PT2471903T - População de células estaminais placentárias - Google Patents

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Ye Qian
Faleck Herbert
Dawn Abramson Sascha
J Hariri Robert
S Labazzo Kristen
Periera Marian
Wang Jia-Iun
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Description

DESCRIÇÃO "POPULAÇÃO DE CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS"
Este pedido reivindica o beneficio do Pedido
Provisório U.S. N.° 60/754,968, apresentado em 29 de dezembro de 2005; e reivindica o beneficio do Pedido
Provisório U.S. N.° 60/846,641, apresentado em 22 de setembro de 2006.
1. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se geralmente a células estaminais placentárias isoladas, populações de células estaminais placentárias, composições que compreendem as células estaminais e métodos de obtenção das células estaminais.
2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As células estaminais humanas são células precursoras totipotentes ou pluripotentes capazes de gerar uma variedade de linhagens de células humanas maduras. Há evidência que demonstra que as células estaminais podem ser utilizadas para repovoar muitos, se não todos os, tecidos e restabelecer a funcionalidade fisiológica e anatómica.
Foram caracterizados muitos tipos diferentes de células estaminais de mamífero. Ver, e.g., Caplan et al., Patente U.S. N.° 5,486,359 (células estaminais mesenquimatosas humanas); Boyse et al., Patente U.S. N.° 5,004,681 (células estaminais e progenitoras hematopoiéticas fetais e neonatais); Boyse et al., U.S. 5,192,553 (mesma); Beltrami et al., Cell 114(6):763-766 (2003) (células estaminais cardíacas); Forbes et al., J. Pathol. 197(4):510-518 (2002) (células estaminais hepáticas). O sangue do cordão umbilical e as células nucleadas totais derivadas do sangue do cordão foram utilizados em transplantes para restabelecer, parcial ou totalmente, a função hematopoiética em doentes que sofreram terapia ablativa.
In'tAnker PS et al. (2004) examina a expressão de certos marcadores sobre a superfície de células da medula óssea, sangue do cordão umbilical, líquido amniótico e o âmnio, decídua parietal e decídua basal dos tecidos placentários. Zhang, Y. et al. (2004) descreve um estudo sobre placenta humana como uma fonte alternativa de células progenitoras mesenquimatosas humanas (MPC) com potencial imunorregulador semelhante às MPC da medula óssea e capaz de expandir células de iniciação de culturas de longo prazo a partir de células sanguíneas do cordão umbilical. Li Chang Dong et al. (2005) descreve um estudo dirigido ao isolamento e caracterização de células estaminais mesenquimatosas (MSCs) derivadas da placenta humana que mostrou que estas células exibiam capacidade para modular a proliferação de linfócitos do sangue do cordão umbilical. Fukuchi, Y. et al. (2004) descreve um estudo que examina células derivadas da placenta humano possuindo o potencial de células estaminais e progenitoras mesenquimatosas. O pedido internacional WO 2005/001076 descreve células derivadas de placenta pós-parto caracterizadas inter alia por certos marcadores e métodos para o seu isolamento e utilizações potenciais daquelas células derivadas da placenta.
3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se geralmente a células estaminais placentárias isoladas, populações de células estaminais placentárias, composições que compreendem as células estaminais e métodos de obtenção das células estaminais.
Especificamente, a presente invenção proporciona uma população de células estaminais corioamnióticas aderentes isoladas, em que as células estaminais corioamnióticas expressam o gene TCF21 a um nível pelo menos duas vezes superior a um número equivalente de BM-MSCs que foram cultivadas sob condições equivalentes e sofreram o mesmo número de passagens em cultura que as referidas células estaminais corioamnióticas, e em que as referidas células estaminais corioamnióticas são: (a) CD200 + , CD10\ CD105+ e CD34-; ou (b) CD200 + , CD10+, CD105+, CD34-, CD90+ e CD45“.
De acordo com uma forma de realização da população de células da presente invenção, pelo menos 90% ou pelo menos 99% das células estaminais corioamnióticas são de origem não materna. Noutra forma de realização, as células estão numa forma adequada para administração intravenosa. Ainda noutra forma de realização da presente invenção, as células têm a capacidade para diferenciar-se em células com caracteristicas de células neuronais, células adipogénicas, células pancreáticas ou células cardíacas.
Noutra forma de realização da presente invenção, as células estaminais placentárias expressam o referido gene a um nível mais alto de forma detetável que um número equivalente de BM-MSCs ao longo de 3, ao longo de 11-14, ou ao longo de 24-38 duplicações da população. Além disso, numa forma de realização, a população de células compreende pelo menos 1 x 108 ou pelo menos 1 x 109 células. Noutra forma de realização a população de células sofreu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ou 40, ou mais, duplicações da população. Ainda noutra forma de realização, as células estaminais corioamnióticas têm a capacidade para se replicar 10 a 40 vezes em cultura. Noutra forma de realização, as células estaminais corioamnióticas foram passadas 5 a 10 vezes.
De acordo com uma forma de realização da população de células da presente invenção, as células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma caracteristica de células condrogénicas quando cultivadas em DMEM que compreende 15% de soro de sangue do cordão e 0,01 yg/mL de fator de crescimento transformante beta-3 (TGFp3); e em que a referida caracteristica de células condrogénicas é a revelação positiva com o corante Azul de Alciano.
De acordo com outra forma de realização da população de células da presente invenção, as células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma caracteristica de células osteogénicas quando cultivadas em DMEM que compreende 15% de soro de sangue do cordão, dexametasona 0,1 μΜ, ácido ascórbico-2-fosfato 0, 05 mM e beta-glicerofosfato 10 mM; e em que a referida caracteristica de células osteogénicas é demonstrada por revelação com o corante de von Kossa ou pela produção de ARNm para a fosfatase alcalina como determinada por RT-PCR.
De acordo com outra forma de realização da população de células da presente invenção, as células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma caracteristica de células adipogénicas quando cultivadas em: (i) DMEM ou MCDB-201 que compreende 2% de soro fetal de vitelo, 0,5% de hidrocortisona, isobutilmetilxantina (IBMX) 0,5 mM e indometacina 60 μΜ; ou (ii) DMEM ou MCDB-201 que compreende 2% de soro fetal de vitelo e 0,5% de ácido linoleico; e em que a referida caracteristica de células adipogénicas é demonstrada por revelação com óleo de revelação lipófilo vermelho O ou pela expressão de lipase ou proteína de ligação de ácidos gordos como determinada por RT-PCR.
De acordo com ainda outra forma de realização da população de células da presente invenção, as células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma característica de células cardíacas quando cultivadas em: (1) DMEM que compreende 2 0% de soro de sangue do cordão, ácido retinoico 1 μΜ, 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básico, 2 ng/mL de fator de crescimento transformante beta-1 e 100 ng/mL de fator de crescimento epidérmico; ou (ii) DMEM que compreende 20% de soro de sangue do cordão e 50 ng/mL de Cardiotrofina-1; e em que a referida caracteristica de células cardíacas é demonstrada pela expressão de actina cardíaca como determinada por RT-PCT.
De acordo com outra forma de realização da população de células da presente invenção, as células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma caracteristica de células pancreáticas quando cultivadas em DMEM que compreende 20% de soro de sangue do cordão, 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básico e 2 ng/mL de fator de crescimento transformante beta-1; e em que a referida caracteristica de células pancreáticas é demonstrada pela produção de insulina como determinada pelo ensaio de insulina ou RT-PCR.
Numa forma de realização da população de células da presente invenção, as células estaminais corioamnióticas expressam os referidos genes pelo menos num nível três vezes mais alto que um número equivalente de BM-MSCs. A presente invenção também proporciona um método de produção de uma população de células estaminais corioamnióticas da invenção, que compreende a identificação de células estaminais corioamnióticas aderentes que expressam o gene TCF21 num nível pelo menos duas vezes superior a um número equivalente de células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea que foram cultivadas sob condições equivalentes e sofreram o mesmo número de passagens em cultura que as referidas células estaminais corioamnióticas, e isolando as referidas células estaminais corioamnióticas, em que as referidas células estaminais corioamnióticas são CD200+, CD10+, CD105+ e CD34-; ou CD200+, CD10+, CD105+, CD34-, CD90+ e CD45-.
Dentro dos limites da presente invenção, a referência a células estaminais corioamnióticas da invenção na descrição que se segue implica que essas células expressam o gene TCF21 a um nivel mais alto de forma detetável que um número equivalente de BM-MSCs que sofreram o mesmo número de passagens em cultura que as referidas células estaminais placentárias, e em que as referidas células estaminais placentárias são: (a) CD200+, CD10 + , CD105+, e CD34-; ou (b) CD200 + , CD10+, CD105+, CD34“, CD90+ e CD45-, como definido nas reivindicações.
Assim, são aqui divulgadas células estaminais isoladas, e populações de células que compreendem essas células estaminais, em que as células estaminais estão presentes e podem ser isoladas de tecido placentário (e.g., âmnio, cório, cotilédones placentários, etc.) As células estaminais placentárias exibem uma ou mais caracteristicas de uma célula estaminal (e.g., exibem marcadores associados a células estaminais, replicam pelo menos 10-20 vezes em cultura num estado indiferenciado, diferenciam-se em células adultas representativas das três camadas germinativas, etc.), e podem aderir a um substrato de cultura de tecidos (e.g., plástico de cultura de tecidos tal como a superfície de uma placa ou placa multipoço de cultura de tecidos).
Num aspeto é aqui divulgado uma célula estaminal placentária isolada que é C200+ ou HLA-G+. Noutro aspeto, a referida célula é CD200+ e HLA-G+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD73+ e CD105+. Noutro aspeto de forma de realização específica, a referida célula estaminal é CD34~, CD38~ ou CD45~. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38~ e CD45~. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38~, CD45~, CD73+ e CD105+. Noutro aspeto aqui divulgado, a referida célula estaminal facilita a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide a partir de uma população de células placentárias isoladas que compreende células estaminais placentárias quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide.
Noutro aspeto é aqui divulgada uma população de células placentárias isoladas que compreende, e.g., que está enriquecida em células estaminais CD200+, HLA-G+. Em vários aspetos, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% ou mais das referidas células placentárias isoladas são células estaminais CD200+, HLA-G+. Num aspeto das populações anteriores, as referidas células estaminais são CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34~, CD38~ ou CD45~. Ainda noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34~, CD38", CD45' CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida população foi expandida, e.g., passada pelo menos uma vez, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes ou pelo menos 20 vezes. Noutro aspeto, a referida população forma um ou mais corpos de tipo embrioide quando cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide.
Noutro aspeto é aqui divulgada, uma célula estaminal isolada que é CD73+, CD105+ e CD200+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é HLA-G+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38“ ou CD45~.
Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38~ e CD45-. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38-, CD45- e HLA-G+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal facilita o desenvolvimento de um ou mais corpos de tipo embrioide a partir de uma população de células placentárias isoladas que compreende a célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide.
Noutro aspeto é aqui divulgada uma população de células placentárias isoladas que compreende, e.g., que está enriquecida em células estaminais CD73+, CD105+, CD200+. Em vários aspetos, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 34%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% das referidas células placentárias isoladas são células estaminais CD73+, CD105+, CD200+. Num aspeto das referidas populações, as referidas células estaminais são HLA-G+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34-, CD38‘ ou CD45~. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34~, CD38- e CD45-. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34-, CD38-, CD45“ e HLA-G+. Noutros aspetos, a referida população foi expandida, por exemplo, passada pelo menos uma vez, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, ou pelo menos 20 vezes. Noutro aspeto, a referida população forma um ou mais corpos de tipo embrioide em cultura sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. É também aqui divulgada uma célula estaminal isolada que é C200 + e 0CT-4+. Num aspeto, a célula estaminal é CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é HLA-G+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38- ou CD45". Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38- e CD45". Num outro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38~, CD45~, CD73+, CD105+ e HLA-G+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal facilita a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide a partir de uma população de células placentárias isoladas que compreende células estaminais placentárias quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide.
Noutro aspeto, é aqui divulgada uma população de células isoladas que compreende, e.g., que está enriquecida em células estaminais CD200+ 0CT-4+. Em vários aspetos, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% das referidas células placentárias isoladas são células estaminais CD200 + , OCT-4+. Num aspeto das populações anteriores, as referidas células estaminais são CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são HLA-G+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34-, CD38~ e CD45". Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34", CD38", CD45", CD73+, CD105+ e HLA-G+. Noutros aspetos, a referida população foi expandida, por exemplo, foi passada pelo menos uma vez, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes ou pelo menos 20 vezes. Noutro aspeto, a referida população forma um ou mais corpos de tipo embrioide quando cultivadas sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide.
Noutro aspeto, é aqui divulqada uma célula estaminal isolada que é CD73+ e CD105+ e que facilita a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias isoladas que compreende a referida célula estaminal, quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Num um aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38~ ou CD45~. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38- e CD45-. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é OCT4+. Ainda noutro aspeto, a referida célula estaminal é OCT4+, CD34-, CD38~ e CD45-.
Além disso, é aqui divulqada uma população de células placentárias isoladas que compreende, e.q., que está enriquecida em células estaminais CD73+, CD105+, em que a referida população forma um ou mais corpos de tipo embrioide sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Em várias formas de realização, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% das referidas células placentárias isoladas são células estaminais CD73+, CD105+. Num aspeto das populações anteriores, as referidas células estaminais são CD34~, CD38~ ou CD45-. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34~, CD38" e CD45". Noutro aspeto, as referidas células estaminais são 0CT-4+. Num outro aspeto, as referidas células estaminais são OCT-4+, CD34-, CD38~ e CD45". Noutros aspetos, a referida população foi expandida, por exemplo, foi passada pelo menos uma vez, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes ou pelo menos 20 vezes. É também aqui divulgada uma célula estaminal isolada que é CD73+, CD105+ e HLA-G+. Num aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, CD38~ ou CD45~. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38- e CD45-. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é OCT-4+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD200+. Num outro aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ e CD200 + . Noutro aspeto, a referida célula estaminal facilita a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide a partir de uma população de células placentárias isoladas que compreende células estaminais placentárias em cultura sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. É também aqui divulgada uma população de células placentárias isoladas que compreende, e.g., que está enriquecida em células estaminais CD73+, CD105+ e HLA-G+. Em vários aspetos, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% das referidas células placentárias isoladas são células estaminais CD73+, CD105+ e HLA-G+. Noutro aspeto das populações anteriores, as referidas células estaminais são CD34-, CD38‘ ou CD45~. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34-, CD38~ e CD45-. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são OCT-4+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD200+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34-, CD38~, CD45-, OCT-4+ e CD200+. Noutro aspeto, a referida população foi expandida, por exemplo, foi passada pelo menos uma vez, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes ou pelo menos 20 vezes. Noutro aspeto, a referida população forma corpos de tipo embrioide quando cultivadas sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide.
