamente 70 % de dichas celulas son celulas madre CD200+, HLA-G+. Mas preferiblemente, al menos aproximadamente 90 %, 95 % o 99 % de dichas celulas son celulas madre CD200+, HLA-G+. En otro aspecto de las poblaciones aisladas, dichas celulas madre son ademas CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dichas celulas madre son ademas CD34-, CD38- o CD45- En otro aspecto, dichas celulas madre son ademas CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha poblacion aislada produce uno o mas cuerpos de tipo embrioide cuando se cultivan en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estos marcadores.
En la presente memoria tambien se describe un metodo de seleccion de una poblacion de celulas madre placentarias entre una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una poblacion de celulas placentarias en donde al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 95 % de dichas celulas son celulas madre CD200+, HLA-G+. En un aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que son tambien CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que son tambien CD34-, CD38- o CD45- En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que son tambien CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha seleccion tambien comprende seleccionar una poblacion de celulas madre placentarias que forma uno o mas cuerpos de tipo embrioide, cuando se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una celula madre aislada que es CD73+, CD105+ y CD200+. En un aspecto, dicha celula madre aislada es una celula madre placentaria aislada. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre es HLA-G+. En otro aspecto, dicha celula madre puede es CD34-, CD38- o CD45-. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34-, CD38- y CD45-. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34-, CD38-, CD45- y HLA-G+. En otro aspecto, la celula madre CD73+, CD105+ y CD200+ aislada facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre, cuando la poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estos marcadores.
En la presente memoria se describe un metodo de seleccion de una celula madre placentaria entre una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una celula placentaria CD73+, CD105+, y CD200+, con lo que dicha celula es una celula madre placentaria. En un aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien HLA-G+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD34', CD38' o CD45'. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD34- CD38' y CD45'. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD34', CD38', CD45' y HLA-G+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende adicionalmente seleccionar una celula madre CD73+, CD105+ y CD200+ que facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre, cuando la poblacion se cultiva en condiciones que facilitan la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una poblacion aislada de celulas que comprende, p. ej., que esta enriquecida en, celulas madre CD73+, CD105+, CD200+. En un aspecto, dichas celulas madre son celulas madre placentarias. En diversos aspectos, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 % o al menos aproximadamente 60 % de dichas celulas son celulas madre CD73+, CD105+, CD200+. En otro aspecto, al menos aproximadamente 70 % de dichas celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre CD73+, CD105+, CD200+. En otro aspecto, al menos aproximadamente 90 %, 95 % o 99 % de dichas celulas en dicha poblacion de celulas son celulas madre CD73+, CD105+, CD200+. En otro aspecto, dichas celulas madre son HLA-G+. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34- CD38' o CD45'. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34', CD38' y CD45- En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34', CD38', CD45' y HLA-G+. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas produce uno o mas cuerpos de tipo embrioide cuando se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otro aspecto, se describe en la presente memoria, dicha poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas.
Ademas, en la presente memoria tambien se describe un metodo de seleccion de una poblacion de celulas madre placentarias entre una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una poblacion de celulas placentarias en donde al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 95 % de dichas celulas son celulas madre CD73+, CD105+, CD200+. En un aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que tambien son HLA-G+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que son tambien CD34', CD38' o CD45- En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que son tambien CD34-, CD38- y CD45-. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que son tambien CD34-, CD38-, CD45- y HLA-G+. En otro aspecto, dicha seleccion adicionalmente comprende seleccionar una poblacion de celulas placentarias que produce uno o mas cuerpos de tipo embrioide, cuando la poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
En la presente memoria tambien se describe una celula madre aislada que es CD200+ y OCT-4+. En un aspecto, la celula madre es CD73+ y CD105+. En otro aspecto, la celula madre es una celula madre placentaria. En otro aspecto, dicha celula madre es HLA-G+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34-, CD38- o CD45-. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34-, CD38- y CD45-. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otro aspecto, la celula madre facilita la produccion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide por una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre, cuando la poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estos marcadores.
En la presente memoria tambien se describe un metodo de seleccion de una celula madre placentaria entre una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una celula placentaria CD200+ y OCT-4+, con lo que dicha celula es una celula madre placentaria. En un aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien HLA-G+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD34-, CD38- o CD45-. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD34-, CD38- y CD45-. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD34-, c D38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula madre placentaria que tambien facilita la produccion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide por una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre, cuando la poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
En la presente memoria tambien se describe una poblacion aislada de celulas que comprende, p. ej., que esta enriquecida en, celulas madre CD200+, OCT-4+. En diversos aspectos, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 % o al menos aproximadamente 60 % de dichas celulas son celulas madre CD200+, OCT-4+. En otro aspecto, al menos aproximadamente 70 % de dichas celulas son dichas celulas madre CD200+, OCT-4+. En otro aspecto, al menos aproximadamente 90 %, 95 % o 99 % de dichas celulas son dichas celulas madre CD200+ OCT-4+. En otro aspecto de las poblaciones aisladas, dichas celulas madre son CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dichas celulas madre son HLA-G+. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34-, CD38- y CD45-. En aun otro aspecto, dichas celulas madre son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otro aspecto, la poblacion produce uno o mas cuerpos de tipo embrioide, cuando se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas.
En la presente memoria se describe un metodo de seleccion de una poblacion de celulas madre placentarias entre una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una poblacion de celulas placentarias en donde al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 % al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 95 % de dichas celulas son celulas madre CD200+, OCT-4+. En un aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que son tambien CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que son tambien HLA-G+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar celulas madre que son tambien CD34-, CD38- y CD45-. En otro aspecto, dichas celulas madre son tambien CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G+.
En la presente memoria tambien se describe una celula madre aislada que es CD73+, CD105+ y HLA-G+. En un aspecto, la celula madre es una celula madre placentaria. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34-, CD38- o c D45-. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34-, CD38- y CD45-. En otro aspecto, dicha celula madre es OCT-4+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD200+. En un aspecto, dicha celula madre tambien es CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otro aspecto, dicha celula madre facilita la formacion de cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre, cuando la poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas.
En la presente memoria tambien se describe un metodo de seleccion de una celula madre placentaria entre una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una celula placentaria CD73+, CD105+ y HLA-G+, con lo que dicha celula es una celula madre placentaria. En un aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD34-, CD38- o CD45-. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD34-, CD38- y CD45-. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien OCT-4+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD200+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que es tambien CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otro aspecto, dicha seleccion comprende seleccionar una celula placentaria que tambien facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre, cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
En la presente memoria tambien se describe una poblacion aislada de celulas que comprende, p. ej., que esta enriquecida en, celulas madre CD73+, CD105+ y HLA-G+. En un aspecto, dichas celulas madre son celulas madre placentarias. En diversos aspectos, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 % o al menos aproximadamente 60 % de dichas celulas son celulas madre CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otro aspecto, al menos aproximadamente 70 % de dichas celulas son CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otro aspecto, al menos aproximadamente 90 %, 95 % o 99 % de dichas celulas son celulas madre CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otro aspecto de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son CD34- CD38' o CD45'. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34- CD38' y CD45'. En otro aspecto, dichas celulas madre son OCT-4+. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD200+. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34', CD38- CD45- OCT-4+ y CD200+. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas.
En la presente memoria se describe un metodo de seleccion de una poblacion de celulas madre placentarias entre una pluralidad de celulas placentarias, que comprende seleccionar una poblacion de celulas placentarias en donde una mayona de dichas celulas son CD73+, CD105+ y HLA-G+. En un aspecto, dicha mayona de celulas son tambien CD34', CD38' y/o CD45'. En otro aspecto, dicha mayona de celulas son tambien CD200+. En otro aspecto, dicha mayona de celulas son tambien CD34- CD38- CD45- OCT-4+ y CD200+.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una celula madre aislada que es CD73+ y CD105+ y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende dicha celula madre, cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En un aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' o CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD34', CD38' y CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es OCT4+. En otro aspecto, dicha celula madre es OCT4+, CD34', CD38' y CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas.
En la presente memoria tambien se describe una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende, p. ej., que esta enriquecida en, celulas madre CD73+, CD105+, en donde dicha poblacion forma uno o mas cuerpos de tipo embrioide en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En diversos aspectos, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 % al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre CD73+, CD105+. En otro aspecto de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son CD34', CD38' o CD45'. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34', CD38' y CD45- En otro aspecto, dichas celulas madre son OCT-4+. En otro aspecto, dichas celulas madre son OCT-4+, CD34- CD38' y CD45'. En otros aspectos, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, se ha sometido a un pase al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces o al menos 20 veces. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas.
En la presente memoria tambien se describe una celula madre aislada que es OCT-4+ y que facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias aisladas que comprende dicha celula madre cuando se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En un aspecto, dicha celula madre es CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dicha celula madre es c D34‘, CD38' o CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre es CD200+. En otro aspecto, dicha celula madre es CD73+, CD105+, CD200+, CD34', c D38‘ y CD45'. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas.
En la presente memoria tambien se describe una poblacion de celulas aisladas que comprende, p. ej., que esta enriquecida en, celulas madre OCT-4+, en donde dicha poblacion forma uno o mas cuerpos de tipo embrioide, cuando se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide. En diversos aspectos, al menos 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 % al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 95 % de dichas celulas placentarias aisladas son celulas madre OCT4+. En algunos aspectos de las poblaciones anteriores, dichas celulas madre son CD73+ y CD105+. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD34-, CD38- o CD45-. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD200+. En otro aspecto, dichas celulas madre son CD73+, CD105+, CD200+, Cd34-, CD38- y CD45-. En otro aspecto, dicha poblacion ha sido expandida, por ejemplo, se ha sometido a un pase al menos una vez, al menos tres veces, al menos cinco veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces o al menos 20 veces. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas.
En otra realizacion, la invencion tambien proporciona una celula madre amnios-corion adherentes aislada que es CD10+, CD34-, CD105+ y CD200+. La invencion proporciona ademas una poblacion aislada de celulas madre placentarias, en donde al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 99 % de dichas celulas madre placentarias son CD10+, c D34-, CD105+, CD200+. En una realizacion espedfica de las realizaciones anteriores, dichas celulas madre son adicionalmente CD90+ y CD45-. En una realizacion espedfica, dicha celula madre o poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre o poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas. En otra realizacion espedfica, dicha celula madre placentaria aislada es de origen no materno. En otra realizacion espedfica, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 99 % de dichas celulas en dicha poblacion aislada de celulas madre placentarias, son de origen no materno.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una celula madre placentaria aislada que es HLA-A,B,C, CD45-, CD133- y CD34-. La descripcion describe ademas una poblacion aislada de celulas madre placentarias, en donde al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 99 % de dichas celulas madre placentarias son HLA-A,B,C-, CD45-, CD133- y CD34-. En un aspecto, dicha celula madre o poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria aislada es de origen no materno. En otro aspecto, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 99 % de dichas celulas en dicha poblacion aislada de celulas madre placentarias, son de origen no materno. En otro aspecto, se describe en la presente memoria un metodo de obtencion de una celula madre placentaria que es HLA-A,B,C-, CD45-, CD133- y CD34- que comprende aislar dicha celula del perfundido placentario.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una celula madre placentaria aislada que es CD10+ CD13+, CD33+, c D45- CD117- y CD133-. La descripcion describe ademas una poblacion aislada de celulas madre placentarias, en donde al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 99 % de dichas celulas madre placentarias son CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- y CD133-. En un aspecto, dicha celula madre o poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria aislada es de origen no materno. En otro aspecto, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 99 % de dichas celulas en dicha poblacion aislada de celulas madre placentarias, son de origen no materno. En otro aspecto, dicha celula madre o poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de obtencion de una celula madre placentaria que es CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- y CD133- que comprende aislar dicha celula del perfundido placentario.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una celula madre placentaria aislada que es CD10-, CD33-, CD44+, CD45- y CD117-. La descripcion describe ademas una poblacion aislada de celulas madre placentarias, en donde al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 99 % de dichas celulas madre placentarias son CD10-, CD33-, CD44+, CD45- y CD117-. En un aspecto, dicha celula madre o poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria aislada es de origen no materno. En otro aspecto, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos 99 % de dichas celulas en dicha poblacion aislada de celulas madre placentarias, son de origen no materno. En otro aspecto, dicha celula madre o poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de obtencion de una celula madre placentaria que es CD10-, CD33-, CD44+, CD45+, CD117- que comprende aislar dicha celula del perfundido placentario.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una celula madre placentaria aislada que es CD10-, CD13-, CD33-, CD45- y CD117-. La descripcion describe ademas una poblacion aislada de celulas madre placentarias, en donde al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 99 % de dichas celulas madre placentarias son CD10-, CD13-, CD33-, CD45- y CD117-. En un aspecto, dicha celula madre o poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria aislada es de origen no materno. En otro aspecto, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos 99 % de dichas celulas en dicha poblacion aislada de celulas madre placentarias, son de origen no materno. En otro aspecto, dicha celula madre o poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas. En otro aspecto, se describe en la presente memoria un metodo de obtencion de una celula madre placentaria que es CD10-, CD13-, CD33-, CD45-, y CD117+ que comprende aislar dicha celula del perfundido placentario.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una celula madre placentaria aislada que es HLA A,B,C-. CD45-, CD34-, CD133-, positiva para CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 y/o HLA-G, y/o negativa para CD117. La descripcion describe ademas una poblacion aislada de celulas madre placentarias, en donde dichas celulas madre son HlA A,B,C-, CD45-, CD34-, CD133-, y al menos aproximadamente 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o aproximadamente 99 % de las celulas madre en la poblacion son positivas para CD10, CD13, CD38, CD44, Cd9o, CD105, CD200 y/o HLA-G, y/o negativas para CD 117. En un aspecto, dicha celula madre o poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas placentarias que no son celulas madre. En otro aspecto, dicha celula madre placentaria aislada es de origen no materno. En otro aspecto, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 99 %, de dichas celulas en dicha poblacion aislada de celulas madre placentarias, son de origen no materno. En otro aspecto, dicha celula madre o poblacion de celulas madre placentarias se afsla de celulas madre placentarias que no presentan estas caractensticas. En otro aspecto, se describe en la presente memoria un metodo de obtencion de una celula madre placentaria que es HLA A,B,C-, CD45-, CD34-, CD133- y positiva para CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 y/o HLA-G, y/o negativa para CD117, que comprende aislar dicha celula del perfundido placentario.
En otro aspecto, en la presente memoria se describe una celula madre placentaria que es CD200+ y CD10+, segun lo determinado por union a anticuerpos, y CD117', segun lo determinado tanto por union a anticuerpos como por RT-PCR. En otro aspecto, en la presente memoria se describe una celula madre placentaria que es CD10+, CD29-, CD54+, CD200+, HLA-G+, HLA de clase I- y p-2-microglobulina'. En otro aspecto, en la presente memoria se describen celulas madre placentarias, en donde la expresion de al menos un marcador es al menos dos veces mayor que para una celula madre mesenquimatosa (p. ej., una celula madre mesenquimatosa obtenida a partir de medula osea). En otra realizacion espedfica, dicha celula madre placentaria aislada es de origen no materno. En otra realizacion espedfica, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos 99 %, de dichas celulas en dicha poblacion aislada de celulas madre placentarias, son de origen no materno.
En la presente memoria se describe una poblacion aislada de celulas madre placentarias, en donde una pluralidad de dichas celulas madre placentarias son positivas para aldehfdo deshidrogenasa (ALDH), segun lo evaluado mediante un ensayo de actividad aldehfdo deshidrogenasa. Dichos ensayos son conocidos en la tecnica (vease, p. ej., Bostian y Betts, Biochem. J., 173, 787, (1978)). En un aspecto espedfico, dicho ensayo de ALDH usa ALDEFLUOR® (Aldagen, Inc., Ashland, Oregon) como marcador de actividad aldehfdo deshidrogenasa. En un aspecto espedfico, dicha pluralidad esta entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 25 % de celulas en dicha poblacion de celulas. En otro aspecto, se describe en la presente memoria una poblacion de celulas madre de cordon umbilical, en donde una pluralidad de dichas celulas madre de cordon umbilical son positivas para aldehfdo deshidrogenasa, segun lo evaluado mediante un ensayo de actividad aldehfdo deshidrogenasa que usa ALDEFLUOR® como un indicador de actividad aldehfdo deshidrogenasa. En un aspecto espedfico, dicha pluralidad esta entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 25 % de celulas en dicha poblacion de celulas. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias o celulas madre de cordon umbilical muestra al menos tres veces, o al menos cinco veces, mayor actividad de ALDH que una poblacion de celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea, que tiene el mismo numero de celulas y se cultiva en las mismas condiciones.
En la presente invencion se describen cualquiera de las celulas madres placentarias anteriores, o poblaciones de celulas madre placentarias, en donde la celula madre o poblacion de celulas madre placentarias se ha sometido a un pase al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 veces, o mas, o se ha expandido para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40 duplicaciones de la poblacion, o mas.
En una realizacion espedfica de cualquiera de las anteriores celulas placentarias o poblaciones de celulas, el cariotipo de las celulas, o al menos aproximadamente 95 % o aproximadamente 99 % de las celulas en dicha poblacion, es normal. En otra realizacion espedfica de cualquiera de las anteriores celulas placentarias o poblaciones de celulas, las celulas, o celulas en la poblacion de celulas, son de origen no materno.
Celulas madre placentarias aisladas, o poblaciones de celulas madre placentarias aisladas, que portan cualquiera de las anteriores combinaciones de marcadores, pueden combinarse en cualquier proporcion. En la presente memoria tambien se describe el aislamiento de, o el enriquecimiento en, dos o mas cualesquiera de las anteriores poblaciones de celulas madre placentarias para formar una poblacion de celulas madre placentarias. Por ejemplo, en la presente memoria se describe una poblacion aislada de celulas madre placentarias que comprende una primera poblacion de celulas madre placentarias definida por una de las combinaciones de marcadores descritas anteriormente y una segunda poblacion de celulas madre placentarias definidas por otra de las combinaciones de marcadores descritas anteriormente, en donde dichas primera y segunda poblaciones se combinan en una proporcion de aproximadamente 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, o aproximadamente 99:1. De forma similar, cualesquiera tres, cuatro, cinco o mas de las celulas madre placentarias o poblaciones de celulas madre placentarias descritas anteriormente pueden combinarse.
La invencion se refiere, ademas, a celulas madre placentarias que se obtienen por ruptura de tejido placentario, con o sin digestion enzimatica, seguida por cultivo (vease la Seccion 5.2.3) o perfusion (vease la Seccion 5.2.4). Por ejemplo, se describe en la presente memoria una poblacion aislada de celulas madre placentarias que se produce de acuerdo con un metodo que comprende perfundir una placenta de mairnfero a la que se le ha drenado la sangre del cordon umbilical y ha sido perfundida para eliminar la sangre residual; perfundir dicha placenta con una solucion de perfusion; y recoger dicha solucion de perfusion, en donde dicha solucion de perfusion despues de la perfusion comprende una poblacion de celulas placentarias que comprende celulas madre placentarias; y aislar una pluralidad de dichas celulas madre placentarias de dicha poblacion de celulas. En un aspecto espedfico, se hace pasar a la solucion de perfusion a traves de tanto la vena umbilical como de arterias umbilicales y es recogida despues de que exuda de la placenta. Poblaciones de celulas madre placentarias producidas mediante este metodo tfpicamente comprenden una mezcla de celulas fetales y maternas. En otro aspecto espedfico, se hace pasar a la solucion de perfusion a traves de la vena umbilical y se recoge de las arterias umbilicales, o se hace pasar a traves de las arterias umbilicales y se recoge de la vena umbilical. Poblaciones de celulas madre placentarias producidas mediante este metodo tfpicamente son de forma sustancial exclusivamente de origen fetal; es decir, p. ej., mas de 90 %, 95 %, 99 % o 99,5 % de las celulas madre placentarias en la poblacion son de origen fetal.
En diversos ejemplos, las celulas madre placentarias, contenidas dentro de una poblacion de celulas obtenidas a partir de perfusion de una placenta, son al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o al menos 99,5 % de dicha poblacion de celulas placentarias. En otro aspecto espedfico, las celulas madre placentarias recogidas por perfusion comprenden celulas fetales y maternas. En otro aspecto espedfico, las celulas madre placentarias recogidas por perfusion son al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o al menos 99,5 % celulas fetales. En la presente memoria tambien se describe una composicion que comprende una poblacion de celulas madre placentarias aisladas recogidas por perfusion, en donde dicha composicion comprende al menos una parte de la solucion de perfusion usada para recoger las celulas madre placentarias.
En la presente memoria se describe una poblacion aislada de las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria que se produce de acuerdo con un metodo que comprende digerir tejido placentario con una enzima de ruptura de tejidos para obtener una poblacion de celulas placentarias que comprende celulas madre placentarias, y aislar una pluralidad de celulas madre placentarias del resto de dichas celulas placentarias. Toda, o cualquier parte de, la placenta puede digerirse para obtener celulas madre placentarias. Por ejemplo, dicho tejido placentario es una placenta completa, una membrana amniotica, corion, una combinacion de amnios y corion, o una combinacion de cualquiera de las anteriores. Espedficamente, la enzima de ruptura de tejidos es tripsina o colagenasa. En diversos ejemplos, las celulas madre placentarias, contenidas dentro de una poblacion de celulas obtenida a partir de la digestion de una placenta, son al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o al menos 99,5 % de dicha poblacion de celulas placentarias.
El perfilado genico confirma que las celulas madre placentarias aisladas, y poblaciones de celulas madre placentarias aisladas, son distinguibles de otras celulas, p. ej., celulas madre mesenquimatosas, p. ej., celulas madre obtenidas a partir de medula osea. Las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, pueden distinguirse de celulas madre mesenquimatosas tomando como base la expresion de uno o mas genes, cuya expresion es espedfica de celulas madre placentarias o celulas madre de cordon umbilical en comparacion con celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea. En particular, celulas madre placentarias pueden distinguirse de celulas madre mesenquimatosas tomando como base la expresion de uno o mas genes, cuya expresion es significativamente mayor (es decir, al menos dos veces mayor) en celulas madre placentarias que en celulas madre mesenquimatosas, en donde los uno o mas genes es(son) ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, ZC3H12A, o una combinacion de cualquiera de los anteriores, en donde la expresion de estos genes es mayor en celulas madre placentarias o celulas madre de cordon umbilical que en celulas madre obtenidas a partir de medula osea, cuando las celulas madre se cultivan en condiciones equivalentes. En un ejemplo, el gen espedfico de celulas madre placentarias o gen espedfico de celulas madre del cordon umbilical es CD200.
El nivel de expresion de estos genes puede usarse para confirmar la identidad de una poblacion de celulas placentarias, para identificar una poblacion de celulas que comprende al menos una pluralidad de celulas madre placentarias, o similares. La poblacion de celulas madre placentarias, cuya identidad esta confirmada, puede ser clonica, p. ej., una poblacion de celulas madre placentarias expandidas a partir de una unica celula madre placentaria, o una poblacion mixta de celulas madre, p. ej., una poblacion de celulas que comprende unicamente celulas madre placentarias que se expanden a partir de multiples celulas madre placentarias, o una poblacion de celulas que comprende celulas madre placentarias y al menos otro tipo de celulas.
El nivel de expresion de estos genes puede usarse para seleccionar poblaciones de celulas madre placentarias. Por ejemplo, una poblacion de celulas, p. ej., celulas expandidas de forma clonica, se selecciona si la expresion de uno o mas de estos genes es significativamente mayor en una muestra de la poblacion de celulas que es una poblacion equivalente de celulas madre mesenquimatosas. Dicha seleccion puede ser de una poblacion entre una pluralidad de poblaciones de celulas madre placentarias, entre una pluralidad de poblaciones de celulas, cuya identidad no se conoce, etc.
Celulas madre placentarias pueden seleccionarse tomando como base el nivel de expresion de uno o mas de dichos genes en comparacion con el nivel de expresion en dichos uno o mas genes en una celula madre mesenquimatosa de control. Por ejemplo, el nivel de expresion de dichos uno o mas genes en una muestra que comprende un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas se usa como control. En otro ejemplo, el control, para celulas madre placentarias sometidas a ensayo en ciertas condiciones, es un valor numerico que representa el nivel de expresion de dichos uno o mas genes en celulas madre mesenquimatosas en dichas condiciones.
Las celulas madre placentarias de la invencion presentan las caractensticas anteriores (p. ej., combinaciones de marcadores de la superficie celular y perfiles de expresion genica) en cultivo primario, o durante la proliferacion en medio que comprende DMEM-LG (Gibco) 60 %, MCDB-201(Sigma) 40 %, suero fetal de ternero (Fc S) 2 % (Hyclone Laboratories), 1x insulina-transferrina-selenio (ITS), 1x acido linolenico-albumina de suero bovino (LA-BSA), dexametasona 10'9M (Sigma), 2-fosfato de acido ascorbico 10'4M (Sigma), factor de crecimiento epidermico (EGF)
10 ng/ml (R&D Systems), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/ml (R&D Systems) y 100 U de penicilina/1000 U de estreptomicina.
Las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas descritas anteriormente, y poblaciones de celulas madre placentarias en general, pueden comprender aproximadamente, al menos, o no mas de, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x
106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 10 5.1.3 Crecimiento en cultivo
El crecimiento de las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, como ocurre con cualquier celula de mairnfero, depende en parte del medio particular seleccionado para el crecimiento. En condiciones optimas, celulas madre placentarias tfpicamente doblan su numero en 3-5 dfas. Durante el cultivo, las celulas madre placentarias de la invencion se adhieren a un sustrato en cultivo, p. ej., la superficie de un recipiente para cultivo tisular (p. ej., placa de plastico para cultivo tisular, plastico revestido de fibronectina, y similares) y forman una monocapa.
Poblaciones de celulas placentarias aisladas que comprenden las celulas madre placentarias de la invencion, cuando se cultivan en condiciones apropiadas, forman cuerpos de tipo embrioide, es decir, agrupaciones tridimensionales de celulas crecen encima de la capa de celulas madre adherentes. Las celulas dentro de los cuerpos de tipo embrioide expresan marcadores asociados con celulas madre muy tempranas, p. ej., OCT-4, Nanog, SSEA3 y SSEA4. Las celulas dentro de los cuerpos de tipo embrioide tfpicamente no son adherentes al sustrato de cultivo, como lo son las celulas madre placentarias descritas en la presente memoria, sino que permanecen fijadas a las celulas adherentes durante el cultivo. Las celulas de los cuerpos de tipo embrioide dependen de las celulas madre placentarias adherentes para la viabilidad, dado que los cuerpos de tipo embrioide no se forman en ausencia de las celulas madre adherentes. Las celulas madre placentarias adherentes facilitan de este modo el crecimiento de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprenden las celulas madre placentarias adherentes. Sin desear quedar limitados por la teona, se cree que las celulas de los cuerpos de tipo embrioide crecen sobre las celulas madre placentarias adherentes en gran medida como las celulas madre embrionarias crecen sobre una capa alimentadora de celulas. Las celulas madre mesenquimatosas, p. ej., celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea, no desarrollan cuerpos de tipo embrioide en cultivo.
5.2 METODOS DE OBTENCION DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS
5.2.1 Composicion de recogida de celulas madre
La presente descripcion se refiere ademas a metodos de recogida y de aislamiento de celulas madre placentarias.
Generalmente, las celulas madre se obtienen de una placenta de mamffero usando una solucion fisiologicamente aceptable, p. ej., una composicion de recogida de celulas madre. Una composicion de recogida de celulas madre se describe en detalle en la solicitud provisional de Estados Unidos relacionada N° 60/754.969, titulada “Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs”, presentada el 29 de diciembre de 2005.
La composicion de recogida de celulas madre puede comprender cualquier solucion fisiologicamente aceptable adecuada para la recogida y/o el cultivo de celulas madre, por ejemplo, una solucion salina (p. ej., solucion salina tamponada con fosfato, solucion de Kreb, solucion de Kreb modificada, solucion de Eagle, NaCl a 0,9 %. etc.), un medio de cultivo (p. ej., DMEM, H.DMEM, etc.), y similares.
La composicion de recogida de celulas madre puede comprender uno o mas componentes que tienden a conservar celulas madre placentarias, es decir, impedir que las celulas madre placentarias mueran, o retardar la muerte de las celulas madre placentarias, reducir el numero de celulas madre placentarias en una poblacion de celulas que mueren, o similares, desde el momento de la recogida hasta el momento del cultivo. Dichos componentes pueden ser, p. ej., un inhibidor de la apoptosis (p. ej., un inhibidor de caspasa o inhibidor de JNK); un vasodilatador (p. ej.,
sulfato de magnesio, un farmaco hipotensor, peptido natriuretico auricular (ANP), adrenocorticotropina, hormona liberadora de corticotropina, nitroprusiato de sodio, hidralazina, adenosina trifosfato, adenosina, indometacina o sulfato de magnesio, un inhibidor de fosfodiesterasa, etc.); un inhibidor de necrosis (p. ej., 2-(1H-Indol-3-il)-3-pentilamino-maleimida, ditiocarbamato de pirrolidina, o clonazepam); un inhibidor de TNF-a; y/o un perfluorocarbono portador de ox^geno (p. ej., bromuro de perfluorooctilo, bromuro de perfluorodecilo, etc.).
La composicion de recogida de celulas madre puede comprender una o mas enzimas que degradan el tejido, p. ej., una metaloproteasa, una serina proteasa, una proteasa neutra, una ribonucleasa, o una desoxirribonucleasa, o similares. Dichas enzimas incluyen, aunque sin limitarse a, colagenasas (p. ej., colagenasa I, II, III o IV, una colagenasa de Clostridium histolyticum, etc.); dispasa, termolisina, elastasa, tripsina, LIBERASA, hialuronidasa y similares.