Além disso, é aqui divulgada uma célula estaminal isolada que é OCT-4+ e que facilita a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias isoladas que compreende a referida célula estaminal quando cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Num aspeto, a referida célula estaminal é CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38~ ou CD45~. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD200+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38- e CD45-. É também aqui divulgada uma população de células isoladas que compreende, e.g., que está enriquecida em células estaminais placentárias 0CT-4+, em que a referida população forma um ou mais corpos de tipo embrioide quando cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Em vários aspetos, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das referidas células placentárias isoladas são células estaminais placentárias OCT4+. Num aspeto das populações anteriores, as referidas células estaminais são CD73 e CD105+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34-, CD38- ou CD45-. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD200+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD73+, CD105+, CD200+, CD34~, CD38~ e CD45“. Noutro aspeto, a referida população foi expandida, por exemplo, passada pelo menos uma vez, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes ou pelo menos 20 vezes. É também aqui divulgada uma população isolada das células estaminais placentárias aqui descritas que é produzida de acordo com um método que compreende perfundir uma placenta de mamífero que foi drenada de sangue do cordão e perfundida para remover sangue residual; perfundir a referida placenta com uma solução de perfusão; e recolher a referida solução de perfusão, em que a referida solução de perfusão após a perfusão compreende uma população de células placentárias que compreende células estaminais placentárias; e isolar uma multiplicidade das referidas células estaminais placentárias da referida população de células. Num aspeto, a solução de perfusão é feita passar através tanto da veia umbilical como das artérias umbilicais e recolhida depois de exsudar da placenta. Noutro aspeto, a solução de perfusão é feita passar através da veia umbilical e recolhida das artérias umbilicais, ou feita passar através das artérias umbilicais e recolhida da veia umbilical. A invenção proporciona ainda uma população isolada das células estaminais placentárias aqui descritas que é produzida de acordo com um método que compreende digerir tecido placentário com uma enzima disruptora de tecidos para obter uma população de células placentárias que compreende células estaminais placentárias, e isolar uma multiplicidade de células estaminais placentárias do resto das referidas células placentárias. Em formas de realização especificas, o referido tecido placentário é uma placenta inteira, uma membrana amniótica, cório, uma combinação de âmnio e cório, ou uma combinação de qualquer um dos anteriores. Noutra forma de realização especifica, a enzima disruptora de tecidos é tripsina ou colagenase.
Nalguns casos as células estaminais isoladas anteriores expressam um ou mais genes a um nível mais alto de forma detetável que uma célula estaminal mesenquimatosa derivada de medula óssea, em que o referido um ou mais genes são selecionados do grupo que consiste em ACTG2, ADARBl, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, C0L4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, EL0VL2, F2RL1, FLJl0781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAMl, IER3, IGFBP7, ILlA, IL6, IL18, KRTl8, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAKl, PCDH7, PDLIM3, PJP2, RTNl, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN e ZC3H12A, e em que a referida célula estaminal derivada de medula óssea sofreu um número de passagens em cultura equivalente ao número de passagens que sofreu a referida célula estaminal placentária. As sequências correspondentes a estes genes encontram-se nas matrizes GENECHIP® de Affymetrix. Estes genes podem ser também encontrados nos n.° de acesso do GenBank NM_001615 (ACTG2), BC065545 (ADARBl), (NM_181847 (AMIG02), AY3S8590 (ARTS-1), BC074884 (B4GALT6), BC008396 (BCHE), BC020196 (Cllorf9), BC031103 (CD200), NM_0 0184 5 (COL4A1), NM_001846 (COL4A2), BC052289 (CPA4), BC094758 (DMD), AF293359 (DSC3), NM_001943 (DSG2) , AF338241 (ELOVL2), AY336105 (F2RL1), NM_018215 (FLJ10781), AY 416 7 9 9 (GATA6), BC075798 (GPR126), NM_016235 (GPRC5B), AF340038 (ICAMl), BC000844 (IER3), BC066339 (IGFBP7), BC013142 (ILlA), BT019749 (IL6), BC007461 (IL18), (BC072017) KRTl8, BC075839 (KRT8), BC060825 (LIPG), BC065240 (LRAP), BC010444 (MATN2), BC011908 (MEST), BC068455 (NFE2L3), NM_014840 (NUAKl), AB006755 (PCDH7), NM_014476 (PDLIM3), BC126199 (PKP-2), BC090862 (RTNl), BC002538 (SERPINB9), BC023312 (ST3GAL6), BC001201 (ST6GALNAC5), BC126160 ou BC065328 (SLC12A8), BC025697 (TCF21), BC096235 (TGFB2), BC005046 (VTN), e BC005001 (ZC3H12A) a partir de dezembro de 2006.
Num aspeto, a referida célula estaminal expressa ACTG2, ADARBl, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAMl, IER3, IGFBP7, ILIA, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAKl, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTNl, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN e ZC3H12A a um nivel mais alto de forma detetável que uma célula estaminal mesenquimatosa derivada de medula óssea.
Noutro aspeto, é aqui divulgada qualquer uma das populações de células estaminais isoladas anteriores, em que as referidas células estaminais expressam um ou mais genes a um nivel mais alto de forma detetável que uma população de células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea, em que o referido um ou mais genes são selecionados do grupo que consiste em ACTG2, ADARBl, AMIG02, ARTS-1, B4GALT 6, BCHE, Cllorf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAMl, IER3, IGFBP7, ILIA, IL6, ILl8, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAKl, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTNl, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN e ZC3H12A, e em que a referida população de células estaminais derivadas de medula óssea sofreu um número de passagens em cultura equivalente ao número de passagens que sofreu a referida célula estaminal placentária, e em que a referida população de células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea tem um número de células equivalente à referida população de células estaminais isoladas. Num aspeto, a população de células estaminais isoladas expressa ACTG2, ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, C0L4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, EL0VL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAMl, IER3, IGFBP7, ILlA, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAKl, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTNl, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN e ZC3H12A a um nivel mais alto de forma detetável que a referida população de células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea isoladas.
Nalguns aspetos dos métodos de seleção de populações de células, são aqui divulgados métodos de seleção de uma das populações de células supramencionadas, que compreendem selecionar células que expressam um ou mais genes a um nivel mais alto de forma detetável que uma célula estaminal mesenquimatosa derivada de medula óssea, em que o referido um ou mais genes são selecionados do grupo que consiste em ACTG2, ADARBl, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, C0L4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, EL0VL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAMl, IER3, IGFBP7, ILIA, IL6, IL18, KRTI18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAKl, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN 1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN e ZC3H12A, e em que a referida célula estaminal derivada de medula óssea sofreu um número de passagens em cultura equivalente ao número de passagens que sofreu a referida célula estaminal placentária. Num aspeto, a referida seleção compreende selecionar células que expressam ACTG2, ADARBl, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, C0L4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, EL0VL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAMl, IER3, IGFBP7, ILlA, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAKl, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTNl, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN e ZC3H12A a um nivel mais alto de forma detetável que uma célula estaminal mesenquimatosa derivada de medula óssea. São aqui divulgadas composições que compreendem uma ou mais das células estaminais da invenção, em que a célula estaminal foi isolada a partir da placenta. É também aqui divulgada uma composição que compreende uma célula estaminal, em que a referida célula estaminal é CD200+ e HLA-G+. Num aspeto, a referida célula estaminal é CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, CD38- ou CD45~. Noutro aspeto a referida célula estaminal é CD34-, CD38‘ e CD45“. Num aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, CD38“, CD45~, CD73+, CD105+, CD200+ e HLA-G+. É aqui também divulgada uma composição que compreende uma célula estaminal, em que a referida célula estaminal é CD73 + , CD105+ e CD200+. Num aspeto, a referida célula estaminal é HLA-G+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34“, CD38" ou CD45". Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, C38- e CD45-. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38“, CD45~ e HLA-G+.
Noutro aspeto, é aqui divulgada uma composição que compreende uma célula estaminal, em que a referida célula estaminal é C200+ e 0CT-4+. Num aspeto, a referida célula estaminal é CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é HLA-G+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, CD38- ou CD45~. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, CD38~ e CD45-. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ e HLA-G+.
Noutro aspeto, é aqui divulgada uma composição que compreende uma célula estaminal que é CD73+ e CD105+, em que a referida célula estaminal facilita a formação de um corpo de tipo embrioide numa população de células placentárias isoladas que compreende a referida célula estaminal sob condições que permitem a formação de um corpo de tipo embrioide. Num aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38" ou CD45-. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é 0CT-4+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD200+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é 0CT-4 + , CD200 + , CD34-, CD38‘ e CD45-.
Ainda noutro aspeto, é aqui divulgada uma composição que compreende uma célula estaminal que é CD73+, CD105+ e HLA-G+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, CD38- ou CD45". Noutro aspeto a referida célula estaminal é 0CT-4+. Noutro aspeto a referida célula estaminal é CD200+. Noutro aspeto a referida célula estaminal é 0CT-4 + , CD200 + , CD34~, CD38- e CD45~. É também aqui divulgada uma composição que compreende uma célula estaminal que é 0CT-4+, em que a referida célula estaminal facilita a formação de um corpo de tipo embrioide numa população de células placentárias isoladas que compreende a referida célula estaminal sob condições que permitem a formação de um corpo de tipo embrioide. Numa forma de realização especifica, a referida célula estaminal é CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38~ e CD45-. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD200+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38- e CD45“.
Noutro aspeto das composições divulgadas, a referida célula estaminal expressa um ou mais genes a um nivel mais alto de forma detetável que uma célula estaminal mesenquimatosa derivada de medula óssea, em que o referido um ou mais genes são selecionados do grupo que consiste em ACTG2, ADARB 1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, C0L4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, EL0VL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAMl, IER3, IGFBP7, ILIA, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAKl, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTNl, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN e ZC3H12A, e em que a referida célula estaminal derivada de medula óssea sofreu um número de passagens em cultura equivalente ao número de passagens que sofreu a referida célula estaminal placentária. Noutro aspeto das composições anteriores, as referidas células estaminais expressam ACTG2, ADARBl, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, C0L4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, EL0VL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAMl, IER3, IGFBP7, ILIA, IL6, IL18, KRTl8, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAKl, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTNl, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN e ZC3H12A a um nivel mais alto de forma detetável que uma população de células estaminais mesenquimatosas derivadas de medula óssea isoladas, em que a referida população de células estaminais e a referida população de células mesenquimatosas derivadas de medula óssea têm números equivalentes de células.
Noutro aspeto, qualquer uma das composições anteriores compreendem uma matriz. Num aspeto mais específico, a referida matriz é uma estrutura tridimensional. Noutro aspeto, a referida matriz compreende colagénio, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina ou vitronectina. Noutro aspeto, a matriz é uma membrana amniótica ou um biomaterial derivado da membrana amniótica. Noutro aspeto mais específico, a referida matriz compreende uma proteína da membrana extracelular. Noutro aspeto mais específico, a referida matriz compreende um composto sintético. Noutro aspeto mais especifico, a referida matriz compreende um composto bioativo. Noutro aspeto mais especifico, o referido composto bioativo é um fator de crescimento, citocina, anticorpo ou molécula orgânica inferior a 5 000 daltons.
Noutro aspeto, é aqui divulgada uma composição que compreende meio condicionado por qualquer uma das células estaminais anteriores, ou qualquer uma das populações de células estaminais anteriores. Qualquer composição desse tipo pode compreender uma célula estaminal que não é derivada de uma placenta tal como uma célula estaminal mesenquimatosa, uma célula estaminal derivada de medula óssea, uma célula progenitora hematopoiética, uma célula estaminal somática. Noutro aspeto, a referida célula estaminal somática é uma célula estaminal nervosa, uma célula estaminal hepática, uma célula estaminal pancreática, uma célula estaminal endotelial, uma célula estaminal cardíaca ou uma célula estaminal muscular. São também aqui divulgados métodos de produção de populações de células estaminais derivadas de placenta de mamífero. Num aspeto, por exemplo, é aqui divulgado um método de produção de uma população de células que compreende selecionar células que (a) aderem a um substrato, e (b) expressam CD200 e HLA-G; e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, é aqui divulgado um método de produção de uma população de células, que compreende selecionar células que (a) aderem a um substrato, e (b) expressam CD73, CD105 e CD200; e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, é aqui divulgado um método de produção de uma população de células, que compreende selecionar células que (a) aderem a um substrato e (b) expressam CD200 e OCT-4; e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Ainda noutro aspeto, é aqui divulgado um método de produção de uma população de células, que compreende selecionar células que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD73 e CD105, e (c) facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide quando cultivadas com uma população de células placentárias sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide; e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, é aqui divulgado um método de produção de uma população de células, que compreende selecionar células que (a) aderem a um substrato, e (b) expressam CD73 CD105 e HLA-G; e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. A divulgação também descreve um método de produção de uma população de células, que compreende selecionar células que (a) aderem a um substrato, (b) expressam OCT-4, e (c) facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide quando cultivadas com uma população de células placentárias sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide; e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Num aspeto de qualquer um dos métodos anteriores, o referido substrato compreende fibronectina. Os métodos podem compreender ainda a seleção de células que expressam ABC-p. Noutro aspeto, os métodos compreendem selecionar células que apresentam pelo menos uma característica específica a uma célula estaminal mesenquimatosa. A referida característica específica a uma célula estaminal mesenquimatosa é a expressão de CD29, expressão de CD44, expressão de CD90 ou expressão de uma combinação das anteriores. Alternativamente, a referida seleção é conseguida utilizando um anticorpo ou citometria de fluxo, ou esférulas magnéticas, ou separação de células ativadas por fluorescência. A referida população de células pode ser também expandida.
Uma linha de células estaminais pode ser produzida por um método que compreende transformar uma célula estaminal com uma sequência de ADN que codifica uma proteína promotora do crescimento; e expor a referida célula estaminal a condições que promovem a produção da referida proteína promotora do crescimento. A referida proteína promotora do crescimento pode ser v-myc, N-myc, c-myc, p53, antigénio T grande de SV40, antigénio T grande de polioma, proteína E7 do papilomavírus humano ou adenovírus Ela. A referida sequência de ADN pode ser regulável. Mais especificamente, a referida sequência de ADN é regulável por tetraciclina. A referida proteína promotora do crescimento tem uma atividade regulável. Especificamente, a referida proteína promotora do crescimento pode ser um mutante sensível à temperatura. São aqui divulgadas populações de células estaminais crioconservadas. Por exemplo, é aqui divulgada uma população de células estaminais CD200+, HLA-G+, em que as referidas células foram crioconservadas, e em que a referida população está contida num recipiente. Mais ainda, é aqui divulgada uma população de células estaminais CD73+, CD105+, CD200+, em que as referidas células estaminais foram crioconservadas, e em que a referida população está contida num recipiente. Da mesma forma, é aqui divulgada uma população de células estaminais CD200+, 0CT-4+, em que as referidas células estaminais foram crioconservadas, e em que a referida população está contida num recipiente. E aqui divulgada uma população de células estaminais CD73+, CD105+, em que as referidas células foram crioconservadas, e em que a referida população está contida num recipiente, e em que as referidas células estaminais facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide quando cultivadas com uma população de células placentárias sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Noutro aspeto, é aqui divulgada uma população de células estaminais CD73+, CD105+, HLA-G+, em que as referidas células foram crioconservadas, e em que a referida população está contida num recipiente. É aqui divulgado também uma população de células estaminais OCT-4+, em que as referidas células foram crioconservadas, em que a referida população está contida num recipiente, e em que as referidas células estaminais facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide quando cultivadas com uma população de células placentárias sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Num aspeto de qualquer uma das populações crioconservadas anteriores, o referido recipiente é um saco. Em vários aspetos, a referida população compreende cerca de, pelo menos, ou no máximo 1 x 106 das referidas células estaminais, 5 x 106 das referidas células estaminais, 1 x 107 das referidas células estaminais, 5 x 107 das referidas células estaminais, 1 x 108 das referidas células estaminais, 5 x 108 das referidas células estaminais, 1 x 109 das referidas células estaminais, 5 x 109 das referidas células estaminais, ou 1 x 1010 das referidas células estaminais. Noutros aspetos de qualquer uma das populações crioconservadas anteriores, as referidas células estaminais foram passadas cerca de, pelo menos, ou não mais do que 5 vezes, não mais do que 10 vezes, não mais do que 15 vezes, ou não mais do que 20 vezes. Noutro aspeto de qualquer uma das populações crioconservadas anteriores, as referidas células estaminais foram expandidas dentro do referido recipiente.