La composicion de recogida de celulas madre puede comprender una cantidad eficaz de un antibiotico desde el punto de vista bactericida o bacterioestatico. En ciertos ejemplos no limitantes, el antibiotico es un macrolido (p. ej., tobramicina), una cefalosporina (p. ej., cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixima o cefadroxilo), una claritromicina, una eritromicina, una penicilina (p. ej., penicilina V) o una quinolona (p. ej., ofloxacina, ciprofloxacina o norfloxacina), una tetraciclina, una estreptomicina, etc. En un ejemplo particular, el antibiotico es activo contra bacterias Gram(+) y/o Gram(-), p. ej., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, y similares. La composicion de recogida de celulas madre tambien puede comprender uno o mas de los siguientes compuestos: adenosina (aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM); D-glucosa (aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM); iones magnesio (aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM); una macromolecula de peso molecular mayor de 20.000 daltons, en un ejemplo, presente en una cantidad suficiente para mantener la integridad endotelial y viabilidad celular (p. ej., un coloide de origen natural o sintetico, un polisacarido tal como dextrano o un polietilenglicol presente de aproximadamente 25 g/l a aproximadamente 100 g/l, o aproximadamente 40 g/l a aproximadamente 60 g/l); un antioxidante (p. ej., hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutation, vitamina C o vitamina E presentes de aproximadamente 25 |iM a aproximadamente 100 |iM); un agente reductor (p. ej., N-acetilcistema presente de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 5 mM); un agente que previene la entrada de calcio en las celulas (p. ej., verapamilo presente de aproximadamente 2 |iM a aproximadamente 25 |iM); nitroglicerina (p. ej., aproximadamente 0,05 g/l a aproximadamente 0,2 g/l); un anticoagulante, en un ejemplo, presente en una cantidad suficiente para ayudar a prevenir la coagulacion de sangre residual (p. ej., heparina o hirudina presentes a una concentracion de aproximadamente 1000 unidades/l a aproximadamente 100.000 unidades/l); o un compuesto que contiene amilorida, (p. ej., amilorida, etil isopropil amilorida, hexametilen amilorida, dimetil amilorida o isobutil amilorida presente de aproximadamente 1,0 |iM a aproximadamente 5 |iM).
5.2.2 Recogida y manipulacion de placenta
Generalmente, una placenta humana se recupera poco despues de su expulsion despues del nacimiento. En un aspecto preferido, la placenta se recupera de un paciente despues de que se recoge un consentimiento informado y un historial medico completo del paciente y se asocia con la placenta. Preferiblemente, el historial clmico continua despues del parto. Dicho historial clmico puede utilizarse para coordinar un uso posterior la placenta o las celulas madre recogidas de esta. Por ejemplo, pueden usarse celulas madre placentarias humanas, a la luz del historial clmico, para medicina personalizada para el lactante asociado con la placenta de la cual se obtiene el corion o para los padres, hermanos u otros familiares del lactante.
Antes de la recuperacion de celulas madre placentarias, la sangre del cordon umbilical y la sangre placentaria se retiran. En ciertos ejemplos, despues del parto, se recupera la sangre del cordon en la placenta. La placenta puede someterse a un proceso convencional de recuperacion de sangre del cordon. Tfpicamente se usa una aguja o canula, con la ayuda de la gravedad, para extraer toda la sangre de la placenta (vease, p. ej., Anderson, patente de Estados Unidos N° 5.372.581; Hessel et al., patente de Estados Unidos N° 5.415.665). La aguja o canula se coloca generalmente en la vena umbilical y la placenta puede masajearse suavemente para ayudar a drenar la sangre del cordon de la placenta. Dicha recuperacion de la sangre del cordon puede realizarse comercialmente, p. ej., LifeBank EE. UU., Cedar Knolls, N. J., ViaCord, Cord Blood Registry y Cryocell. Preferiblemente, la placenta se drena por gravedad sin manipulacion adicional para minimizar la ruptura del tejido durante la recuperacion de la sangre del cordon.
Tfpicamente, una placenta se transporta desde la sala de parto o alumbramiento a otra ubicacion, p. ej., un laboratorio, para la recuperacion de la sangre del cordon y la recogida de celulas madre mediante, p. ej., perfusion o disociacion tisular. La placenta preferiblemente se transporta en un dispositivo de transporte termicamente aislado, esteril (manteniendo la temperatura de la placenta entre 20-28 °C), por ejemplo, mediante la colocacion de la placenta, con el cordon umbilical proximal sujeto con una pinza, en una bolsa de plastico con cierre esteril, que se coloca entonces en un recipiente aislado. En otro ejemplo, la placenta se transporta en un kit de recogida de sangre del cordon umbilical sustancialmente tal como se describe en la solicitud de Patente de Estado Unidos pendiente de tramitacion N° 7.147.626. Preferiblemente, la placenta se entrega al laboratorio de cuatro a veinticuatro horas despues del parto. En ciertos ejemplos, el cordon umbilical proximo se pinza, preferiblemente dentro de los 4-5 cm (centfmetros) de la insercion en el disco placentario antes de la recuperacion de la sangre del cordon umbilical. En otros ejemplos, el cordon umbilical proximal se pinza despues de la recuperacion de la sangre del cordon umbilical pero antes de un procesamiento adicional de la placenta.
La placenta, antes de la recogida de celulas madre, puede almacenarse en condiciones esteriles y a temperatura ambiente o a una temperatura de 5 a 25 °C (cenffgrados). La placenta puede almacenarse durante un penodo de cuatro veinticuatro horas, hasta cuarenta y ocho horas o mayor de cuarenta y ocho horas antes de la perfusion de la placenta para retirar cualquier sangre del cordon umbilical residual. En un ejemplo, la placenta se recoge de entre aproximadamente cero horas a aproximadamente dos horas despues de la expulsion. La placenta se almacena preferiblemente en una solucion anticoagulante a una temperatura de 5 a 25 °C (cenffgrados). Las soluciones anticoagulantes adecuadas se conocen bien en la tecnica. Por ejemplo, puede usarse una solucion de heparina o warfarina sodica. En un aspecto preferido, la solucion anticoagulante comprende una solucion de heparina (p. ej., 1 % p/p en solucion 1:1000). La placenta exanguinada se almacena preferiblemente durante no mas de 36 horas antes de que se recojan las celulas madre placentarias.
La placenta de mairnfero o una parte de la misma, una vez recogida y preparada generalmente como anteriormente, puede tratarse de cualquier manera conocida en la tecnica, p. ej., puede perfundirse o romperse, p. ej., digerirse con una o mas enzimas de ruptura de tejidos, para obtener celulas madre.
5.2.3 Ruptura ffsica y digestion enzimatica de tejido placentario
En un aspecto, se recogen celulas madre de una placenta de mamffero mediante ruptura ffsica de parte o todo el organo. Por ejemplo, la placenta, o una parte de la misma, puede, p. ej., triturarse, cortarse, picarse, cortarse en cubos, trocearse, macerarse o similares. El tejido puede cultivarse a continuacion para obtener una poblacion de celulas madre. Tfpicamente, el tejido placentario se rompe usando, p. ej., una composicion de recogida de celulas madre (vease la Seccion 5.2.1 y a continuacion).
La placenta puede diseccionarse en componentes antes de la ruptura ffsica y/o la digestion enzimatica y la recuperacion de celulas madre. Pueden obtenerse celulas madre placentarias de toda o una parte de la membrana amniotica, el corion, el cordon umbilical, los cotiledones placentarios, o cualquier combinacion de las mismas, incluyendo de una placenta completa. Preferiblemente, las celulas madre placentarias se obtienen de tejido placentario que comprende amnios y corion. Tfpicamente, las celulas madre placentarias pueden obtenerse mediante ruptura de un pequeno bloque de tejido placentario, p. ej., un bloque de tejido placentario que tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o aproximadamente 1000 miffmetros cubicos de volumen. Puede usarse cualquier metodo de ruptura ffsica, siempre que el metodo de ruptura deje una pluralidad, mas preferiblemente una mayoffa, y mas preferiblemente al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de las celulas en dicho organo viables, segun lo determinado mediante, p. ej., exclusion con azul de tripano.
Las celulas madre pueden recogerse en general de una placenta, o parte de la misma, en cualquier momento en el plazo de aproximadamente los primeros tres dfas despues de la expulsion, pero preferiblemente entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 18 horas despues de la expulsion.
En un aspecto espedfico, el tejido roto se cultiva en medio de cultivo tisular adecuado para la proliferacion de celulas madre placentarias (vease, p. ej., la Seccion 5.3, a continuacion, que describe el cultivo de celulas madre placentarias).
En otro aspecto espedfico, se recogen celulas madre mediante ruptura ffsica de tejido placentario, en donde la ruptura ffsica incluye digestion enzimatica, que puede conseguirse mediante el uso de una o mas enzimas que digieren tejido. La placenta, o una parte de la misma, tambien puede romperse ffsicamente y digerirse con una o mas enzimas, y el material resultante sumergirse a continuacion en, o mezclarse con, una composicion de recogida de celulas madre.
Una composicion de recogida de celulas madre preferida comprende una o mas enzimas que rompen tejido. La digestion enzimatica usa preferiblemente una combinacion de enzimas, p. ej., una combinacion de una metaloproteasa de la matriz y una proteasa neutra, por ejemplo, una combinacion de colagenasa y dispasa. En un aspecto, la digestion enzimatica de tejido placentario usa una combinacion de una metaloproteasa de la matriz, una proteasa neutra, y una enzima mucofftica para digestion de acido hialuronico, tal como una combinacion de colagenasa, dispasa e hialuronidasa o una combinacion de LIBERASE (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.) e hialuronidasa. Otras enzimas que pueden usarse para romper tejido de la placenta incluyen papama, desoxirribonucleasas, serina proteasas, tales como tripsina, quimotripsina o elastasa. Las serina proteasas pueden inhibirse mediante alfa 2 microglobulina en suero y, por lo tanto, el medio usado para la digestion esta habitualmente libre de suero. EDTA y desoxirribonucleasa se usan habitualmente en procedimientos de digestion enzimatica para incrementar la eficiencia de la recuperacion de celulas. El producto de digestion se diluye preferiblemente para evitar atrapar celulas madre dentro del producto de digestion viscoso.
Puede usarse cualquier combinacion de enzimas de digestion tisular. Las concentraciones ffpicas para enzimas de digestion tisular incluyen, p. ej., 50-200 U/ml para colagenasa I y colagenasa IV, 1-10 U/ml para dispasa, y 10-100 U/ml para elastasa. Pueden usarse proteasas en combinacion, es decir, dos o mas proteasas en la misma reaccion de digestion, o puede usarse secuencialmente para liberar celulas madre placentarias. Por ejemplo, en un aspecto, una placenta o parte de la misma, es digerida en primer lugar con una cantidad apropiada de colagenasa I de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mg/ml durante, p. ej., 30 minutes, seguida por digestion con tripsina, a una concentracion de aproximadamente 0,25 %, durante, p. ej., 10 minutos, a 37 °C. Se usan are preferiblemente serina proteasas de forma consecutiva despues del uso de otras enzimas.
En otro aspecto, el tejido puede romperse ademas mediante la adicion de un quelante, p. ej., acido etilenglicol bis(2-aminoetil eter)-N,N,N'N'-tetraacetico (EGTA) o acido etilendiaminatetraacetico (EDTA) a la composicion de recogida de celulas madre que comprende las celulas madre o a una solucion en la cual el tejido se rompe y/o digiere antes del aislamiento de las celulas madre con la composicion de recogida de celulas madre.
En uno aspecto, una digestion puede desarrollarse de la siguiente manera. Aproximadamente un gramo de tejido placentario se obtiene y se pica. El tejido se digiere en 10 ml de una solucion que comprende aproximadamente 1 mg/ml de colagenasa 1a y aproximadamente 0,25 % de tripsina a 37 °C en un agitador a aproximadamente 100 RPM. El producto de digestion se lava tres veces con medio de cultivo, y las celulas lavadas se siembran en 2 matraces T-75. Las celulas se afslan a continuacion mediante adherencia diferencial, y se caracterizan para, p. ej., viabilidad, marcadores de la superficie celular, diferenciacion, y similares.
Se apreciara que donde una placenta completa, o parte de una placenta que comprende celulas tanto fetales como maternas (por ejemplo, donde la parte de la placenta comprende el corion o cotiledones), las celulas madre placentarias recogidas comprenderan una mezcla de celulas madre placentarias obtenidas a partir de fuentes tanto fetales como maternas. Donde una parte de la placenta que no comprende ninguna, o comprende un numero despreciable de, celulas maternas (por ejemplo, amnios), las celulas madre placentarias recogidas comprenderan casi exclusivamente celulas madre placentarias fetales.
Pueden aislarse celulas madre de tejido roto mediante tripsinizacion diferencial (vease la Seccion 5.2.5, a continuacion) seguida por cultivo en uno o mas nuevos recipientes de cultivo en medio de proliferacion fresco, opcionalmente seguido por una segunda etapa de tripsinizacion diferencial.
5.2.4 Perfusion de la placenta
Tambien pueden obtenerse celulas madre placentarias por perfusion de la placenta de marnffero. Metodos de perfusion de la placenta de marnffero para obtener celulas madre se describen, p. ej., en Hariri, publicacion de solicitud estadounidense N° 2002/0123141, y en la solicitud provisional de Estados Unidos relacionada N° 60/754.969, titulada “Improved Medium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs”, presentada el 29 de diciembre de 2005.
Pueden recogerse celulas madre placentarias mediante perfusion, p. ej., a traves de la vasculatura placentaria, usando, p. ej., una composicion de recogida de celulas madre como solucion de perfusion. En un aspecto, una placenta de mamffero se perfunde mediante el paso de solucion de perfusion a traves de cualquiera o ambas de la arteria umbilical y la vena umbilical. El flujo de solucion de perfusion a traves de la placenta puede conseguirse usando, p. ej., flujo por gravedad al interior de la placenta. Preferiblemente, la solucion de perfusion se hace pasar a traves de la placenta usando una bomba, p. ej., una bomba peristaltica. La vena umbilical puede, p. ej., canularse con una canula, p. ej., una canula de TEFLON® o plastico, que esta conectada a un aparato de conexion esteril, tales como un tubo esteril. El aparato de conexion esteril esta conectado a un colector de perfusion.
En preparacion para la perfusion, la placenta se orienta preferiblemente (p. ej., se suspende) de tal manera que la arteria umbilical y la vena umbilical esten ubicadas en el punto mas alto de la placenta. La placenta puede perfundirse mediante el paso de un fluido de perfusion a traves de la vasculatura placentaria y el tejido circundante. La placenta tambien puede perfundirse mediante el paso de un fluido de perfusion al interior de la vena umbilical y recogida desde las arterias umbilicales, o el paso de un fluido de perfusion al interior de las arterias umbilicales y recogida desde la vena umbilical.
En un aspecto, por ejemplo, la arteria umbilical y la vena umbilical estan conectadas simultaneamente, p. ej., a una pipeta que esta conectada mediante un conector flexible a un deposito de la solucion de perfusion. La solucion de perfusion se hace pasar al interior de la vena y la arteria umbilical. La solucion de perfusion exuda desde y/o pasa a traves de las paredes de los vasos sangumeos al interior de los tejidos circundantes de la placenta, y se recoge en un recipiente abierto adecuado desde la superficie de la placenta que se fijo al utero de la madre durante la gestacion. La solucion de perfusion tambien puede introducirse a traves de la abertura del cordon umbilical y se le puede permitir fluir o percolar fuera de las aberturas en la pared de la placenta que estableda una interfaz con la pared uterina materna. Las celulas placentarias que se recogieron mediante este metodo, que puede denominarse como un metodo “de recipiente”, son tfpicamente una mezcla de celulas fetales y maternas.
En otro aspecto, se hace pasar a la solucion de perfusion a traves de las venas umbilicales y se recoge de la arteria umbilical, o se le hace pasar a traves de la arteria umbilical y se recoge de las venas umbilicales. Las celulas placentarias recogidas mediante este metodo, que puede denominarse como un metodo “de circuito cerrado”, son tfpicamente casi exclusivamente fetales.
Se apreciara que la perfusion usando el metodo de recipiente, es dedr, mediante el cual el perfundido se recoge despues de que ha exudado desde el lado materno de la placenta, da como resultado una mezcla de celulas fetales y maternas. Como resultado, las celulas recogidas mediante este metodo comprenden una poblacion mixta de celulas madre placentarias de origen tanto fetal como materno. En contraste, la perfusion unicamente a traves de la vasculatura placentaria en el metodo de circuito cerrado, con lo que se hace pasar al fluido de perfusion a traves de uno o dos vasos placentarios y es recogido unicamente a traves de del vaso o vasos restantes, da como resultado la recogida de una poblacion de celulas madre placentarias casi exclusivamente de origen fetal.
El metodo de perfusion de circuito cerrado puede, en un aspecto, realizarse de la siguiente manera. Una placenta postparto se obtiene en el plazo de aproximadamente 48 horas despues del nacimiento. El cordon umbilical se sujeta con pinzas y se corta por encima de la pinza. El cordon umbilical puede desecharse, o puede procesarse para recuperar, p. ej., celulas madre de cordon umbilical, y/o para procesar la membrana del cordon umbilical para la produccion de un biomaterial. La membrana amniotica puede retenerse durante la perfusion, o puede separarse del corion, p. ej., usando diseccion sin filo con los dedos. Si la membrana amniotica se separa del corion antes de la perfusion, puede, p. ej., desecharse, o procesarse, p. ej., para obtener celulas madre mediante digestion enzimatica, o para producir, p. ej., un biomaterial de membrana amniotica, p. ej., el biomaterial descrito en la publicacion de solicitud estadounidense N° 2004/0048796. Despues de limpiar la placenta de todos los coagulos de sangre visibles y de sangre residual, p. ej., usando una gasa esteril, los vasos del cordon umbilical se exponen, p. ej., cortando parcialmente la membrana del cordon umbilical para dejar expuesta una seccion transversal del cordon. Los vasos se identifican, y se abren, p. ej., haciendo avanzar una pinza de cocodrilo cerrada a traves del extremo cortado de cada vaso. Despues, el aparato, p. ej., un tubo de plastico conectado a un dispositivo de perfusion o una bomba peristaltica, se inserta en cada una de las arterias placentarias. La bomba puede ser cualquier bomba adecuada para ese fin, p. ej., una bomba peristaltica. El tubo de plastico, conectado a un deposito de recogida esteril, p. ej., una bolsa de sangre tal como una bolsa de recogida de 250 ml, se inserta a continuacion en la vena placentaria. Como alternativa, el tubo conectado a la bomba se inserta en la vena placentaria, y tubos a un deposito o depositos de recogida se insertan en una o ambas de las arterias placentarias. La placenta se perfunde a continuacion con un volumen de solucion de perfusion, p. ej., aproximadamente 750 ml de solucion de perfusion. Las celulas en el perfundido se recogen a continuacion, p. ej., por centrifugado.
En un aspecto, el cordon umbilical proximal se sujeta con pinzas durante la perfusion, y mas preferiblemente, se sujeta con pinzas en 4-5 cm (centimetros) de la insercion del cordon en el disco placentario.
La primera recogida de fluido de perfusion procedente de una placenta de mairnfero durante el proceso de extraccion de toda la sangre esta generalmente coloreada con globulos rojos residuales de la sangre del cordon umbilical y/o la sangre placentaria. El fluido de perfusion se vuelve mas incoloro a medida que avanza la perfusion y las celulas de la sangre del cordon umbilical residuales son lavadas de la placenta. Generalmente de 30 a 100 ml (mililitros) de fluido de perfusion son adecuados para extraer toda la sangre inicialmente de la placenta, pero puede usarse mas o menos fluido de perfusion dependiendo de los resultados observados.
El volumen de lfquido de perfusion usado para recoger celulas madre placentarias puede variar dependiendo del numero de celulas madre a recoger, el tamano de la placenta, el numero de recogidas a realizar a partir de una unica placenta, etc. En diversos ejemplos, el volumen de lfquido de perfusion puede ser de 50 ml a 5000 ml, 50 ml a 4000 ml, 50 ml a 3000 ml, 100 ml a 2000 ml, 250 ml a 2000 ml, 500 ml a 2000 ml, o 750 ml a 2000 ml. Tfpicamente, la placenta se perfunde con 700-800 ml de lfquido de perfusion despues de la extraccion de toda la sangre.
La placenta puede perfundirse una pluralidad de veces en el transcurso de varias horas o varios dfas. Donde la placenta debe perfundirse una pluralidad de veces, puede mantenerse o cultivarse en condiciones asepticas en un recipiente u otro vaso adecuado, y perfundirse con la composicion de recogida de celulas madre, o una solucion de perfusion convencional (p. ej., una solucion salina normal tal como solucion salina tamponada con fosfato (“PBS”)) con o sin un anticouagulante (p. ej., heparina, warfarina sodica, coumarina, bishidroxicoumarina), y/o con o sin un agente antimicrobiano (p. ej., p-mercaptoetanol (0,1 mM); antibioticos tales como estreptomicina (p. ej., a 40-100 |ig/ml), penicilina (p. ej., a 40 U/ml), amfotericina B (p. ej., a 0,5 |ig/ml). En una realizacion, una placenta aislada se mantiene o se cultiva durante un periodo de tiempo sin recoger el perfundido, de modo que la placenta se mantiene o cultiva durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 horas, o 2 o 3 o mas dfas antes de la perfusion y la recogida de perfundido. La placenta perfundida puede mantenerse durante uno o mas periodos de tiempo adicionales, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o mas horas, y perfundirse una segunda vez con, p. ej., 700-800 ml de fluido de perfusion. La placenta puede perfundirse 1, 2, 3, 4, 5 o mas veces, por ejemplo, una vez cada 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En un aspecto preferido, la perfusion de la placenta y la recogida de solucion de perfusion, p. ej., composicion de recogida de celulas madre, se repite hasta que el numero de celulas nucleadas recuperadas caiga por debajo de 100 celulas/ml. Los perfundidos en diferentes puntos temporales pueden procesarse ademas individualmente para recuperar poblaciones dependientes del tiempo de celulas, p. ej., celulas madre. Perfundidos de diferentes puntos temporales tambien pueden combinarse. Preferiblemente, se recogen celulas madre en un momento o momentos entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 18 horas despues de la expulsion.
Sin desear quedar vinculados por ninguna teona, despues de la extraccion de toda la sangre y un tiempo suficiente de perfusion de la placenta, se cree que las celulas madre placentarias migran en la microcirculacion exanguinada y perfundida de la placenta donde, de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria, se recogen, preferiblemente mediante lavado en un recipiente de recogida mediante perfusion. Perfundir la placenta aislada no solamente sirve para retirar sangre del cordon umbilical residual sino que tambien proporciona a la placenta los nutrientes apropiados, incluyendo oxfgeno. La placenta puede cultivarse y perfundirse con una solucion similar que se uso para retirar las celulas de sangre del cordon umbilical residual, preferiblemente, sin la adicion de agentes anticoagulantes.
La perfusion de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria da como resultado la recogida de significativamente mas celulas madre placentarias que el numero obtenible de una placenta de mairnfero no perfundida con dicha solucion, y no tratada de otro modo para obtener celulas madre (p. ej., mediante ruptura tisular, p. ej., digestion enzimatica). En este contexto, “significativamente mas” significa al menos 10 % mas. La perfusion de acuerdo con los metodos relacionados con la invencion produce significativamente mas celulas madre placentarias que, p. ej., el numero de celulas madre placentarias obtenibles a partir de medio de cultivo en el que se ha cultivado una placenta, o parte de la misma.
Pueden aislarse celulas madre de la placenta mediante perfusion con una solucion que comprende una o mas proteasas u otras enzimas de ruptura de tejidos. En un ejemplo espedfico, una placenta o parte de la misma (p. ej., membrana amniotica, amnios y corion, lobulo o cotiledon placentario, cordon umbilical, o combinacion de cualquiera de los anteriores) se lleva a 25-37 °C, y se incuba con una o mas enzimas de ruptura de tejidos en 200 ml de un medio de cultivo durante 30 minutos. Las celulas del perfundido se recogen, se llevan a 4 °C, y se lavan con una mezcla inhibidora fna que comprende EDTA 5 mM, ditiotreitol 2 mM y beta-mercaptoetanol 2 mM. Las celulas madre se lavan despues de varios minutos con una composicion de recogida de celulas madre fna (p. ej., 4 °C).
5.2.5 Aislamiento, clasificacion y caracterizacion de celulas madre placentarias
Celulas madre de placenta de mamffero, ya fueran obtenidas mediante perfusion o digestion enzimatica, pueden purificarse inicialmente de (es decir, aislarse de) otras celulas mediante centrifugado con gradiente de Ficoll. Dicho centrifugado puede seguir cualquier protocolo convencional para velocidad de centrifugado, etc. Por ejemplo, celulas recogidas de la placenta se recuperan del perfundido mediante centrifugado a 5000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente, lo que separa las celulas de, p. ej., residuos contaminantes y plaquetas. En otra realizacion, el perfundido placentario se concentra a aproximadamente 200 ml, se dispone en capas suavemente sobre Ficoll, y se centrifuga a aproximadamente 1100 x g durante 20 minutos a 22 °C, y la capa de celulas de interfaz de baja densidad se recoge para procesamiento adicional.
Los sedimentos celulares pueden resuspenderse en composicion de recogida de celulas madre fresca, o un medio adecuado para el mantenimiento de celulas madre, p. ej., medio libre de suero IMDM que contiene 2 U/ml de heparina y EDTA 2 mM (GibcoBRL, NY). La fraccion de celulas mononucleares totales puede aislarse, p. ej., usando Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante. Tal como se usa en la presente memoria, “aislar” celulas madre placentarias significa retirar al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de las celulas con las que las celulas madre estan asociadas normalmente en la placenta de mamffero intacta. Una celula madre de otros organos esta “aislada” cuando esta presente en una poblacion de celulas que comprende menos de 50 % de las celulas con las que la celula madre esta asociada normalmente en el organo intacto.
Las celulas placentarias obtenidas mediante perfusion o digestion pueden, por ejemplo, aislarse adicional, o inicialmente mediante tripsinizacion diferencial usando, p. ej., una solucion de tripsina 0,05 % con EDTA 0,2 % (Sigma, St. Louis MO). La tripsinizacion diferencial es posible porque las celulas madre placentarias tfpicamente se desprenden de superficies plasticas en el plazo de aproximadamente cinco minutos mientras que otras poblaciones adherentes tfpicamente requieren mas de 20-30 minutos de incubacion. Las celulas madre placentarias desprendidas pueden recogerse despues de la tripsinizacion y la neutralizacion de la tripsina, usando, p. ej., solucion neutralizante de tripsina (TNS, Cambrex). En un aspecto de aislamiento de celulas adherentes, alfcuotas de, por ejemplo, aproximadamente 5-10 x 106 celulas se colocan en cada uno de varios matraces T-75, preferiblemente matraces T75 revestidos de fibronectina. En dicho ejemplo, las celulas pueden cultivarse con medio de crecimiento de celulas madre mesenquimatosas disponible en el mercado (MSCGM) (Cambrex), y colocarse en una incubadora para cultivo tisular (37 °C, CO25 %). Despues de 10 a 15 dfas, las celulas no adherentes se retiran de los matraces mediante lavado con PBS. El PBS se sustituye a continuacion por MSCGM. Los matraces son examinados preferiblemente a diario en busca de la presencia de diversos tipos de celulas adherentes y en particular, para la identificacion y la expansion de agrupamientos de celulas fibroblastoides.
El numero y el tipo de celulas recogidas de una placenta de mamffero puede monitorizarse, por ejemplo, midiendo cambios de morfologfa y marcadores de la superficie celular usando tecnicas de deteccion de celulas convencionales tales como citometna de flujo, clasificacion de celulas, inmunocitoqmmica (p. ej., tincion con anticuerpos espedficos de tejido o espedficos de marcadores celulares) clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), clasificacion de celulas activadas por magnetismo (MACS), mediante examen de la morfologfa de celulas usando microscopfa optica o confocal, y/o midiendo cambios de la expresion genica usando tecnicas bien conocidas en la tecnica, tales como PCR y perfilado de la expresion genica. Estas tecnicas pueden usarse, tambien, para identificar celulas que son positivas para uno o mas marcadores particulares. Por ejemplo, usando anticuerpos para CD34, se puede determinar, usando las tecnicas anteriores, si una celula comprende una cantidad detectable de CD34; si este es el caso, la celula es CD34+. Del mismo modo, si una celula produce suficiente ARN de OCT-4 para ser detectable por RT-PCR, o significativamente mas ARN de OCT-4 que una celula adulta, la celula es OCT-4+. Los anticuerpos para marcadores de la superficie celular (p. ej., marcadores CD tales como CD34) y la secuencia de genes espedficos de celulas madre, tales como OCT-4, se conocen bien en la tecnica.
Celulas placentarias, particularmente celulas que han sido aisladas mediante separacion con Ficoll, adherencia diferencial, o una combinacion de ambas, pueden clasificarse usando un clasificador de celulas activado por fluorescencia (FACS). La clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) es un metodo bien conocido para separar partfculas, incluyendo celulas, basandose en las propiedades fluorescentes de las partmulas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, l5 l: 150-165). La excitacion por laser de fracciones fluorescentes en las partmulas individuales da como resultado una pequena carga electrica que permite la separacion electromagnetica de partfculas positivas y negativas de una mezcla. En un ejemplo, anticuerpos o ligandos espedficos de marcadores de la superficie celular estan marcados con distintas marcas fluorescentes. Las celulas se procesan a traves del clasificador celular, permitiendo la separacion de celulas basandose en su capacidad para unirse a los anticuerpos usados. Las partmulas clasificadas por FACS pueden depositarse directamente en pocillos individuales de placas de 96 pocillos o 384 pocillos para facilitar la separacion y la clonacion.
En un esquema de clasificacion, celulas madre de placenta se clasifican tomando como base la expresion de los marcadores CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 y/o HLA-G. Esto puede conseguirse en relacion con procedimientos para seleccionar celulas madre tomando como base sus propiedades de adherencia en cultivo. Por ejemplo, una celula madre de seleccion de adherencia puede conseguirse antes o despues de la clasificacion tomando como base la expresion de marcadores. En un aspecto, por ejemplo, las celulas se clasifican en primer lugar tomando como base su expresion de CD34; las celulas CD34' son retenidas, y las celulas que son CD200+HLA-G+, se separan de todas las demas celulas CD34'. En otro aspecto, las celulas de la placenta se basan en su expresion de marcadores CD200 y/o HLA-G; por ejemplo, celulas que presentan cualquiera de estos marcadores se afslan para un uso adicional. Celulas que expresan, p. ej., CD200 y/o HLA-G pueden, en un aspecto espedfico, clasificarse basandose en su expresion de CD73 y/o CD105, o epftopos reconocidos por anticuerpos SH2, SH3 o SH4, o la falta de expresion de CD34, CD38 o CD45. Por ejemplo, en un aspecto, las celulas placentarias se clasifican mediante la expresion, o falta de la misma, de CD200, HlA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 y CD45, y celulas placentarias que son CD200+, HLA-G+, CD73+, CD105+, CD34', CD38' y CD45' se afslan de otras celulas placentarias para uso adicional.