3.1 DEFINIÇÕES
Como aqui utilizado, o termo "SH2" refere-se a um anticorpo que liga um epítopo no marcador CD105. Assim, as células que são referidas como SH2+ são CD105+.
Como aqui utilizados, os termos "SH3" e SH4" referem-se a anticorpos que ligam epítopos presentes no marcador CD73. Assim, as células que são referidas como SH3+ e/ou SH4 + são CD73+.
Como aqui utilizado, o termo "célula estaminal isolada" significa uma célula estaminal que está substancialmente separada de outras células não estaminais do tecido, e.g., placenta, a partir da qual a célula estaminal é proveniente. Uma célula estaminal está "isolada" se pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou pelo menos 99% das células não estaminais com as quais a célula estaminal está naturalmente associada, ou células estaminais que apresentam um perfil de marcadores diferente, são removidas da célula estaminal, e.g., durante a colheita e/ou cultura da célula estaminal.
Como aqui utilizado, o termo "população de células isoladas" significa uma população de células que está substancialmente separada de outras células do tecido, e.g., placenta, do qual a população de células é proveniente. Uma célula estaminal está "isolada" se pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou pelo menos 99% das células com as quais a população de células, ou células das quais as populações de células são provenientes, está naturalmente associada, i.e., células estaminais que apresentam um perfil de marcadores diferente, são removidas da célula estaminal, e.g., durante a colheita e/ou cultura da célula estaminal.
Como aqui utilizado, o termo "célula estaminal placentária" refere-se a uma célula estaminal ou célula progenitora que é proveniente de uma placenta de mamífero, independentemente da morfologia, marcadores da superfície celular ou do número de passagens depois de uma cultura primária. 0 termo "célula estaminal placentária" como aqui utilizado não se refere, contudo, a um trofoblasto. Uma célula é considerada uma "célula estaminal" se a célula conservar pelo menos um atributo de uma célula estaminal, e.g., um perfil de marcadores ou expressão de genes associado a um ou mais tipos de células estaminais; a capacidade para se replicar pelo menos 10-40 vezes em cultura, a capacidade para diferenciar-se em células de todas as três camadas germinativas; a ausência de características de células adultas (i.e., diferenciadas), ou semelhantes. Os termos "célula estaminal placentária" e "célula estaminal derivada da placenta" podem ser utilizados indistintamente.
Como aqui utilizado, uma célula estaminal é "positiva" para um marcador particular quando esse marcador pode ser detetado acima do valor de base. Por exemplo, uma célula estaminal placentária é positiva para, e.g., CD73, porque o CD73 pode ser detetado nas células estaminais placentárias numa quantidade superior ao valor de base de forma detetável (em comparação com, e.g., um controlo de isotipo). Uma célula é também positiva para um marcador quando esse marcador pode ser utilizado para distinguir a célula de pelo menos um outro tipo de células, ou pode ser utilizado para selecionar ou isolar a célula quando presente ou expressada pela célula. No contexto, e.g., da deteção mediada por anticorpos, "positiva," como uma indicação de que está presente um marcador particular na superfície celular, significa que o marcador pode ser detetado utilizando um anticorpo, e.g., um anticorpo marcado de forma fluorescente, especifico para esse marcador; "positiva" significa também que uma célula tem esse marcador numa quantidade que produz um sinal, e.g., num citómetro, que está acima do valor de base de forma detetável. Por exemplo, uma célula é "CD200+" quando a célula é marcada de forma detetável com um anticorpo especifico contra CD200, e o sinal do anticorpo é superior de forma detetável a um controlo (e.g., valor de base). Reciprocamente, "negativa" no mesmo contexto significa que o marcador da superfície celular não pode ser detetado utilizando um anticorpo específico para esse marcador em comparação com o valor de base. Por exemplo, uma célula é "CD34~" quando a célula não é marcada de forma detetável com um anticorpo específico contra CD34. Salvo disposição em contrário neste documento, os marcadores de agregados de diferenciação ("CD") são detetados utilizando anticorpos. OCT-4 é determinado como estando presente, e uma célula é "0CT-4+" se o OCT-4 puder ser detetado utilizando RT-PCR.
4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIG. 1: Viabilidade de células estaminais placentárias de perfusão (A), âmnio (B), cório (C), placa corioamniótica (D) ou cordão umbilical (E) . Os números no eixo dos X designam a placenta a partir da qual foram obtidas as células estaminais. FIG. 2: Percentagem de células HLA ABC~/CD45_ /CD34~/CD133+ de perfusão (A), âmnio (B) , cório (C) , placa corioamniótica (D) ou cordão umbilical (E) como determinada por FACSCalibur. Os números no eixo dos X designam a placenta a partir da qual foram obtidas as células estaminais. FIG. 3: Percentagem de células HLA ABC~/CD45~ /CD34~/CD133+ de perfusão (A), âmnio (B) , cório (C) , placa corioamniótica (D) ou cordão umbilical (E), como determinada por FACS Aria. Os números no eixo dos X designam a placenta a partir da qual foram obtidas as células estaminais. FIG. 4: Expressão de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 em células estaminais derivadas de perfusato placentário. FIG. 5: Expressão de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 em células estaminais derivadas do âmnio. FIG. 6: Expressão de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 em células estaminais derivadas do cório. FIG. 7: Expressão de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 em células estaminais derivadas da placa corioamniótica. FIG. 8: Expressão de HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 em células estaminais derivadas do cordão umbilical. FIG. 9: Expressão média da expressão de HLA-G, CDl0, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 em células estaminais derivadas de perfusão (A) , âmnio (B) , cório (C) , placa corioamniótica (D) ou cordão umbilical (E) . FIG. 10: Cursos de tempo de cultura para linhas de células do âmnio/cório (AC), cordão umbilical (UC) , células estaminais derivadas de medula óssea (BM-MSC) e fibroblastos dérmicos humanos (NHDF) utilizadas neste estudo. Todas as culturas foram cultivadas e propagadas utilizando as mesmas densidades de inoculação e passagem. Os círculos indicam que culturas foram utilizadas para isolamento de ARN. As culturas tardias foram colhidas imediatamente antes da senescência. Foram colhidas duas culturas de UC a 38 duplicações (UC-38) para comparar o efeito da tripsinização sobre a expressão de genes. Todas as outras culturas foram sujeitas a lise diretamente nos seus balões de cultura antes do isolamento do ARN. FIG. 11: Gráfico de linhas de níveis de expressão relativos de 8215 genes em células do âmnio/cório (AC) , cordão umbilical (UC), células estaminais derivadas de medula óssea (BM-MSC) e fibroblastos dérmicos humanos (DF). 0 número associado a cada designação de linha de células no eixo dos X indica o número de dias que a linha de células foi cultivada antes da avaliação dos níveis de expressão dos genes. 0 gráfico foi gerado a partir dos dados de expressão de ARN analisados pelo software GeneSpring. AC-03 foi utilizada como a condição selecionada. FIG. 12: Subconjunto de toda a lista de genes que apresenta genes sobreexpressados ^ 6 vezes em AC-03 para as células do âmnio/cório (AC), cordão umbilical (UC), células estaminais derivadas de medula óssea (BM-MSC) e fibroblastos dérmicos humanos (DF) . 0 número associado a cada designação de linha de células no eixo dos X indica o número de dias que a linha de células foi cultivada antes da avaliação dos níveis de expressão dos genes. 0 gráfico foi gerado a partir dos dados de expressão de ARN analisados pelo software GeneSpring. AC-03 foi utilizada como a condição selecionada. FIG. 13: Genes específicos de células estaminais placentárias ou específicos de células estaminais do cordão umbilical encontrados por filtração do número de vezes de alteração para células do âmnio/cório (AC), cordão umbilical (UC), células estaminais derivadas de medula óssea (BM-MSC) e fibroblastos dérmicos humanos (DF). 0 número associado a cada designação de linhas de células no eixo dos X indica o número de dias que a linha de células foi cultivada antes da avaliação dos níveis de expressão dos genes. 0 gráfico foi gerado a partir dos dados de expressão de ARN analisados pelo software GeneSpring. AC-03 foi utilizada como a condição selecionada.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Especificamente, a presente invenção proporciona uma população de células estaminais corioamnióticas aderentes isoladas, em que as células estaminais corioamnióticas expressam o gene TCF21 a um nível pelo menos duas vezes superior a um número equivalente de BM-MSCs que foram cultivadas sob condições equivalentes e sofreram o mesmo número de passagens em cultura que as referidas células estaminais corioamnióticas, e em que as referidas células estaminais corioamnióticas são: (a) CD200 + , CD10 + , CD105+ e CD34“; ou (b) CD200 + , CD10 + , CD105+, CD34-, CD90 + e CD45“.
De acordo com uma forma de realização da população de células da presente invenção, pelo menos 90% ou pelo menos 99% das células estaminais corioamnióticas são de origem não materna. Noutra forma de realização, as células estão numa forma adequada para administração intravenosa. Ainda noutra forma de realização da presente invenção, as células têm a capacidade para diferenciar-se em células com caracteristicas de células neuronais, células adipogénicas, células pancreáticas ou células cardíacas.
Noutra forma de realização da presente invenção, as células estaminais placentárias expressam o referido gene a um nível mais alto de forma detetável que um número equivalente de BM-MSCs ao longo de 3, ao longo de 11-14, ou ao longo de 24-38 duplicações da população. Além disso, numa forma de realização a população de células compreende pelo menos 1 x 108 ou pelo menos 1 x 109 células. Noutra forma de realização, a população de células sofreu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ou 40, ou mais, duplicações da população. Ainda noutra forma de realização, as células estaminais corioamnióticas têm a capacidade para se replicar 10 a 40 vezes em cultura. Noutra forma de realização, as células estaminais corioamnióticas foram passadas 5 a 10 vezes.
De acordo com uma forma de realização da população de células da presente invenção, as células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma característica de células condrogénicas quando cultivadas em DMEM que compreende 15% de soro de sangue do cordão e 0,01 yg/mL de fator de crescimento transformante beta-3 (TGFp3); e em que a referida característica de células condrogénicas é a revelação positiva com corante Azul de Alciano.
De acordo com outra forma de realização da população de células da presente invenção, as células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma característica de células osteogénicas quando cultivadas em DMEM que compreende 15% de soro de sangue do cordão, dexametasona 0,1 μΜ, ácido ascórbico-2-fosfato 0,05 mM, e beta-glicerofosfato 10 mM; e em que a referida caracteristica de células osteogénicas é demonstrada pela revelação com corante de von Kossa ou produção de ARNm para fosfatase alcalina como determinada por RT-PCR.
De acordo com outra forma de realização da população de células da presente invenção, as células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma caracteristica de células adipogénicas quando cultivadas em: (i) DMEM ou MCDB-2 01 que compreende 2% de soro fetal de vitelo, 0,5% de hidrocortisona, isobutilmetilxantina (IBMX) 0,5 mM e indometacina 60 μΜ; ou (ii) DMEM ou MCDB-201 que compreende 2% de soro fetal de vitelo e 0,5% de ácido linoleico; e em que a referida caracteristica de células adipogénicas é demonstrada pela revelação com óleo de revelação lipófilo vermelho O ou expressão de lipase ou proteína de ligação de ácidos gordos como determinada por RT-PCR.
De acordo com ainda outra forma de realização da população de células da presente invenção, as células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma característica de células cardíacas quando cultivadas em: (1) DMEM que compreende 2 0% de soro de sangue do cordão, ácido retinoico 1 μΜ, 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básico, 2 ng/mL de fator de crescimento transformante beta-1 e 100 ng/mL de fator de crescimento epidérmico; ou (ii) DMEM que compreende 20% de soro de sangue do cordão e 50 ng/mL de Cardiotrofina-1; e em que a referida característica de células cardíacas é demonstrada pela expressão de actina cardíaca como determinada por RT-PCT.
De acordo com outra forma de realização da população de células da presente invenção, as células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma característica de células pancreáticas quando cultivadas em DMEM que compreende 20% de soro de sangue do cordão, 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básico e 2 ng/mL de fator de crescimento transformante beta-1; e em que a referida caracteristica de células pancreáticas é demonstrada pela produção de insulina como determinada pelo ensaio de insulina ou RT-PCR.
Numa forma de realização da população de células da presente invenção, as células estaminais corioamnióticas expressam os referidos genes pelo menos a um nível três vezes mais alto que um número equivalente de BM-MSCs. A presente invenção também proporciona um método de produção de uma população de células estaminais corioamnióticas da invenção, que compreende identificar células estaminais corioamnióticas aderentes que expressam o gene TCF21 a um nivel pelo menos duas vezes superior a um número equivalente de células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea que foram cultivadas sob condições equivalentes e sofreram o mesmo número de passagens em cultura que as referidas células estaminais corioamnióticas, e isolar as referidas células estaminais corioamnióticas, em que as referidas células estaminais corioamnióticas são CD200+, CD10+, CD105+ e CD34-; ou CD200+, CD10+, CD105+, CD34-, CD90+ e CD45-.
Dentro dos limites da presente invenção, a referência a células estaminais corioamnióticas da invenção na descrição que se segue implica que essas células expressam o gene TCF21 a um nivel mais alto de forma detetável que um número equivalente de BM-MSCs que sofreram o mesmo número de passagens em cultura que as referidas células estaminais placentárias, e em que as referidas células estaminais placentárias são: (a) CD200+, CD10+, CD105+ e CD34-; ou (b) CD200+, CD10+, CD105+, CD34~, CD90+ e CD45~, como definido nas reivindicações.