Con respecto a la deteccion y clasificacion de celulas madre placentarias mediadas por anticuerpos, puede usarse cualquier anticuerpo, espedfico para un marcador particular, en combinacion con cualquier fluoroforo u otra marca adecuada para la deteccion y clasificacion de celulas (p. ej., clasificacion de celulas activadas por fluorescencia). Las combinaciones de anticuerpo/fluoroforo para marcadores espedficos incluyen, aunque sin limitarse a, anticuerpos monoclonales conjugados a isotiocianato de fluorescema (FlTC) contra HLA-G (disponibles de Serotec, Raleigh, Carolina del Norte), CD10 (disponible de BD Immunocytometry Systems, San Jose, California), CD44 (disponible de BD Biosciences Pharmingen, San Jose, California), y CD105 (disponible de R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota); anticuerpos monoclonales conjugados a ficoeritrina (PE) contra CD44, CD200, CD 117, y CD13 (BD Biosciences Pharmingen); anticuerpos monoclonales conjugados a ficoeritrina-Cy7 (PE Cy7) contra CD33 y CD10 (BD Biosciences Pharmingen); estreptavidina conjugada a aloficocianina (APC) y anticuerpos monoclonales contra CD38 (BD Biosciences Pharmingen); y CD90 biotinilado (BD Biosciences Pharmingen). Otros anticuerpos que pueden usarse incluyen, aunque sin limitarse a, CD133-APC (Miltenyi), KDR-Biotina (CD309, Abcam), CitoqueratinaK-Fitc (Sigma o Dako), HLA ABC-Fitc (BD), HLA DRDQDP-PE (BD), p-2-microglobulina-PE (BD), CD80-PE (BD) y CD86-APC (BD).
Otras combinaciones de anticuerpo/marca que pueden usarse incluyen, aunque sin limitarse a, CD45-PerCP (peridina clorofila protema); CD44-PE; CD19-PE; CD10-F (fluorescema); HLA-G-F and 7-amino-actinomicina-D (7-Aa D); HLA-ABC-F; y similares.
Las celulas madre placentarias pueden ser ensayadas para CD117 o CD133 usando, por ejemplo, estreptavidina conjugada a ficoeritrina-Cy5 (PE Cy5) y anticuerpos monoclonales conjugados a biotina contra CD117 o CD133; sin embargo, usando este sistema, puede parecer que las celulas son positivas para CD117 o CD133, respectivamente, debido a un fondo relativamente elevado.
Las celulas madre placentarias pueden marcarse con un anticuerpo para un unico marcador y detectarse y/clasificarse. Las celulas madre placentarias tambien pueden marcarse simultaneamente con multiples anticuerpos para diferentes marcadores.
En otro ejemplo, pueden usarse perlas magneticas para separar celulas. Las celulas pueden clasificarse usando una tecnica de clasificacion de celulas activadas por magnetismo (MACS), un metodo para separar partmulas basandose en su capacidad para unirse a perlas magneticas (0,5-100 |im de diametro). Pueden realizarse diversas modificaciones utiles en las microesferas magneticas, incluyendo adicion covalente de un anticuerpo que reconoce espedficamente una molecula o hapteno de la superficie celular particular. Las perlas se mezclan a continuacion con las celulas para permitir la union. A continuacion se hace pasar a las celulas a traves de un campo magnetico para separar celulas que tienen el marcador de la superficie celular espedfico. En un ejemplo, estas celulas pueden aislarse a continuacion y remezclarse con perlas magneticas acopladas a un anticuerpo contra marcadores de la superficie celular adicionales. Se hace pasar de nuevo a las celulas a traves de un campo magnetico, que afsla celulas que se unieron a ambos anticuerpos. Dichas celulas pueden diluirse a continuacion en placas separadas, tales como placas de microvaloracion para aislamiento clonico.
Las celulas madre placentarias tambien pueden caracterizarse y/o clasificarse basandose en la morfologfa celular y caractensticas de crecimiento. Por ejemplo, celulas madre placentarias pueden caracterizarse como teniendo, y/o seleccionarse tomando como base, p. ej., un aspecto fibroblastoide en cultivo. Las celulas madre placentarias tambien pueden caracterizarse como teniendo, y/o seleccionarse, tomando como base su capacidad para formar cuerpos de tipo embrioide. Por ejemplo, las celulas placentarias que son de forma fibroblastoide, expresan CD73 y CD105, y producen uno o mas cuerpos de tipo embrioide en cultivo se afslan de otras celulas placentarias. En otro ejemplo, celulas placentarias OCT-4+ que producen uno o mas cuerpos de tipo embrioide en cultivo se afslan de otras celulas placentarias.
En otro aspecto, las celulas madre placentarias pueden identificarse y caracterizarse mediante un ensayo de unidades formadoras de colonias. Los ensayos de unidades formadoras de colonias se conocen habitualmente en la tecnica, tales como medio MESEN CULT™ (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver, Columbia Britanica).
Puede ensayarse la viabilidad, el potencial de proliferacion y la longevidad de las celulas madre placentarias usando tecnicas convencionales conocidas en la tecnica, tales como ensayo de exclusion con azul de tripano, ensayo de captacion de diacetato de fluorescema, ensayo de captacion de yoduro de propidio (para evaluar la viabilidad); y ensayo de captacion de timidina, ensayo de proliferacion celular MTT (para evaluar la proliferacion). La longevidad puede determinarse mediante metodos bien conocidos en la tecnica, tales como determinando el numero maximo de duplicaciones de la poblacion en un cultivo extendido.
Las celulas madre placentarias tambien pueden separarse de otras celulas placentarias usando otras tecnicas conocidas en la tecnica, p. ej., crecimiento selectivo de celulas deseadas (seleccion positiva), destruccion selectiva de celulas no deseadas (seleccion negativa); separacion basandose en la capacidad de aglutinacion diferencial de celulas en la poblacion mixta como, por ejemplo., con aglutinina de soja; procedimientos de congelaciondescongelacion; filtracion; centrifugado convencional y zonal; elutriacion centnfuga (centrifugado a contracorriente); separacion unitaria por gravedad; distribucion a contracorriente; electroforesis; y similares.
5.3 CULTIVO DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS
5.3.1 Medios de cultivo
Pueden usarse celulas madre placentarias aisladas, o una poblacion de celulas madre placentarias, o celulas o tejido placentario a partir del cual crecen celulas madre placentarias, para iniciar, o sembrar, cultivos celulares. Las celulas son generalmente transferidas a recipientes para cultivo tisular esteriles sin revestir o revestidos con matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colageno (p. ej., nativo o desnaturalizado), gelatina, fibronectina, ornitina, vitronectina, y protema de la membrana extracelular (p. ej., MATRIGEL® (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)).
Las celulas madre placentarias pueden cultivarse en cualquier medio, en cualesquiera condiciones, reconocidas en la tecnica como aceptables para el cultivo de celulas madre. Preferiblemente, el medio de cultivo comprende suero. Las celulas madre placentarias pueden cultivarse en, por ejemplo, DMEM-LG (Medio esencial modificado por Dulbecco, baja glucosa)/MCDB 201 (medio basal de fibroblasto de pollo) que contiene ITS (insulina-transferrinaselenio), LA+BSA (acido linoleico-albumina de suero de bovino), dextrosa, L-acido ascorbico, PDGF, EGF, IGF-1 y penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (alta glucosa) que comprende 10 % de suero fetal bovino (FBS); DMEM-HG que comprende 15 % de FBS; IMDM (medio Dulbecco con modificacion de Iscove) que comprende 10 % de FBS, 10 % de suero equino e hidrocortisona; M199 que comprende 10 % de FBS, EGF y heparina; a-MEM (medio esencial mmimo) que comprende 10 % de FBS, GlUTAMAX™ y gentamicina; DMEM que comprende 10 % de FBS, GLUTAmAx ™ y gentamicina, etc. Un medio preferido es Dm EM-LG/MCDB-201 que comprende 2 % de FBS, ITS, LA+BSA, dextrosa, L-acido ascorbico, PDGF, EGF y penicilina/estreptomicina.
Otros medios que pueden usarse para cultivar celulas madre placentarias incluyen DMEM (alta o baja glucosa), medio basal de Eagle, medio F10 de Ham (F10), medio F-12 de Ham (F12), medio Dulbecco con modificacion de Iscove, Medio de Crecimiento de Celulas Madre Mesenquimatosas (MSCGM), medio L-15 de Liebovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM avanzado (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma) y CELL-GRO FREE.
El medio de cultivo puede estar suplementado con uno o mas componentes que incluyen, por ejemplo, suero (p. ej., suero fetal bovino (FBS), preferiblemente aproximadamente 2-15 % (v/v); suero equino (de caballo) (ES); suero humano (HS)); beta-mercaptoetanol (BME), preferiblemente aproximadamente 0,001 % (v/v); uno o mas factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor basico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), factor inhibidor de leucemia (LIF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y eritropoyetina (EPO); aminoacidos, incluyendo L-valina; y uno o mas agentes antimicoticos y/o antibioticos para controlar la contaminacion microbiana, tal como, por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina, ya sea en solitario o en combinacion.
Las celulas madre placentarias pueden cultivarse en condiciones de cultivo tisular convencionales, p. ej., en placas de cultivo tisular o placas de multiples pocillos. Las celulas madre placentarias tambien pueden cultivarse usando un metodo de gota colgante. En este metodo, celulas madre placentarias se suspenden a aproximadamente 1 x 104 celulas por ml en aproximadamente 5 ml de medio y una o mas gotas del medio se colocan en el interior de la tapa de un recipiente para cultivo tisular, p. ej., una placa de Petri de 100 ml. Las gotas pueden ser, p. ej., gotas individuales o gotas multiples de, p. ej., una pipeta multicanal. La tapa se invierte cuidadosamente y se coloca sobre el fondo de la placa, que contiene un volumen de lfquido, p. ej., PBS esteril suficiente para mantener el contenido de humedad en la atmosfera de la placa, y las celulas se cultivan.
En un aspecto, las celulas madre placentarias se cultivan en presencia de un compuesto que actua para mantener un fenotipo indiferenciado en la celula madre placentaria. Espedficamente, el compuesto es una 3,4-dihidropiridimol[4,5-d]pirimidina sustituida. Mas espedficamente, el compuesto es un compuesto que tiene la siguiente estructura qmmica:
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El compuesto puede ponerse en contacto con una celula madre placentaria, o poblacion de celulas madre placentarias, a una concentracion de, por ejemplo, entre aproximadamente 1 |iM y aproximadamente 10 |iM.
5.3.2 Expansion y proliferacion de celulas madre placentarias
Una vez que se obtiene una celula madre placentaria aislada, o poblacion aislada de celulas madre (p. ej., una celula madre o poblacion de celulas madre separada de al menos 50 % de las celulas placentarias con las que la celula madre o poblacion de celulas madre esta normalmente asociada in vivo), la celula madre o poblacion de celulas madre puede proliferarse y expandirse in vitro. Por ejemplo, una poblacion de celulas madre placentarias puede cultivarse en recipientes para el cultivo tisular, p. ej., placas, matraces, placas de multiples pocillos, o similares, durante un tiempo suficiente para que las celulas madre proliferen a 70-90 % confluencia, es decir, hasta que las celulas madre y su progenie ocupen 70-90 % del area superficial de cultivo del recipiente para cultivo tisular. Las celulas madre placentarias pueden sembrarse en recipientes de cultivo a una densidad que permita el crecimiento de celulas. Por ejemplo, las celulas pueden sembrarse desde una densidad baja (p. ej., de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 5.000 celulas/cm2) a una densidad alta (p. ej., aproximadamente 50.000 o mas celulas/cm2). Por ejemplo, las celulas se cultivan desde aproximadamente 0 a aproximadamente 5 por ciento en volumen de CO2 en el aire. En algunos ejemplos preferidos, las celulas se cultivan de aproximadamente 2 a aproximadamente 25 por ciento de O2 en el aire, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento de O2 en el aire. Las celulas se cultivan preferiblemente a de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 40 °C, preferiblemente 37 °C. Las celulas preferiblemente se cultivan en una incubadora. El medio de cultivo puede ser estatico o agitado, por ejemplo, utilizando un biorreactor. Las celulas madre placentarias preferiblemente se cultivan con estres oxidativo bajo (p. ej., con adicion de glutation, acido ascorbico, catalasa, tocoferol, N-acetilcistema o similares).
Una vez que se obtiene una confluencia de 70 %-90 %, se puede someter a un pase a las celulas. Por ejemplo, las celulas pueden tratarse enzimaticamente, p. ej., tripsinizarse usando tecnicas bien conocidas en la tecnica, para separarlas de la superficie de cultivo tisular. Despues de retirar las celulas mediante pipeteo y de contar las celulas, aproximadamente 20.000-100.000 celulas, preferiblemente aproximadamente 50.000 celulas, se hacen pasar a un nuevo recipiente para cultivo que contiene un medio de cultivo fresco. Tfpicamente, el nuevo medio es el mismo tipo de medio del cual las celulas se retiraron. La invencion abarca poblaciones de celulas madre placentarias que se han sometido a un pase al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 o mas veces.
5.3.3 Poblaciones de celulas madre placentarias
En la presente memoria se describen poblaciones espedficas de celulas madre placentarias. La poblacion de celulas madre placentarias puede aislarse directamente de una o mas placentas; es decir, la poblacion de celulas madre placentarias puede ser una poblacion de celulas placentarias que comprende celulas madre placentarias obtenidas de, o contenidas en, perfundido, u obtenidas de, o contenidas en, tejido placentario roto, p. ej., producto de digestion de tejido placentario (es dedr, la coleccion de celulas obtenidas mediante digestion enzimatica de una placenta o parte de la misma). Las celulas madre placentarias aisladas descritas en la presente memoria tambien pueden cultivarse y expandirse para producir poblaciones de celulas madre placentarias. Las poblaciones de celulas placentarias que comprenden celulas madre placentarias tambien pueden cultivarse y expandirse para producir poblaciones de celulas madre placentarias.
Las poblaciones de celulas madre placentarias descritas en la presente memoria comprenden celulas madre placentarias, por ejemplo, celulas madre placentarias tal como se describen en la presente memoria. En diversas realizaciones, al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de las celulas en una poblacion de celulas madre placentarias aislada son celulas madre placentarias. Es decir, una poblacion de celulas madre placentarias puede comprender, p. ej., hasta 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % de celulas no madre.
En la presente memoria se describen metodos de produccion de una poblacion de celulas madre placentarias aislada, seleccionando, p. ej., celulas madre placentarias, ya procedan de digestion enzimatica o perfusion, que expresan marcadores particulares y/o caractensticas de cultivo o morfologicas particulares. En un aspecto, por ejemplo, en la presente memoria se describe un metodo de produccion de una poblacion de celulas que comprende seleccionar celulas placentarias que (a) se adhieren a un sustrato, y (b) expresan CD200 y HLA-G; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, se describe un metodo de produccion de una poblacion de celulas que comprende identificar celulas placentarias que expresan CD200 y HLA-G, y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, el metodo de produccion de una poblacion de celulas comprende seleccionar celulas placentarias que (a) se adhieren a un sustrato, y (b) expresan CD73, CD105, y CD200; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de produccion de una poblacion de celulas que comprende identificar celulas placentarias que expresan CD73, CD105 y CD200, y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, el metodo de produccion de una poblacion de celulas comprende seleccionar celulas placentarias que (a) se adhieren a un sustrato y (b) expresan CD200 y OCT-4; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de produccion de una poblacion de celulas que comprende identificar celulas placentarias que expresan CD200 y OCT-4, y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, el metodo de produccion de una poblacion de celulas comprende seleccionar celulas placentarias que (a) se adhieren a un sustrato, (b) expresan CD73 y CD105, y (c) facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de produccion de una poblacion de celulas que comprende identificar celulas placentarias que expresan CD73 y CD105, y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide, y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, el metodo de produccion de una poblacion de celulas comprende seleccionar celulas placentarias que (a) se adhieren a un sustrato, y (b) expresan CD73, CD105 y HLA-G; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de produccion de una poblacion de celulas que comprende identificar celulas placentarias que expresan CD73, CD105 y HLA-G, y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, el metodo de produccion de una poblacion de celulas comprende seleccionar celulas placentarias que (a) se adhieren a un sustrato, (b) expresan OCT-4, y (c) facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide; y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un metodo de produccion de una poblacion de celulas que comprende identificar celulas placentarias que expresan OCT-4, y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre, cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide, y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas.
Dichas poblaciones de celulas pueden usarse para tratar cualquiera de las enfermedades o afecciones enumeradas a continuacion en la presente memoria. Dichas poblaciones de celulas tambien pueden usarse para evaluar poblaciones de celulas madre placentarias, p. ej., como parte de un metodo de control de calidad.
En cualquiera de los aspectos anteriores, el metodo puede comprender adicionalmente seleccionar celulas placentarias que expresan ABC-p (una protema transportadora ABC espedfica de la placenta; vease, p. ej., Allikmets et al., Cancer Res. 58(23): 5337-9 (1998)). El metodo tambien puede comprender seleccionar celulas que muestran al menos una caractenstica espedfica de, p. ej., una celula madre mesenquimatosa, por ejemplo, expresion de CD29, expresion de CD44, expresion de CD90, o expresion de una combinacion de los anteriores.
En el aspecto anterior, el sustrato puede ser cualquier superficie en la que pueda conseguirse el cultivo y/o la seleccion de celulas, p. ej., celulas madre placentarias. Tfpicamente, el sustrato es plastico, p. ej., plastico de una placa de cultivo tisular o una placa de multiples pocillos. El plastico para cultivo tisular puede estar revestido con una biomolecula, p. ej., laminina o fibronectina.
Pueden seleccionarse celulas, p. ej., celulas madre placentarias, para una poblacion de celulas madre placentarias mediante cualquier medio conocido en la tecnica de la seleccion de celulas. Por ejemplo, pueden seleccionarse celulas usando un anticuerpo o anticuerpos para uno o mas marcadores de la superficie celular, por ejemplo, en citometna de flujo o FACS. La seleccion puede conseguirse usando anticuerpos junto con perlas magneticas. Los anticuerpos que son espedficos para ciertos marcadores relacionados con celulas madre se conocen en la tecnica. Por ejemplo, anticuerpos para OCT-4 (Abcam, Cambridge, MA), CD200 (Abcam), HLA-G (Abcam), CD73 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), CD105 (Abeam; BioDesign International, Saco, ME), etc. Anticuerpos para otros marcadores tambien estan disponibles en el mercado, p. ej., CD34, CD38 y CD45 estan disponibles de, p. ej., StemCell Technologies o BioDesign International.
La poblacion de celulas madre placentarias aislada puede comprender celulas placentarias que no son celulas madre, o celulas que no son celulas placentarias.
Las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas pueden combinarse con una o mas poblaciones de celulas no madre o celulas no placentarias. Por ejemplo, una poblacion aislada de celulas madre placentarias puede combinarse con sangre (p. ej., sangre placentaria o sangre del cordon umbilical), celulas madre obtenidas a partir de la sangre (p. ej., celulas madre obtenidas a partir de sangre placentaria o sangre del cordon umbilical), celulas madre de cordon umbilical, poblaciones de celulas nucleadas obtenidas a partir de la sangre, celulas mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea, poblaciones de celulas madre obtenidas a partir del hueso, medula osea en bruto, celulas madre adultas (somaticas), poblaciones de celulas madre contenidas dentro del tejido, celulas madre cultivadas, poblaciones de celulas completamente diferenciadas (p. ej., condrocitos, fibroblastos, celulas amnioticas, osteoblastos, celulas musculares, celulas cardiacas, etc.) y similares. En un aspecto, en la presente memoria se describe una poblacion de celulas madre que comprende celulas madre placentarias y celulas madre de cordon umbilical. Las celulas en una poblacion de celulas madre placentarias aislada pueden combinarse con una pluralidad de celulas de otro tipo en proporciones de aproximadamente 100.000.000:1, 50.000.000:1, 20.000.000:1, 10.000.000:1, 5.000.000:1, 2.000.000:1, 1.000.000:1, 500.000:1, 200.000:1, 100.000:1, 50.000:1, 20.000:1, 10.000:1, 5.000:1, 2.000:1, 1.000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1.000; 1:2.000; 1:5.000; 1:10.000; 1:20.000; 1:50.000; 1:100.000; 1:500.000; 1:1.000.000; 1:2.000.000; 1:5.000.000; 1:10.000.000; 1:20.000.000; 1:50.000.000; o aproximadamente 1:100.000.000, comparando numeros de celulas nucleadas totales en cada poblacion. Las celulas en una poblacion de celulas madre placentarias aislada pueden combinarse con una pluralidad de celulas de una pluralidad de tipos celulares tambien.
En un aspecto, una poblacion aislada de celulas madre placentarias se combina con una pluralidad de celulas madre hematopoyeticas. Dichas celulas madre hematopoyeticas pueden estar, por ejemplo, contenidas dentro de sangre placentaria, del cordon umbilical o sangre periferica sin procesar; en celulas nucleadas totales de sangre placentaria, sangre del cordon umbilical o sangre periferica; en una poblacion aislada de celulas CD34+ de sangre placentaria, sangre del cordon umbilical o sangre periferica; en medula osea sin procesar; en celulas nucleadas totales de medula osea; en una poblacion aislada de celulas CD34+ de medula osea, o similares.
5.4 PRODUCCION DE UN BANCO DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS
Celulas madre de placentas postparto pueden cultivarse en una serie de diferente manera para producir un conjunto de lotes, por ejemplo, un conjunto de dosis administrables de forma individual, de celulas madre placentarias. Dichos lotes pueden, por ejemplo, obtenerse de celulas madre de perfundido placentario o de tejido placentario digerido por enzimas. Conjuntos de lotes de celulas madre placentarias, obtenidos de una pluralidad de placentas, pueden disponerse en un banco de celulas madre placentarias para, por ejemplo, almacenamiento a largo plazo. Generalmente, celulas madre adherentes se obtienen de un cultivo inicial de material placentario para formar un cultivo de siembra, que se expande en condiciones controladas para formar poblaciones de celulas a partir de numeros aproximadamente equivalentes de duplicaciones. Los lotes se obtienen preferentemente del tejido de una unica placenta, pero pueden obtenerse del tejido de una pluralidad de placentas.
En un aspecto, los lotes de celulas madre se obtienen de la siguiente manera. El tejido placentario se rompe en primer lugar, por ejemplo, picando, se digiere con una enzima adecuada, por ejemplo, colagenasa (vease la Seccion 5.2.3, anterior). El tejido placentario preferentemente comprende, por ejemplo, todo el amnios, todo el corion, o ambos, de una unica placenta, pero puede comprender solamente una parte de cualquiera del amnios o el corion. El tejido digerido se cultiva, por ejemplo, durante aproximadamente 1-3 semanas, preferentemente aproximadamente 2 semanas. Despues de la retirada de celulas no adherentes, las colonias de alta densidad que se forman se recogen, por ejemplo, mediante tripsinizacion. Estas celulas se recogen y se resuspenden en un volumen conveniente de medio de cultivo, y se definen como celulas de pase 0.
Las celulas de pase 0 se usan a continuacion para sembrar cultivos de expansion. Los cultivos de expansion pueden ser cualquier disposicion de aparatos de cultivo celular independientes, por ejemplo, una factona celular de NUNC™. Las celulas en el cultivo de pase 0 pueden subdividirse en cualquier grado para sembrar cultivos de expansion con, por ejemplo, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 1 x 104, 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104 o 10 usan de aproximadamente 2 x 104 a aproximadamente 3 x 104 celulas de pase 0 para sembrar cada cultivo de expansion. El numero de cultivos de expansion puede depender del numero de celulas de pase 0, y puede ser mayor o menor en numero dependiendo de la placenta o placentas particulares de las que se obtienen las celulas madre.
Los cultivos de expansion se cultivan hasta que la densidad de las celulas en el cultivo alcanza cierto valor, por ejemplo, aproximadamente 1 x 105 celulas/cm2 Las celulas pueden recogerse y crioconservarse en este momento o someterse a un pase para formar nuevos cultivos de expansion tal como se ha descrito anteriormente. Las celulas pueden someterse a un pase, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces antes de su uso. Preferentemente se mantiene un registro del numero acumulativo de duplicaciones de poblaciones durante el cultivo o los cultivos de expansion. Las celulas de un cultivo de pase 0 pueden expandirse para 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40 duplicaciones o hasta 60 duplicaciones. Sin embargo, preferentemente, el numero de duplicaciones de la poblacion, antes de dividir la poblacion de celulas en dosis individuales, es de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30, preferentemente aproximadamente 20 duplicaciones. Las celulas pueden cultivarse continuamente a lo largo del proceso de expansion o pueden congelarse en uno o mas puntos durante la expansion.
Las celulas a utilizar para dosis individuales pueden congelarse, por ejemplo, crioconservarse para uso posterior.
Las dosis individuales pueden comprender, por ejemplo, de aproximadamente 1 millon a aproximadamente 100 millones de celulas por ml, y pueden comprender entre aproximadamente 106 y aproximadamente 109 celulas en total.
En un aspecto del metodo, celulas de pase 0 se cultivan para un primer numero de duplicaciones, por ejemplo, aproximadamente 4 duplicaciones, a continuacion se congelan en un primer banco de celulas. Las celulas del primer banco de celulas se congelan y se usan para sembrar un segundo banco de celulas, cuyas celulas se expanden para un segundo numero de duplicaciones, por ejemplo, aproximadamente otras ocho duplicaciones. Las celulas en esta fase se recogen y congelan y se usan para sembrar nuevos cultivos de expansion que se dejan desarrollar para un tercer numero de duplicaciones, por ejemplo, aproximadamente ocho duplicaciones adicionales, llevando el numero acumulativo de duplicaciones celulares a aproximadamente 20. Las celulas en los puntos intermedios de los pases pueden congelarse en unidades de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 10 millones de celulas por ml, preferentemente aproximadamente 1 millon de celulas por ml, para su uso en un cultivo de expansion posterior.
Las celulas a aproximadamente 20 duplicaciones pueden congelarse en dosis individuales de entre aproximadamente 1 millon y aproximadamente 100 millones de celulas por ml para la administracion o el uso para preparar una composicion que contiene celulas madres.
En un aspecto, se describe en la presente memoria un metodo de preparacion de un banco de celulas madre placentarias, que comprende: expandir celulas madre placentarias de cultivo primario procedentes de una placenta postparto humana para una primera pluralidad de duplicaciones de la poblacion; crioconservar dichas celulas madre placentarias para formar un banco de celulas patron; expandir una pluralidad de celulas madre placentarias procedentes del banco de celulas patron para una segunda pluralidad de duplicaciones de la poblacion; crioconservar dichas celulas madre placentarias para formar un banco de celulas de trabajo; expandir una pluralidad de celulas madre placentarias procedentes del banco de celulas de trabajo para una tercera pluralidad de duplicaciones de la poblacion; y crioconservar dichas celulas madre placentarias en dosis individuales, en las que dichas dosis individuales componen colectivamente un banco de celulas madre placentarias. En un aspecto, el numero total de duplicaciones de la poblacion es de aproximadamente 20. En otro aspecto, dicha primera pluralidad de duplicaciones de la poblacion es de aproximadamente cuatro duplicaciones de la poblacion; dicha segunda pluralidad de duplicaciones de la poblacion es de aproximadamente ocho duplicaciones de la poblacion; y dicha tercera pluralidad de duplicaciones de la poblacion es de aproximadamente ocho duplicaciones de la poblacion. En otro aspecto, dichas celulas madre placentarias de cultivo primario comprenden celulas madre placentarias de perfundido placentario. En otro aspecto, dichas celulas madre placentarias de cultivo primario comprenden celulas madre placentarias procedentes de tejido placentario digerido. En otro aspecto, dichas celulas madre placentarias de cultivo primario comprenden celulas madre placentarias procedentes de perfundido placentario y procedentes de tejido placentario digerido. En otro aspecto, todas de dichas celulas madre placentarias en dicho cultivo primario de celulas madres placentarias son de la misma placenta. En otro aspecto, el metodo comprende ademas la etapa de seleccionar celulas madre placentarias CD200+ o HLA-G+ entre dicha pluralidad de dichas celulas madre placentarias procedentes de dicho banco de celulas de trabajo para formar dosis individual. En otro aspecto, dichas dosis individuales comprenden de aproximadamente 104 a aproximadamente 105 celulas madre placentarias. En otro aspecto, dichas dosis individuales comprenden de aproximadamente 105 a aproximadamente 106 celulas madre placentarias. En otro aspecto, dichas dosis individuales comprenden de aproximadamente 106 a aproximadamente
107 celulas madre placentarias. En otro aspecto, dichas dosis individuales comprenden de aproximadamente 107 a aproximadamente 108 celulas madre placentarias.
En un aspecto preferido, el donante del cual se obtiene la placenta (por ejemplo, la madre) se ensaya para detectar al menos un patogeno. Si los ensayos de la madre resultan positivos para un patogeno ensayado, el lote completo de la placenta se descarta. Dicho ensayo puede realizarse en cualquier momento durante la produccion de lotes de celulas madre placentarias, incluyendo antes o despues de establecer las celulas de pase 0 o durante el cultivo de expansion. Los patogenos para los cuales la presencia se ensaya pueden incluir, sin limitacion, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, virus de inmunodeficiencia humana (tipos I y II), citomegalovirus, herpesvirus y similares.