5.1 CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS E POPULAÇÕES DE CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS
As células estaminais placentárias são células estaminais, que podem ser obtidas de uma placenta ou parte da mesma, que aderem a um substrato de cultura de tecidos e têm a capacidade para diferenciar-se em tipos de células não placentárias. As células estaminais placentárias podem ser de origem fetal ou materna (isto é, podem ter o genótipo do feto ou da mãe, respetivamente) . Preferencialmente, as células estaminais placentárias e as populações de células estaminais placentárias da invenção são de origem fetal. As populações de células estaminais placentárias ou populações de células que compreendem células estaminais placentárias podem compreender células estaminais placentárias que são exclusivamente de origem fetal ou materna, ou podem compreender uma população mista de células estaminais placentárias de origem fetal e materna. As células estaminais placentárias e as populações de células que compreendem as células estaminais placentárias podem ser identificadas e selecionadas pelas caracteristicas morfológicas, de marcadores e cultura que se discute a seguir. 5.1.1 Caracteristicas Físicas e Morfológicas
As células estaminais placentárias da presente invenção, quando cultivadas em culturas primárias ou em culturas de células, aderem ao substrato de cultura de tecidos, e.g., superfície do recipiente da cultura de tecidos (e.g., plástico de cultura de tecidos). As células estaminais placentárias em cultura assumem um aspeto geralmente fibroblastoide em estrela, com um número de processos citoplasmáticos que se prolongam a partir do corpo celular central. No entanto, as células estaminais placentárias podem ser diferenciadas morfologicamente dos fibroblastos cultivados nas mesmas condições, já que as células estaminais placentárias exibem um maior número desses processos que os fibroblastos. Morfologicamente, as células estaminais placentárias podem ser também diferenciadas das células estaminais hematopoiéticas, as quais assumem geralmente uma morfologia mais arredondada, ou paralelepipédica, em cultura. 5.1.2 Marcadores da Superfície Celular, Moleculares e Genéticos
As células estaminais placentárias aqui divulgadas, e as populações de células estaminais placentárias, expressam uma multiplicidade de marcadores que podem ser utilizados para identificar e/ou isolar as células estaminais, ou populações de células que compreendem as células estaminais. As células estaminais placentárias, e populações de células estaminais aqui divulgadas (isto é, duas ou mais células estaminais placentárias) incluem células estaminais e populações de células que contêm células estaminais obtidas diretamente da placenta, ou qualquer parte da mesma (e.g., âmnio, cório, cotilédones placentários e semelhantes) . As populações de células estaminais placentárias incluem também populações de (isto é, duas ou mais) células estaminais placentárias em cultura, e uma população num recipiente, e.g., um saco. As células estaminais placentárias não são, contudo, trofoblastos.
As células estaminais placentárias aqui divulgadas expressam geralmente os marcadores CD73, CD105, CD200, HLA-G e/ou OCT-4, e não expressam CD34, CD38 ou CD45. As células estaminais placentárias podem expressar também HLA-ABC (MHC-1) e HLA-DR. Estes marcadores podem ser utilizados para identificar células estaminais placentárias e para distinguir as células estaminais placentárias de outros tipos de células estaminais. Uma vez que as células estaminais placentárias podem expressar CD73 e CD105, elas podem ter caracteristicas semelhantes a células estaminais mesenquimatosas. No entanto, uma vez que as células estaminais placentárias podem expressar CD200 e HLA-G, um marcador especifico fetal, podem ser distinguidas das células estaminais mesenquimatosas, e.g., células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea, que não expressam CD200 nem HLA-G. Da mesma maneira, a ausência de expressão de CD34, CD38 e/ou CD45 identifica as células estaminais placentárias como células estaminais não hematopoiéticas.
Assim, num aspeto, é aqui divulgada uma célula estaminal isolada que é CD200+ ou HLA-G+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é uma célula estaminal placentária. Num aspeto a célula estaminal é CD200+ e HLA- G+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, CD38~ ou CD45-. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38" e CD45". Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38", CD45“, CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal CD200+ ou HLA-G+ facilita a formação de corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende as células estaminais, sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária é separada das células placentárias que não sejam células estaminais. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estes marcadores. É também aqui divulgado um método de seleção de uma célula estaminal placentária a partir de uma multiplicidade de células placentárias, que compreende selecionar uma célula placentária CD200+ ou HLA-G+, pelo que a referida célula é uma célula estaminal placentária. Num aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é CD200+ e HLA-G+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD34~, CD38~ ou CD45~. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD34~, CD38~ e CD45". Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD34~, CD38~, CD45-, CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que também facilita a formação de corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende as células estaminais, sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide.
Noutro aspeto, é aqui divulgada uma população isolada de células que compreende, e.g., que está enriquecida em células estaminais CD200 + , HLA-G+. Num aspeto, a referida população é uma população de células placentárias. Em vários aspetos, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60% das referidas células são células estaminais CD200 + , HLA-G+. Preferencialmente, pelo menos cerca de 70% das referidas células são células estaminais CD200+, HLA-G+. Mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90%, 95%, ou 99% das referidas células são células estaminais CD200+, HLA-G+. Noutro aspeto das populações isoladas, as referidas células estaminais são também CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são também CD34", CD38~ ou CD45". Noutro aspeto as referidas células estaminais são também CD34~, CD38~, CD45~, CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida população isolada produz um ou mais corpos de tipo embrioide quando cultivadas sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estes marcadores. É também aqui divulgado um método de seleção de uma população de células estaminais placentárias a partir de uma multiplicidade de células placentárias, que compreende selecionar uma população de células placentárias em que pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% das referidas células são células estaminais CD200+, HLA-G+. Num aspeto, a referida seleção compreende selecionar células estaminais que são também CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar células estaminais que são também CD34-, CD38- ou CD45-. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar células estaminais que são também CD34-, CD38-, CD45~, CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida seleção também compreende selecionar uma população de células estaminais placentárias que forma um ou mais corpos de tipo embrioide quando cultivadas sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide.
Noutro aspeto, é aqui divulgada uma célula estaminal isolada que é CD73+, CD105+ e CD200+. Num aspeto, a referida célula estaminal isolada é uma célula estaminal placentária isolada. Noutra forma de realização especifica, a referida célula estaminal é HLA-G+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38- ou CD45~. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, CD38- e CD45~. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, CD38~, CD45- e HLA-G+. Noutro aspeto, a célula estaminal CD73+, CD105+ e CD200+ isolada facilita a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a célula estaminal, quando a população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estes marcadores. É aqui divulgado um método de seleção de uma célula estaminal placentária a partir de uma multiplicidade de células placentárias, que compreende selecionar uma célula placentária CD73+, CD105+ e CD200+, pelo que a referida célula é uma célula estaminal placentária. Num aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também HLA-G+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD34-, CD38~ ou CD45~. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD34-, CD38- e CD45-. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD34~, CD38-, CD45- e HLA-G+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende adicionalmente selecionar uma célula estaminal CD73+, CD105+ e CD200+ que facilita a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a célula estaminal, quando a população é cultivada sob condições que facilitam a formação de corpos de tipo embrioide.
Noutro aspeto, é aqui divulqada uma população isolada de células que compreende, e.g., que está enriquecida em células estaminais CD73+, CD105+, CD200+. Num aspeto, as referidas células estaminais são células estaminais placentárias. Em aspetos, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60% das referidas células são células estaminais CD73+, CD105+, CD200+. Noutro aspeto, pelo menos cerca de 70% das referidas células na referida população de células são células estaminais CD73+, CD105+, CD200+. Noutro aspeto, pelo menos cerca de 90%, 95% ou 99% das referidas células na referida população de células são células estaminais CD73+, CD105 + , CD2 0 0+. Noutro aspeto das referidas populações, as referidas células estaminais são HLA-G+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34~, CD38" ou CD45~. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34~, CD38~ e CD45~. Num outro aspeto, as referidas células estaminais são CD34~, CD38-, CD45“ e HLA- G+. Noutro aspeto, a referida população de células produz um ou mais corpos de tipo embrioide quando cultivadas sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas características.
Além disso, é também aqui divulgado um método de seleção de uma população de células estaminais placentárias a partir de uma multiplicidade de células placentárias, que compreende selecionar uma população de células placentárias em que pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% das referidas células são células estaminais CD73+, CD105+, CD200+. Num aspeto, a referida seleção compreende selecionar células estaminais que são também HLA-G+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar células estaminais que são também CD34~, CD38- ou CD45~. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar células estaminais que são também CD34-, CD38~ e CD45~. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar células estaminais que são também CD34-, CD38~, CD45~ e HLA-G+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar adicionalmente uma população de células placentárias que produz um ou mais corpos de tipo embrioide quando a população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. É também aqui divulgada uma célula estaminal isolada que é CD200+ e 0CT-4+. Num aspeto, a célula estaminal é CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a célula estaminal é uma célula estaminal placentária. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é HLA-G+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, CD38- ou CD45-. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, CD38- e CD45-. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34-, CD38", CD45~, CD73+, CD105+ e HLA-G+. Noutro aspeto, a célula estaminal facilita a produção de um ou mais corpos de tipo embrioide por uma população de células placentárias que compreende a célula estaminal, quando a população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estes marcadores. É também aqui divulgado um método de seleção de uma célula estaminal placentária a partir de uma multiplicidade de células placentárias, que compreende selecionar uma célula placentária CD200+ e 0CT-4 + , pelo que a referida célula é uma célula estaminal placentária. Num aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também HLA-G+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD34~, CD38~ ou CD45~. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD34~, CD38- e CD45". Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD34-, CD38~, CD45“, CD73+, CD105+ e HLA-G+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula estaminal placentária que também facilita a produção de um ou mais corpos de tipo embrioide por uma população de células placentárias que compreende a célula estaminal, quando a população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. É também aqui divulgada uma população isolada de células que compreende, e.g., que está enriquecida em células estaminais CD200+, 0CT-4+. Em vários aspetos pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 60% das referidas células são células estaminais CD200 + , OCT-4+. Noutro aspeto, pelo menos cerca de 70% das referidas células são as referidas células estaminais CD200+, 0CT-4+. Noutro aspeto, pelo menos cerca de 90%, 95% ou 99% das referidas células são as referidas células estaminais CD200+, OCT-4+. Noutro aspeto das populações isoladas, as referidas células estaminais são CD7 3+ e CD105+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são HLA-G+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34~, CD38~ e CD45-. Ainda noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34-, CD38~, CD45~, CD73+, CD105+ e HLA-G+. Noutro aspeto, a população produz um ou mais corpos de tipo embrioide quando cultivadas sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas caracteristicas. É aqui divulgado um método de seleção de uma população de células estaminais placentárias a partir de uma multiplicidade de células placentárias, que compreende selecionar uma população de células placentárias em que pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50% pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% das referidas células são células estaminais CD200 + , OCT-4+. Num aspeto, a referida seleção compreende selecionar células estaminais que são também CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar células estaminais que são também HLA-G+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar células estaminais que são também CD34~, CD38~ e CD45-. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são também CD34“, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ e HLA-G+. É também aqui divulgada uma célula estaminal isolada que é CD73+, CD105+ e HLA-G+. Num aspeto, a célula estaminal é uma célula estaminal placentária. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38~ ou CD45~. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34", CD38~ e CD45~. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é 0CT-4+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD200+. Num aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38-, CD45~, 0CT-4+ e CD200+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal facilita a formação de corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a referida célula estaminal, quando a população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas características. É também aqui divulgado um método de seleção de uma célula estaminal placentária a partir de uma multiplicidade de células placentárias, que compreende selecionar uma célula placentária CD73+, CD105+ e HLA-G+, pelo que a referida célula é uma célula estaminal placentária. Num aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD34-, CD38~ ou CD45~. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD34-, CD38~ e CD45-. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também 0CT-4+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD200+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que é também CD34~, CD38-, CD45-, 0CT-4+ e CD200+. Noutro aspeto, a referida seleção compreende selecionar uma célula placentária que também facilita a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a referida célula estaminal, quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. É também aqui divulgada uma população isolada de células que compreende, e.g., que está enriquecida em células estaminais CD73+, CD105+ e HLA-G+. Num aspeto as referidas células estaminais são células estaminais placentárias. Em vários aspetos, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60% das referidas células são células estaminais CD73+, CD105+ e HLA-G+. Noutro aspeto, pelo menos cerca de 70% das referidas células são CD73+, CD105+ e HLA-G+. Noutro aspeto, pelo menos cerca de 90%, 95% ou 99% das referidas células são células estaminais CD73 + , CD105+ e HLA-G+.
Noutro aspeto das populações anteriores, as referidas células estaminais são CD34~, CD38~ ou CD45~. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34-, CD38" e CD45".
Noutro aspeto, as referidas células estaminais são 0CT-4+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD200+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34~, CD38", CD45", 0CT-4+ e CD200+. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas características. É aqui divulgado um método de seleção de uma população de células estaminais placentárias a partir de uma multiplicidade de células placentárias, que compreende selecionar uma população de células placentárias em que uma maioria das referidas células são CD73+, CD105+ e HLA-G+. Num aspeto, a referida maioria de células são também CD34-, CD38~ e/ou CD45~. Noutro aspeto, a referida maioria de células são também CD200+. Noutro aspeto, a referida maioria de células são também CD34~, CD38~, CD45~, 0CT-4+ e CD200+.
Noutro aspeto, é aqui divulgada uma célula estaminal isolada que é CD73+ e CD105+ e que facilita a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias isoladas que compreende a referida célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Num aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38- ou CD45". Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38~ e CD45~. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é 0CT4+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é 0CT4+, CD34~, CD38~ e CD45-. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas caracteristicas. É também aqui divulgada uma população de células placentárias isoladas que compreende, e.g., que está enriquecida em células estaminais CD73+, CD105+, em que a referida população forma um ou mais corpos de tipo embrioide sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Em vários aspetos, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50% pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% das referidas células placentárias isoladas são células estaminais CD73+, CD105+. Noutro aspeto das populações anteriores, as referidas células estaminais são CD34~, CD38- ou CD45“. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34~, CD38" e CD45". Noutro aspeto, as referidas células estaminais são OCT-4+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são 0CT-4+, CD34~, CD38- e CD45". Noutros aspetos, a referida população foi expandida, por exemplo, foi passada pelo menos uma vez, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, ou pelo menos 20 vezes. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas características. É também aqui divulgada uma célula estaminal isolada que é OCT-4+ e que facilita a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias isoladas que compreende a referida célula estaminal quando cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Num um aspeto, a referida célula estaminal é CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD34~, CD38- ou CD45-. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD200+. Noutro aspeto, a referida célula estaminal é CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38~ e CD45". Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas caracteristicas. É também aqui divulgada uma população de células isoladas que compreende, e.g., que está enriquecida em células estaminais OCT-4+, em que a referida população forma um ou mais corpos de tipo embrioide quando cultivadas sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. Em vários aspetos, pelo menos 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50% pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% das referidas células placentárias isoladas são células estaminais OCT4+. Nalguns aspetos das populações anteriores, as referidas células estaminais são CD73+ e CD105+. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são CD34-, CD38~ ou CD45-.