5.5 DIFERENCIACION DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS
5.5.1 Induccion de la diferenciacion en celulas neuronales o neurogenicas
La diferenciacion neuronal de celulas madre placentarias puede conseguirse, por ejemplo, colocando celulas madre placentarias en condiciones de cultivo celular que inducen la diferenciacion en neuronas. En un metodo ejemplar, un medio neurogenico comprende DMEM/FBS 20% y betamercaptoetanol 1 mM; dicho medio puede sustituirse despues del cultivo durante aproximadamente 24 horas con medio constituido por DMEM y betamercaptoetanol 1-10 mM. En otra realizacion, las celulas se ponen en contacto con DMEM/DMSO 2% /200 |iM de hidroxianisol butilado. En una realizacion espedfica, el medio de diferenciacion comprende DMEMIF-12 libre de suero, hidroxianisol butilado, cloruro de potasio, insulina, forskolina, acido valproico e hidrocortisona. En otra realizacion, la diferenciacion neuronal se consigue sembrando celulas madre placentarias en placas revestidas de laminina en medio Neurobasal-A (Invitrogen, Carlsbad CA) que contiene suplemento B27 y L-glutamina, opcionalmente suplementado con bFGF y/o EGF. Las celulas madre placentarias tambien pueden ser inducidas a diferenciacion neural mediante cocultivo con celulas neurales, o cultivo en medio condicionado con neuronas.
La diferenciacion neuronal puede evaluarse, por ejemplo, mediante deteccion de morfologfa similar a las neuronas (por ejemplo, celulas bipolares que comprenden procesos extendidos) deteccion de la expresion de por ejemplo, receptor del factor de crecimiento nervioso y genes de cadena pesada del neurofilamento mediante RT-PCR; o deteccion de actividad electrica, por ejemplo, mediante fijacion de voltaje “patch-clamp”. Se considera que una celula madre placentaria se ha diferenciado en una celula neuronal cuando la celula cuando la celula presenta una o mas de estas caractensticas.
5.5.2 Induccion de la diferenciacion en celulas adipogenicas
La diferenciacion adipogenica de celulas madre placentarias puede conseguirse, por ejemplo, situando a celulas madre placentarias en condiciones de cultivo celular que inducen la diferenciacion en adipocitos. Un medio adipogenico preferido comprende MSCGM (Cambrex) o DMEM suplementado con suero de sangre del cordon umbilical 15%. En una realizacion, celulas madre placentarias son alimentadas con medio de induccion de la adipogenesis (Cambrex) y se cultivan durante 3 dfas (a 37°C, CO25%), seguidos por 1-3 dfas de cultivo en medio de mantenimiento de la adipogenesis (Cambrex). Despues de 3 ciclos completos de induccion/mantenimiento, las celulas se cultivan durante 7 dfas adicionales en medio de mantenimiento de la adipogenesis, sustituyendo el medio cada 2-3 dfas.
En otra realizacion, celulas madre placentarias se cultivan en medio que comprende dexametasona 1 |iM, indometacina 0,2 mM, 0,01 mg/ml de insulina, IBMX 0,5 mM, DMEM-alta glucosa, FBS y antibioticos. Celulas madre placentarias tambien pueden ser inducidas hacia la adipogenesis mediante cultivo en medio que comprende uno o mas glucocorticoides (por ejemplo, dexametasona, indometasona, hidrocortisona, cortisona), insulina, un compuesto que eleva los niveles intracelulares de AMPc (por ejemplo, dibutiril-AMPc; 8-CPT-AMPc (8-(4)clorofeniltio)-adenosina, monofosfato 3',5' dclico); 8-bromo-AMPc; dioctanoil-AMPc; forskolina) y/o un compuesto que inhibe la degradacion de AMPc (por ejemplo, un inhibidor de fosdodiesterasa tal como isobutilmetilxantina (IBMX), metil isobutilxantina, teofilina, cafema, indometacina).
Un sello distintivo de la adipogenesis es el desarrollo de multiples vesfculas lipfdicas intracitoplasmaticas que pueden observarse facilmente usando la tincion lipofila aceite rojo O. La expresion de genes de lipasa y/o protemas de union a acidos grasos se confirma mediante RT/PCR en celulas madre placentarias que han comenzado a diferenciarse en adipocitos. Se considera que una celula madre placentaria se ha diferenciado en una celula adipodtica cuando la celula presenta una o mas de estas caractensticas.
5.5.3 Induccion de la diferenciacion en celulas condrocfticas
La diferenciacion condrogenica de celulas madre placentarias puede conseguirse, por ejemplo, colocando a celulas madre placentarias en condiciones de cultivo celular que inducen la diferenciacion en condrocitos. Un medio condrogenico preferido comprende MSCGM (Cambrex) o DMEM suplementado con suero de sangre del cordon umbilical 15%. En una realizacion, celulas madre placentarias se dividen en alfcuotas en un tubo de polipropileno esteril, se centrifugan (por ejemplo, a 150 x g durante 5 minutos), y se lavan dos veces en medio de condrogenesis incompleto (Cambrex). Las celulas se resuspenden en medio de condrogenesis completo (Cambrex) que contema 0,01 |ig/ml de TGF-beta-3 a una concentracion de aproximadamente 1-20 x 105 celulas/ml. En otras realizaciones, celulas madre placentarias se ponen en contacto con factores de crecimiento exogenos, por ejemplo, GDF-5 o factor de crecimiento transformante beta3 (TGF-beta3), con o sin ascorbato. El medio condrogenico puede suplementarse con aminoacidos que incluyen prolina y glutamina, piruvato sodico, dexametasona, acido ascorbico, e insulina/transferrina/selenio. El medio condrogenico puede suplementarse con hidroxido sodico y/o colageno. Las celulas madre placentarias pueden cultivarse a alta o baja densidad. Las celulas se cultivan preferentemente en ausencia de suero.
La condrogenesis puede evaluarse mediante, por ejemplo, observacion de la produccion de sustancia fundamental eosinofila, tincion con safranina-O para la expresion de glucosaminoglucano; tincion con hematoxilina/eosina, evaluacion de la morfologfa celular, y/o confirmacion por RT/PCR de la expresion de genes de colageno 2 y colageno 9. La condrogenesis tambien puede observarse cultivando las celulas madre en un sedimento, formado, por ejemplo, centrifugando suavemente celulas madre en suspension (por ejemplo, a aproximadamente 800 g durante aproximadamente 5 minutos). Despues de 1-28 dfas, el sedimento de celulas madre comienza a formar una matriz resistente y demuestra una integridad estructural no descubierta en lmeas celulares no inducidas, o no condrogenicas, cuyos sedimentos tienden a desmoronarse cuando son estimulados. La condrogenesis tambien puede demostrarse, por ejemplo, en dichos sedimentos de celulas, tinendo con un colorante que tine el colageno, por ejemplo, rojo sirio, y/o un colorante que tine glucosaminoglucanos (GAG), tales como, por ejemplo, azul alcian. Se considera que una celula madre placentaria se ha diferenciado en una celula condrodtica cuando la celula presenta una o mas de estas caractensticas.
5.5.4 Induccion de la diferenciacion en celulas osteodticas
La diferencia osteogenica de celulas madre placentarias puede conseguirse, por ejemplo, situando a celulas madre placentarias en condiciones de cultivo celular que inducen la diferenciacion en osteocitos. Un medio osteodtico preferido comprende MSCGM (Cambrex) o DMEM suplementado con suero de sangre del cordon umbilical 15%, seguido por Medio de induccion osteogenica (Cambrex) que contiene dexametasona 0,1 |iM, acido ascorbico-2-fosfato 0,05 mM, beta glicerofosfato 10 mM. En otra realizacion, celulas madre placentarias se cultivan en medio (por ejemplo, DMEM-baja glucosa) que contiene de aproximadamente 10'7 a aproximadamente dexametasona 10'9 M, sal de ascorbato fosfato aproximadamente 10-50 |iM (por ejemplo, ascorbato-2-fosfato) y p-glicerofosfato de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 10 mM. El medio osteogenico tambien puede incluir suero, uno o mas agentes antibioticos/antimicoticos, factor de crecimiento transformante-beta (por ejemplo, TGF-P1) y/o protema morfogenica osea (por ejemplo, BMP-2, BMP-4, o una combinacion de las mismas).
La diferenciacion puede ensayarse usando una tincion espedfica de calcio, por ejemplo, tincion de von Kossa, y deteccion por RT/PCR de, por ejemplo, fosfatasa alcalina, osteocalcina, sialoprotema osea y/o expresion del gen de osteopontina. Se considera que una celula madre placentaria se ha diferenciado en una celula osteodtica cuando la celula presenta una o mas de estas caractensticas.
5.5.5 Induccion de la diferenciacion en celulas pancreaticas
La diferenciacion de celulas madre placentarias en celulas pancreaticas productoras de insulina puede conseguirse, por ejemplo, colocando a celulas madre placentarias en condiciones de cultivo celular que inducen la diferenciacion en celulas pancreaticas.
Un medio pancreatico ejemplar comprende DMEM/CBS 20%, suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos basico, 10 ng/ml; y factor de crecimiento transformante beta-1, 2 ng/ml. Este medio se combina con medios condicionados procedentes de cultivos de celulas neuronales positivas para nestina a 50/50 v/v. Puede usarse Suero de sustitucion Knockout en lugar de CBS. Las celulas se cultivan durante 14-28 dfas, realimentando cada 3-4 dfas.
La diferenciacion puede confirmarse ensayando para, por ejemplo, produccion de protema de insulina, o expresion de genes de insulina mediante RT/PCR. Se considera que una celula madre placentaria se ha diferenciado en una celula pancreatica cuando la celula presenta una o mas de estas caractensticas.
5.5.6 Induccion de la diferenciacion en celulas cardiacas
La diferenciacion miogenica (cardiogenica) de celulas madre placentarias puede conseguirse, por ejemplo, situando a celulas madre placentarias en condiciones de cultivo celular que inducen la diferenciacion en cardiomiocitos. Un medio cardiomiodtico preferido comprende DMEM/CBS 20% suplementado con acido retinoico, 1 |iM; factor de crecimiento de fibroblastos basico, 10 ng/ml; y factor de crecimiento transformante beta-1, 2 ng/ml; y factor de crecimiento epidermico, 100 ng/ml. Puede usarse suero de sustitucion Knockout (Invitrogen, Carlsbad, California) en lugar de CBS. Como alternativa, se cultivan celulas madre placentarias en DMEM/CBS 20% suplementado con 50 ng/ml de Cardiotropina-1 durante 24 horas. En otro ejemplo, pueden cultivarse celulas madre placentarias 10-14 dfas en medio libre de protemas durante 5-7 dfas, a continuacion estimularse con extracto de miocardio humano, por ejemplo, producido homogeneizando miocardio humano en tampon HEPES 1% suplementado con suero de sangre del cordon umbilical 1%.
La diferenciacion puede confirmarse mediante demostracion de expresion de genes de actina cardiaca, por ejemplo, mediante RT/PCR, o mediante latido visible de la celula. Se considera que una celula madre placentaria se ha diferenciado en una celula cardiaca cuando la celula presenta una o mas de estas caractensticas.
5.6 CONSERVACION DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS
Celulas madre placentarias pueden conservarse, es dedr, colocarse en condiciones que permiten almacenamiento a largo plazo, o condiciones que inhiben la muerte celular mediante, por ejemplo, apoptosis o necrosis.
Las celulas madre placentarias pueden conservarse usando, por ejemplo, una composicion que comprende un inhibidor de apoptosis, inhibidor de necrosis y/o un perfluorocarbono portador de ox^geno, tal como se describe en la solicitud provisional de Estados Unidos relacionada N° 60/754.969, titulada “Improved Medium for Collecting Celulas madre placentarias and Preserving Organs”, presentada el 25 de diciembre de 2005. En la presente memoria se describe un metodo de conservacion de una poblacion de celulas madre que comprende poner en contacto a dicha poblacion de celulas madre con una composicion de recogida de celulas madre que comprende un inhibidor de apoptosis y un perfluorocarbono portador de oxfgeno, en la que dicho inhibidor de apoptosis esta presente en una cantidad y durante un tiempo suficientes para reducir o prevenir la apoptosis en la poblacion de celulas madre, en comparacion con una poblacion de celulas madre no puesta en contacto con el inhibidor de apoptosis. En un aspecto espedfico, dicho inhibidor de apoptosis es un inhibidor de caspasa. En otro aspecto espedfico, dicho inhibidor de apoptosis es un inhibidor de JNK. En un aspecto mas espedfico, dicho inhibidor de JNK no modula la diferenciacion o proliferacion de dichas celulas madre. En otro aspecto, dicha composicion de recogida de celulas madre comprende dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarbono portador de oxfgeno en fases separadas. En otro aspecto, dicha composicion de recogida de celulas madre comprende dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarbono portador de oxfgeno en una emulsion. En otro aspecto, la composicion de recogida de celulas madre adicionalmente comprende un emulsionante, por ejemplo, lecitina. En otro aspecto, dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarbono estan entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 25°C en el momento de contactar con las celulas madre. En otro aspecto mas espedfico, dicho inhibidor de apoptosis y dicho perfluorocarbono estan entre aproximadamente 2°C y 10°C, o entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 5°C, en el momento de contactar con las celulas madre. En otro aspecto mas espedfico, dicho contacto se realiza durante el transporte de dicha poblacion de celulas madre. En otro aspecto mas espedfico, dicho contacto se realiza durante la congelacion y descongelacion de dicha poblacion de celulas madre.
En la presente memoria se desvela ademas un metodo de conservacion de una poblacion de celulas madre placentarias que comprende poner en contacto dicha poblacion de celulas madre con un inhibidor de apoptosis y un compuesto que conserva los organos, en el que dicho inhibidor de apoptosis esta presente en una cantidad y durante un tiempo suficientes para reducir o prevenir la apoptosis en la poblacion de celulas madre, en comparacion con una poblacion de celulas madre no puesta en contacto con el inhibidor de apoptosis. En un aspecto espedfico, el compuesto que conserva los organos es solucion UW (descrita en la patente de Estados Unidos N° 4.798.824; tambien conocida como ViaSpan; vease tambien Southard et al., Transplantation 49(2): 251-257 (1990)) o una solucion descrita en Stern et al., patente de Estados Unidos N° 5.552.267. En otro aspecto, dicho compuesto que conserva los organos es hidroxietilalmidon, acido lactobionico, rafinosa, o una combinacion de los mismos. En otro aspecto, la composicion de recogida de celulas madre adicionalmente comprende un perfluorocarbono portador de oxfgeno, en dos fases o en forma de una emulsion.
En otro aspecto del metodo, celulas madre placentarias se ponen en contacto con una composicion de recogida de celulas madre que comprende un inhibidor de apoptosis y perfluorocarbono portador de oxfgeno, compuesto que conserva los organos, o combinacion de los mismos, durante la perfusion. En otro aspecto, dichas celulas madre son contactadas durante un proceso de ruptura de tejidos, por ejemplo, digestion enzimatica. En otro aspecto, las celulas madre placentarias son puestas en contacto con dicho compuesto de recogida de celulas madre despues de la recogida por perfusion, o despues de la recogida mediante ruptura de tejidos, por ejemplo, digestion enzimatica.
Tfpicamente, durante la recogida, enriquecimiento y aislamiento de celulas placentarias, es preferible minimizar o eliminar la tension celular debido a hipoxia y la tension mecanica. En otro aspecto del metodo, por lo tanto, una celula madre, o poblacion de celulas madre, es expuesta a una condicion hipoxica durante la recogida, enriquecimiento o aislamiento durante menos de seis horas durante dicha conservacion, en la que una condicion hipoxica es una concentracion de oxfgeno que es menor que la concentracion normal de oxfgeno en la sangre. En un aspecto mas espedfico, dicha poblacion de celulas madre es expuesta a dicha condicion hipoxica durante menos de dos horas durante dicha conservacion. En otro aspecto mas espedfico, dicha poblacion de celulas madre es expuesta a dicha condicion hipoxica durante menos de una hora, o menos de treinta minutos, o no es expuesta a una condicion hipoxica, durante la recogida, el enriquecimiento o el aislamiento. En otro aspecto espedfico, dicha poblacion de celulas madre no es expuesta a tension cortante durante la recogida, el enriquecimiento o el aislamiento.
Las celulas madre placentarias de la invencion pueden crioconservarse, por ejemplo, en un medio de crioconservacion en recipientes pequenos, por ejemplo, ampollas. El medio de crioconservacion adecuado incluye, aunque sin limitarse a, un medio de cultivo que incluye, por ejemplo, un medio de crecimiento o medio de congelacion de celulas, por ejemplo un medio de congelacion de celulas disponible en el mercado, por ejemplo, C2695, C2639 o C6039 (Sigma). El medio de crioconservacion preferentemente comprende DMSO (dimetilsulfoxido), a una concentracion de, por ejemplo, aproximadamente 10% (v/v). El medio de crioconservacion puede comprender agentes adicionales, por ejemplo, metilcelulosa y/o glicerol. Las celulas madre placentarias preferentemente se enfnan a aproximadamente 1°C/min durante la crioconservacion. Una temperatura de crioconservacion preferida es de aproximadamente -80°C a aproximadamente -180°C, preferentemente de aproximadamente -125°C a aproximadamente -140°C. Las celulas crioconservadas pueden transferirse a nitrogeno Ifquido antes de descongelarlas para su uso. Por ejemplo, una vez que las ampollas han alcanzado aproximadamente -90°C, se transfieren a un area de almacenamiento en nitrogeno Kquido. Las celulas crioconservadas preferentemente se descongelan a una temperature de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, preferentemente a una temperatura de aproximadamente 37°C.
5.7 USOS DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS
5.7.1 Poblaciones de celulas madre placentarias
Las poblaciones de celulas madre placentarias pueden usarse para tratar cualquier enfermedad, trastorno o afeccion que responda al tratamiento mediante administracion de una poblacion de celulas madre. Tal como se usa en la presente memoria, “tratar” abarca la cura, el remedio, la mejona, la disminucion de la gravedad, o la reduccion de la evolucion temporal de, una enfermedad, trastorno o afeccion, o cualquier parametro o smtoma de la misma.
Las celulas madre placentarias, y las poblaciones de celulas madre placentarias, pueden inducirse a diferenciarse en un tipo de celula particular, ex vivo o in vivo, en preparacion para la administracion a un individuo que necesita celulas madre, o celulas diferenciadas a partir de celulas madre. Por ejemplo, pueden inyectarse celulas madre placentarias en un organo danado, y para neogenesis de organos y reparacion de lesiones in vivo. Dicha lesion puede deberse a dichas afecciones y trastornos incluyendo, aunque sin limitarse a, infarto de miocardio, trastornos convulsivos, esclerosis multiple, apoplejfa, hipotension, paro cardiaco, isquemia, inflamacion, tiroiditis, perdida de la funcion cognitiva asociada a la edad, dano por radiacion, paralisis cerebral, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Leigh, demencia por SIDA, perdida de memoria, esclerosis lateral amiotrofica, distrofia muscular, enfermedad renal isquemica traumatismo cerebral o de la medula espinal, bypass cardiopulmonar, glaucoma, isquemia retiniana, o traumatismo de la retina.
Las celulas madre placentarias pueden usarse para tratar afecciones autoinmunitarias tales como diabetes juvenil, lupus, distrofia muscular, artritis reumatoide, y similares.
Pueden usarse poblaciones de celulas madre placentarias aisladas en terapia de sustitucion enzimatica autologa o heterologa para tratar enfermedades o afecciones espedficas, incluyendo, aunque sin limitarse a enfermedades de almacenamiento lisosomal, tales como enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Fabry, enfermedad de Gaucher (por ejemplo, deficiencia de glucocerbrosidasa), smdromes de Hunter y Hurler, smdrome de Maroteaux-Lamy, fucosidosis (deficiencia de fucosidasa), enfermedad de Batten (CLN3), asf como otras gangliosidosis, mucopolisacaridosis y glucogenosis.
Las poblaciones de celulas madre placentarias aisladas, en solitario o en combinacion con poblaciones de celulas madre o progenitoras, pueden usarse en solitario, o como portadores de transgenes autolologos o heterologos en terapia genica, para corregir errores innatos del metabolismo, fibrosis qrnstica, adrenoleucodistrofia (por ejemplo, deficiencia de co-A ligasa), leucodistrofia metacromatica (deficiencia de arilsulfatasa A) (por ejemplo, formas infantil tardfa o juvenil sintomatica o presintomatica), leucodistrofia de celulas globosas (enfermedad de Krabbe; deficiencia de galactocerebrosidasa), deficiencia de la lipasa acida (enfermedad de Wolman), enfermedad de almacenamiento de glucogeno, hipotiroidismo, anemia (por ejemplo, anemia aplasica, anemia de celulas falciformes, etc.), smdrome de Pearson, enfermedad de Pompe, fenilcetonuria (PKU), porfiria, enfermedad del jarabe de arce, homocistinuria, mucopolisacaridenosis, enfermedad cronica granulomatosa y tirosinemia y enfermedad de Tay-Sachs o para tratar cancer (por ejemplo, un neoplasia hematologica), tumores u otras afecciones patologicas. Las celulas madre placentarias pueden usarse para tratar displasia esqueletica. En un aspecto, las celulas madre placentarias transformadas para expresar el activador de plasminogeno tisular (tPA) pueden administrarse a un individuo para tratar un trombo.
Pueden usarse poblaciones de celulas madre placentarias aisladas en terapias o protocolos de regeneracion sustitucion tisular autologas o heterologas, incluyendo, aunque sin limitarse a, tratamiento de defectos epiteliales de la cornea, tratamiento de la osteogenesis imperfecta, reparacion del cartflago, dermoabrasion facial, membranas mucosas, membranas timpanicas, revestimientos intestinales, estructuras neurologicas (por ejemplo, retina, neuronas auditivas en membrana basilar, neuronas olfativas en epitelio olfativo), reparacion de quemaduras y heridas para lesiones traumaticas de la piel, o para la reconstruccion de otros organos o tejidos danados o enfermos. Una poblacion aislada de celulas madre placentarias se usa en reconstruccion hematopoyetica en un individuo que ha sufrido una perdida parcial o total de celulas madre hematopoyeticas, por ejemplo, individuos expuestos a dosis letales o subletales de radiacion (ya sea industrial, medica o militar); individuos que se han sometido a mieloablacion como parte de, por ejemplo, terapia para cancer, y similares, en el tratamiento de, por ejemplo, una neoplasia hematologica. Pueden usarse celulas madre placentarias en reconstitucion hematopoyetica en individuos que tienen anemia (por ejemplo, anemia aplasica, anemia de celulas falciformes, etc.). Preferentemente, las celulas madre placentarias son administradas a aquellos individuos con una poblacion de celulas madre hematopoyeticas. Pueden usarse poblaciones aisladas de celulas madre obtenidas a partir de la placenta en lugar de, o para suplementar, medula osea o poblaciones de celulas madre obtenidas a partir de medula osea. Tfpicamente, aproximadamente de 1 x 108 a 2 x 108 celulas mononucleares de medula osea por kilogramo de peso del paciente se infunden para injerto en un trasplante de medula osea (es decir, aproximadamente 70 ml de medula para un donante de 70 kg). Para obtener 70 ml se requiere una donacion intensiva y una perdida significativa de sangre del donante en el proceso de
donacion. Una poblacion aislada de celulas madre placentarias para reconstitucion hematopoyetica puede
comprender, aproximadamente, al menos, o no mas de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o mas celulas madre placentarias.
Por lo tanto, pueden usarse celulas madre placentarias para tratar a pacientes que tienen un cancer de la sangre, tal
como un linfoma, leucemia (como leucemia mieloide cronica o aguda, leucemia linfodtica aguda, enfermedad de
Hodgkin, etc.), mielodisplasia, smdrome mielodisplasico, y similares. En otro aspecto, la enfermedad, trastorno o
afeccion es enfermedad granulomatosa cronica.
Puesto que la reconstitucion hematopoyetica puede usarse en el tratamiento de anemias, en la presente memoria se
desvela ademas el tratamiento de un individuo con una combinacion de celulas madre desvelada en la presente
memoria, en la que el individuo tiene una anemia o trastorno de la hemoglobina de la sangre. La anemia o trastorno
puede ser natural (por ejemplo, causado por la genetica o una enfermedad), o puede ser inducida de forma artificial
(por ejemplo, mediante envenenamiento accidental o deliberado, quimioterapia, y similares). En otro aspecto, la
enfermedad o trastorno es un smdrome de insuficiencia de la medula (por ejemplo, anemia aplasica, smdrome de
Kostmann, anemia de Diamond Blackfan, trombocitopenia amegacariodtica, y similares), un trastorno de medula
osea o una enfermedad o trastorno hematopoyetico.
Tambien pueden usarse celulas madre placentarias para tratar enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave,
incluyendo, aunque sin limitarse a, una enfermedad de inmunodeficiencia combinada (por ejemplo, smdrome de
Wiskott-Aldrich, smdrome grave de DiGeorge, y similares).
Las celulas madre placentarias desveladas en la presente memoria, en solitario o en combinacion con otras
poblaciones de celulas madre o celulas progenitoras, pueden usarse en la fabricacion de un tejido u organo in vivo.
Los metodos desvelados en la presente memoria abarcan el uso de celulas obtenidas de la placenta, por ejemplo,
celulas madre o celulas progenitoras, para sembrar una matriz y para cultivarlas en las condiciones apropiadas para
permitir a las celulas diferenciarse y poblar la matriz. Los tejidos y organos obtenidos mediante los metodos
desvelados en la presente memoria pueden usarse para diversos fines, incluyendo fines de investigacion y
terapeuticos.
Pueden usarse celulas madre placentarias y poblaciones de celulas madre placentarias para trasplantes autologos y
alogenicos, incluyendo trasplantes hematopoyeticos de tipo HLA coincidente y no coincidente. En un aspecto del uso
de celulas madre placentarias como trasplantes hematopoyeticos alogenicos, el huesped es tratado para reducir la
reaccion inmunologica de las celulas del donante, o para crear inmunotolerancia (vease, por ejemplo, las patentes
de Estados Unidos N° 5.800.539 y 5.806.529). En otro aspecto, el huesped no es tratado para reducir el rechazo
inmunologico o para crear inmunotolerancia.
Celulas madre placentarias, en solitario o en combinacion con una o mas poblaciones de celulas madre diferentes,
pueden usarse en protocolos de trasplante terapeutico, por ejemplo, para aumentar o sustituir celulas madre o
progenitoras del hngado, pancreas, rinon, pulmon, sistema nervioso, aparato muscular, hueso, medula osea, timo,
bazo, tejido mucosal, gonadas, o cabello. Adicionalmente, pueden usarse celulas madre placentarias en lugar de
clases espedficas de celulas progenitoras (por ejemplo, condrocitos, hepatocitos, celulas hematopoyeticas, celulas
el parenquima pancreatico, neuroblastos, celulas progenitoras musculares, etc.) en protocolos terapeuticos o de
investigacion en los que se usanan tfpicamente celulas progenitoras.
Pueden usarse celulas madre placentarias, particularmente celulas madre placentarias CD200+, como complemento
a la terapia de sustitucion capilar. Por ejemplo, celulas madre placentarias, por ejemplo, celulas madre placentarias
CD200+, se inyectan por via subcutanea o por via intradermica en un lugar en el que se desea el crecimiento o
recrecimiento del cabello. El numero de celulas madre inyectadas puede estar, por ejemplo, entre aproximadamente
100 y aproximadamente 10.000 por inyeccion, en un volumen de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 |il,
aunque tambien pueden usarse mas o menos celulas en mayor o menor volumen. La administracion de celulas
madre placentarias para facilitar el recrecimiento del cabello puede comprender una unica inyeccion o multiples
inyecciones en, por ejemplo, un patron regular o aleatorio en una zona en la que se desea el recrecimiento del
cabello. Pueden usarse terapias de recrecimiento del cabello conocidas junto con las celulas madre placentarias, por
ejemplo, minoxidil topico. La cafda del cabello que puede tratarse usando celulas madre placentarias puede ser de
origen natural (por ejemplo, calvicie de patron masculino) o inducida (por ejemplo, resultante de exposicion a
productos qrnmicos toxicos).
Pueden usarse celulas madre placentarias y poblaciones de celulas madre placentarias de la invencion para el
aumento, la reparacion o la sustitucion de cartflago, tendones, o ligamentos. Por ejemplo, en ciertos aspectos,
protesis (por ejemplo, protesis de cadera) pueden revestirse con construcciones de tejido de cartflago de sustitucion
que se hicieron crecer a partir de celulas madre placentarias. En otros aspectos, pueden reconstruirse articulaciones
(por ejemplo, la rodilla) con construcciones de tejido de cartflago que se hicieron crecer a partir de celulas madre
placentarias. Las construcciones de tejido de cartflago tambien pueden emplearse en cirugfa reconstructiva mayor
para diferentes tipos de articulaciones (vease, por ejemplo, Resnick & Niwayama, eds., 1988, Diagnosis of Bone and
Joint Disorders, 2d ed., W. B. Saunders Co.).
Las celulas madre placentarias pueden usarse para reparar el dano a tejidos y organos que resulta de, por ejemplo, traumatismo, trastornos metabolicos, o enfermedad. El traumatismo puede ser, por ejemplo, traumatismo por c io^a, por ejemplo, cirugfa cosmetica. En dicho ejemplo, a un paciente se le pueden administrar celulas madre placentarias, en solitario o combinadas con otras poblaciones de celulas madre o progenitoras, para regenerar o restaurar tejidos u organos que han sido danados como consecuencia de una enfermedad.
5.7.2 Composiciones que comprenden celulas madre placentarias
La presente invencion se refiere a composiciones que comprenden celulas madre placentarias, o biomoleculas de las mismas. Las celulas madre placentarias de la presente invencion pueden combinarse con cualquier compuesto, composicion o dispositivo fisiologicamente aceptable o medicamente aceptable, para uso en, por ejemplo, investigacion o terapeutica.
5.7.2.1 Celulas madre placentarias crioconservadas
Las poblaciones de celulas madre placentarias de la invencion pueden conservarse, por ejemplo, crioconservarse para uso posterior. Los metodos para la crioconservacion de celulas, tales como celulas madre, se conocen bien en la tecnica. Pueden prepararse poblaciones de celulas madre placentarias en una forma que sea facilmente administrable a un individuo. Por ejemplo, la invencion se refiere a una poblacion de celulas madres placentarias que esta contenida dentro de un recipiente que es adecuado para uso medico. Dicho recipiente puede ser, por ejemplo, una bolsa, matraz, frasco de plastico esteril u otro recipiente a partir del cual la poblacion de celulas madre placentarias puede dispensarse facilmente. Por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de sangre u otra bolsa de plastico medicamente aceptable adecuada para la administracion intravenosa de un lfquido a un receptor. El recipiente es preferentemente uno que permite la crioconservacion de la poblacion de celulas madre combinada.