Noutro, as referidas células estaminais são CD200+. Num outro aspeto, as referidas células estaminais são CD73+, CD105+, CD200 + , CD34-, CD38“ e CD45-. Noutro aspeto, a referida população foi expandida, por exemplo, passada pelo menos uma vez, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, ou pelo menos 20 vezes. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas características.
Noutra forma de realização, a invenção também proporciona uma célula estaminal placentária isolada que é CD10+, CD34~, CD105+ e CD200+. A invenção proporciona ainda uma população isolada de células estaminais placentárias, em que pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% das referidas células estaminais placentárias são CD10 + , CD34~, CD105+, CD200+. Numa forma de realização específica das formas de realização acima, as referidas células estaminais são adicionalmente CD90 + e CD45~. Numa forma de realização específica, a referida célula estaminal ou população de células estaminais placentárias é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutra forma de realização específica, a referida célula estaminal ou população de células estaminais placentárias é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas características. Noutra forma de realização específica, a referida célula estaminal placentária isolada é de origem não materna. Noutra forma de realização específica, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99% das referidas células na referida população isolada de células estaminais placentárias, são de origem não materna.
Noutro aspeto, é aqui divulgada uma célula estaminal placentária isolada que é HLA-A,B,C~, CD45~, CD133- e CD34". A divulgação descreve ainda uma população isolada de células estaminais placentárias, em que pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% das referidas células estaminais placentárias são HLA-A,B,C~, CD45", CD133+ e CD34". Num aspeto, a referida célula estaminal ou população de células estaminais placentárias é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas características. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária isolada é de origem não materna. Noutro aspeto, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99% das referidas células na referida população isolada de células estaminais placentárias, são de origem não materna. Noutro aspeto, a invenção proporciona um método de obtenção de uma célula estaminal placentária que é HLA-A,B,C-, CD45~, CD133" e CD34~ que compreende isolar a referida célula a partir de um perfusato placentário.
Noutro aspeto, é aqui divulgada uma célula estaminal placentária isolada que é CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- e CD133-. A divulgação descreve ainda uma população isolada de células estaminais placentárias, em que pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% das referidas células estaminais placentárias são CD10 + , CD13+, CD33+, CD45", CD117" e CD133". Num aspeto, a referida célula estaminal ou população de células estaminais placentárias é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária isolada é de origem não materna. Noutro aspeto, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99% das referidas células na referida população isolada de células estaminais placentárias, são de origem não materna. Noutro aspeto, a referida célula estaminal ou população de células estaminais placentárias é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas características. Noutro aspeto, é aqui divulgado um método de obtenção de uma célula estaminal placentária que é CD10+, CD13+, CD33+, CD45", CD117- e CD133" que compreende isolar a referida célula de um perfusato placentário.
Noutro aspeto, é aqui divulgada uma célula estaminal placentária isolada que é CD10", CD33~, CD44+, CD45" e CD117-. A divulgação descreve ainda uma população isolada de células estaminais placentárias, em que pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% das referidas células estaminais placentárias são CD10“, CD33", CD44 + , CD45~ e CD117-. Num aspeto, a referida célula estaminal ou população de células estaminais placentárias é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária isolada é de origem não materna. Noutro aspeto, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos 99% das referidas células na referida população isolada de células estaminais placentárias, são de origem não materna. Noutro aspeto, a referida célula estaminal ou população de células estaminais placentárias é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas características. Noutro aspeto, é aqui divulgado um método de obtenção de uma célula estaminal placentária que é CD10-, CD33", CD44 + , CD45-, CD117- que compreende isolar a referida célula de um perfusato placentário.
Noutro aspeto, é aqui divulgada uma célula estaminal placentária isolada que é CD10~, CD13“, CD33-, CD45- e CD117~. A divulgação descreve ainda uma população isolada de células estaminais placentárias, em que pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% das referidas células estaminais placentárias são CD10“, CD13-, CD33-, CD45- e CD117-. Num aspeto, a referida célula estaminal ou população de células estaminais placentárias é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária isolada é de origem não materna. Noutro aspeto, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos 99% das referidas células na referida população isolada de células estaminais placentárias, são de origem não materna. Noutro aspeto, a referida célula estaminal ou população de células estaminais placentárias é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas características. Noutro aspeto, a invenção proporciona um método de obtenção de uma célula estaminal placentária que é CD10-, CD13", CD33-, CD45- e CD117+ que compreende isolar a referida célula de um perfusato placentário.
Noutro aspeto, é aqui divulgada uma célula estaminal placentária isolada que é HLA A,B,C~, CD45~, CD34~, CD133", positiva para CD10, CD13, CD38, CD44, CD90,
CD105, CD200 e/ou HLA-G, e/ou negativa para CD117. A divulgação descreve ainda uma população isolada de células estaminais placentárias, em que as referidas células estaminais são HLA A,B,C“, CD45-, CD34", CD133“ e pelo menos cerca de 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou cerca de 99% das células estaminais na população são positivas para CD10, CD 13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 e/ou HLA-G, e/ou negativas para CD117. Num aspeto, a referida célula estaminal ou população de células estaminais placentárias é separada das células placentárias que não são células estaminais. Noutro aspeto, a referida célula estaminal placentária isolada é de origem não materna. Noutro aspeto, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99%, das referidas células na referida população isolada de células estaminais placentárias, são de origem não materna. Noutro aspeto, a referida célula estaminal ou população de células estaminais placentárias é separada das células estaminais placentárias que não apresentam estas características. Noutro aspeto, a invenção proporciona um método de obtenção de uma célula estaminal placentária que é HLA A,B,C“, CD45~, CD34~, CD133" e positiva para CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200 e/ou HLA-G, e/ou negativa para CD117, que compreende isolar a referida célula de um perfusato placentário.
Noutro aspeto, é aqui divulgada uma célula estaminal placentária que é CD200+ e CD10+, como determinado por ligação de anticorpo, e CD117-, como determinado tanto por ligação de anticorpo como por RT-PCR. Noutro aspeto é aqui divulgada uma célula estaminal placentária que é CD10 + , CD29~, CD54 + , CD200 + , HLA-G+, HLA classe I" e microglobulina β-2~. Noutro aspeto, são aqui divulgadas células estaminais placentárias, em que a expressão de pelo menos um marcador é pelo menos duas vezes superior que para uma célula estaminal mesenquimatosa (e.g., uma célula estaminal mesenquimatosa derivada de medula óssea). Noutra forma de realização especifica, a referida célula estaminal placentária isolada é de origem não materna. Noutra forma de realização especifica, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos 99%, das referidas células na referida população isolada de células estaminais placentárias, são de origem não materna. É aqui divulgada uma população isolada de células estaminais placentárias, em que uma multiplicidade das referidas células estaminais placentárias é positiva para a aldeído-desidrogenase (ALDH) , como avaliada por um ensaio de atividade de aldeído-desidrogenase. Tais ensaios são conhecidos na técnica (ver, e.g., Bostian e Betts, Biochem. J., 173, 787, (1978)). Num aspeto específico, o referido ensaio de ALDH utiliza ALDEFLUOR® (Aldagen, Inc., Ashland, Oregon) como um marcador da atividade de aldeído-desidrogenase. Num aspeto específico, a referida multiplicidade é entre cerca de 3% e cerca de 25% de células da referida população de células. Noutro aspeto, a invenção proporciona uma população de células estaminais do cordão umbilical, em que uma multiplicidade das referidas células estaminais do cordão umbilical é positiva para a aldeído-desidrogenase, como avaliada por um ensaio de atividade de aldeído-desidrogenase que utiliza ALDEFLUOR® como um indicador de atividade de aldeído-desidrogenase. Num aspeto específico, a referida multiplicidade é entre cerca de 3% e cerca de 25% de células na referida população de células. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias ou células estaminais do cordão umbilical exibe pelo menos três vezes, ou pelo menos cinco vezes, maior atividade de ALDH que uma população de células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea com o mesmo número de células e cultivada nas mesmas condições. A invenção proporciona células estaminais corioamnióticas ou populações de células estaminais corioamnióticas, em que a célula estaminal ou população de células estaminais corioamnióticas foi passada pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20 vezes, ou mais, ou expandidas durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ou 40 duplicações da população, ou mais.
Numa forma de realização específica de qualquer uma das células corioamnióticas ou populações de células anteriores, o cariótipo das células, ou pelo menos de cerca de 95% ou cerca de 99% das células na referida população, é normal. Noutra forma de realização específica de qualquer uma das células corioamnióticas ou populações de células, as células, ou células na população de células, são de origem não materna.
As células estaminais placentárias isoladas, ou populações isoladas de células estaminais placentárias, que têm qualquer uma das combinações de marcadores anteriores, podem ser combinadas em qualquer proporção. É também aqui divulgado o isolamento ou enriquecimento de quaisquer duas ou mais das populações de células estaminais placentárias anteriores para formar uma população de células estaminais placentárias. Por exemplo, é aqui divulgada uma população isolada de células estaminais placentárias que compreende uma primeira população de células estaminais placentárias definida por uma das combinações de marcadores descritas acima e uma segunda população de células estaminais placentárias definida por uma outra das combinações de marcadores descritas acima, em que a referida primeira e segunda populações são combinadas numa proporção de cerca de 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2 ou cerca de 99:1. De maneira semelhante, podem ser combinadas quaisquer três, quatro, cinco ou mais das células estaminais placentárias ou populações de células estaminais placentárias descritas anteriormente. A invenção refere-se ainda a células estaminais corioamnióticas que são obtidas por rutura de tecido placentário, com ou sem digestão enzimática, seguido de cultura (ver Secção 5.2.3) ou perfusão (ver Secção 5.2.4).
Por exemplo, a invenção proporciona uma população isolada de células estaminais amnióticas que é produzida de acordo com um método que compreende perfundir uma placenta de mamífero que foi drenada de sangue do cordão e perfundida para remover sangue residual; perfundir a referida placenta com uma solução de perfusão; e recolher a referida solução de perfusão, em que a referida solução de perfusão após perfusão compreende uma população de células placentárias que compreende células estaminais corioamnióticas; e isolar uma multiplicidade das referidas células estaminais corioamnióticas a partir da referida população de células. Numa forma de realização específica, a solução de perfusão é feita passar através tanto da veia umbilical como das artérias umbilicais e recolhida depois de exsudar da placenta. As populações de células estaminais corioamnióticas produzidas por este método compreendem tipicamente uma mistura de células fetais e maternas. Noutra forma de realização específica, a solução de perfusão é feita passar através da veia umbilical e recolhida das artérias umbilicais, ou feita passar através das artérias umbilicais e recolhida da veia umbilical. Tipicamente, as populações de células estaminais corioamnióticas produzidas por este método são exclusivamente, de forma substancial, de origem fetal; isto é, e.g., mais de 90%, 95%, 99% ou 99,5% das células estaminais placentárias na população são de origem fetal.
Em várias formas de realização, as células estaminais corioamnióticas, contidas dentro de uma população de células obtida a partir de perfusão de uma placenta, são pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou pelo menos 99,5% de células placentárias na referida população. Noutra forma de realização especifica, as células estaminais placentárias recolhidas por perfusão compreendem células fetais e maternas. Noutra forma de realização especifica, as células estaminais placentárias recolhidas por perfusão são pelo menos 50%, 60%, 70%, 90%, 90%, 95%, 99% ou pelo menos 99,5% de células fetais. É também aqui divulgada uma composição que compreende uma população de células estaminais placentárias isoladas colhidas por perfusão, em que a referida composição compreende pelo menos uma porção da solução de perfusão utilizada para recolher as células estaminais placentárias. A invenção proporciona ainda uma população isolada das células estaminais corioamnióticas aqui descritas que é produzida de acordo com um método que compreende digerir o tecido placentário com uma enzima disruptora de tecidos para obter uma população de células placentárias que compreende células estaminais placentárias, e isolar uma multiplicidade de células estaminais corioamnióticas do resto das referidas células placentárias. A totalidade ou qualquer parte da placenta pode ser digerida para obter as células estaminais placentárias. Em formas de realização especificas, por exemplo, o referido tecido placentário é uma placenta inteira, uma membrana amniótica, cório, uma combinação de âmnio e cório, ou uma combinação de qualquer um dos anteriores. Noutra forma de realização especifica, a enzima disruptora de tecidos é tripsina ou colagenase. Em várias formas de realização, as células estaminais placentárias, contidas dentro de uma população de células obtida a partir da digestão de uma placenta, são pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou pelo menos 99,5% da referida população de células placentárias. A determinação do perfil de genes confirma que as células estaminais placentárias isoladas, e populações de células estaminais placentárias isoladas, podem ser distinguidas de outras células, e.g., células estaminais mesenquimatosas, e.g., células estaminais derivadas de medula óssea. As células estaminais placentárias aqui descritas, podem ser distinguidas das células estaminais mesenquimatosas com base na expressão de um ou mais genes, cuja expressão é especifica para células estaminais placentárias ou células estaminais do cordão umbilical em comparação com células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea. Em particular, as células estaminais placentárias podem ser distinguidas das células estaminais mesenquimatosas com base na expressão de um ou mais genes, cuja expressão é significativamente mais alta (isto é, pelo menos duas vezes mais alta) nas células estaminais placentárias que nas células estaminais mesenquimatosas, em que o um ou mais genes é(são) ACTG2, ADARBl, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, EL0VL2, F2RL1, FNJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAMl, IER3, IGFBP7, ILIA, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, ZC3H12A, ou uma combinação de qualquer um dos anteriores, em que a expressão destes qenes é maior nas células estaminais placentárias ou células estaminais do cordão umbilical que nas células estaminais derivadas de medula óssea, quando as células estaminais são cultivadas sob condições equivalentes. Num exemplo, o qene especifico de células estaminais placentárias ou especifico de células estaminais do cordão umbilical é CD200. 0 nível de expressão destes genes pode ser utilizado para confirmar a identidade de uma população de células placentárias, para identificar uma população de células como compreendendo pelo menos uma multiplicidade de células estaminais placentárias, ou semelhantes. A população de células estaminais placentárias, cuja identidade é confirmada, pode ser clonal, e.g., uma população de células estaminais placentárias expandidas forma uma única célula estaminal placentária, ou uma população mista de células estaminais, e.g., uma população de células que compreende exclusivamente células estaminais placentárias que são expandidas a partir de múltiplas células estaminais placentárias, ou uma população de células que compreende células estaminais placentárias e pelo menos um outro tipo de célula. 0 nível de expressão destes genes pode ser utilizado para selecionar populações de células estaminais placentárias. Por exemplo, uma população de células, e.g., células expandidas de forma clonal, é selecionada se a expressão de um ou mais destes genes é significativamente maior numa amostra da população de células que numa população equivalente de células estaminais mesenquimatosas. Tal seleção pode ser de uma população a partir de uma multiplicidade de populações de células estaminais placentárias, a partir de uma multiplicidade de populações de células, cuja identidade não é conhecida, etc.
As células estaminais placentárias podem ser selecionadas com base no nível de expressão de um ou mais desses genes em comparação com o nível de expressão do referido um ou mais genes num controlo de células estaminais mesenquimatosas. Por exemplo, o nível de expressão do referido um ou mais genes numa amostra que compreende um número equivalente de células estaminais mesenquimatosas é utilizado como um controlo. Noutro exemplo, o controlo, para células estaminais placentárias testadas em certas condições, é um valor numérico que representa o nível de expressão do referido um ou mais genes em células estaminais mesenquimatosas nas referidas condições.
As células estaminais placentárias da invenção apresentam as características anteriores (e.g., combinações de marcadores da superficie celular e perfis de expressão de genes) em cultura primária ou durante a proliferação em meio que compreende 60% de DMEM-LG (Gibco), 40% de MCDB-201 (Sigma), 2% de soro fetal de vitelo (FCS) (Hyclone Laboratories), lx insulina-transferrina-selénio (ITS), lx ácido linoleico-albumina de soro bovino (LA-BSA), dexametasona IO-9 M (Sigma), ácido ascórbico-2-fosfato IO-4 M (Sigma), 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF) (R&D Systems), 10 ng/mL de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) (R&D Systems), e 100U de penicilina/lOOOU de estreptomicina.
As populações isoladas de células estaminais placentárias descritas acima e as populações de células estaminais placentárias, em geral, podem compreender cerca de pelo menos, ou não mais do que, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x ΙΟ8, 5x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 ou mais células estaminais placentárias. 5.1.3 Crescimento em Cultura O crescimento das células estaminais placentárias aqui descritas, assim como para qualquer célula de mamifero, depende em parte do meio particular selecionado para crescimento. Em condições ótimas, as células estaminais placentárias duplicam tipicamente em número em 3-5 dias. Durante a cultura, as células estaminais placentárias da invenção aderem a um substrato em cultura, e.g. a superfície de um recipiente de cultura de tecidos (e.g., plástico da placa da cultura de tecidos, plástico revestido com fibronectina, e semelhantes) e formam um monocamada.
As populações de células placentárias isoladas que compreendem as células estaminais placentárias da invenção, quando cultivadas sob condições apropriadas, formam corpos de tipo embrioide, isto é, agregados tridimensionais de células crescem sobre a camada de células estaminais aderente. As células dentro dos corpos de tipo embrioide expressam marcadores associados a células estaminais muito precoces, e.g., OCT-4, Nanog, SSEA3 e SSEA4. As células dentro dos corpos de tipo embrioide são tipicamente não aderentes ao substrato de cultura, como são as células estaminais placentárias aqui descritas, mas permanecem ligadas às células aderentes durante a cultura. As células dos corpos de tipo embrioide são dependentes das células estaminais placentárias aderentes para a viabilidade, já que os corpos de tipo embrioide não se formam na ausência das células estaminais aderentes. Assim, as células estaminais placentárias aderentes facilitam o crescimento de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreendem as células estaminais placentárias aderentes. Sem pretender ficar limitado pela teoria, julga-se que as células dos corpos de tipo embrioide crescem sobre as células estaminais placentárias aderentes tanto como as células estaminais embrionárias crescem numa camada alimentadora de células. As células estaminais mesenquimatosas, e.g., células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea, não desenvolvem corpos de tipo embrioide em cultura.
5.2 MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS 5.2.1 Composição da Colheita de Células
Estaminais A presente invenção refere-se ainda a métodos de colheita e isolamento de células estaminais placentárias. Em geral, as células estaminais são obtidas a partir de uma placenta de mamífero utilizando uma solução fisiologicamente aceitável, e.g., uma composição de colheita de células estaminais. Uma composição de colheita de células estaminais é descrita em pormenor no Pedido Provisório U.S. N.° 60/754,969 relacionado, intitulado "Improved Médium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs, " submetido em 29 de dezembro de 2005. A composição de colheita de células estaminais pode compreender qualquer solução fisiologicamente aceitável adequada para a colheita e/ou cultura de células estaminais, por exemplo, um soro fisiológico (e.g., soro fisiológico tamponado com fosfato, solução de Kreb, solução de Kreb modificada, solução de Eagle, NaCl a 0,9%. etc.), um meio de cultura (e.g., DMEM, H.DMEM, etc.), e semelhantes. A composição de colheita de células estaminais pode compreender um ou mais componentes que tendem a conservar as células estaminais placentárias, isto é, impedem que as células estaminais placentárias morram ou retardam a morte das células estaminais placentárias, reduzem o número de células estaminais placentárias numa população de células que morre, ou semelhantes, desde o momento da colheita até ao momento da cultura. Tais componentes podem ser, e.g., um inibidor de apoptose (e.g., um inibidor de caspase ou inibidor de JNK); um vasodilatador (e.g., sulfato de magnésio, um fármaco anti-hipertensor, péptido natriurético auricular (ANP), adrenocorticotrofina, hormona de libertação de corticotrofina, nitroprussiato de sódio, hidralazina, adenosina trifosfato, adenosina, indometacina ou sulfato de magnésio, um inibidor da fosfodiesterase, etc.); um inibidor de necrose (e.g., 2-(lH-Indol-3-il)-3-pentilamino-maleimida, ditiocarbamato de pirrolidina, ou clonazepam); um inibidor de TNF-α; e/ou um perfluorocarboneto portador de oxigénio (e.g., brometo de perfluorooctilo, brometo de perfluorodecilo, etc.). A composição de colheita de células estaminais pode compreender uma ou mais enzimas degradadoras de tecido, e.g., uma metaloprotease, uma serina-protease, uma protease neutra, uma RNase, ou uma DNase, ou semelhantes.
Tais enzimas incluem, mas não se limitam a, colagenases (e.g., colagenase I, II, III ou IV, uma colagenase de Clostridium histolyticum, etc.); dispase, termolisina, elastase, tripsina, LIBERASE, hialuronidase, e semelhantes. A composição de colheita de células estaminais pode compreender uma quantidade bactericida ou bacteriostaticamente eficaz de um antibiótico. Em certos exemplos não limitativos, o antibiótico é um macrólido (e.g., tobramicina) , uma cefalosporina (e.g., cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixima ou cefadroxil), uma claritromicina, uma eritromicina, uma penicilina (e.g., penicilina V) ou uma quinolona (e.g., ofloxacina, ciprofloxacina ou norfloxacina), uma tetraciclina, uma estreptomicina, etc. Num exemplo particular, o antibiótico é ativo contra bactérias Gram(+) e/ou Gram(-), e.g., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, e semelhantes. A composição de colheita de células estaminais pode compreender também um ou mais dos seguintes compostos: adenosina (cerca de 1 mM a cerca de 50 mM) ; D-glicose (cerca de 20 mM a cerca de 100 mM); iões magnésio (cerca de 1 mM a cerca de 50 mM); uma macromolécula de peso molecular superior a 20 000 daltons, num exemplo, presente numa quantidade suficiente para manter a integridade endotelial e a viabilidade celular (e.g., um coloide sintético ou natural, um polissacárido tal como dextrano ou um polietileno glicol presente a cerca de 25 g/L a cerca de 100 g/L, ou cerca de 40 g/L a cerca de 60 g/L) ; um antioxidante (e.g., hidroxianisole butilado, hidroxitolueno butilado, glutationa, vitamina C ou vitamina E presente a cerca de 25 μΜ a cerca de 100 μΜ) ; um agente de redução (e.g., N-acetilcisteina presente a cerca de 0,1 mM a cerca de 5 mM) ; um agente que previne a entrada de cálcio nas células (e.g., verapamil presente a cerca de 2 μΜ a cerca de 25 μΜ); nitroglicerina (e.g., cerca de 0,05 g/L a cerca de 0,2 g/L); um anticoagulante, num exemplo, presente numa quantidade suficiente para ajudar a impedir a coagulação de sangue residual (e.g., heparina ou hirudina presente a uma concentração de cerca de 1000 unidades/L a cerca de 100 000 unidades/L); ou um composto que contém amilorida (e.g., amilorida, etil isopropil amilorida, hexametileno amilorida, dimetil amilorida ou isobutil amilorida presente a cerca de 1,0 μΜ a cerca de 5 μΜ). 5.2.2 Colheita e Manuseamento da Placenta
Em geral, uma placenta humana é recuperada pouco depois da sua expulsão após parto. Num aspeto preferido, a placenta é recuperada a partir de um doente depois de consentimento esclarecido e depois de obter um histórico médico completo do doente que é associado à placenta. Preferencialmente, o histórico médico continua após o parto. Um tal histórico médico pode ser utilizado para coordenar a utilização subsequente da placenta ou das células estaminais colhidas daquela. Por exemplo, podem ser utilizadas células estaminais placentárias humanas, à luz do histórico médico, para medicina personalizada para o bebé associado à placenta, ou para pais, irmãos ou outros familiares do bebé.
Antes da recuperação das células estaminais placentárias, são removidos o sangue do cordão umbilical e o sangue placentário. Em certos exemplos, após o parto, o sangue do cordão na placenta é recuperado. A placenta pode ser submetida a um processo de recuperação de sangue do cordão convencional. Tipicamente, uma agulha ou cânula é utilizada, com a ajuda da gravidade, para dessangrar a placenta (ver, e.g., Anderson, Patente U.S. N.° 5,372,581; Hessel et al., Patente U.S. N.° 5, 415, 665). A agulha ou cânula é geralmente colocada na veia umbilical e a placenta pode ser massajada suavemente para ajudar na drenagem do sangue do cordão da placenta. Essa recuperação do sangue do cordão pode ser realizada comercialmente, e.g., LifeBank USA, Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry and Cryocell. Preferencialmente, a placenta é drenada por gravidade sem mais manipulação de forma a minimizar a rutura do tecido durante a recuperação do sangue do cordão.
Tipicamente, uma placenta é transportada desde a sala de parto ou nascimento para outro local, e.g., um laboratório, para recuperação do sangue do cordão e colheita das células estaminais, e.g., por perfusão ou dissociação de tecido. A placenta é preferencialmente transportada num dispositivo de transporte termicamente isolado, estéril (mantendo a temperatura da placenta entre 20-28 °C), por exemplo, colocando a placenta, com o cordão umbilical proximal fixo, num saco de plástico com fecho estéril, que é em seguida colocado num recipiente isolado. Noutro exemplo, a placenta é transportada num kit de colheita de sangue do cordão substancialmente como descrito na Patente dos Estados Unidos pendente N.° 7,147,626. Preferencialmente, a placenta é entregue no laboratório quatro a vinte e quatro horas após o parto. Em certos exemplos, o cordão umbilical proximal é fixo, preferencialmente dentro de 4-5 cm (centímetro) da inserção no disco placentário antes da recuperação do sangue do cordão. Noutros exemplos, o cordão umbilical proximal é fixo após recuperação do sangue do cordão, mas antes de processamento adicional da placenta. A placenta, antes da colheita das células estaminais, pode ser armazenada sob condições estéreis e à temperatura ambiente ou a uma temperatura de 5 a 25 °C (centígrado). A placenta pode ser armazenada durante um período de quatro a vinte e quatro horas, até quarenta e oito horas, ou mais de quarenta e oito horas, antes de perfundir a placenta para remover qualquer sangue residual do cordão. Num exemplo, a placenta é colhida entre cerca de zero horas a cerca de duas horas após expulsão. A placenta é preferencialmente armazenada numa solução anticoagulante a uma temperatura de 5 a 25 °C (centígrado) . As soluções anticoagulantes adequadas são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, pode ser utilizado uma solução de heparina ou varfarina sódica. Num aspeto preferido, a solução anticoagulante compreende uma solução de heparina (e.g., 1% p/p em solução a 1:1000). A placenta dessangrada é preferencialmente armazenada durante não mais que 36 horas antes de recolher as células estaminais placentárias. A placenta de mamífero ou uma parte da mesma, uma vez recolhida e preparada geralmente como acima, pode ser tratada de qualquer maneira conhecida na técnica, e.g., pode ser perfundida ou rompida, e.g., digerida com uma ou mais enzimas disruptoras de tecidos, para obter células estaminais. 5.2.3 Rutura Física e Digestão Enzimática do Tecido Placentário
Numa forma de realização, as células estaminais são recolhidas de uma placenta de mamífero por rutura física de parte ou de todo o órgão. Por exemplo, a placenta, ou uma porção da mesma, pode ser, e.g., esmagada, cortada, picada, cortada em cubos, triturada, macerada ou semelhantes. O tecido pode ser em seguida cultivado para obter uma população de células estaminais. Tipicamente, o tecido placentário é rompido utilizando, e.g., uma composição de colheita de células estaminais (ver Secção 5.2.1 e abaixo). A placenta pode ser dissecada em componentes antes da rutura física e/ou digestão enzimática e recuperação das células estaminais. As células estaminais placentárias podem ser obtidas a partir da totalidade ou uma porção da membrana amniótica, cório, cordão umbilical, cotilédones placentários, ou qualquer combinação dos mesmos, incluindo a partir de uma placenta inteira. Preferencialmente, as células estaminais placentárias são obtidas a partir de tecido placentário que compreende o âmnio e o cório. Tipicamente, as células estaminais placentárias podem ser obtidas por rutura de um pequeno bloco do tecido placentário, e.g., um bloco de tecido placentário que tem cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou cerca de 1000 milímetros cúbicos de volume. Pode ser utilizado qualquer método de rutura fisica, na condição de que o método de rutura deixe uma multiplicidade, mais preferencialmente uma maioria, e mais preferencialmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou 99% das células no referido órgão viável, como determinado por, e.g., exclusão com azul de tripano.
As células estaminais podem ser geralmente recolhidas de uma placenta, ou porção da mesma, em qualquer altura dentro de aproximadamente os primeiros três dias após expulsão, mas preferencialmente entre cerca de 8 horas e cerca de 18 horas após expulsão.
Numa forma de realização específica, o tecido rompido é cultivado em meios de cultura de tecido adequados para a proliferação de células estaminais placentárias (ver, e.g., Secção 5.3, abaixo, que descreve a cultura de células estaminais placentárias).
Noutra forma de realização especifica, as células estaminais são recolhidas por rutura fisica do tecido placentário, em que a rutura fisica inclui digestão enzimática, a qual pode ser conseguida através da utilização de uma ou mais enzimas de digestão de tecido. A placenta, ou uma porção da mesma, pode ser também fisicamente rompida e digerida com uma ou mais enzimas, e o material resultante em seguida mergulhado ou misturado numa composição de colheita de células estaminais.