La poblacion de celulas madre placentarias crioconservada puede comprender celulas madre placentarias obtenidas a partir de un unico donante, o de multiples donantes. La poblacion de celulas madre placentarias pueden tener compatibilidad HLA completa con un receptor pretendido, o incompatibilidad HLA parcial o total.
Por lo tanto, en la presente memoria se describe una composicion que comprende una poblacion de celulas madres placentarias en un recipiente. En un aspecto, la poblacion de celulas madre esta crioconservada. En otro aspecto, el recipiente es una bolsa, matraz o frasco. En otro aspecto espedfico, dicha bolsa es una bolsa de plastico esteril. En un aspecto mas espedfico, dicha bolsa es adecuada para, permite o facilita la administracion intravenosa de dicha poblacion de celulas madre placentarias. La bolsa puede comprender multiples luces o compartimentos que estan interconectados para permitir la mezcla de las celulas madre placentarias y una o mas soluciones mas, por ejemplo, un farmaco, antes de, o durante, la administracion. En otro aspecto, la composicion comprende uno o mas compuestos que facilitan la crioconservacion de la poblacion de celulas madre combinada. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias esta contenida dentro de una solucion acuosa fisiologicamente aceptable.
En otro aspecto mas espedfico, dicha solucion acuosa fisiologicamente aceptable es una solucion de NaCl 0,9%. En otro aspecto, dicha poblacion de celulas madre placentarias comprende celulas placentarias que tienen compatibilidad HLA a un receptor de dicha poblacion de celulas madre. En otra realizacion espedfica, dicha poblacion de celulas madre combinadas comprende celulas placentarias que tienen incompatibilidad HLA al menos parcial con un receptor de dicha poblacion de celulas madre. En otro aspecto, dichas celulas madre placentarias proceden de una pluralidad de donantes.
5.7.2.2 Composiciones farmaceuticas
Poblaciones de celulas madre placentarias, o poblaciones de celulas que comprenden celulas madre placentarias, pueden formularse en composiciones farmaceuticas para uso in vivo. Dichas composiciones farmaceuticas comprenden una poblacion de celulas madre placentarias, o una poblacion de celulas que comprende celulas madre placentarias, en un veldculo farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, una solucion salina u otra solucion fisiologicamente aceptable aceptada para administracion in vivo. Las composiciones farmaceuticas pueden comprenden cualquiera de las poblaciones de celulas madre placentarias, o tipos de celulas madre placentarias, descritas en otra parte en la presente memoria. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender celulas madre placentarias fetales, maternas, o tanto fetales como maternas. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender ademas celulas madre placentarias obtenidas de un unico individuo o placenta, o de una pluralidad de individuos o placentas.
Las composiciones farmaceuticas pueden comprender cualquier numero de celulas madre placentarias. Por ejemplo, una unica dosis unitaria de celulas madre placentarias puede comprender aproximadamente, al menos, o no mas de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1011 o mas celulas madre placentarias.
Las composiciones farmaceuticas comprenden poblaciones de celulas que comprenden 50% de celulas viables o mas (es decir, al menos 50% de las celulas en la poblacion son funcionales o vivas). Preferentemente, al menos
60% de las celulas en la poblacion son viables. Mas preferentemente, al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las celulas en la poblacion en la composicion farmaceutica son viables.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden comprender uno o mas compuestos que, por ejemplo, facilitan el injerto (por ejemplo, anticuerpos anti-receptor de celulas T, un inmunosupresor, o similares); estabilizantes tales como albumina, dextrano 40, gelatina, hidroxietilalmidon, y similares.
Cuando se formula como una solucion inyectable, en una realizacion, la composicion farmaceutica de la invencion comprende aproximadamente 1,25% de HSA y aproximadamente 2,5% de dextrano. Pueden usarse otras formulaciones inyectables, adecuadas para la administracion de productos celulares.
En un aspecto, la composicion descrita en la presente memoria comprende celulas madre placentarias que son sustancialmente, o completamente, de origen no materno. Por ejemplo, en la presente memoria se describe una composicion que comprende una poblacion de celulas madre placentarias que son CD200+ y HLA-G+; CD73+, CD105+ y CD200+; CD200+ y OCT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G+; CD73+ y CD105+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha poblacion de celulas madre placentarias, cuando dicha poblacion de celulas placentarias se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo similar a embrioide; u OCT-4+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha poblacion de celulas madre placentarias, cuando dicha poblacion de celulas placentarias se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo similar a embrioide; o una combinacion de las anteriores, en la que al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de dichas celulas madre placentarias son de origen no materno. En un aspecto espedfico, la composicion adicionalmente comprende una celula madre que no se obtiene de una placenta.
5.7.2.3 Medios condicionados por celulas madre placentarias
Las celulas madre placentarias de la invencion pueden usarse para producir medio condicionado, es decir, medio que comprende una o mas biomoleculas secretadas o excretadas por las celulas madre. En diversos aspectos, el medio condicionado comprende medio en el que celulas madre placentarias han crecido durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o mas dfas. En otros aspectos, el medio condicionado comprende medio en el que celulas madre placentarias han crecido hasta al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de confluencia, o hasta 100% confluencia. Dicho medio condicionado puede usarse para soportar el cultivo de una poblacion independiente de celulas madre placentarias, o de celulas madre de otro tipo. En otro aspecto, el medio condicionado comprende medio en el que celulas madre placentarias se han diferenciado en un tipo de celula adulta. En otro aspecto, el medio condicionado de la invencion comprende medio en el que se han cultivado celulas madre placentarias y celulas madre no placentarias.
5.7.2.4 Matrices que comprenden celulas madre placentarias
En la presente memoria se describen, ademas, matrices, hidrogeles, matrices de soporte, y similares que comprenden una celula madre placentaria, o una poblacion de celulas madre placentarias.
Celulas madre placentarias pueden sembrarse sobre una matriz natural, por ejemplo, un biomaterial placentario tal como una membrana amniotica material. Dicha membrana amniotica material puede ser, por ejemplo, membrana amniotica diseccionada directamente de una placenta de mairnfero; membrana amniotica fijada o tratada termicamente, membrana amniotica sustancialmente seca (es decir, <20% H2O), membrana corionica, membrana corionica sustancialmente seca, membrana amniotica y corionica sustancialmente seca, y similares. Biomateriales placentarios preferidos en los que pueden sembrarse celulas madre placentarias se describen en Hariri, publicacion de solicitud estadounidense N° 2004/0048796.
Las celulas madre placentarias pueden suspenderse en una solucion de hidrogel adecuada para, por ejemplo, inyeccion. Hidrogeles adecuados para dichas composiciones incluyen peptidos de autoensamblaje, tales como RAD16. En un aspecto, una solucion de hidrogel que comprende las celulas se dejar endurecer, por ejemplo, en un molde, para formar una matriz que tiene celulas dispersadas en su interior para implantacion. Las celulas madre placentarias en dicha matriz tambien pueden cultivarse de modo que las celulas se expandan mediante mitosis antes de la implantacion. El hidrogel es, por ejemplo, un polfmero organico (natural o sintetico) que se reticula mediante enlaces covalentes, ionicos o de hidrogeno para crear una estructura reticular abierta tridimensional que atrapa las moleculas de agua para formar un gel. Materiales de formacion de hidrogeles incluyen polisacaridos tales como alginato y sales del mismo, peptidos, polifosfazinas y poliacrilatos, que se reticulan ionicamente, o polfmeros de bloque tales como copolfmeros de oxido de polietilen-propilenglicol, que se reticulan por temperatura o pH, respectivamente. En algunos aspectos, el hidrogel o matriz es biodegradable.
En algunos aspectos, la formulacion comprende un gel polimerizable in situ (vease., por ejemplo, publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos 2002/0022676; Anseth et al., J. Control Release, 78(1-3): 199-209 (2002); Wang et al., Biomaterials, 24(22): 3969-80 (2003).
En algunos aspectos, los polfmeros son al menos parcialmente solubles en soluciones acuosas, tales como agua, soluciones salinas tamponadas o soluciones alcoholicas acuosas, que tienen grupos laterales cargados o una sal ionica monovalente de los mismos. Ejemplos de polfmeros que tienen grupos laterales acidos que pueden reaccionar con cationes son poli(fosfazenos), acido poli(acnlicos), acidos poli(metacnlicos), copolfmeros de acido acnlico y acido metacnlico, poli(acetato de vinilo) y polfmeros sulfonados, tales como poliestireno sulfonado.
Tambien pueden utilizarse copoUmeros que tienen grupos laterales acidos formados por reaccion de acido acnlico o metacnlico y monomeros o polfmeros de eter vimlico. Ejemplos de grupos acidos son grupos de acido carboxflico, grupos de acido sulfonico, grupos de alcohol halogenados (preferentemente fluorados), grupos OH fenolicos y grupos OH acidos.
Las celulas madre placentarias o cocultivos de las mismas pueden sembrarse sobre un marco o matriz de soporte tridimensional o implantarse in vivo. Dicho marco puede implantarse en combinacion con cualquiera de uno o mas factores de crecimiento, celulas, farmacos u otros componentes que estimulan la formacion de tejido o potencian o mejoran de otro modo la puesta en practica de la invencion.
Los ejemplos de matrices de soporte que pueden usarse incluyen mallas no tejidas, espumas porosas o peptidos de autoensamblaje. Las mallas no tejidas pueden formarse usando fibras que comprenden un copolfmero absorbible sintetico de acidos glicolicos y lacticos (por ejemplo, PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, N.J.). Espumas, compuestas por, por ejemplo, copolfmero de poli(g-caprolactona)/acido poli(glicolico) (PCL/PGA), formadas por procesos tales como liofilizacion (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.355.699), tambien pueden usarse como matrices de soporte.
Celulas madre placentarias tambien pueden sembrarse en, o ponerse en contacto con, un material de ceramica fisiologicamente aceptable incluyendo, aunque sin limitarse a, mono-, di-, tri-, alfa-tri-, beta-tri- y tetra-fosfato de calcio, hidroxiapatita, fluoroapatitas, sulfatos de calcio, fluoruros de calcio, oxidos de calcio, carbonatos de calcio, fosfatos de calcio de magnesio, vidrios biologicamente activos tales como BIOGLASS® y mezclas de los mismos. Los materiales ceramicos biocompatibles porosos disponibles actualmente en el mercado incluyen SURGIBONE® (CanMedica Corp., Canada), En Do BON® (Merck Biomaterial France, Francia), CEROS® (Mathys, AG, Bettlach, Suiza) y productos de injertos oseos de colageno mineralizado tales como HEALOS™ (DePuy, Inc., Raynham, MA) y VIt Os S®, RHAKOSS™ y CORTOSS® (Orthovita, Malvern, Pa.). El marco puede ser una mezcla, combinacion o compuesto de materiales naturales y/o sinteticos.
En otra realizacion, celulas madre placentarias pueden sembrarse en, o ponerse en contacto con, un fieltro, que puede, por ejemplo, estar compuesto por un hilo multifilamento hecho de material bioabsorbible tal como copolfmeros o combinaciones de PGA, PLA, PCL, o acido hialuronico.
Las celulas madre placentarias pueden sembrarse en matrices de soporte de espuma que pueden ser estructuras compuestas. Dichas matrices de soporte de espuma pueden moldearse en una forma util, tal como la de una parte de una estructura espedfica en el cuerpo que debe repararse, reemplazarse o aumentarse. En algunos ejemplos, el marco se trata, por ejemplo, con acido acetico 0,1 M mediante incubacion en polilisina, PBS y/o colageno, antes de la inoculacion de las celulas para mejorar la union celular. Las superficies externas de una matriz pueden modificarse para mejorar la fijacion o el crecimiento de celulas y la diferenciacion de tejido, tal como mediante revestimiento con plasma de la matriz, o adicion de una o mas protemas (por ejemplo, colagenos, fibras elasticas, fibras reticulares), glucoprotemas, glucosaminoglucanos (por ejemplo, sulfato de heparina, condroitin-4-sulfato, condroitin-6-sulfato, sulfato de dermatan, sulfato de queratina, etc.), una matriz celular y/u otros materiales tales como, aunque sin limitarse a, gelatina, alginatos, agar, agarosa y gomas vegetales y similares.
En algunos ejemplos, la matriz de soporte comprende, o se trata con, materiales que le hacen no trombogenica. Estos tratamientos y materiales tambien pueden promover y sostener el crecimiento endotelial, la migracion y la deposicion de matriz extracelular. Los ejemplos de estos materiales y tratamientos incluyen, aunque no se limitan a, materiales naturales tales como protemas de la membrana basal tales como laminina y colageno de Tipo IV, materiales sinteticos tales como EPTFE y siliconas de poliuretanourea segmentadas, tales como PURSPAN™ (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif). La matriz de soporte tambien puede comprender agentes antitromboticos tales como heparina; las matrices de soporte tambien pueden tratarse para alterar la carga de la superficie (por ejemplo, revistiendo con plasma) antes de sembrar con celulas madre placentarias.
5.7.3 Lmeas de celulas madre placentarias inmortalizadas
Las celulas placentarias de mairnfero pueden inmortalizarse condicionalmente mediante transfeccion con cualquier vector adecuado que contenga un gen promotor del crecimiento, es decir, un gen que codifica una protema que, en las condiciones apropiadas, promueve el crecimiento de la celula transfectada, de modo que la produccion y/o actividad de la protema promotora del crecimiento sea regulable mediante un factor externo. En una realizacion preferida el gen promotor del crecimiento es un oncogen tal como, aunque sin limitarse a, v-myc, N-myc, c-myc, p53, antfgeno T grande de SV40, antfgeno T grande de polioma, adenovirus E1a o protema E7 de papilomavirus humano.
La regulacion externa de la protema promotora del crecimiento puede lograrse situando al gen promotor del crecimiento bajo el control de un promotor externamente regulable, por ejemplo, un promotor cuya actividad puede controlarse mediante, por ejemplo, modificacion de la temperatura de las celulas transfectadas o la composicion del medio en contacto con las celulas. Puede emplearse un sistema de expresion genica controlada por tetraciclina (tet) (vease Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89: 5547-5551, 1992; Hoshimaru et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 93: 1518-1523, 1996). En ausencia de tet, un transactivador controlado por tet (tTA) dentro de este vector activa fuertemente la transcripcion de phcMwi, un promotor mmimo del citomegalovirus humano fusionado con secuencias operadoras de tet. La tTA es una protema de fusion del represor (tetR) del operon de resistencia a tet procedente del transposon-10 de Escherichia coli y el dominio acido de VP16 del virus del herpes simplex. Concentraciones no toxicas bajas de tet (por ejemplo, 0,01-1,0 |ig/ml) suprimen casi completamente la transactivacion mediante tTA.
El vector contiene, ademas, un gen que codifica un marcador seleccionable, por ejemplo, una protema que confiere resistencia a los farmacos. El gen de resistencia a la neomicina bacteriana (neoR) es un marcador tal que puede emplearse como se describe en la presente memoria. Las celulas que portan neoR pueden seleccionarse por medios conocidos por los expertos en la materia, tal como la adicion de, por ejemplo, 100-200 |ig/ml de G418 al medio de cultivo.
La transfeccion puede conseguirse mediante cualquiera de diversos medios conocidos por los expertos en la materia que incluyen, aunque sin limitarse a, la infeccion retroviral. En general, un cultivo celular puede transfectarse mediante incubacion con una mezcla de medio condicionado recogida de la lmea celular del productor para el vector y DMEM/F12 que contiene suplementos de N2. Por ejemplo, un cultivo celular placentario preparado como se ha descrito anteriormente puede infectarse despues de, por ejemplo, cinco dfas in vitro mediante incubacion durante aproximadamente 20 horas en un volumen de medio condicionado y dos volumenes de DMEM/F12 que contiene suplementos de N2. Las celulas transfectadas que portan un marcador seleccionable pueden seleccionarse a continuacion tal como se ha descrito anteriormente.
Despues de la transfeccion, los cultivos se hacen pasar sobre una superficie que permite la proliferacion, por ejemplo, permite que al menos aproximadamente 30% de las celulas se dupliquen en un penodo de 24 horas. Preferentemente, el sustrato es un sustrato de poliornitina/laminina, que consta de plastico de cultivo tisular revestido con poliornitina (10 |ig/ml) y/o laminina (10 |ig/ml), un sustrato de polilisina/laminina o una superficie tratada con fibronectina. Los cultivos se alimentan entonces cada 3-4 dfas con un medio de cultivo, que puede suplementarse o no con uno o mas factores que mejoran la proliferacion. Pueden anadirse al medio de cultivo factores que mejoran la proliferacion cuando los cultivos son menos de 50% confluentes.
Las lmeas de celulas madre placentarias inmortalizadas condicionalmente pueden hacerse pasar usando tecnicas convencionales, tales como mediante tripsinizacion, cuando son 80-95% confluentes. Hasta aproximadamente el vigesimo pase, en algunos ejemplos, es beneficioso mantener la seleccion (mediante, por ejemplo, la adicion de G418 para celulas que contienen un gen de resistencia a la neomicina). Las celulas tambien pueden congelarse en nitrogeno lfquido para almacenamiento a largo plazo.
Las lmeas celulares clonicas pueden aislarse de una lmea de celulas madre placentarias inmortalizadas condicionalmente tal como se ha descrito anteriormente. En general, dichas lmeas celulares clonicas pueden aislarse usando tecnicas estandar, tal como mediante dilucion lfmite o usando anillos de clonacion y expandirse. Las lmeas celulares clonicas pueden alimentarse en general y someterse a pase tal como se ha descrito anteriormente. Lmeas de celulas madre placentarias humanas inmortalizadas condicionalmente, que pueden ser clonicas, pero no necesariamente lo son, pueden inducirse en general a diferenciarse mediante supresion de la produccion y/o actividad de la protema promotora de crecimiento en condiciones que facilitan la diferenciacion. Por ejemplo, si el gen que codifica la protema promotora del crecimiento esta bajo el control de un promotor externamente regulable, las condiciones, por ejemplo, temperatura o composicion del medio, pueden modificarse para suprimir la transcripcion del gen promotor del crecimiento. Para el sistema de expresion genica controlada por tetraciclina que se ha descrito anteriormente, la diferenciacion puede lograrse mediante adicion de la tetraciclina para suprimir la transcripcion del gen promotor de crecimiento. En general, 1 |ig/ml de tetraciclina durante 4-5 dfas es suficiente para iniciar la diferenciacion. Para promover una mayor diferenciacion, pueden incluirse agentes adicionales en el medio de cultivo.
5.7.4 Ensayos
Las celulas madre placentarias pueden usarse en ensayos para determinar la influencia de las condiciones de cultivo, los factores ambientales, moleculas (por ejemplo, biomoleculas, pequenas moleculas inorganicas, etc.) y similares sobre la proliferacion, expansion y/o diferenciacion de celulas madre, en comparacion con las celulas madre placentarias no expuestas a dichas condiciones.
En un aspecto preferido, las celulas madre placentarias se ensayan para cambios en la proliferacion, expansion o diferenciacion en el momento del contacto con una molecula. En la presente memoria se desvela un metodo de identificacion un compuesto que modula la proliferacion de una pluralidad de celulas madre placentarias, que comprende poner en contacto dicha pluralidad de celulas madre con dicho compuesto en condiciones que permiten la proliferacion, en la que si dicho compuesto causa un cambio detectable en la proliferacion de dicha pluralidad de celulas madre en comparacion con una pluralidad de celulas madre no puestas en contacto con dicho compuesto, dicho compuesto se identifica como un compuesto que modula la proliferacion de celulas madre placentarias. En un aspecto espedfico, dicho compuesto se identifica como un inhibidor de la proliferacion. En otro aspecto espedfico, dicho compuesto se identifica como un potenciador de la proliferacion.
En la presente memoria se describe ademas un metodo de identificacion un compuesto que modula la expansion de una pluralidad de celulas madre placentarias, que comprende poner en contacto dicha pluralidad de celulas madre con dicho compuesto en condiciones que permiten expansion, en el que si dicho compuesto causa un cambio detectable en la expansion de dicha pluralidad de celulas madre en comparacion con una pluralidad de celulas madre no puestas en contacto con dicho compuesto, dicho compuesto se identifica como un compuesto que modula la expansion de celulas madre placentarias. En un aspecto espedfico, dicho compuesto se identifica como un inhibidor de la expansion. En otro aspecto espedfico, dicho compuesto se identifica como un potenciador de la expansion.
En la presente memoria se describe tambien un metodo de identificacion un compuesto que modula la diferenciacion de una celula madre placentaria, que comprende poner en contacto dichas celulas madre con dicho compuesto en condiciones que permiten la diferenciacion, en el que si dicho compuesto causa un cambio detectable en la diferenciacion de dichas celulas madre en comparacion con una celula madre no puesta en contacto con dicho compuesto, dicho compuesto se identifica como un compuesto que modula la proliferacion de celulas madre placentarias. En un aspecto espedfico, dicho compuesto se identifica como un inhibidor de la diferenciacion. En otro aspecto espedfico, dicho compuesto se identifica como un potenciador de la diferenciacion.
6. Ejemplos
6.1 EJEMPLO 1: CULTIVO DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS
Se obtienen celulas madre placentarias de una placenta de mamffero postparto mediante perfusion o mediante ruptura ffsica, por ejemplo, digestion enzimatica. Las celulas se cultivan en un medio de cultivo que comprende d Me M-LG 60% (Gibco), MCDB-201 40% (Sigma), suero fetal de ternero 2% (FCS) (Hyclone Laboratories), 1x insulina-transferrina-selenio (ITS), 1x acido lenolenico-albumina de suero bovino (LA-BSA), dexametasona 10-9 M (Sigma), 2-fosfato de acido ascorbico 10'4 M (Sigma), factor de crecimiento epidermico (EGF) 10 ng/ml (R&D Systems), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/ml (R&D Systems), y 100 U de penicilina/1000 U de estreptomicina.
El matraz de cultivo en el que se cultivan las celulas se prepara de la siguiente manera. Matraces T75 se revisten con fibronectina (FN), anadiendo 5 ml de PBS que contiene 5 ng/ml FN humana (Sigma F0895) al matraz. Los matraces con solucion de FN se dejan a 37°C durante 30 minutos. La solucion de FN se retira a continuacion antes del cultivo celular. No hay necesidad de secar los matraces despues del tratamiento. Como alternativa, los matraces se dejan en contacto con la solucion de FN a 4°C durante una noche o mas; antes del cultivo, los matraces se calientan y la solucion de FN se retira.
Celulas madre placentarias aisladas mediante perfusion
Los cultivos de celulas madre placentarias a partir de perfundido placentario se establecen de la siguiente manera. Celulas procedentes de un gradiente de Ficoll se siembran en matraces T75 revestidos de FN, preparados como anteriormente, a 50-100x106 celulas/matraz en 15 ml de medio de cultivo. Tfpicamente, se siembran de 5 a 10 matraces. Los matraces se incuban a 37°C durante 12-18 h para permitir la fijacion de las celulas adherentes. Se anaden 10 ml de PBS caliente a cada matraz para retirar las celulas en suspension, y se mezcla suavemente. A continuacion se retiran 15 ml del medio y se sustituyen por 15 ml de medio de cultivo fresco. Todo el medio se cambia 3-4 dfas despues del comienzo del cultivo. Los posteriores cambios del medio de cultivo se realizan, durante los cuales se retira 50% o 7,5 ml del medio.
Comenzando en aproximadamente el dfa 12, el cultivo se verifica en un microscopio para examinar el crecimiento de las colonias de celulas adherentes. Cuando los cultivos celulares se vuelven aproximadamente 80% confluentes, tfpicamente entre el dfa 13 y el dfa 18 despues del comienzo del cultivo, las celulas adherentes se recogen mediante digestion con tripsina. Las celulas recogidas de estos cultivos primarios se designan de pase 0 (cero).
Celulas madre placentarias aisladas mediante ruptura fisica y digestion enzimatica
Los cultivos de celulas madre placentarias se establecen a partir de tejido placentario digerido de la siguiente manera. La placenta perfundida se coloca sobre una hoja de papel esteril con el lado materno arriba. Aproximadamente 0,5 cm de la capa superficial en el lado materno de la placenta se raspa con una cuchilla, y la cuchilla se usa para retirar un bloque de tejido placentario que mide aproximadamente 1 x 2 x 1 cm. Este tejido placentario se pica a continuacion en trozos de aproximadamente 1 mm3. Estos trozos se recogen en un tubo Falcon de 50 ml y se digieren con colagenasa IA (2 mg/ml, Sigma) durante 30 minutos, seguida por tripsina-EDTA (0,25%, GIBCO BRL) durante 10 minutos, a 37°C en un bano de agua. La solucion resultante se centrifuga a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, y la solucion de digestion se retira. El sedimento se resuspende a aproximadamente 10 volumenes con PBS (por ejemplo, un sedimento de 5 ml se resuspende con 45 ml de PBS), y los tubos se centrifugan a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sedimento de tejido/celulas se resuspende en 130 ml de medio de cultivo, y las celulas se siembran a 13 ml por matraz T-75 revestido con fibronectina. Las celulas se incuban a 37°C con una atmosfera humidificada con CO2 5%. Las celulas madre placentarias opcionalmente se crioconservan en esta fase.
Subcultivo y expansion de celulas madre placentarias
Las celulas crioconservadas se descongelan rapidamente en un bano de agua a 37°C. Las celulas madre placentarias se retiran inmediatamente del criovial con 10 ml de medio caliente y se transfieren a un tubo esteril de 15 ml. Las celulas se centrifugan a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las celulas se resuspenden suavemente en 10 ml de medio de cultivo caliente mediante pipeteo, y los recuentos de celulas viables se determinan mediante exclusion con azul de tripano. Las celulas se siembran a continuacion a aproximadamente 6000-7000 celulas por cm2 en matraces revestidos con FN, preparados como anteriormente (aproximadamente 5x105 celulas por matraz T-75). Las celulas se incuban a 37°C, CO25% y 90% de humedad. Cuando las celulas alcanzaban 75-85% de confluencia, todo el medio agotado se retira de forma aseptica de los matraces y se desecha. Se anaden 3 ml de solucion tripsina/EDTA 0,25% (p/v) para cubrir la capa de celulas, y las celulas se incuban a 37°C, CO2 5% y 90% de humedad durante 5 minutos. El matraz se golpea una o dos veces para acelerar el desprendimiento de celulas, Una vez que >95% de las celulas estan redondeadas y desprendidas, se anaden 7 ml de medio de cultivo caliente a cada matraz T-75, y la solucion se dispersa mediante pipeteo sobre la superficie de la capa de celulas varias veces.
Despues de contar las celulas y determinar la viabilidad como anteriormente, las celulas se centrifugan a 1000 RPM durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las celulas se someten a un pase resuspendiendo suavemente el sedimento de celulas de un matraz T-75 con medio de cultivo, y sembrando uniformemente las celulas sobre dos matraces T-75 revestidos con FN.
Usando los metodos anteriores, se identifican poblaciones ejemplares de celulas madre placentarias adherentes que expresan los marcadores CD105, CD33, CD73, CD29, Cd44, CD10, y CD90. Estas poblaciones de celulas tfpicamente no expresan CD34, CD45, CD117 o CD133. Algunos, aunque no todos los cultivos de estas celulas madre placentarias expresaban HLA-ABC y/o HLA-DR.
6.2 EJEMPLO 2:
AISLAMIENTO DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS A PARTIR DE ESTRUCTURAS PLACENTARIAS
6.2.1 Materiales y metodos
6.2.1.1 Aislamiento de poblaciones de celulas placentarias que comprenden celulas madre placentarias
Se obtuvieron poblaciones de celulas placentarias distintas de las placentas de embarazos a termino normales. Todas las donantes dieron su consentimiento por escrito para el uso de sus placentas para fines de investigacion. Se obtuvieron celulas madre placentarias de las siguientes fuentes: (1) perfundido placentario (de la perfusion de la vasculatura placentaria); y digestiones enzimaticas de (2) amnios, (3) corion, (4) amnios-placa corionica, y (5) el cordon umbilical. Los diversos tejidos placentarios se limpiaron en PBS esteril (Gibco-Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) y se colocaron en placas de Petri esteriles diferentes. Los diversos tejidos se picaron usando un escalpelo quirurgico esteril y se colocaron en tubos conicos Falcon de 50 ml. Los tejidos picados se digirieron con 1X Colagenasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 20 minutos en un bano con agua a 37°C, se centrifugaron, y a continuacion se digirieron con Tripsina-EDTA 0,25% (Gibco-Invitrogen Corp) durante 10 minutos en un bano con agua a 37°C. Los diversos tejidos se centrifugaron despues de la digestion y se aclararon una vez con PBS esteril (Gibco-Invitrogen Corp). Las celulas reconstituidas se filtraron a continuacion dos veces, una vez con colorantes celulares de 100 |im y una vez con filtros de separacion de 30 |im, para retirar cualquier matriz extracelular residual o resto celular.
6.2.1.2 Evaluacion de la viabilidad celular y recuentos celulares
El metodo de exclusion con azul de tripano manual se empleo despues de la digestion para calcular recuentos celulares y evaluar la viabilidad celular. Las celulas se mezclaron con colorante azul de tripano (Sigma-Aldrich) a una proporcion de 1:1, y las celulas se leyeron en un hemacitometro.
6.2.1.3 Caracterizacion de marcadores de la superficie celular
Celulas que eran HLA ABCVCD45YCD34VCD133+ se seleccionaron para caracterizacion. Celulas que tienen este fenotipo se identificaron, cuantificaron y se caracterizaron mediante dos citometros de flujo de Becton-Dickinson, FACSCalibur y FACS Aria (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE. UU.). Las diversas celulas placentarias se tineron, a una proporcion de aproximadamente 10 |il de anticuerpo por 1 millon de celulas, durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador. Se usaron los siguientes anticuerpos anti-ser humano: anticuerpos monoclonales conjugados a isotiocianato de fluorescema (FITC) contra HLA-G (Serotec, Raleigh, NC), CD10 (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA), CD44 (BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA) y CD105 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN); anticuerpos monoclonales conjugados a ficoeritrina (PE) contra CD44, CD200, CD117 y CD13 (BD Biosciences Pharmingen); estreptavidina conjugada a ficoeritrina-Cy5 y anticuerpos monoclonales (PE Cy5) contra CD117 (BD Biosciences Pharmingen); anticuerpos monoclonales conjugados a ficoeritrina-Cy7 (PE Cy7) contra CD33 y CD10 (BD Biosciences); estreptavidina conjugada a alloficocianina (APC) y anticuerpos monoclonales contra CD38 (BD Biosciences Pharmingen); y CD90 biotinilado (BD Biosciences Pharmingen). Despues de la incubacion, las celulas se aclararon una vez para retirar anticuerpos no unidos y se fijaron durante una noche con paraformaldetndo 4% (USB, Cleveland, OH) a 4°C. Al dfa siguiente, las celulas se aclararon dos veces, se filtraron a traves de un filtro de separacion de 30 |im, y se hicieron pasar por el citometro o citometros de flujo.
Las muestras que se tineron con anticuerpos IgG anti-raton (BD Biosciences Pharmingen) se usaron como controles negativos y se usaron para ajustar los tubos fotomultiplicadores (PMTs). Las muestras que se tineron unicamente con anticuerpos anti-ser humano se usaron como controles positivos y se usaron para ajustar solapamientos/compensaciones espectrales.
6.2.1.4 Clasificacion y cultivo celular
Un conjunto de celulas placentarias (de perfundido, amnios o corion), antes de cualquier cultivo, se tino con 7-Amino-Actinomicina D (7AAD; BD Biosciences Pharmingen) y anticuerpos monoclonales espedficos para el fenotipo de interes. Las celulas se tineron a una proporcion de 10 |il de anticuerpo por 1 millon de celulas, y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador. Estas celulas se clasificaron a continuacion positivamente para celulas vivas que expresan el fenotipo de interes en BD FACS Aria y se sembraron en cultivo. Las poblaciones de celulas placentarias clasificadas (poblacion de interes) y “todas” (no clasificadas) se sembraron en placas para comparaciones. Las celulas se sembraron en una placa de 96 pocillos revestida con fibronectina (Sigma-Aldrich) a las densidades celulares enumeradas en la tabla 1 (celulas/cm2). La densidad celular, y si el tipo de celulas estaba sembrado por duplicado o triplicado, se determino y se rigio por el numero de celulas que expresan el fenotipo de interes.
Tabla 1: Densidades de siembra de celulas
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Medio completo (60% DMEM-LG (Gibco) y MCDB-201 40% (Sigma); suero fetal de ternero 2% (Hyclone Labs.); 1x insulina-transferrina-selenio (ITS); 1x acido linoleico-albumina de suero bovino (LA-BSA); dexametasona 10‘9 M (Sigma); 2-fosfato de acido ascorbico 10‘4 M (Sigma); factor de crecimiento epidermico 10 ng/ml (R&D Systems); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/ml (R&D Systems)) se anadio a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y la placa se coloco en una incubadora con CO25%/37°C. El dfa 7, se anadieron 100 |il de medio completo a cada uno de los pocillos. La placa de 96 pocillos se monitorizo durante aproximadamente dos semanas y una evaluacion final del cultivo se completo el dfa 12. Esto es muy temprano en el cultivo de celulas madre placentarias, y representa celulas de pase 0.
6.2.1.5 Analisis de los datos
Los datos de FACSCalibur se analizaron en FlowJo (Tree star, Inc) usando tecnicas de acotamiento convencionales. Los datos de BD FACS Aria se analizaron usando el software FACSDiva (Becton-Dickinson). Los datos de FACS Aria se analizaron usando acotamiento por discriminacion de dobletes para minimizar los dobletes, asf como, tecnicas de acotamiento convencionales. Todos los resultados se compilaron en Microsoft Excel y todos los valores, en la presente memoria, se representan como promedio ± desviacion tfpica (numero, error tfpico de la media).
6.2.2 Resultados
6.2.2.1 Viabilidad celular
La viabilidad despues de la digestion se evaluo usando el metodo manual de exclusion con azul de tripano (figura 1). La viabilidad de celulas promedio obtenidas a partir de la mayona del tejido digerido (procedente de amnios, corion o amnios-placa corionica) era aproximadamente 70%. El amnios presentaba una viabilidad promedio de 74,35%±10,31% (n=6, ETM=4,21), el corion presentaba una viabilidad promedio de 78,18%± 12,65% (n=4, ETM=6,32), el amnios-placa corionica presentaba una viabilidad promedio de 69,05% ±10,80% (n=4, ETM=5,40), y el cordon umbilical presentaba una viabilidad promedio de 63,30% ±20,13% (n=4, ETM=10,06). Celulas procedentes de perfusion, que no experimentaban digestion, conservaban la viabilidad promedio mas elevada, 89,98±6,39% (n=5, ETM=2,86).
6.2.2.2 Cuantificacion de celulas
Las poblaciones de celulas placentarias y celulas del cordon umbilical se analizaron para determinar los numeros de celulas HLA ABCVCD45Vc D34YCD133+. A partir del analisis de los datos de BD FACSCalibur, se observo que el amnios, el perfundido, y el corion conteman el mayor numero total de estas celulas, 30,72 ± 21,80 celulas (n=4, ETM=10,90), 26,92 ± 22,56 celulas (n=3, ETM=13,02), y 18,39 ± 6,44 celulas (n=2, ETM=4,55) respectivamente (no se muestran los datos). El amnios-placa corionica y el cordon umbilical conteman el mmimo numero total de celulas que expresan el fenotipo de interes, 4,72 ± 4,16 celulas (n=3, ETM=2,40) y 3,94 ± 2,58 celulas (n=3, ETM=1,49) respectivamente (no se muestran los datos).
Analogamente cuando se analizo el porcentaje de celulas totales que expresan el fenotipo de interes, se observo que el amnios y el perfundido placentario conteman los mayores porcentajes de celulas que expresan este fenotipo (0,0319% ± 0,0202% (n=4, ETM=0,0101) y 0,0269% ± 0,0226% (n=3, ETM=0,0130) respectivamente (figura 2). Aunque el cordon umbilical contema una pequena cantidad de celulas que expresan el fenotipo de interes (figura 2), contema el tercer porcentaje mas alto de celulas que expresan el fenotipo de interes, 0,020±0,0226% (n=3, ETM=0,0131) (figura 2). El corion y el amnios-placa corionica conteman los porcentajes mas bajos de celulas que expresan el fenotipo de interes, 0,0184±0,0064% (n=2, ETM=0,0046) y 0,0177±0,0173% (n=3, ETM=0,010) respectivamente (figura 2).
De forma coherente con los resultados del analisis de BD FACSCalibur, los datos de BD FACS Aria tambien identificaron que el amnios, perfundido, y corion proporcionaban numeros mas elevados de celulas HLA ABCVCD45' /CD34VCD133+ que las fuentes restantes. El numero total promedio de celulas que expresan el fenotipo de interes entre amnios, perfundido, y corion era 126,47 ± 55,61 celulas (n=15, ETM=14,36), 81,65 ± 34,64 celulas (n=20, ETM=7,75), y 51,47 ± 32,41 celulas (n=15, ETM=8,37), respectivamente (no se muestran los datos). El amnios-placa corionica y el cordon umbilical conteman el mmimo numero total de celulas que expresan el fenotipo de interes, 44,89 ± 37,43 celulas (n=9, ETM=12,48) y 11,00 ± 4,03 celulas (n=9, ETM=1,34) respectivamente (no se muestran los datos).
Los datos de BD FACS revelaron que el perfundido y el amnios produdan los mayores porcentajes de celulas HLA ABCVCD45VCD34VCD133+, 0,1523 ± 0,0227% (n=15, ETM=0,0059) y 0,0929 ± 0,0419% (n=20, ETM=0,0094) respectivamente (figura 3). El amnios-placa corionica contema el tercer porcentaje mas alto de celulas que expresan el fenotipo de interes, 0,0632±0,0333% (n=9, ETM=0,0111) (figura 3). El corion y el cordon umbilical conteman los porcentajes mas bajos de celulas que expresan el fenotipo de interes, 0,0623±0,0249% (n=15, ETM=0,0064) y 0,0457±0,0055% (n=9, ETM=0,0018) respectivamente (figura 3).
Despues de que las celulas HLA ABCVCD45VCD34VCD133+ se identificaron y se cuantificaron de cada fuente de celulas, sus celulas se analizaron adicionalmente y se caracterizaron para su expresion de marcadores de la superficie celular HLA-G, CD10, CD 13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD 105, CD117, CD200, y CD105.
6.2.2.3 Celulas obtenidas a partir de perfundido placentario
Las celulas obtenidas a partir del perfundido eran positivas sistematicamente para HLA-G, CD33, CD117, CD10, CD44, CD200, CD90, c D38, CD105, y CD13 (figura 4). La expresion promedio de cada marcador para celulas obtenidas a partir de perfundido era la siguiente: 37,15% ± 38,55% (n=4, ETM=19,28) de las celulas expresaban HLA-G; 36,37% ± 21,98% (n=7, ETM=8,31) de las celulas expresaban CD33; 39,39% ± 39,91% (n=4, ETM=19,96) de las celulas expresaban CD117; 54,97% ± 33,08% (n=4, ETM=16,54) de las celulas expresaban CD10; 36,79% ± 11,42% (n=4, ETM=5,71) de las celulas expresaban CD44; 41,83% ± 19,42% (n=3, ETM=11,21) de las celulas expresaban CD200; 74,25% ± 26,74% (n=3, ETM=15,44) de las celulas expresaban CD90; 35,10% ± 23,10% (n=3, ETM=13,34) de las celulas expresaban CD38; 22,87% ± 6,87% (n=3, ETM=3,97) de las celulas expresaban CD105; y 25,49% ± 9,84% (n=3, ETM=5,68) de las celulas expresaban CD13.
6.2.2.4 Celulas obtenidas a partir del amnios
Las celulas obtenidas a partir del amnios eran positivas sistematicamente para HLA-G, CD33, CD117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105, y CD13 (figura 5). La expresion promedio de cada marcador para celulas obtenidas a partir del amnios era la siguiente: 57,27% ± 41,11% (n=3, ETM=23,73) de las celulas expresaban HLA-G; 16,23% ± 15,81% (n=6, ETM=6,46) de las celulas expresaban CD33; 62,32% ± 37,89% (n=3, ETM=21,87) de las celulas expresaban CD117; 9,71% ± 13,73% (n=3, ETM=7,92) de las celulas expresaban CD10; 27,03% ± 22,65% (n=3, ETM=13,08) de las celulas expresaban CD44; 6,42% ± 0,88% (n=2, ETM=0,62) de las celulas expresaban CD200; 57,61% ±22,10% (n=2, ETM=15,63) de las celulas expresaban CD90; 63,76% ± 4,40% (n=2, ETM=3,11) de las celulas expresaban CD38; 20,27% ± 5,88% (n=2, ETM=4,16) de las celulas expresaban CD105; y 54,37% ± 13,29% (n=2, ETM=9,40) de las celulas expresaban CD13.
6.2.2.5 Celulas obtenidas a partir del corion
Las celulas obtenidas a partir del corion eran positivas sistematicamente para HLA-G, CD117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38, y CD13, mientras que expresion de CD33, y CD105 variaba (figura 6). La expresion promedio de cada marcador para celulas del corion era la siguiente: 53,25% ± 32,87% (n=3, ETM=18,98) de las celulas expresaban HLA-G; 15,44% ± 11,17% (n=6, ETM=4,56) de las celulas expresaban CD33; 70,76% ± 11,87% (n=3, ETM=6,86) de las celulas expresaban c D117; 35,84% ± 25,96% (n=3, ETM=14,99) de las celulas expresaban CD10; 28,76% ± 6,09% (n=3, ETM=3,52) de las celulas expresaban CD44; 29,20% ± 9,47% (n=2, ETM=6,70) de las celulas expresaban CD200; 54,88% ± 0,17% (n=2, ETM=0,12) de las celulas expresaban CD90; 68,63% ± 44,37% (n=2, ETM=31,37) de las celulas expresaban CD38; 23,81% ± 33,67% (n=2, ETM=23,81) de las celulas expresaban CD105; y 53,16% ± 62,70% (n=2, ETM=44,34) de las celulas expresaban CD13.
6.2.2.6 Celulas obtenidas a partir del amnios-placa corionica
Las celulas de amnios-placa corionica eran positivas sistematicamente para HLA-G, CD33, CD117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105, y CD13 (figura 7). La expresion promedio de cada marcador para celulas obtenidas a partir del amnios-placa corionica era la siguiente: 78,52% ±13,13% (n=2, ETM=9,29) de las celulas expresaban HLA-G; 38,33%± 15,74% (n=5, ETM=7,04) de las celulas expresaban CD33; 69,56% ± 26,41% (n=2, ETM=18,67) de las celulas expresaban CD117; 42,44% ± 53,12% (n=2, Et M=37,56) de las celulas expresaban CD10; 32,47% ± 31,78% (n=2, ETM=22,47) de las celulas expresaban CD44; 5,56% (n=1) de las celulas expresaban CD200; 83,33% (n=1) de las celulas expresaban CD90; 83,52% (n=1) de las celulas expresaban CD38; 7,25% (n=1) de las celulas expresaban CD105; y 81,16% (n=1) de las celulas expresaban CD 13.
6.2.2.7 Celulas obtenidas a partir del cordon umbilical
Las celulas obtenidas a partir del cordon umbilical eran positivas sistematicamente para HLA-G, CD33, CD90, CD38, CD105, y CD13, mientras que la expresion de CD117, CD10, CD44, y CD200 variaba (figura 8). La expresion promedio de cada marcador para celulas obtenidas a partir del cordon umbilical era la siguiente: 62,50% ± 53,03% (n=2, ETM=37,50) de las celulas expresaban HLA-G; 25,67% ± 11,28% (n=5, ETM=5,04) de las celulas expresaban CD33; 44,45% ± 62,85% (n=2, ETM=44,45) de las celulas expresaban CD117; 8,33% ± 11,79% (n=2, ETM=8,33) de las celulas expresaban CD10; 21,43% ± 30,30% (n=2, ETM=21,43) de las celulas expresaban CD44; 0,0% (n=1) de las celulas expresaban CD200; 81,25% (n=1) de las celulas expresaban CD90; 64,29% (n=1) de las celulas expresaban c D38; 6,25% (n=1) de las celulas expresaban CD105; y 50,0% (n=1) de las celulas expresaban CD 13. En la figura 9 se muestra un resumen de los promedios de expresion de todos los marcadores.
6.2.2.8 Informe de clasificacion BD FACS Aria
Las tres poblaciones distintas de celulas placentarias que expresaban los mayores porcentajes de HLA ABC, CD45, CD34 y CD133 (celulas obtenidas a partir de perfundido, amnios y corion) se tineron con 7AAD y los anticuerpos para estos marcadores. Las tres poblaciones se clasificaron positivamente para las celulas vivas que expresaban el fenotipo de interes. Los resultados de la clasificacion BD FACS Aria se enumeran en la tabla 2.
Tabla 2:
Figure imgf000043_0001
Se cultivaron las tres poblaciones distintas de celulas clasificadas positivamente (“clasificadas”) y sus celulas no clasificadas correspondientes y los resultados del cultivo se evaluaron el dfa 12 (tabla 3). Las celulas obtenidas a partir de perfundido clasificadas, cultivadas a una densidad celular de 40.600/cm2, dieron como resultado pequenas celulas redondas no adherentes. Dos de los tres conjuntos de celulas obtenidas a partir de perfundido no clasificadas, cada una cultivada a una densidad celular de 40.600/cm2, dieron como resultado principalmente celulas pequenas, redondas no adherentes con varias celulas adherentes localizadas alrededor de la periferia del pocillo. Las celulas obtenidas del perfundido no clasificadas, cultivadas a una densidad celular de 93.800/cm2, dieron como resultado principalmente celulas pequenas, redondas no adherentes con varias celulas adherentes localizadas alrededor de la periferia de los pocillos.
Celulas obtenidas del amnios, clasificadas, cultivadas a una densidad celular de 6.300/cm2, dieron como resultado pequenas celulas redondas no adherentes. Celulas obtenidas del amnios, no clasificadas, cultivadas a una densidad celular de 6.300/cm2, dieron como resultado pequenas celulas redondas no adherentes. Celulas obtenidas del amnios, no clasificadas, cultivadas a una densidad celular de 62.500/cm2 dieron como resultado pequenas celulas redondas no adherentes.
Celulas obtenidas de corion, clasificadas, cultivadas a una densidad celular de 6.300/cm2, dieron como resultado pequenas celulas redondas no adherentes. Celulas obtenidas de corion no clasificadas, cultivadas a una densidad celular de 6.300/cm2, dieron como resultado pequenas celulas redondas no adherentes. Celulas obtenidas de corion, no clasificadas, cultivadas a una densidad celular de 62.500/cm2, dieron como resultado pequenas celulas redondas no adherentes.
Despues de ejecutar los experimentos relacionados anteriormente, y el cultivo adicional de las celulas madre placentarias, se determino que el marcaje de los anticuerpos para CD117 y CD133, en el que un anticuerpo conjugado a estreptavidina se marco con ficoeritrina (PE) conjugada a biotina, produda un fondo suficientemente significativo para registrar a una lectura positiva. Este fondo habfa dado como resultado inicialmente que las celulas madre placentarias fueran consideradas positivas para ambos marcadores. Cuando se uso una marca diferente, APC o PerCP, el fondo se redujo, y se determino correctamente que las celulas madre placentarias eran negativas tanto para CD117 como para CDl33.
6.3 EJEMPLO 3: CARACTERIZACION DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS Y CELULAS MADRE DE CORDON UMBILICAL
Este ejemplo demuestra un perfil de marcadores de la superficie celular ejemplar de celulas madre placentarias. Celulas madre placentarias o celulas madre de cordon umbilical, obtenidas mediante digestion enzimatica, en medio de cultivo se lavaron una vez anadiendo 2 ml de FBS 2%-PBS y centrifugando a 400 g durante 5 minutos. El sobrenadante se decanto, y el sedimento se resuspendio en 100-200 |il FBS 2%-PBS. Se prepararon 4 tubos con BD™ CompBeads (N° de Cat 552843) anadiendo 100 |il de FBS 2%-PBS a cada tubo, anadiendo 1 gota completa (aproximadamente 60 |il) del control negativo BD™ CompBeads y 1 gota de las perlas anti-raton BD™ CompBeads a cada tubo, y agitando en vertice. A los 4 tubos de BD™ CompBeads, se les anadieron los siguientes anticuerpos:
Figure imgf000044_0001
Se prepararon tubos de control de la siguiente manera:
Figure imgf000044_0002
Los siguientes anticuerpos se anadieron a los tubos de muestra:
Figure imgf000044_0003
Figure imgf000045_0001
Los tubos de control y de muestra se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutes. Despues de la incubacion, los tubos se lavaron anadiendo 2 ml de FBS 2%-PBS y centrifugando a 400 g durante 5 minutes. El sobrenadante se decanto, y el sedimento se resuspendio en 100-200 |il de FBS 2%-PBS y se adquirio en un citometro de flujo. Todos los demas anticuerpos se usaron siguiendo este procedimiento.
Celulas madre placentarias coincidentes de la membrana amniotica y celulas madre de cordon umbilical se analizaron usando anticuerpos marcados por fluorescencia y citometna de flujo para identificar marcadores de la superficie celular que estaban presentes o ausentes. Los marcadores analizados inclrnan CD105 (marcador espedfico endotelial relacionado con la proliferacion); CD200 (marcador asociado con la funcion reguladora); CD34 (expresado en celulas endoteliales y en celulas madre hematopoyeticas); CD10 (marcador de celulas madre/celulas precursoras); citoqueratina K (marcador epitelial); CD44 (migracion celular, retorno linfodtico selectivo, hematopoyesis); c D45 (marcador de linaje); CD133 (marcador para celulas progenitoras hematopoyeticas); CD117 (factor de celulas madre (c-Kit)); CD90 (expresado en celulas madre hematopoyeticas primitivas en medula osea normal, sangre del cordon umbilical y celulas hepaticas fetales); HLA ABC (pan MHC I, presentacion de antigenos, inmunogenicidad); p-2-microglobulina (se asocia con MHC I, presentacion de antigenos, inmunogenicidad); HLA DR,DQ,DP (pan m Hc II, presentacion de antfgenos, inmunogenicidad); y CD80/86 (moleculas coestimuladoras para presentacion de antfgenos).
Los resultados de citometna de flujo mostraban que para las celulas madre placentarias que fueron ensayadas, 93,83% de las celulas eran CD105+, 90,76% de las celulas eran CD200+, y 86,93% de las celulas eran tanto CD105+ como CD200+. 99,97% de las celulas eran CD10+, 99,15% de las celulas eran CD34', y 99,13% de las celulas eran tanto CD10+ como CD34'. 98,71% de las celulas eran positivas para citoqueratina, 99,95% de las celulas eran CD44+, y 98,71% de las celulas eran positivan tanto para citoqueratina como para CD44. 99,51% de las celulas eran CD45', 99,78% de las celulas eran negativa para CD133, y 99,39% de las celulas eran negativas tanto para CD45 como para CD133. 99,31% de las celulas eran positivas para CD90, 99,7% eran negativas para CD117, y 99,01% eran positivas para CD90 y negativas para CD 117. 95,7% de las celulas eran negativas tanto para CD80 como para CD86.
Los resultados de citometna de flujo para celulas madre de cordon umbilical mostraban que 95,95% de las celulas eran CD200+, 94,71% eran CD105+, y 92,69% eran CD105+ y CD200+. 99,93% de las celulas eran CD10+, 99,99% de las celulas eran CD34', y 99,6% de las celulas eran tanto CD10+ como CD34'. 99,45% de las celulas eran positivas para citoqueratina, 99,78% de las celulas eran CD44+, y 99,3% de las celulas eran positivas tanto para citoqueratina como para CD44. 99,33% de las celulas eran CD45', 99,74% eran CD133', y 99,15% de las celulas eran tanto CD45' como CD133'. 99,84% de las celulas eran CD117', 98,78% de las celulas eran CD90+, y 98,64% de las celulas eran tanto CD90+ como CD117-Un fenotipo (CD200+, CD105+, CD10+, CD34') parece ser sistematico durante numerosos de dichos analisis. Este fenotipo es adicionalmente positivo para CD90, CD44, HLA ABC (debil), p-2-microglobulina (debil), y citoqueratina K, y negativo para HLA DR,d Q,DP, CD117, CD133 y CD45.
6.4 EJEMPLO 4: DETERMINACION DE ACTIVIDAD ALDEHfDO DESHIDROGENASA EN CELULAS MADRE PLACENTARIAS
El nivel de actividad aldehfdo deshidrogenasa (ALDH), un potencial marcador de la capacidad de injerto de celulas madre, se determino usando un kit de ensayo ALDEFLUOR® de Stem Cell Technologies, Inc. Tfpicamente, las celulas madre indiferenciadas mas primitivas demuestran menos actividad ALDH que las celulas madre mas diferenciadas.
El ensayo usa ALDEFLUOR®, un sustrato de ALDH fluorescente (Aldagen, Inc., Durham, Carolina del Norte). Se siguio el protocolo del fabricante. El reactivo ALDEFLUOR® seco se proporciona en una forma inactiva estable. El ALDEFLUOR® se activo disolviendo el compuesto seco en dimetilsulfoxido (DMSO) y anadiendo HCl 2 N, y se anadio inmediatamente a las celulas. Tambien se establecio un tubo de control combinando las celulas con ALDEFLUOR® mas DEAB, un inhibidor espedfico de ALDH.
Las celulas analizadas inclrnan cuatro lmeas de celulas madre del cordon umbilical y tres lmeas de celulas madre placentarias de amnios-placa corionica, una lmea de celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea (BM-MSC), una lmea de celulas madre obtenidas a partir de tejido adiposo (ADSC), una lmea celular de trofoblastos vellosos humanos (HVT), y celulas madre CD34+ purificadas de sangre dl cordon umbilical.
El ensayo se desarrolla de la siguiente manera. La concentracion de la muestra se ajusto a 1X106 celulas /ml con tampon de ensayo proporcionado con el kit de ensayo ALDEFLUOR®. 1 ml de suspension celular ajustada en tubo experimental y de control para cada una de las lmeas celulares ensayadas, y 5 |il de DEAB se anadieron adicionalmente al tubo de control marcado como control.
El sustrato ALDEFLUOR® se activo anadiendo 25 |il de DMSO al reactivo ALDEFLUOR® seco, y se dejo reposar durante 1 minuto a temperatura ambiente. Se anadieron 25 |il de HCl 2N y se mezclaron bien. Esta mezcla se incubo durante 15 min a temperatura ambiente. Se anadieron 360 |il de tampon de ensayo ALDEFLUOR® al vial y se mezclaron. La mezcla resultante se almaceno a 2-8°C durante el uso.
Se anadieron 5 |il del reactivo ALDEFLUOR® activado por 1 mililitro de muestra a los tubos experimentales, y 0,5 ml de esta mezcla se transfirieron inmediatamente a los tubos de control. Los tubos experimentales y de control para cada lmea celular se incubaron durante 30 minutos a 37°C. Despues de la incubacion, los tubos se centrifugaron a 400 x g, y el sobrenadante se desecho. Las celulas en el sedimento resultante se resuspendieron en 0,5 ml de tampon de ensayo y se analizaron mediante citometna de flujo. Los datos se analizaron usando el software FLOWJO™ (Tree Star, Ashland, Oregon). Se crearon diagramas graficos de SSC frente a FSC y SSC frente a FL1 en el espacio de trabajo de FLOWJO™. Se abrieron archivos de datos de control y experimentales para cada muestra, y se determinaros los acotamientos apropiados en base a muestras de control. Las celulas positivas se calcularon como un porcentaje positivo para ALDEFLUOR® del numero total de acontecimientos contados.
Lmeas de celulas madre placentarias demostraron actividad ALDH de aproximadamente 3% a aproximadamente 25% (3,53%, 8,76% y 25,26%). Lmeas de celulas madre del cordon umbilical demostraron actividad ALDH de aproximadamente 16% a aproximadamente 20% (16,59%, 17,01%, 18,44% y 19,83%). En contraste, BM-MSC y HVT eran negativas y 1,5% respectivamente para ALDH, pero las MSC obtenidas a partir de tejido adiposo estan cerca al 30% ALDH+. Las celulas CD34+ de control positivo purificadas de sangre del cordon umbilical eran, tal como se esperaba, altamente positivas (75%) para ALDH.
6.5 EJEMPLO 5: RECOGIDA DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS MEDIANTE PERFUSION EN CIRCUITO CERRADO
Este ejemplo demuestra un metodo de recogida de celulas madre placentarias mediante perfusion.
Se obtiene una placenta postparto en el plazo de 24 horas despues del nacimiento. El cordon umbilical pinza con una pinza para cordon umbilical aproximadamente 7,62 a 10,16 cm (3 a 4 pulgadas) alrededor del disco placentario, y el cordon se corta encima de la pinza. El cordon umbilical se desecha o se procesa para recuperar, por ejemplo, celulas madre de cordon umbilical, y/o para procesar la membrana del cordon umbilical para la produccion de un biomaterial. El exceso de membrana amniotica y de corion se corta de la placenta, dejando aproximadamente 0,64 cm (% de pulgada) alrededor del borde de la placenta. El material recortado se desecha.
Empezando desde el borde de la membrana placentaria, la membrana amniotica se separa del corion usando diseccion sin filo con los dedos. Cuando la membrana amniotica esta completamente separada del corion, la membrana amniotica se corta alrededor de la base del cordon umbilical con tijeras, y se desprende del disco placentario. La membrana amniotica puede desecharse, o procesarse, por ejemplo, para obtener celulas madre mediante digestion enzimatica, o para producir, por ejemplo, un biomaterial de la membrana amniotica.
El lado fetal del material placentario restante se limpia de todos los coagulos de sangre visibles y la sangre residual usando gasa esteril, y a continuacion se esteriliza limpiando con un hisopo con yodo y a continuacion con un hisopo con alcohol. El cordon umbilical se pinza a continuacion de forma transversal con un hemostato esteril por debajo de la pinza para el cordon umbilical, y se hace girar al hemostato, tirando del cordon sobre la pinza para crear un pliegue. Despues, el cordon se corta parcialmente por debajo del hemostato para dejar expuesta una seccion transversal del cordon sujetada por la pinza. Como alternativa, el cordon se pinza con un hemostato esteril. El cordon se coloca despues sobre una gasa esteril y se sujeta con el hemostato para proporcionar tension. El cordon se corta despues en lmea recta transversal, directamente por debajo del hemostato, y el borde del cordon cerca del vaso se pinza de nuevo.
Los vasos expuestos tal como se ha descrito anteriormente, habitualmente una vena y dos arterias, se identifican y se abren de la siguiente manera. Una pinza de cocodrilo se hace avanzar a traves del extremo cortado de cada vaso, teniendo cuidado de no perforar con la pinza la pared del vaso. La insercion se detiene cuando la punta de la pinza esta ligeramente por encima de la base del cordon umbilical. A continuacion, la pinza se abre ligeramente, y se retira lentamente del vaso para dilatarlo.
Un tubo de plastico, conectado a un dispositivo de perfusion o bomba peristaltica, se inserta en cada una de las arterias placentarias. Un tubo de plastico, conectado a una bolsa de recogida de 250 ml, se inserta en la vena placentaria. El tubo se fija en su sitio con cinta adhesiva.
Un pequeno volumen de solucion de NaCl 0,9% de calidad para inyeccion esteril para comprobar las fugas. Si no hay fugas presentes, la velocidad de la bomba se incrementa, y aproximadamente 750 ml de la solucion de NaCl 0,9% de calidad para inyeccion se bombean a traves de la vasculatura placentaria. La perfusion puede asistirse masajeando suavemente el disco placentario desde los bordes externos hasta el cordon. Cuando la bolsa de recogida esta llena, la bolsa se retira del acoplador que conecta el tubo a la bolsa, y una nueva bolsa se conecta al tubo.