Uma composição de colheita de células estaminais preferida compreende uma ou mais enzima(s) disruptora(s) de tecido. A digestão enzimática utiliza preferencialmente uma combinação de enzimas, e.g., uma combinação de uma metaloprotease da matriz e uma protease neutra, por exemplo, uma combinação de colagenase e dispase. Numa forma de realização, a digestão enzimática do tecido placentário utiliza uma combinação de uma metaloprotease da matriz, uma protease neutra e uma enzima mucolitica para digestão de ácido hialurónico, tal como uma combinação de colagenase, dispase e hialuronidase, ou uma combinação de LIBERASE (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.) e hialuronidase. Outras enzimas que podem ser utilizadas para romper o tecido da placenta incluem papaína, desoxirribonucleases, serina-proteases, tais como tripsina, quimotripsina ou elastase. As serina-proteases podem ser inibidas por microglobulina alfa 2 no soro e, portanto, o meio utilizado para digestão é geralmente sem soro. 0 EDTA e a DNase são comummente utilizados em procedimentos de digestão com enzimas para aumentar a eficiência da recuperação de células. 0 produto de digestão é preferencialmente diluído de forma a evitar a retenção de células estaminais dentro do material de digestão viscoso.
Pode ser utilizada qualquer combinação de enzimas de digestão de tecido. As concentrações típicas para as enzimas de digestão de tecido incluem, e.g., 50-200 U/mL para a colagenase I e colagenase IV, 1-10 U/mL para a dispase e 10-100 U/mL para a elastase. As proteases podem ser utilizadas em combinação, isto é, duas ou mais proteases na mesma reação de digestão, ou podem ser utilizadas sequencialmente para libertar as células estaminais placentárias. Por exemplo, numa forma de realização, uma placenta, ou parte da mesma, é digerida primeiro com uma quantidade apropriada de colagenase I a cerca de 1 a cerca de 2 mg/mL durante, e.g., 30 minutos, seguido de digestão com tripsina, a uma concentração de cerca de 0,25%, durante, e.g., 10 minutos, a 37 °C. As serina-proteases são preferencialmente utilizadas consecutivamente após a utilização de outras enzimas.
Noutra forma de realização, o tecido pode ser ainda rompido pela adição de um quelante, e.g., ácido etileno glicol bis(éter 2-aminoetílico)-N,N,N'N'-tetracético (EGTA) ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) à composição de colheita de células estaminais que compreende as células estaminais, ou a uma solução onde o tecido é rompido e/ou digerido antes do isolamento das células estaminais com a composição de colheita de células estaminais.
Numa forma de realização, uma digestão pode ocorrer da seguinte maneira. Aproximadamente um grama de tecido placentário é obtido e picado. 0 tecido é digerido em 10 mL de uma solução que compreende cerca de 1 mg/mL de colagenase IA e cerca de 0,25% de tripsina a 37 °C num agitador a cerca de 100 RPM. O produto de digestão é lavado três vezes com meio de cultura, e as células lavadas são aplicadas em 2 balões T-75. As células são em seguida isoladas por aderência diferencial, e caracterizadas quanto à, e.g., viabilidade, marcadores da superfície celular, diferenciação, e semelhantes.
Entender-se-á que no caso de uma placenta inteira ou porção de uma placenta que compreende células fetais e maternas (por exemplo, no caso da porção da placenta compreender o cório ou cotilédones), as células estaminais placentárias recolhidas compreenderão uma mistura de células estaminais placentárias derivadas de fontes fetais e maternas. No caso de uma porção da placenta que não compreende, ou compreende um número insignificante, de células maternas (por exemplo, âmnio), as células estaminais placentárias recolhidas compreenderão quase exclusivamente células estaminais placentárias fetais.
As células estaminais podem ser isoladas a partir de tecido rompido por tripsinização diferencial (ver Secção 5.2.5, abaixo), seguido de cultura em um ou mais recipientes de cultura novos em meio de proliferação fresco, seguido opcionalmente de um segundo passo de tripsinização diferencial. 5.2.4 Perfusâo Placentária
As células estaminais placentárias podem ser também obtidas por perfusâo da placenta de mamifero. Os métodos de perfusâo da placenta de mamifero para obter células estaminais são divulgados, e.g., em Hariri, Publicação de Pedido U.S. N.° 2002/0123141, e no Pedido Provisório U.S. N.° 60/754,969 relacionado, intitulado "Improved Médium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs," submetido em 29 de dezembro de 2005.
As células estaminais placentárias podem ser recolhidas por perfusâo, e.g., através da vasculatura placentária, utilizando, e.g., uma composição de colheita de células estaminais como uma solução de perfusâo. Numa forma de realização, uma placenta de mamifero é perfundida por passagem da solução de perfusâo através de qualquer uma ou de ambas da artéria umbilical e veia umbilical. O fluxo da solução de perfusâo através da placenta pode ser conseguido utilizando, e.g., fluxo por gravidade na placenta. Preferencialmente, a solução de perfusâo é forçada através da placenta utilizando uma bomba, e.g., uma bomba peristáltica. A veia umbilical pode ser, e.g., canulada com uma cânula, e.g., uma cânula de TEFLON® ou plástico, que é conectada a um aparelho de conexão estéril, tal como tubo estéril. 0 aparelho de conexão estéril é conectado a um coletor de perfusão.
Na preparação para a perfusão, a placenta é preferencialmente orientada (e.g., suspensa) de tal maneira que a artéria umbilical e a veia umbilical são localizadas no ponto mais alto da placenta. A placenta pode ser perfundida pela passagem de um líquido de perfusão através da vasculatura placentária e tecido circundante. A placenta pode ser também perfundida pela passagem de um líquido de perfusão na veia umbilical que é colhido das artérias umbilicais, ou a passagem de um líquido de perfusão nas artérias umbilicais que é colhido da veia umbilical.
Numa forma de realização, por exemplo, a artéria umbilical e a veia umbilical são conectadas simultaneamente, e.g., a uma pipeta que é conectada via um conector flexível a um reservatório da solução de perfusão. A solução de perfusão é feita passar na veia e artéria umbilical. A solução de perfusão exsuda e/ou passa através das paredes dos vasos sanguíneos para os tecidos circundantes da placenta, e é recolhida num vaso aberto adequado a partir da superfície da placenta que estava ligada ao útero da mãe durante gestação. A solução de perfusão pode ser também introduzida através da abertura do cordão umbilical e deixada fluir ou sair pelas aberturas na parede da placenta que estavam conectadas com a parede uterina materna. As células placentárias que são recolhidas por este método, que pode ser referido como um método "pan", são tipicamente uma mistura de células fetais e maternas.
Noutra forma de realização, a solução de perfusão é feita passar através das veias umbilicais e recolhidas da artéria umbilical, ou é feita passar através da artéria umbilical e recolhida das veias umbilicais. As células placentárias recolhidas por este método, que pode ser referido como um método em "circuito fechado", são tipicamente quase exclusivamente fetais.
Entender-se-á que a perfusão utilizando o método pan, isto é, pelo qual o perfusato é recolhido depois de ter exsudado do lado materno da placenta, resulta numa mistura de células fetais e maternas. Como consequência, as células recolhidas por este método compreendem uma população mista de células estaminais placentárias de oriqem tanto fetal como materna. Pelo contrário, a perfusão exclusivamente através da vasculatura placentária no método de circuito fechado, pelo qual o liquido de perfusão é feito passar através de um ou dois vasos placentários e é recolhido exclusivamente através do(s) restante(s) vaso(s), resulta na colheita de uma população de células estaminais placentárias quase exclusivamente de oriqem fetal.
Numa forma de realização, o método de perfusão de circuito fechado pode ser realizado como se segue. Uma placenta pós-parto é obtida dentro de cerca de 48 horas após o parto. 0 cordão umbilical é fixo e cortado acima da pinça. 0 cordão umbilical pode ser rejeitado ou pode ser processado para recuperar, e.g., células estaminais do cordão umbilical, e/ou para processar a membrana do cordão umbilical para a produção de um biomaterial. A membrana amniótica pode ser conservada durante a perfusão ou pode ser separada do cório, e.g., utilizando dissecção romba com os dedos. Se a membrana amniótica é separada do cório antes da perfusão, pode ser, e.g., rejeitada, ou processada, e.g., para obter células estaminais por digestão enzimática, ou para produzir, e.g., um biomaterial de membrana amniótica, e.g., o biomaterial descrito na Publicação de Pedido U.S. N.° 2004/0048796. Depois de limpar a placenta de todos os coágulos de sangue visíveis e sangue residual, e.g., utilizando gaze estéril, os vasos do cordão umbilical são expostos, e.g., cortando parcialmente a membrana do cordão umbilical para expor uma secção transversal do cordão. Os vasos são identificados, e abertos, e.g., introduzindo uma pinça crocodilo fechada através da extremidade cortada de cada vaso. O aparelho, e.g., tubo de plástico conectado a um dispositivo de perfusão ou bomba peristáltica, é em seguida inserido em cada uma das artérias placentárias. A bomba pode ser qualquer bomba adequada para o fim, e.g., uma bomba peristáltica. O tubo de plástico, conectado a um reservatório de colheita estéril, e.g., um saco de sangue tal como um saco de colheita de 250 mL, é em seguida inserido na veia placentária. Alternativamente, o tubo conectado à bomba é inserido na veia placentária, e os tubos conectados a um reservatório (s) de colheita são inseridos numa ou em ambas as artérias placentárias. A placenta é em seguida perfundida com um volume de solução de perfusão, e.g., cerca de 750 mL de solução de perfusão. As células no perfusato são em seguida recolhidas, e.g., por centrifugação.
Numa forma de realização, o cordão umbilical proximal é fixo durante a perfusão, e mais preferencialmente, é fixo dentro de 4-5 cm (centímetro) da inserção do cordão no disco placentário. A primeira colheita de líquido de perfusão de uma placenta de mamífero durante o processo de exsanguinação é geralmente corada com glóbulos vermelhos residuais do sangue do cordão e/ou sangue placentário. O líquido de perfusão torna-se mais incolor à medida que a perfusão prossegue e as células sanguíneas residuais do cordão são lavadas para fora da placenta. Em geral, desde 30 a 100 mL (mililitro) de líquido de perfusão é adequado para dessangrar inicialmente a placenta, mas pode ser utilizado mais ou menos líquido de perfusão dependendo dos resultados observados. O volume do líquido de perfusão utilizado para recolher as células estaminais placentárias pode variar dependendo do número de células estaminais a serem recolhidas, do tamanho da placenta, do número de colheitas que são efetuadas a partir de uma única placenta, etc. Em várias formas de realização, o volume de líquido de perfusão pode ser desde 50 mL a 5000 mL, 50 mL a 4000 mL, 5 0 mL a 30 0 0 mL, 10 0 mL a 2 0 0 0 mL, 2 5 0 mL a 2 0 0 0 mL, 50 0 mL a 2000 mL, ou 750 mL a 2000 mL. Tipicamente, a placenta é perfundida com 700-800 mL de líquido de perfusão após exsanguinação. A placenta pode ser perfundida uma multiplicidade de vezes ao longo do curso de várias horas ou vários dias. Quando a placenta é para ser perfundida uma multiplicidade de vezes, esta pode ser mantida ou cultivada sob condições asséticas num recipiente ou outro vaso adequado, e perfundida com a composição de colheita de células estaminais, ou uma solução de perfusão padrão (e.g., um soro fisiológico normal, tal como soro fisiológico tamponado com fosfato ("PBS")) com ou sem um anticoagulante (e.g., heparina, varfarina sódica, cumarina, bis-hidroxicumarina) , e/ou com ou sem um agente antimicrobiano (e.g., β-mercaptoetanol (0,1 mM); antibióticos tais como estreptomicina (e.g., a 40-100 yg/mL), penicilina (e.g., a 40 U/mL), anfotericina B (e.g., a 0,5 pg/mL). Numa forma de realização, uma placenta isolada é mantida ou cultivada durante um intervalo de tempo sem recolher o perfusato, de tal forma que a placenta é mantida ou cultivada durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas, ou 2 ou 3 ou mais dias antes da perfusão e colheita do perfusato. A placenta perfundida pode ser mantida durante um ou mais tempo(s) adicional/adicionais, e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou mais horas, e perfundida uma segunda vez com, e.g., 700- 800 mL de líquido de perfusão. A placenta pode ser perfundida 1, 2, 3, 4, 5 ou mais vezes, por exemplo, uma vez a cada 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 horas. Numa forma de realização preferida, a perfusão da placenta e colheita da solução de perfusão, e.g., composição de colheita de células estaminais, é repetida até que o número de células nucleadas recuperadas desça abaixo de 100 células/mL. Os perfusatos em diferentes pontos no tempo podem ser ainda processados individualmente para recuperar populações dependentes do tempo de células, e.g., células estaminais. Os perfusatos de diferentes pontos no tempo podem ser também agrupados. Preferencialmente, as células estaminais são recolhidas de uma vez ou vezes entre cerca de 8 horas e cerca de 18 horas após expulsão.
Sem se pretender ficar limitado por qualquer teoria, após exsanguinação e um tempo suficiente de perfusão da placenta, julga-se que as células estaminais placentárias migram para a microcirculação dessangrada e perfundida da placenta onde, de acordo com os métodos da invenção, são recolhidas, preferencialmente lavando um vaso de colheita por perfusão. A perfusão da placenta isolada serve não só para remover o sangue residual do cordão, mas também para proporcionar a placenta com os nutrientes apropriados, incluindo oxigénio. A placenta pode ser cultivada e perfundida com uma solução semelhante que foi utilizada para remover as células sanguíneas residuais do cordão, preferencialmente, sem a adição de agentes anticoagulantes. A perfusão de acordo com os métodos relacionados com a invenção resulta na colheita de significativamente mais células estaminais placentárias que o número que pode ser obtido a partir de uma placenta perfundida de mamífero não com a referida solução, e que não foi tratada de outro modo para obter células estaminais (e.g., por rutura de tecido, e.g., digestão enzimática). Neste contexto, "significativamente mais" significa pelo menos 10% mais. A perfusão de acordo com os métodos relacionados com a invenção produz significativamente mais células estaminais placentárias que, e.g., o número de células estaminais placentárias que podem ser obtidas do meio de cultura onde foi cultivada uma placenta, ou porção da mesma.
As células estaminais podem ser isoladas a partir da placenta por perfusão com uma solução que compreende uma ou mais proteases ou outras enzimas disruptoras de tecido. Numa forma de realização específica, uma placenta ou porção da mesma (e.g., membrana amniótica, âmnio e cório, lóbulo ou cotilédone placentário, cordão umbilical, ou combinação de qualquer um dos anteriores) é trazida até 25-37 °C, e é incubada com uma ou mais enzimas disruptoras de tecido em 200 mL de um meio de cultura durante 30 minutos. As células do perfusato são recolhidas, trazidas até 4 °C, e lavadas com uma mistura inibidora fria que compreende EDTA 5 mM, ditiotreitol 2 mM e beta-mercaptoetanol 2 mM. As células estaminais são lavadas após vários minutos com uma composição de colheita de células estaminais fria (e.g., 4 °C) . 5.2.5 Isolamento, Classificação e Caracterização de Células Estaminais Placentárias
As células estaminais da placenta de mamífero, obtidas por perfusão ou digestão enzimática, podem ser inicialmente purificadas de (i.e., ser isoladas de) outras células por centrifugação com gradiente Ficoll. Tal centrifugação pode seguir qualquer protocolo padrão para a velocidade de centrifugação, etc. Numa forma de realização, por exemplo, as células recolhidas da placenta são recuperadas a partir do perfusato por centrifugação a 5000 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente, o que separa as células de, e.g., detritos e plaquetas contaminantes. Noutra forma de realização, o perfusato placentário é concentrado até cerca de 200 mL, aplicado suavemente sobre Ficoll e centrifugado a cerca de 1100 x g durante 20 minutos a 22 °C, e a camada de interface de baixa densidade de células é recolhida para processamento adicional.