Cuando la recogida esta terminada, las bolsas de recogida se pesan y se equilibran para centrifugado. Despues del centrifugado, cada bolsa se coloca dentro de un extractor de plasma sin romper los sedimentos de celulas. El sobrenadante dentro de las bolsas se elimina y se desecha a continuacion. La bolsa se masajea suavemente a continuacion para resuspender las celulas en el sobrenadante restante. Usando una jeringa esteril de 1 ml, se extraen aproximadamente 300-500 |il de celulas de la bolsa de recogida, mediante un acoplador al sitio de muestreo, y se transfieren a un tubo de centrifuga de 1,5 ml. El peso y el volumen del perfundido restante se determinan, y se anade 1/3 del volumen de heta-almidon al perfundido y se mezcla minuciosamente. El numero de celulas por ml se determina. Se retiran los globulos rojos del perfundido usando un extractor de plasma.
Las celulas placentarias se cultivan a continuacion inmediatamente para aislar celulas madre placentarias, o se crioconservan para uso posterior.
6.6 EJEMPLO 6: DIFERENCIACION DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS
6.6.1 Induccion de la diferenciacion en neuronas
La diferencia neuronal de celulas madre placentarias tambien puede conseguirse de la siguiente manera:
1. Celulas madre placentarias se cultivan durante 24 h en medio de preinduccion que consta de DMEM/FBS 20% y beta-mercaptoetanol 1 mM.
2. El medio de preinduccion se retira y las celulas se lavan con PBS.
3. Medio de induccion neuronal que consta de DMEM y betamercaptoetanol 1-10 mM se anade a las celulas. Como alternativa, pueden usarse medios de induccion que constan de DMEM/DMSO 2% / hidroxianisol butilado 200 |iM. 4. En ciertas realizaciones, pueden producirse cambios morfologicos y moleculares ya a los 60 minutos despues de la exposicion a medios libres de suero y betamercaptoetanol. Puede usarse RT/PCR para evaluar la expresion de, por ejemplo, genes del receptor del factor de crecimiento nervioso y cadena pesada del neurofilamento.
6.6.2 Induccion de la diferenciacion en adipocitos
Varios cultivos de celulas madre placentarias obtenidas a partir de digestion enzimatica del amnios, a 50-70% de confluencia, se indujeron en medio que comprendfa (1) DMEM/MCDB-201 con FCS 2%, hidrocortisona 0,5%, isobutilmetilxantina 0,5 mM (IBMX), indometacina 60 |iM; o (2) DMEM/MCDB-201 con FCS 2% y acido linoleico 0. 5.. Se examinaron las celulas en busca de cambios morfologicos; despues de 3-7 dfas, aparedan gotitas de aceite. La diferenciacion tambien se evaluo mediante PCR cuantitativa en tiempo real para examinar la expresion de genes espedficos asociados con la adipogenesis, es dedr, PPAR-y2, aP-2, lipoprotema lipasa, y osteopontina. Dos cultivos de celulas madre placentarias mostraban un incremento de 6,5 veces y 24,3 veces en la expresion de genes espedficos de adipocitos, respectivamente. Otros cuatro cultivos mostraban un incremento moderado (1,5-2,0 veces) en la expresion de PPAR-y2 despues de la induccion de la adipogenesis.
En otro experimento, celulas madre placentarias obtenidas de perfundido se cultivaron en DMEM/MCDB-201 (medio basal de fibroblasto de pollo) con FCS 2%. Las celulas se tripsinizaron y centrifugaron. Las celulas se resuspendieron en medio de adipo-induccion (AIM) 1 o 2. AIM1 comprendfa medio basal MesenCult para celulas madre mesenquimatosas humanas (StemCell Technologies) suplementadas con suplementos adipogenicos de celulas madre mesenquimatosas (StemCell Technologies). A iM2 comprendfa DMEM/m Cd B-201 con FcS 2% y LA-BSA (1%). Aproximadamente 1,25 x 1045 celulas madre placentarias se cultivaron en 5 ml de AIM1 o AIM2 en matraces T-25. Las celulas se cultivaron en incubadoras durante 7-21 dfas. Las celulas desarrollaron vacuolas con gotas de aceite en el citoplasma, segun lo confirmado mediante tincion con rojo aceite, lo que sugena la diferenciacion de las celulas madre en adipocitos.
La diferenciacion adipogenica de celulas madre placentarias tambien puede conseguirse de la siguiente manera: 1. Celulas madre placentarias se cultivan en MSCGM (Cambrex) o DMEM suplementado con suero de sangre del cordon umbilical 15%.
2. Se usan tres ciclos de induccion/mantenimiento. Cada ciclo consta de alimentar las celulas madre placentarias con medio de induccion de la adipogenesis (Cambrex) y cultivar las celulas durante 3 dfas (a 37°C, CO25%), seguido por 1-3 dfas de cultivo en medio de mantenimiento de la adipogenesis (Cambrex). Un medio de induccion alternativo que puede usarse contiene dexametasona 1 |iM, indometacina 0,2 mM, 0,01 mg/ml de insulina, IBMX 0,5 mM, DMEM-alta glucosa, FBS, y antibioticos.
3. Despues de 3 ciclos completos de induccion/mantenimiento, las celulas se cultivan durante 7 dfas adicionales en medio de mantenimiento de la adipogenesis, sustituyendo el medio cada 2-3 dfas.
4. Un sello distintivo de la adipogenesis es el desarrollo de multiples vesfculas lipfdicas intracitoplasmaticas que pueden observarse facilmente usando el colorante lipofilo aceite rojo O. La expresion de genes de lipasa y/o protema de union a acidos grasos se confirma mediante RT/PCR en celulas madre placentarias que han comenzado a diferenciarse en adipocitos.
6.6.3 Induccion de la diferenciacion en osteocitos
Se preparo medio osteogenico a partir de 185 ml de medio basal de diferenciacion de Cambrex - Osteogenic y SingleQuots (uno cada de dexametasona, 1-glutamina, ascorbato, pen/estrep, MCGS, y p-glicerofosfato). Celulas madre placentarias procedentes de perfundido se cultivaron, a aproximadamente 3 x l03 celulas por cm2 de area superficial para cultivo tisular en 0,2-0,3 ml de MSCGM por cm2 de area para cultivo tisular. Tfpicamente, todas las celulas se adhenan a la superficie para cultivo durante 4-24 horas en MSCGM a 37°C en CO25%. La diferenciacion osteogenica se indujo sustituyendo el medio por medio de diferenciacion osteogenica. La morfologfa celular comenzo a cambiar desde el tfpico aspecto en forma de huso de las celulas madre placentarias adherentes, a un aspecto cuboidal, acompanado por mineralizacion. Algunas celulas se delaminaron de la superficie para cultivo tisular durante la diferenciacion.
La diferenciacion osteogenica tambien puede conseguirse de la siguiente manera:
1. Cultivos adherentes de celulas madre placentarias se cultivan en MSCGM (Cambrex) o DMEM suplementado con suero de sangre del cordon umbilical 15%.
2. Los cultivos se cultivan durante 24 horas en matraces para cultivo tisular.
3. La diferenciacion osteogenica se induce sustituyendo MSCGM por medio de induccion osteogenica (Cambrex) que contema dexametasona 0,1 |iM, acido ascorbico-2-fosfato 0,05 mM, beta glicerofosfato 10 mM.
4. Las celulas se alimentan cada 3-4 dfas durante 2-3 semanas con medio de induccion osteogenica.
5. La diferenciacion se evalua usando un colorante espedfico de calcio y RT/PCR para la expresion de genes de fosfatasa alcalina y osteopontina.
6.6.4 Induccion de la diferenciacion en celulas pancreaticas
La diferenciacion pancreatica se consigue de la siguiente manera:
1. Celulas madre placentarias se cultivan en DMEM/CBS 20%, suplementado con factor de crecimiento de fibroblastos basico, 10 ng/ml; y factor de crecimiento transformante beta-1,2 ng/ml. puede usarse suero de sustitucion Knockout en lugar de CBS.
2. Medio condicionado procedente de cultivos de celulas neuronales positivas para nestina se anade a los medios a una concentracion 50/50.
3. Las celulas se cultivan durante 14-28 dfas, realimentando cada 3-4 dfas.
4. La diferenciacion se caracteriza ensayando para protema insulina o la expresion de genes de insulina mediante RT/PCR.
6.6.5 Induccion de la diferenciacion en celulas cardiacas
La diferenciacion miogenica (cardiogenica) se consigue de la siguiente manera:
1. Celulas madre placentarias se cultivan en DMEM/CBS 20%, suplementado con acido retinoico, 1 |iM; factor de crecimiento de fibroblastos basico, 10 ng/ml; y factor de crecimiento transformante beta-1, 2 ng/ml; y factor de crecimiento epidermico, 100 ng/ml. Puede usarse suero de sustitucion Knockout (Invitrogen, Carlsbad, California) en lugar de CBS.
2. Como alternativa, celulas madre placentarias se cultivan en DMEM/CBS 20% suplementado con 50 ng/ml Cardiotropina-1 durante 24 horas.
3. Como alternativa, celulas madre placentarias se mantienen en medios libres de protemas durante 5-7 dfas, a continuacion se estimulan con extracto de miocardio humano (analisis de dosis con aumento gradual). Se produce extracto de miocardio homogenizando 1 g de miocardio humano en tampon HEPES 1% suplementado con suero de sangre del cordon umbilical 1%. La suspension se incuba durante 60 minutos, a continuacion se centrifuga y el sobrenadante se recoge.
4. Las celulas se cultivan durante 10-14 dfas, realimentando cada 3-4 dfas.
5. La diferenciacion se confirma mediante demostracion de la expresion de genes de actina cardiaca mediante RT/PCR.
6.6.6 Induccion de la diferenciacion en condrocitos
6.6.6.1 Metodo general
La diferenciacion condrogenica de celulas madre placentarias se consigue generalmente de la siguiente manera: 1. Celulas madre placentarias se mantienen en MSCGM (Cambrex) o DMEM suplementado con suero de sangre del cordon umbilical 15%.
2. Celulas madre placentarias se dividen en alteuotas en un tubo de polipropileno esteril. Las celulas se centrifugan (150 x g durante 5 minutos), y se lavan dos veces en medio de condrogenesis incomplete (Cambrex).
3. Despues del ultimo lavado, las celulas se resuspenden en medio de condrogenesis completo (Cambrex) que contiene 0,01 |ig/ml de TGF-beta-3 a una concentracion de 5 x 10(5) celulas/ml.
4. 0,5 ml de celulas se dividen en alteuotas en un tubo para cultivo de polipropileno de 15 ml. Las celulas se sedimentan a 150 x g durante 5 minutos. El sedimento se deja intacto en el medio.
5. Tubos tapados sin apretar se incuban a 37°C, CO25% durante 24 horas.
6. Los sedimentos de celulas se alimentan cada 2-3 dfas con medio de condrogenesis completo recien preparado.
7. Los sedimentos se mantienen suspendidos en medio mediante agitacion diaria usando un vortice a baja velocidad.
8. Los sedimentos de celulas condrogenicas se recogen despues de 14-28 dfas en cultivo.
9. La condrogenesis se caracteriza mediante por ejemplo, observacion de la produccion de sustancia fundamental eosinofila, evaluando la morfologfa celular, y/o confirmacion por RT/PCR de la expresion de genes de colageno 2 y/o colageno 9 y/o la produccion de mucopolisacaridos acidos de la matriz de carfflago, segun lo confirmado mediante tincion citoqmmica con azul Alcian.
6.6.6.2 Diferenciacion de celulas madre placentarias y de cordon umbilical en celulas condrogenicas
El ejemplo demuestra la diferenciacion de celulas madre placentarias en celulas condrogenicas y el desarrollo de tejido similar a cartflago a partir de dichas celulas.
El cartflago es un tejido avascular, alinfatico que carece de inervacion. El cartflago tiene una baja densidad de condrocitos (<5%), sin embargo estas celulas son sorprendentemente eficientes en el mantenimiento de la matriz extracelular a su alrededor. En el cuerpo existen tres tipos principales de cartflago: (1) cartflago articular, que facilita la lubricacion articular en articulaciones; (2) fibrocartflago, que proporciona absorcion de choques en, por ejemplo, el menisco y el disco intervertebral; y (3) cartflago elastico, que proporciona estructura anatomica en, por ejemplo, nariz y orejas. Los tres tipos de cartflago son de estructura bioqmmica similar.
El dolor articular es una causa principal de incapacidad y produce una necesidad insatisfecha de alivio en el area de la ortopedia. La artrosis primaria (que puede causar degeneracion articular), y el traumatismo son dos causan comunes de dolor. Aproximadamente 9% de la poblacion estadounidense tiene artrosis de cadera o rodilla, y mas de 2 millones de cirugfas de rodilla se realizan al ano. Desafortunadamente, los tratamientos actuales estan mas orientados hacia el tratamiento de smtomas en lugar de la reparacion del cartflago. La reparacion natural se produce cuando celulas similares a fibroblastos invaden el area y lo llenan con tejido fibroso que no es tan resiliente o elastico como el tejido normal, causando de este modo mas dano. Las opciones de tratamiento historicamente inclrnan injertos de tejido, perforacion subcondral, o sustitucion total de la articulacion. Tratamientos mas recientes incluyen, sin embargo, CARTICEL®, una inyeccion de condrocitos autologos; SYNVISC® y ORTHOVISC®, que son inyecciones de acido hialuronico para alivio temporal del dolor; y CHONDROGEN™, una inyeccion de celulas madre mesenquimatosas adultas para reparacion de menisco. En general, la tendencia parece estar yendo mas hacia terapias celulares y/o productos tisulares genomanipulados que implican condrocitos o celulas madre.
Materiales y metodos.
Dos lmeas de celulas madre placentarias, designadas AC61665, P3 (pase 3) y AC63919, P5, y dos lmeas de celulas madre del cordon umbilical, designadas UC67249, P2 y UC67477, P3 se usaron en los estudios perfilados a continuacion. Se usaron celulas madre mesenquimatosas humanas (MSC) como controles positivos, y una lmea celular de osteosarcoma, MC3T3, y fibroblastos dermicos humanos (HDF) se usaron como controles negativos. Celulas madre placentarias y de cordon umbilical se aislaron y se purificaron de placenta humana a termino mediante digestion enzimatica. Las celulas MSC humanas y celulas HDF se adquirieron de Cambrex, y las celulas MC3T3 se adquirieron de la coleccion americana de cultivos tipo “American Type Culture Collection”. Todas las lmeas celulares usadas se centrifugaron en sedimentos en tubos de centrifuga de polipropileno a 800 RPM durante 5 minutos y se cultivaron tanto en medios de induccion condrogenica (Cambrex) y medios MSC basales no inductores (Cambrex). Los sedimentos se recogieron y se analizaron histologicamente a 7, 14, 21 y 28 dfas mediante tincion para glucosaminoglucanos (GAG) con azul Alcian, y/o para colagenos con rojos sirio. El tipo de colageno se evaluo ademas con inmunotincion. El analisis de ARN para genes espedficos de cartflago se realizo a los 7 y 14 dfas.
Resultados
Experimento 1: Se disenaron estudios de condrogenesis para alcanzar tres objetivos principales: (1) demostrar que las celulas madre placentarias y de cordon umbilical pueden diferenciarse y formar tejido cartilaginoso; (2) demostrar que las celulas madre placentarias y de cordon umbilical pueden diferenciarse funcionalmente en condrocitos; y (3) validar los resultados obtenidos con las celulas madre evaluando lmeas celulares de control.
Para el objetivo 1, en un estudio preliminar, una celula madre placentaria se cultivo en medio de induccion condrogenica en forma de sedimentos celulares, con o sin protema morfogenica osea (BMP) a una concentracion final de 500 ng/ml. Los sedimentos se evaluaron en busca de evidencias de induccion condrogenica cada semana durante 4 semanas. Los resultados indicaban que los sedimentos aumentan de tamano a lo largo del tiempo. Sin embargo, no se observaron diferencias visuales entre las muestras BMP+ y BMP-. Los sedimentos tambien se analizaron histologicamente para GAG, un indicador de tejido cartilaginoso, mediante tincion con azul Alcian. Las celulas BMP+ generalmente paredan metabolicamente mas activas con vacuolas palidas mientras que las celulas BMP- eran mas pequenas con nucleos tenidos densos y menos citoplasma (refleja baja actividad metabolica). A los 7 dfas, las celulas BMP+ se hadan tenido fuertemente de azul, mientras que las BMP- se hadan tenido solo ligeramente. A los 28 dfas de induccion, las celulas tanto BMP+ como BMP- estaban tenidas de forma aproximadamente equivalente con azul Alcian. En general, la densidad celular disminrna con el tiempo, y la matriz sobrepaso al sedimento. En contraste, la lmea celular negativa MC3T3 no demostro presencia alguna de GAG cuando se tino con azul Alcian.
Experimento 2: en base a los resultados del experimento 1, se diseno un estudio mas detallado para evaluar el potencial de diferenciacion condrogenica de dos lmeas de celulas madre placentarias y dos de celulas madre del cordon umbilical. Ademas de la histologfa con azul Alcian, las celulas tambien se tineron con rojo sirio, que es espedfico para colageno de tipo II. Se prepararon multiples sedimentos para cada lmea celular, con y sin medios de induccion.
Las lmeas celulares cultivadas y sedimentadas se evaluaron en primer lugar mediante observacion macroscopica en busca de generacion macroscopica de cardago. En general, se observo que las lmeas de celulas madre forman sedimentos ya el dfa 1. Estos sedimentos credan a lo largo del tiempo y formaban una matriz resistente, que parece blanca, brillante y similar al cardago, y se volvieron mecanicamente resistentes. Mediante inspeccion visual, los sedimentos de celulas madre placentarias o celulas madre de cordon umbilical eran mucho mas grandes que los controles de MSC. Los sedimentos de control en medios no de induccion comenzaron a desmoronarse el dfa 11, y eran mucho mas pequenos a los 28 dfas que los sedimentos desarrollados por celulas cultivadas en medio de induccion condrogenica. Visualmente, no existian diferencias entre sedimentos formados por celulas madre placentarias o de cordon umbilical. Sin embargo, la lmea de celulas madre UC67249, que se inicio en medios libres de dexametasona, formaba sedimentos mas grandes. Las celulas MC3T3 de control negativo no formaba sedimentos; sin embargo, los HDF formaban sedimentos.
Sedimentos representativos de todos los grupos de ensayo se sometieron a continuacion a analisis histologicos para GAG y colageno. Generalmente, los sedimentos formados por las celulas madre en condiciones inductoras eran mucho mas grandes y permanedan intactos mejor que los sedimentos formados en condiciones no inductoras. Los sedimentos formados en condiciones inductoras mostraban produccion de GAG e incrementaban el contenido de colageno a lo largo del tiempo, y ya a los siete dfas, mientras que los sedimentos formados en condiciones no inductoras mostraban poca o ninguna produccion de colageno, tal como se evidenciaba mediante una debil tincion con azul Alcian. En general, las celulas madre placentarias y las celulas madre de cordon umbilical paredan, mediante inspeccion visual, producir sedimentos mas resistentes, mas grandes, y paredan estar produciendo mas colageno a lo largo del tiempo, que las MSC humanas. Ademas, en el transcurso del estudio, el colageno pareda engrosarse, y el tipo de colageno pareda cambiar, segun se evidencia mediante cambios en los colores de la fibra bajo luz polarizada (los colores se correlacionan con el grosor de la fibra lo que puede ser indicativo del tipo de colageno). Las celulas madre placentarias no inducidas produdan mucho menos colageno de tipo II, si producen alguno, en comparacion con las celulas madre inducidas. Durante el periodo de 28 dfas, la densidad celular disminrna a medida que la produccion de la matriz se incrementaba, una caractenstica del tejido cartilaginoso.
Estos estudios confirman que las celulas madre placentarias y de cordon umbilical pueden diferenciarse a lo largo de una ruta condrogenica, y pueden inducirse facilmente a formar tejido cartilaginoso. Las observaciones iniciales indican que dichas celulas madre son preferibles a MSC para la formacion de tejido cartilaginoso.
6.7 EJEMPLO 7: CULTIVO POR GOTA COLGANTE DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS
Celulas madre adherentes placentarias en cultivo se tripsinizan a 37°C durante aproximadamente 5 minutos, y se sueltan de la placa de cultivo golpeando. Se anade FBS 10% al cultivo para detener la tripsinizacion. Las celulas se diluyen a aproximadamente 1 x 104 celulas por ml en aproximadamente 5 ml de medio. Gotas (una unica gota o gotas procedentes de una micropipeta multicanal se colocan en el interior de la tapa de una placa de Petri de 100 ml. La tapa se invierte cuidadosamente y se coloca encima de la parte inferior de la placa, que contiene aproximadamente 25 ml de PBS esteril para mantener el contenido de humedad en la atmosfera de la placa. Las celulas se cultivan durante 6-7 dfas.
6.8 EJEMPLO 8: DIGESTION DE TEJIDO PLACENTARIO PARA OBTENER CELULAS MADRE PLACENTARIAS Este ejemplo demuestra un aislamiento aumentado de celulas madre placentarias, mediante digestion enzimatica. Aproximadamente 10 gramos de tejido placentario (amnios y corion) se obtienen, se maceran, y se digieren usando volumenes iguales de colagenasa A (1 mg/ml) (Sigma) y Tripsina-EDTA (0,25%) (Gibco-BRL) en un volumen total de aproximadamente 30 ml durante aproximadamente 30 minutos a 37°C. Las celulas liberadas por la digestion se lavan 3 veces con medio de cultivo, se distribuyen en cuatro matraces T-225 y se cultivan tal como se ha descrito en el ejemplo 1. El rendimiento de celulas madre placentaria esta entre aproximadamente 4 x 108 y 5 x 108 celulas por 10 g de material de partida. Las celulas, caracterizadas en el pase 3, son de forma predominante CD10+, CD90+, CD105+, CD200+, CD34- y CD45'.
6.9 EJEMPLO 9: PRODUCCION DE PRODUCTO DE CELULAS MADRE CRIOCONSERVADAS Y BANCO DE CELULAS MADRE
Este ejemplo demuestra el aislamiento de celulas madre placentaria y la produccion de un producto a base de celulas madre congeladas.
Resumen: tejido placentario se disecciona y se digiere, seguido por cultivos primario y de expansion para conseguir un producto celular expandido que produce muchas dosis de celulas. Las celulas se almacenan en un banco de celulas de dos niveles y se distribuyen como un producto celular congelado. Todas las dosis de celulas obtenidas a partir de la placenta de una unica donante se definen como un lote, y un lote de placenta se procesa cada vez usando tecnica esteril en una sala dedicada y una campa de flujo laminar de clase 100. El producto celular se define como siendo CD105+, CD200+, CD10+, y CD34-, teniendo un cariotipo normal y ningun o sustancialmente ningun contenido celular materno.
6.9.1 Obtencion de celulas madre
Diseccion y digestion tisular: se obtiene una placenta menos de 24 horas despues de la expulsion. Se obtiene tejido placentario del amnios, una combinacion de amnios y corion, o corion. El tejido se pica en pequenos trozos, de aproximadamente 1 mm de tamano. El tejido picado se digiere en 1mg/ml de Colagenasa 1A durante 1 hora a 37°C seguida por Tripsina-EDTA durante 30 minutos a 37°C. Despues de tres lavados en FBS 5% en PBS, el tejido se resuspende en medio de cultivo.
Cultivo primario: el proposito del cultivo primario es establecer celulas a partir de tejido placentario digerido. El tejido digerido se suspende en medio de cultivo y se coloca en matraces T de Corning, que se incuban en una camara humidificada mantenida a 37°C con CO25%. La mitad del medio se repone despues de 5 dfas de cultivo. Colonias de alta densidad de celulas se forman a las 2 semanas de cultivo. Las colonias se recogen con Tripsina-EDTA, que a continuacion se inactiva con FBS al 2% en PBS. Las celulas se centrifugan y se resuspenden en medio de cultivo para sembrar cultivos de expansion. Estas celulas se definen como celulas de pase 0 que se han duplicado 0 veces. Cultivo de expansion: las celulas recogidas del cultivo primario, recogidas de cultivo de expansion, o descongeladas a partir del banco de celulas se usan para sembrar cultivos de expansion. Factonas celulares (NUNC™) son tratadas con CO25% en aire a 50 ml/min/bandeja durante 10 minutos a traves de un filtro esteril y se calientan en una incubadora humidificada mantenida a 37°C con CO2 5%. Las semillas de celulas se cuentan en un hemacitometro con azul de tripano, y el numero, la viabilidad y el numero de pase de las celulas, y el numero acumulativo de duplicaciones se registran. Las celulas se suspenden en medio de cultivo a aproximadamente 2,3 X 104 celulas/ml y 110 ml/bandeja se siembran en las factonas celulares. Despues de 3-4 dfas y de nuevo a los 5-6 dfas de cultivo, medio de cultivo se retira y se sustituye por medio fresco, seguido por otro tratamiento con CO25% en aire. Cuando las celulas alcanzan aproximadamente 105 celulas/cm2, las celulas se recogen con Tripsina-EDTA, seguida por inactivacion con FBS 2% en PBS. Las celulas se centrifugan a continuacion y se resuspenden en medio de cultivo.
Crioconservacion: las celulas a congelar se recogen del cultivo con Tripsina-EDTA, se inactivan con FBS 2% en PBS, y se cuentan en un hemacitometro. Despues del centrifugado, las celulas se resuspenden con DMSO 10% en FBS a una concentracion de aproximadamente 1 millon de celulas/ml para celulas que se usaran para ensamblaje de un banco de celulas, y 10 millones de celulas/ml para dosis de celulas congeladas individuales. La solucion de celulas se transfiere a un recipiente de congelacion, que se coloca en un bano con alcohol isopropflico en un congelador a -80°C. Al dfa siguiente, las celulas se transfieren a nitrogeno lfquido.
6.9.2 Diseno de un banco de celulas madre
Un “lote” se define como todas las dosis de celulas obtenidas a partir de la placenta de una unica donante. Las celulas manteman un crecimiento, cariotipo y fenotipo de marcadores de la superficie celular normales durante mas de 8 pases y 30 duplicaciones durante cultivo de expansion. Dada esta limitacion, las dosis comprenden celulas de 5 pases y aproximadamente 20 duplicaciones. Para generar un suministro de celulas equivalentes, un unico lote se expande en cultivo y se almacena en un banco de celulas de dos niveles y las dosis se congelan. En particular, celulas recogidas del cultivo primario, que se definen como celulas de pase 0 que han experimentado 0 duplicaciones, se usan para iniciar un cultivo de expansion. Despues del primer pase, se producen aproximadamente 4 duplicaciones, y las celulas se congelan en un banco de celulas patron (MCB). Se usan viales procedentes del MCB para sembrar cultivos de expansion adicionales. Despues de dos pases adicionales de celulas descongeladas procedentes del MCB, las celulas se congelan en un banco de celulas de trabajo (WCB), aproximadamente 12 duplicaciones acumulativas. Viales del WCB se usan para sembrar un cultivo de expansion durante otros 2 pases, dando como resultado celulas de pase 5 a aproximadamente 20 duplicaciones que se congelan en dosis individuales.
6.9.3 Descongelacion de celulas para cultivo
Recipientes congelados de celulas se colocan en una bolsa de plastico sellada y se sumergen en un bano con agua a 37°C. Los recipientes se agitan suavemente hasta que todo el contenido se funde excepto un pequeno trozo de hielo. Los recipientes se retiran de la bolsa de plastico sellada y un volumen 10X de medio de cultivo se anade lentamente a las celulas con mezclado suave. Una muestra se cuenta en el hemacitometro y se siembra en cultivos de expansion.
6.9.4 Descongelacion de celulas para inyeccion
Recipientes congelados de celulas se transfieren al punto de administracion en un transportador con nitrogeno seco. Antes de la administracion, los recipientes se colocan en una bolsa de plastico sellada y se sumergen en un bano con agua a 37°C. Los recipientes se agitan suavemente hasta que todo el contenido se funde excepto un pequeno trozo de hielo. Los recipientes se retiran de la bolsa de plastico sellada y se anade un volumen igual de HSA 2,5%/Dextrano 5%. Las celulas se inyectan sin lavado adicional alguno.
6.9.5 Pruebas y especificaciones
Una muestra de sangre materna acompana a la placenta de todas las donantes. La muestra es cribada para anticuerpo del nucleo de Hepatitis B y antfgeno de superficie, anticuerpo del virus de Hepatitis C y acido nucleico y anticuerpo de VIH I y II y acido nucleico. El procesamiento placentario y de cultivo primario comienza antes de la recepcion de los resultados de las pruebas, pero continua solo para placentas asociadas con muestras de sangre materna que resultan negativas para todos los virus. Un lote se rechaza si la donante da positivo para cualquier patogeno. Ademas, las pruebas descritas en la tabla 3 se realizan en el MCB, el WCB y una muestra del material de dosis celular procedente de un vial del WCB. Un lote se libera solo cuando se cumplen todas las especificaciones. Tabla 3: Pruebas y especificaciones celulares
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* Para el producto disenado que es 40 ml de celulas congeladas/dosis y un maximo de 5 EU/ml, el producto celular esta por debajo del lfmite superior de 5 EU/kg/dosis para receptores de peso corporal superior a 40 kg.
6.9.6 Analisis del fenotipo de marcadores celulares
Las celulas se colocan en paraformaldetndo 1% (PFA) en PBS durante 20 minutos y se almacenan en un frigonfico hasta que se tinen (hasta una semana). Las celulas se lavan con FBS 2%, azida sodica 0,05% en PBS (tampon de tincion) y a continuacion se resuspenden en tampon de tincion. Las celulas se tinen con los siguientes conjugados de anticuerpo: CD105-FITC, CD200-PE, CD34-PECy7, CD10-APC. Las celulas tambien se tinen con controles de isotipo. Despues de 30 minutos de incubacion, las celulas se lavan y se resuspenden con tampon de tincion, seguido por analisis en un citometro de flujo. Las celulas que tienen una fluorescencia incrementada en comparacion con controles de isotipo se cuentan como positivas para un marcador.
6.10 EJEMPLO 10: IDENTIFICACION DE GENES ESPEdFICOS DE CELULAS MADRE PLACENTARIAS Los patrones de expresion genica de celulas madre placentarias de amnios-corion (AC) y cordon umbilical (UC) se compararon con patrones de expresion genica de celulas madre mesenquimatosas multipotentes obtenidas a partir de medula osea (BM) y fibroblastos dermicos (DF), de las cuales se considera que las ultimas estan diferenciadas de forma terminal. Las celulas se cultivaron para un unico pase, un numero intermedio de pases, y gran numero de pases (incluyendo hasta la senescencia). Los resultados indican que el numero de duplicaciones de la poblacion tiene un impacto fundamental sobre la expresion genica. Se identifico un conjunto de genes que estan regulados positivamente en AC y UC, y regulados negativamente o ausentes en BM y d F, y que se expresan independientes del numero de pases. Este conjunto de genes espedficos de celulas madre placentarias o celulas madre del cordon umbilical codifica una serie de protemas del citoesqueleto y de adhesion celula a celula con celulas epiteliales y una protema de la superficie similar a inmunoglobulina, CD200, implicada en la tolerancia inmunitaria materno-fetal. Celulas madre placentarias y celulas madre de cordon umbilical se denominaran colectivamente en lo sucesivo en este ejemplo como celulas madre AC/UC.
6.10.1 Metodos y materiales
6.10.1.1 Celulas y cultivo celular
BM (N° de Cat PT-2501) y DF (N° de Cat CC-2511) se adquirieron de Cambrex. AC y UC se originaban de matraces para cultivo tisular de pase 0. AC y UC en los matraces se obtuvieron mediante digestion a partir de la placenta de un donante designada 2063919. Matraces de cultivo T-75 se sembraron a 6000 celulas/cm2 y las celulas se sometieron a un pase cuando se volvieron confluentes. Las duplicaciones de la poblacion se estimaron a partir de recuentos de celulas con azul de tripano. Los cultivos se ensayaron para expresion genica despues de 3, 11-14, y 24-38 duplicaciones de la poblacion.
6.10.1.2 ARN, micromatrices multigenicas, y analisis
Las celulas se lisaron directamente en sus matraces de cultivo tisular, con la excepcion de un cultivo que se tripsinizo antes de la lisis. El ARN total se aislo con el kit RNeasy de QIAGEN. La integridad y las concentraciones del ARN se determinaron con un bioanalizador Agilent 2100. Diez microgramos de ARN total de cada cultivo se hibridaron en una plataforma GENECHIP® de Affymetrix. El ARN total se convirtio en ARNc marcados y se hibrido con matrices multigenicas (“arrays") Human Genome U133A 2.0 de oiligonucleoticos de acuerdo con los metodos del fabricante. Archivos de imagenes se procesaron con el software MAS 5.0 de Affymetrix, y se normalizaron y se analizaron con el software GeneSpring 7.3 de Agilent.
6.10.2 Resultados
6.10.2.1 Seleccion de puntos de temporales de cultivo de BM MSC, celulas madre AC/UC, y DF para analisis de micromatrices multigenicas
Para establecer un patron de expresion genica unico para celulas madre AC/UC, dos lmeas de celulas madre, AC(6) y UC(6), se cultivaron en paralelo con BM-MSC y Df . Para maximizar la identificacion de un perfil de expresion genica atribuible al origen celular y minimizar las influencias exogenas, todas las celulas se cultivaron en el mismo medio, se sembraron y se sub-cultivaron usando los mismos criterios. Las celulas se recogieron despues de 3 duplicaciones de la poblacion, 11-14 duplicaciones, o 35 duplicaciones o senescencia, lo que ocurra en primer lugar. Los genes cuya expresion en celulas madre AC/UC permanece sin cambios por el tiempo en cultivo y estan regulados positivamente con respecto a BM y DF son candidatos a genes espedficos de celulas madre AC/UC. La figura 10 muestra perfiles de crecimiento para las cuatro lmeas celulares en el estudio; los drculos indican que cultivos fueron recogidos para aislamiento de ARN. En total se recogieron doce muestras. BM, AC(6), y UC(6) se recogieron despues de tres duplicaciones de la poblacion; se considero que estas muestras estaban en cultivo durante un “corto” periodo de tiempo. Una muestra de DF a corto plazo no se recogio. Cultivos de duracion intermedia, 11 a 14 duplicaciones, se recogieron para todos los tipos de celulas. Los cultivos a largo plazo se recogieron de todas las lmeas celulares a aproximadamente 35 duplicaciones de la poblacion o justo antes de la senescencia, lo que ocurra antes. La senescencia se produda antes de 15 duplicaciones para BM y a 25 duplicaciones para DF. Las celulas BM y DF adquiridas se expandieron muchas veces antes del analisis de genes, y no pueden considerarse de fase temprana. Sin embargo, de forma operativa, BM cultivadas durante tres duplicaciones (BM-03) se consideran un cultivo a corto plazo. Del mismo modo, BM-11 se denomina de forma operativa como un cultivo de duracion intermedia, pero dado que la senescencia se produda a 14 duplicaciones, BM-11 es de la forma mas probable un cultivo biologicamente a largo plazo.
6.10.2.2 El agrupamiento jerarquico muestra relacion entre BM, celulas madre AC/UC y DF
El analisis de micromatrices multigenicas identifica patrones de expresion genica, y el agrupamiento jerarquico (HC) intenta descubrir similitudes en el contexto de dos dimensiones - genes en la primera dimension y diferentes condiciones (diferentes muestras de ARN) en la segunda. Los chips genicos “GeneChips” usados en este experimento conteman mas de 22.000 conjuntos de sonda (denominado como la “lista de todos los genes”), pero muchos de estos conjuntos interrogan a genes que no son expresados en ninguna condicion. Para reducir la lista de todos los genes, los genes que no se expresaban o se expresaban a niveles bajos (valores no procesados por debajo de 250) en todas las muestras se eliminaron para producir una lista de 8.215 genes.
6.10.2.3 Analisis de la expresion genica usando la vista grafica lineal
Patrones de expresion genica de los 8215 genes se visualizaron usando la vista grafica lineal en GeneSpring (figura 11). El eje x muestra las doce condiciones experimentales y el eje y muestra los valores de expresion del conjunto de sondas normalizadas en una escala logantmica. El eje y cubre un intervalo de 10.000 veces, y genes que no se expresan o se expresan a niveles muy bajos son ajustados a un valor de 0,01. Por defecto el valor normalizado se ajusta a 1. Cada lmea representa un unico gen (en realidad un conjunto de sondas, algunos genes tienen multiples conjuntos de sondas) y discurre a traves de las doce condiciones como un unico color. Los colores representan niveles de expresion relativa, segun lo descrito para los mapas termicos, pero el patron de coloracion se determina seleccionando una condicion. AC-03 es la condicion seleccionada en la figura 11. Los genes regulados positivamente con respecto al valor normalizado se visualizan mediante el software como rojos, y los que estan regulados negativamente, se visualizan como azules. Los picos que apuntan hacia arriba y hacia abajo obvios en AC-03 a UC-11 indican que muchos genes se expresan de forma diferente a traves de estas condiciones. La impactante similitud en los patrones de color entre AC-03 y UC-03 muestra que muchos de los mismos genes estan regulados positiva o negativamente en estas dos muestras. Los segmentos de lmea horizontal indican que el nivel de expresion de un gen permanece sin cambios a traves de una serie de condiciones. Esto es lo mas notable comparando UC-36, UC-38, y UC-38-T. No existen picos obvios, pero existe una tendencia sutil en que una serie de lmeas rojas entre UC-36 y UC-38-T estan por debajo del valor normalizado de 1. Esto indica que estos genes, que estan regulados positivamente en AC-03 y UC-03, estan regulados negativamente en los cultivos tardfos. El hecho de que los patrones de expresion entre UC-38 y UC-38-T sean tan similares indica que tripsinizar celulas justo antes del aislamiento del ARN tiene poco efecto sobre la expresion genica.
Ademas del metodo HC computacionalmente intensivo, mediante inspeccion visual las dos muestras de BM son mas similares entre sf que a las otras condiciones. Lo mismo es cierto para los dos cultivos de DF. Y a pesar del gran numero de genes expresados de forma diferencial presentes en las muestras de BM y DF, el aspecto general sugiere que dos BM y los dos DF son mas similares entre sf que a celulas madre AC/UC. Esto se confirma mediante los resultados de HC descritos anteriormente.
Cuando el proceso anterior se aplica usando AC-11 como condicion seleccionada, esta claro que AC-11 y UC-11 comparten muchos de los mismos genes expresados de forma diferencial, pero el numero total de genes en comun entre estas dos condiciones parece menor que el numero de genes expresados de forma diferencial compartidos por AC-03 y UC-03. La figura 12 muestra: genes sobreexpresados de forma diferencial, pero seis o mas veces con respecto al valor inicial, en AC-03. La mayona de los genes regulados positivamente en AC-03 estan tambien regulados positivamente en UC-03, y son mas divergentes en BM y DF.
6.10.2.4 Metodos de filtracion usados para identificar genes espedficos de celulas madre AC/UC
Los genes que permanecen constantes a traves de todas las muestras de AC/UC, y estan regulados negativamente en BM and DF, se consideran espedficos de celulas madre de AC/UC. Se combinaron dos metodos de filtracion para crear una lista de 58 genes espedficos de celulas madre AC/UC (Tabla 4).
Tabla 4: 58 genes espedficos de celulas madre placentarias o celulas madre del cordon umbilical
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En primer lugar, se identificaron 58 genes seleccionando aquellos genes sobreexpresados > tres veces en al menos siete de ocho condiciones de celulas madre AC/UC con respecto a todas las muestras de BM y DF (figura 13). La filtracion en ocho de las ocho condiciones de celulas madre AC/UC produda una lista similar. El segundo metodo de filtracion usaba resultados “ausentes” y “presentes” proporcionadas por el software MAS 5.0 de Affymetrix. Se creo una lista identificando genes ausentes en todas las condiciones de BM y DF y presentes en AC-03, AC-11, UC-03, and UC-11. Los resultados genicos en las condiciones de celulas madre AC/UC tardfas no se estipularon.
Las dos listas se solapaban significativamente y se combinaban. La lista combinada se recorto adicionalmente eliminando (1) varios genes expresados a niveles muy bajos en la mayona o todas las condiciones de celulas madre AC/UC, y (2) genes portados en el cromosoma Y. se confirmo que las celulas AC y UC usadas en este estudio son masculinas mediante analisis FISH, y las BM y DF procedfan de un donante femenino. La lista resultante de 46 genes espedficos de celulas madre AC/UC se muestra en la tabla 5.
Tabla 5. Genes espedficos de AC/UC enumerados por ontologfa
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Esta lista de 46 genes codifica una coleccion de protemas que presentan un numero de grupos de ontologfa. El grupo con mayor representacion, adhesion celular, contiene ocho genes. Ninguno de los genes codifica protemas implicadas en la replicacion del ADN o la division celular. Dieciseis genes con referencias espedficas para epitelios tambien se enumeran.
6.10.3 Discusion
Se identifico un patron de expresion espedfico de celulas madre placentarias, y distinguible de celulas mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea. De forma operativa, este patron incluye 46 genes que se sobreexpresan en todas las muestras de celulas madre placentarias con respecto a todas las muestras de BM y DF. El diseno experimental comparaba celulas cultivadas durante periodos cortos, medios y largos de tiempo en cultivo. Para celulas AC y UC, cada periodo de cultivo tiene un conjunto caractenstico de genes expresados de forma diferencial. Durante el corto plazo o fase temprana (AC-03 y UC-03) doscientos genes regulados positivamente volvfan a la media despues de ocho duplicaciones de la poblacion. Sin quedar vinculados por la teona, es probable que este patron de expresion genica de fase temprana recuerde al perfil de expresion de Ac y UC mientras que en el entorno placentario natural. En la placenta estas celulas no se estan dividiendo activamente, son nutrientes metabolizantes, senalizantes entre ellos, y que fijan su ubicacion remodelando los entornos extracelulares.
La expresion genica por los cultivos de duracion intermedia se define mediante division celular rapida y genes expresados de forma diferencial en este momento son bastante diferentes de aquellos expresados de forma diferencial durante la fase temprana. Muchos de los genes regulados positivamente en AC-11 y UC-11, junto con BM-03 y DF-14, estan implicados en la replicacion cromosomica y la division celular. En base a la expresion genica, BM-03 parece biologicamente ser un cultivo a medio plazo. En esta fase media, la expresion genica espedfica del tipo celular esta eclipsada por la proliferacion celular. Ademas, casi todos los genes sobreexpresados en los cultivos de AC o UC a corto plazo estan regulados negativamente en las condiciones de fase media y tardfa. 143 genes estaban regulados positivamente > cinco veces durante esta fase altamente proliferativa, constituyendo aproximadamente 1,7% de los genes expresados.
Los cultivos a largo plazo representan la fase final o senescente. En esta fase, las celulas han agotado su capacidad de dividirse y, especialmente para AC y UC, el numero absoluto de genes expresados de forma diferencial se reduce notoriamente. Esto puede ser el resultado de que las celulas estan completamente adaptadas a su entorno de cultivo y un lastre reducido en consecuencia a biosintetizar. Sorprendentemente, cultivos BM y DF tardfos no presentan este mismo comportamiento; un gran numero de genes se expresan de forma diferencial en BM-11 y DF-24 con respecto a AC y UC y el valor normalizado de 1. AC y UC son distinguibles de BM y DF de la forma mas notable en los cultivos a largo plazo.
La lista de genes espedficos de celulas madre placentarias descrita en esta memoria es diversa. COL4A1 y COL4A2 estan regulados de forma coordinada, y KRT18 y KRT8 tambien parecen sobreexpresarse. Ocho de los genes codifican protemas implicadas en contacto celula a celula, tres de los cuales (DSC3, DSG2, y PKP2) estan localizadas en desmosomas, puntos de contacto intercelular anclados a protemas citoesqueleticas de filamento intermedio tales como queratina 18 y queratina 8. El contacto estrecho celula a celula es caractenstico de celulas epiteliales y endoteliales y no esta tfpicamente asociado con fibroblastos. La tabla 3 enumera 16 genes, de los 46 en total, caractensticos de celulas epiteliales. Las celulas madre placentarias se describen generalmente como celulas pequenas en forma de huso similares a fibroblastos. Esta morfologfa es tfpicamente distinta de BM y DF, especialmente a densidades celulares mas bajas. Cabe mencionar ademas el patron de expresion de CD200, que esta presente en celulas madre AC/UC y ausente en todas las muestras de BM y d F. Ademas, CD200 ha demostrado estar asociado con tolerancia inmunitaria en la placenta durante el desarrollo fetal (vease, por ejemplo, Clark et al., Am. J. Reprod Immunol. 50(3): 187-195 (2003)).
Este subconjunto de genes de 46 genes constituye un conjunto de biomarcadores moleculares que distingue celulas madre AC/UC de celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea o fibroblastos.
Aspectos adicionales descritos en la presente memoria, con fines de referencia solamente:
1. Un metodo de produccion de una poblacion de celulas que comprende identificar celulas placentarias que se adhieren a un sustrato y:
expresan CD200 y HLA-G;
expresan CD73, CD105 y CD200;
expresan CD200 y OCT-4;
expresan CD73, CD105 y HLA-G;
expresan CD73 y CD105, y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide; o
expresan OCT-4, y (c) facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide;
y aislar dichas celulas de otras celulas para formar una poblacion de celulas.
2. El metodo del punto 1, en donde dicho sustrato comprende fibronectina.
3. El metodo del punto 1, en donde dicha identificacion se consigue usando un anticuerpo.
4. El metodo del punto 1, en donde dicha identificacion se consigue usando citometna de flujo.
5. El metodo del punto 1, en donde dicho aislamiento se consigue usando perlas magneticas.
6. El metodo del punto 1, en donde dicho aislamiento se consigue mediante clasificacion de celulas activadas por fluorescencia.
7. El metodo del punto 1, en donde dicha poblacion de celulas se expande despues de dicho aislamiento.
8. Un metodo de produccion de una lmea de celulas madre, que comprende transformar una celula madre con una secuencia de ADN que codifica una protema promotora del crecimiento; y exponer dicha celula madre a condiciones que promueven la produccion de dicha protema promotora del crecimiento.
9. El metodo del punto 8, en donde dicha protema promotora del crecimiento es v-myc, N-myc, c-myc, p53, antfgeno T grande de SV40, antfgeno T grande de polioma, protema E1a de adenovirus o protema E7 de papilomavirus humano.
10. El metodo del punto 8, en donde dicha secuencia de ADN es regulable.
11. El metodo del punto 8, en donde dicha secuencia de ADN es regulable por tetraciclina.
12. El metodo del punto 8, en donde dicha protema promotora del crecimiento tiene una actividad regulable.
13. El metodo del punto 8, en donde dicha protema promotora del crecimiento es un mutante sensible a temperatura.
14. Un metodo de produccion de una poblacion de celulas madre, que comprende identificar celulas madre placentarias adherentes que expresan uno o mas genes, en donde dichos genes son ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A, a un nivel notoriamente mas elevado que una celula madre mesenquimatosa obtenida a partir de medula osea que se ha sometido al mismo numero de pases en cultivo que dicha celula madre placentaria, y aislar dichas celulas placentarias.
15. El metodo del punto 14, en donde dicha celula placentaria adherente expresa cinco o mas de dichos genes a un nivel notoriamente mas elevado que una celula madre mesenquimatosa obtenida a partir de medula osea que se ha sometido al mismo numero de pases en cultivo que dicha celula madre placentaria.
16. El metodo del punto 14, en donde dicha celula placentaria adherente expresa diez o mas de dichos genes a un nivel notoriamente mas elevado que una celula madre mesenquimatosa obtenida a partir de medula osea que se ha sometido al mismo numero de pases en cultivo que dicha celula madre placentaria.
17. El metodo del punto 14, en donde dicha celula placentaria adherente expresa veinte o mas de dichos genes a un nivel notoriamente mas elevado que una celula madre mesenquimatosa obtenida a partir de medula osea que se ha sometido al mismo numero de pases en cultivo que dicha celula madre placentaria.
18. El metodo del punto 14, en donde dicha celula placentaria adherente expresa cada uno de dichos genes a un nivel notoriamente mas elevado que una celula madre mesenquimatosa obtenida a partir de medula osea que se ha sometido al mismo numero de pases en cultivo que dicha celula madre placentaria.
19. Un metodo de preparacion de un banco de celulas madre placentarias, que comprende:
expandir celulas madre placentarias de cultivo primario procedentes de una placenta postparto humana para una primera pluralidad de duplicaciones de la poblacion;
crioconservar dichas celulas madre placentarias para formar un banco de celulas patron;
expandir una pluralidad de celulas madre placentarias procedentes del banco de celulas patron para una segunda pluralidad de duplicaciones de la poblacion;
crioconservar dichas celulas madre placentarias para formar un banco de celulas de trabajo;
expandir una pluralidad de celulas madre placentarias procedentes del banco de celulas de trabajo para una tercera pluralidad de duplicaciones de la poblacion; y
crioconservar dichas celulas madre placentarias en dosis individuales,
en donde dichas dosis individuales componen colectivamente un banco de celulas madre placentarias.
20. El metodo del punto 19, en donde el numero total de duplicaciones de la poblacion es aproximadamente 20. 21. El metodo del punto 19, en donde dicha primera pluralidad de duplicaciones de la poblacion es aproximadamente cuatro duplicaciones de la poblacion; dicha segunda pluralidad de duplicaciones de la poblacion es aproximadamente ocho duplicaciones de la poblacion; y dicha tercera pluralidad de duplicaciones de la poblacion es aproximadamente ocho duplicaciones de la poblacion.
22. El metodo del punto 19, en donde dichas celulas madre placentarias de cultivo primario comprenden celulas madre placentarias de perfundido placentario.
23. El metodo del punto 19, en donde dichas celulas madre placentarias de cultivo primario comprenden celulas madre placentarias de tejido placentario digerido.
24. El metodo del punto 19, en donde dichas celulas madre placentarias de cultivo primario comprenden celulas madre placentarias de perfundido placentario y de tejido placentario digerido.
25. El metodo del punto 19, en donde todas de dichas celulas madres placentarias en dicho cultivo primario de celulas madre placentarias son de la misma placenta.
26. El metodo del punto 19, que comprende ademas la etapa de seleccionar celulas madre placentarias CD200+ o HLA-G+ entre dicha pluralidad de dichas celulas madres placentarias de dicho banco de celulas de trabajo para formar dosis individuales.
27. El metodo del punto 19, en donde dichas dosis individuales comprenden de aproximadamente 104 a aproximadamente 105 celulas madre placentarias.
28. El metodo del punto 19, en donde dichas dosis individuales comprenden de aproximadamente 105 a aproximadamente 106 celulas madre placentarias.
29. El metodo del punto 19, en donde dichas dosis individuales comprenden de aproximadamente 106 a aproximadamente 107 celulas madre placentarias.
30. El metodo del punto 19, en donde dichas dosis individuales comprenden de aproximadamente 107 a aproximadamente 108 celulas madre placentarias.
31. Una composicion que comprende medio condicionado, en donde dicho medio esta condicionado por celulas madre placentarias que son:
CD200+ y HLA-G+;
CD73+, CD105+ y CD200+;
CD200+ y OCT-4+;
CD73+, CD105+ y HLA-G+;
CD73+ y CD105+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide; o
OCT-4+ y facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide.
32. La composicion del punto 31, en donde dichas celulas madres placentarias se han cultivado en dicho medio durante al menos un dfa.
33. La composicion del punto 31, en donde dichas celulas madres placentarias se han cultivado en dicho medio durante al menos tres dfas.
34. Una composicion que comprende una poblacion de celulas madre placentarias que son:
CD200+ y HLA-G+;
CD73+, CD105+ y CD200+;
CD200+ y OCT-4+;
CD73+, CD105+ y HLA-G+;
CD73+ y CD105+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha poblacion de celulas madre placentarias cuando dicha poblacion de celulas placentarias se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide; o
OCT-4+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha poblacion de celulas madre placentarias cuando dicha poblacion de celulas placentarias se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide; o una combinacion de las anteriores; y
una celula madre que no se obtiene a partir de una placenta, en donde al menos 70 % de dichas celulas madres placentarias son de origen no materno.
35. La composicion del punto 34, en donde dicha celula madre no obtenida a partir de una placenta es una celula madre embrionaria.
36. La composicion del punto 34, en donde dicha celula madre no obtenida a partir de una placenta es una celula madre mesenquimatosa.
37. La composicion del punto 34, en donde dicha celula madre no obtenida a partir de una placenta es una celula madre obtenida a partir de medula osea.
38. La composicion del punto 34, en donde dicha celula madre no obtenida a partir de una placenta es una celula progenitora hematopoyetica.
39. La composicion del punto 34, en donde dicha celula madre no obtenida a partir de una placenta es una celula madre somatica.
40. La composicion del punto 39, en donde dicha celula madre somatica es una celula madre neural, una celula madre hepatica, una celula madre pancreatica, una celula madre endotelial, una celula madre cardiaca o una celula madre muscular.
41. Un metodo de aislamiento de una poblacion de celulas madre placentarias, que comprende cultivar una parte de una placenta durante un tiempo suficiente para que una pluralidad de celulas madre placentarias proliferen fuera de dicho tejido, y aislar dichas celulas madres placentarias a partir de dicho tejido.
42. El metodo del punto 41, en donde dicho tejido es una membrana amniotica, corion, una combinacion de amnios y corion, o una combinacion de cualquiera de las anteriores.
43. Una celula madre placentaria adherente, en donde dicha celula madre es:
CD200+ y HLA-G+;
CD73+, CD105+ y CD200+;
CD200+ y OCT-4+;
CD73+, CD105+ y HLA-G+;
CD73+ y CD 105+ y facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide; o
OCT-4+ y facilita la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide, o una combinacion de las mismas;
y en donde dicha celula madre placentaria es de origen no materno.
44. Una poblacion de celulas madre placentarias adherentes aisladas, en donde dichas celulas madre son:
CD200+ y HLA-G+;
CD73+, CD105+ y CD200+;
CD200+ y OCT-4+;
CD73+, CD105+ y HLA-G+;
CD73+ y CD105+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende dicha celula madre cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de un cuerpo de tipo embrioide; o
OCT-4+ y facilitan la formacion de uno o mas cuerpos de tipo embrioide en una poblacion de celulas placentarias que comprende la celula madre cuando dicha poblacion se cultiva en condiciones que permiten la formacion de cuerpos de tipo embrioide;
y en donde al menos 70 % de dichas celulas madres placentarias son de origen no materno.
45. La poblacion del punto 44, en donde al menos 90 % de dichas celulas madres placentarias son de origen no materno.
46. La poblacion del punto 44, en donde al menos 99 % de dichas celulas madres placentarias son de origen no materno.
47. Una composicion que comprende la celula madre placentaria aislada del punto 43.
48. Una composicion que comprende la poblacion de celulas madre placentarias aisladas de la reivindicacion 44. 49. La composicion del punto 47, que esta en una forma adecuada para administracion intravenosa.
50. La composicion del punto 48, que esta en una forma adecuada para administracion intravenosa.
51. La composicion del punto 47, en donde dicha composicion esta en un recipiente adecuado para administracion intravenosa de dicha composicion.
52. La composicion del punto 48, en donde dicha composicion esta en un recipiente adecuado para administracion intravenosa de dicha composicion.
53. Un metodo de recogida de celulas madre placentarias, que comprende:
perfundir una placenta de mairnfero a la que se le ha drenado sangre del cordon y ha sido perfundida para eliminar sangre residual;
perfundir dicha placenta con una solucion de perfusion a traves de la vasculatura placentaria;
recoger dicha solucion de perfusion solamente a partir de dicha vasculatura, en donde dicha solucion de perfusion despues de la perfusion comprende una poblacion de celulas que comprende celulas madre placentarias, en donde al menos 95 % de dichas celulas madres placentarias son de origen fetal;
y aislar una pluralidad de dichas celulas madres placentarias entre dicha poblacion de celulas.
54. El metodo del punto 53, en donde la solucion de perfusion se hace pasar a traves de la vena umbilical y se recoge de las arterias umbilicales.
55. El metodo del punto 53, en donde la solucion de perfusion se hace pasar a traves de las arterias umbilicales y se recoge de la vena umbilical.
56. Una poblacion aislada de celulas madre placentarias adherentes recogidas mediante el metodo del punto 53, en donde al menos 95 % de dicha poblacion aislada de celulas madre placentarias es de origen fetal.
57. La poblacion aislada del punto 51, en donde mas de 99 % de dichas celulas madres placentarias son de origen fetal.
58. La poblacion aislada del punto 51 en donde las celulas madre placentarias son al menos 50 % de dicha poblacion de celulas placentarias.
59. La poblacion aislada del punto 51 en donde las celulas madre placentarias son al menos 95 % de dicha poblacion de celulas placentarias.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una poblacion de celulas madre de amnios-corion adherentes aisladas, en donde dichas celulas madre de amnios-corion expresan el gen SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mayor que un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea (BM-MSC) que se han cultivado en condiciones equivalentes y se han sometido al mismo numero de pases en cultivo que dichas celulas madre de amnios-corion, en donde dichas celulas madre de amnios-corion son CD10+, CD34', Cd 105+, y CD200+.
2. La poblacion de la reivindicacion 1, en donde dichas celulas madre de amnios-corion son ademas CD90+ y CD45'.
3. La poblacion de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dichas celulas madre de amnios-corion tienen la capacidad de diferenciarse en celulas que tienen caractensticas de celulas neuronales.
4. La poblacion de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas celulas madre de amnios-corion expresan dicho gen SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mas elevado que un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea durante 3, durante 11-14 o durante 24-38 duplicaciones de la poblacion.
5. La poblacion de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha poblacion comprende 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, o 1 x1011 celulas madre de amnioscorion.
6. La poblacion de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha poblacion se ha sometido a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40, o mas, duplicaciones de la poblacion.
7. La poblacion de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dichas celulas madre de amnios-corion expresan dicho gen SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mas elevado que un numero equivalente de celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea cuando dichas celulas madre de amnios-corion y dichas celulas madre mesenquimales derivadas de la medula osea se cultivan en un medio que comprende DMEM-LG 60 % y MCDB-201 40 %; suero fetal de ternero 2 %, 1x insulina-transferrina-selenio, 1x acido linolenico-albumina de suero bovino, dexametasona 10'9 M, acido 2-fosfato ascorbico 10'4 M, factor de crecimiento epidermico 10 ng/ml, y factor de crecimiento derivado de plaquetas 10 ng/ml
8. La poblacion de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dichas celulas madre de amnios-corion tienen la capacidad de replicarse de 10 a 40 veces en cultivo.
9. La poblacion de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dichas celulas madre de amnios-corion se han sometido a un pase de 5 a 10 veces.
10. La poblacion de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dichas celulas madre de amnios-corion se diferencian en celulas que tienen una caractenstica de celulas condrogenicas cuando se cultivan en DMEM que comprende 15 % de suero de sangre del cordon y 0,01 |ig/ml de factor de crecimiento transformante beta (TGFp); y en donde dicha caractenstica de celulas condrogenicas es tincion positiva con colorante azul alcian.
11. La poblacion de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dichas celulas madre de amnios-corion se diferencian en celulas que tienen una caractenstica de celulas osteogenicas cuando se cultivan en DMEM que comprende 15 % de suero de sangre del cordon, dexametasona 0,1 |iM, 2-fosfato de acido ascorbico 0,05 mM, y beta glicerofosfato 10 mM; y en donde dicha caractenstica de celulas osteogenicas se demuestra mediante tincion con colorante de von Kossa o produccion de ARNm para fosfatasa alcalina segun lo determinado por RT-PCR.
12. La poblacion de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dichas celulas madre de amnios-corion expresan dicho gen SLC12A8 a un nivel al menos tres veces mas elevado que un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea.
13. La poblacion de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde al menos el 90% o al menos el 99% de dichas celulas madre de amnios-corion son de origen no materno
14. Una composicion que comprende las celulas madre adherentes aisladas de las reivindicaciones 1-13, en donde la composicion esta en una forma adecuada para administracion intravenosa.
15. Un metodo de produccion de una poblacion de celulas madre de amnios-corion de la reivindicacion 1, que comprende identificar celulas madre de amnios-corion adherentes que expresan el gen SLC12A8 a un nivel al menos dos veces mayor que un numero equivalente de celulas madre mesenquimatosas obtenidas a partir de medula osea que se han cultivado en condiciones equivalentes y se han sometido al mismo numero de pases en cultivo que dichas celulas madre de amnios-corion, y aislar dichas celulas madre de amnios-corion, en donde dichas celulas madre de amnios-corion son CD10+, CD34', CD105+ y, CD200+.
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