Os sedimentos celulares podem ser ressuspensos em composição de colheita de células estaminais fresca, ou um meio adequado para a manutenção de células estaminais, e.g., meio IMDM sem soro que contém 2 U/mL de heparina e EDTA 2 mM (GibcoBRL, NY). A fração de células mononucleares totais pode ser isolada, e.g., utilizando Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante.
Como aqui utilizado, "isolar" células estaminais placentárias significa remover pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% das células com as quais as células estaminais estão normalmente associadas na placenta intacta de mamífero. Uma célula estaminal de um órgão está "isolada" quando está presente numa população de células que compreende menos de 50% das células com as quais a célula estaminal está normalmente associada no órgão intacto.
As células placentárias obtidas por perfusâo ou digestão podem ser, por exemplo, adicionalmente, ou inicialmente, isoladas por tripsinização diferencial utilizando, e.g., uma solução de tripsina a 0,05% com 0,2% de EDTA (Sigma, St. Louis MO) . A tripsinização diferencial é possível porque as células estaminais placentárias tipicamente se desprendem das superfícies do plástico em menos de cerca de cinco minutos, enquanto outras populações aderentes requerem tipicamente mais de 20-30 minutos de incubação. As células estaminais placentárias desprendidas podem ser colhidas após tripsinização e neutralização da tripsina, utilizando, e.g., Solução Neutralizante de
Tripsina (TNS, Cambrex). Num exemplo de isolamento de células aderentes, alíquotas de, por exemplo, cerca de 5-10 x 106 células são colocadas em cada um de vários balões T-75, preferencialmente balões T75 revestidos com fibronectina. Num tal exemplo, as células podem ser cultivadas com Meio de Crescimento de Células Estaminais Mesenquimatosas (MSCGM) comercialmente disponível (Cambrex), e colocadas numa incubadora de cultura de tecidos (37 °C, 5% CO2) . Após 10 a 15 dias, as células não aderentes são retiradas dos balões lavando com PBS. O PBS é em seguida substituído por MSCGM. Os balões são preferencialmente examinados diariamente para a presença de vários tipos de células aderentes e, em particular, para a identificação e expansão de agregados de células fibroblastoides. O número e tipo de células recolhidas de uma placenta de mamífero podem ser monitorizados, por exemplo, medindo alterações na morfologia e marcadores da superfície celular utilizando técnicas de deteção de células padrão tais como citometria de fluxo, separação de células, imunocitoquímica (e.g., revelação com anticorpos específicos para o tecido ou específicos para marcadores das células), separação de células ativadas por fluorescência (FACS), separação de células ativada magneticamente (MACS), por exame da morfologia de células utilizando microscopia ótica ou confocal, e/ou medindo alterações na expressão de genes utilizando técnicas bem conhecidas na técnica, tais como PCR e perfil de expressão de genes. Estas técnicas também podem ser utilizadas para identificar células que são positivas para um ou mais marcadores particulares. Por exemplo, utilizando anticorpos contra CD34, pode-se determinar, utilizando as técnicas anteriores, se uma célula compreende uma quantidade detetável de CD34; se assim for, a célula é CD34+. Do mesmo modo, se uma célula produz ARN de OCT-4 suficiente para ser detetável por RT-PCR, ou significativamente mais ARN de OCT-4 que uma célula adulta, a célula é 0CT-4+. Os anticorpos contra marcadores da superfície celular (e.g., marcadores de CD tais como CD34) e a sequência de genes específicos para a célula estaminal, tal como OCT-4, são bem conhecidos na técnica.
As células placentárias, em particular as células que foram isoladas por separação com Ficoll, aderência diferencial ou uma combinação de ambas, podem ser classificadas utilizando um separador de células ativadas por fluorescência (FACS). A separação de células ativadas por fluorescência (FACS) é um método bem conhecido para classificar partículas, incluindo células, com base nas propriedades fluorescentes das partículas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165). A excitação com laser de unidades fluorescentes nas partículas individuais resulta numa pequena carga elétrica que permite a separação eletromagnética de partículas positivas e negativas de uma mistura. Num exemplo, os anticorpos ou ligandos específicos de marcadores da superfície celular são marcados com etiquetas fluorescentes distintas. As células são processadas através do separador de célula, permitindo a separação de células com base na sua capacidade para ligar-se aos anticorpos utilizados. As partículas separadas por FACS podem ser depositadas diretamente nos poços individuais de placas de 96 poços ou 384 poços para facilitar a separação e clonagem.
Num esquema de separação, as células estaminais da placenta são separadas com base na expressão dos marcadores CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 e/ou HLA-G. Isto pode ser conseguido em conexão com procedimentos para selecionar células estaminais com base nas suas propriedades de aderência em cultura. Por exemplo, uma seleção por aderência de células estaminais pode ser conseguida antes ou após separação com base na expressão de marcadores. Num aspeto, por exemplo, as células são separadas primeiro com base na sua expressão de CD34; as células CD34- são retidas, e as células que são CD200+HLA-G+, são separadas de todas as outras células CD34-. Noutro aspeto, as células da placenta baseiam-se na sua expressão de marcadores CD200 e/ou HLA-G; por exemplo, células que apresentam qualquer um destes marcadores são isoladas para utilização adicional. As células que expressam, e.g., CD200 e/ou HLA-G podem, num aspeto específico, ser separadas adicionalmente com base na sua expressão de CD73 e/ou CD105, ou epitopos reconhecidos pelos anticorpos SH2, SH3 ou SH4, ou ausência de expressão de CD34, CD38 ou CD45. Por exemplo, as células placentárias podem ser separadas pela expressão, ou ausência da mesma, de CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 e CD45, e as células placentárias que são CD200 + , HLA-G+, CD73+, CD105+, CD34“, CD38' e CD45“ são isoladas a partir de outras células placentárias para utilização adicional.
Em relação à deteção mediada por anticorpo e separação de células estaminais placentárias, pode ser utilizado qualquer anticorpo, especifico para um marcador particular, em combinação com qualquer fluoróforo ou outra etiqueta adequada para a deteção e separação de células (e.g., separação de células ativadas por fluorescência). As combinações de anticorpo/fluoróforo para marcadores específicos incluem, mas não se limitam a, anticorpos monoclonais conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) contra HLA-G (disponível de Serotec, Raleigh, North Carolina), CD10 (disponível de BD Immunocytometry Systems, San Jose, Califórnia), CD44 (disponível de BD Biosciences Pharmingen, San Jose, Califórnia), e CD105 (disponível de R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota); anticorpos monoclonais conjugados com ficoeritrina (PE) contra CD44, CD200, CD117 e CD13 (BD Biosciences Pharmingen); anticorpos monoclonais conjugados com ficoeritrina-Cy7 (PE Cy7) contra CD33 e CD10 (BD Biosciences Pharmingen); anticorpos monoclonais e estreptavidina conjugados com aloficocianina (APC) contra CD38 (BD Biosciences Pharmingen); e CD90 Biotinilado (BD Biosciences Pharmingen). Outros anticorpos que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a, CD133-APC (Miltenyi), KDR-Biotina (CD309, Abcam), citoqueratina K-Fitc (Sigma ou Dako), HLA ABC-Fitc (BD) , HLA DRDQDP-PE (BD), microglobulina β-2-ΡΕ (BD), CD80-PE (BD) e CD86-APC (BD).
Outras combinações de anticorpo/etiqueta que podem ser utilizadas incluem, mas não se limitam a, CD45-PerCP (proteína de peridina clorofila); CD44-PE; CD19-PE; CD10-F (fluoresceína); HLA-G-F e 7-amino-actinomicina-D (7-AAD); HLA-ABC-F; e semelhantes.
As células estaminais placentárias podem ser analisadas para CD117 ou CD133 utilizando, por exemplo, anticorpos monoclonais conjugados com estreptavidina e biotina conjugados com ficoeritrina-Cy5 (PE Cy5) contra CD117 ou CD133; contudo, ao utilizar este sistema, as células podem parecer positivas para CD117 ou CD133, respetivamente, devido a um valor de base relativamente alto.
As células estaminais placentárias podem ser marcadas com um anticorpo contra um único marcador e detetadas e/ou separadas. As células estaminais placentárias podem ser também marcadas simultaneamente com múltiplos anticorpos contra diferentes marcadores.
Noutro exemplo, as esférulas magnéticas podem ser utilizadas para separar células. As células podem ser separadas utilizando uma técnica de separação de células ativada magneticamente (MACS), um método para separar partículas com base na sua capacidade para ligar esférulas magnéticas (0,5-100 ym de diâmetro). Pode realizar-se uma variedade de modificações úteis nas microesferas magnéticas, incluindo adição covalente de anticorpo que reconhece especificamente uma molécula ou hapteno da superfície celular particular. As esférulas são em seguida misturadas com as células para permitir a ligação. As células são em seguida feitas passar através de um campo magnético para separar as células que têm o marcador da superfície celular específico. Num exemplo, estas células podem ser em seguida isoladas e novamente misturadas com esférulas magnéticas acopladas a um anticorpo contra marcadores da superfície celular adicionais. As células são novamente feitas passar através de um campo magnético, isolando as células que ligaram ambos os anticorpos. Tais células podem ser em seguida diluídas em placas separadas, tais como placas microtítulo para isolamento clonal.
As células estaminais placentárias podem ser também caracterizadas e/ou separadas com base na morfologia das células e características de crescimento. Por exemplo, as células estaminais placentárias podem ser caracterizadas como tendo, e/ou selecionadas com base em, e.g., um aspeto fibroblastoide em cultura. As células estaminais placentárias podem ser também caracterizadas como tendo, e/ou ser selecionadas, com base na sua capacidade para formar corpos de tipo embrioide. Por exemplo, as células placentárias que são de forma fibroblastoide, expressam CD73 e CD105, e produzem um ou mais corpos de tipo embrioide em cultura são isoladas de outras células placentárias. Noutro exemplo, células placentárias 0CT-4+ que produzem um ou mais corpos de tipo embrioide em cultura são isoladas de outras células placentárias.
Noutro aspeto, as células estaminais placentárias podem ser identificadas e caracterizadas por um ensaio de unidades formadoras de colónias. Os ensaios de unidades formadoras de colónias são comummente conhecidos na técnica, tal como o meio MESEN CULT™ (Stem Cell Technologies, Inc., Vancouver British Columbia)
As células estaminais placentárias podem ser avaliadas quanto à viabilidade, potencial de proliferação, e longevidade utilizando técnicas convencionais conhecidas na técnica, tais como ensaio de exclusão com azul de tripano, ensaio de captação de diacetato de fluoresceina, ensaio de captação de iodeto de propídio (para avaliar a viabilidade); e ensaio de captação de timidina, ensaio de proliferação celular MTT (para avaliar a proliferação). A longevidade pode ser determinada por métodos bem conhecidos na técnica, tais como através da determinação do número máximo de duplicação da população numa cultura prolongada.
As células estaminais placentárias podem ser também separadas de outras células placentárias utilizando outras técnicas conhecidas na matéria, e.g., crescimento seletivo de células desejadas (seleção positiva), destruição seletiva de células indesejadas (seleção negativa); separação com base na capacidade de aglutinação diferencial de células na população mista como, por exemplo, com aglutinina de soja; procedimentos de congelação-descongelação; filtração; centrifugação convencional e zonal; elutriação centrífuga (centrifugação em contracorrente) ; separação por gravidade unitária; distribuição em contracorrente; eletroforese; e semelhantes.
5.3 CULTURA DE CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS 5.3.1 Meios de cultura
As células estaminais placentárias isoladas, ou população de células estaminais placentárias, ou células ou tecido placentário do qual crescem células estaminais placentárias, podem ser utilizados para iniciar, ou inocular, culturas de células. As células são geralmente transferidas para vasos de cultura de tecido estéreis quer não revestidos ou revestidos com matriz extracelular ou ligandos tais como laminina, colagénio (e.g., nativo ou desnaturado), gelatina, fibronectina, ornitina, vitronectina e proteína da membrana extracelular (e.g., MATRIGEL® (BD Discovery Labware, Bedford, Massa.)).
As células estaminais placentárias podem ser cultivadas em qualquer meio, e sob quaisquer condições, reconhecidas na técnica como aceitáveis para a cultura de células estaminais. Preferencialmente, o meio de cultura compreende soro. As células estaminais placentárias podem ser cultivadas, por exemplo, em DMEM-LG (Meio Essencial Modificado por Dulbecco, glicose baixa)/MCDB 201 (meio basal de fibroblastos de pinto) que contém ITS (insulina-transferrina-selénio), LA+BSA (ácido linoleico-albumina de soro bovino), dextrose, ácido L-ascórbico, PDGF, EGF, IGF-1, e penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (glicose alta) que compreende 10% de soro fetal bovino (FBS); DMEM-HG que compreende 15% de FBS; IMDM (Meio de Dulbecco modificado por Iscove) que compreende 10% de FBS, 10% de soro de cavalo e hidrocortisona; M199 que compreende 10% de FBS, EGF e heparina; α-MEM (meio essencial mínimo) que compreende 10% de FBS, GLUTAMAX™ e gentamicina; DMEM que compreende 10% de FBS, GLUTAMAX™ e gentamicina, etc. Um meio preferido é DMEM-LG/MCDB-201 que compreende 2% de FBS, ITS, LA+BSA, dextrose, ácido L-ascórbico, PDGF, EGF e penicilina/estreptomicina.
Outros meios que podem ser utilizados para a cultura de células estaminais placentárias incluem DMEM (glicose alta ou baixa) , meio basal de Eagle, meio F10 de Ham (F10), meio F-12 de Ham (F12), meio de Dulbecco modificado por Iscove, Meio de Crescimento de Células Estaminais Mesenquimatosas (MSCGM), meio L-15 de Liebovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM avançado (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma) e CELL-GRO FREE. O meio de cultura pode ser suplementado com um ou mais componentes incluindo, por exemplo, soro (e.g., soro fetal bovino (FBS), preferencialmente cerca de 2-15% (v/v); soro equino (cavalo) (ES); soro humano (HS)); beta-mercaptoetanol (BME), preferencialmente cerca de 0,001% (v/v); um ou mais fatores de crescimento, por exemplo, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), fator de crescimento análogo a insulina-1 (IGF-1), fator inibidor de leucemia (LIF), fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), e eritropoietina (EPO); aminoácidos, incluindo L-valina; e um ou mais antibiótico e/ou agentes antimicóticos para controlar a contaminação microbiano, tal como, por exemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina e nistatina, quer sozinhos ou em combinação.
As células estaminais placentárias podem ser cultivadas em condições de cultura de tecido padrão, e.g., em placas ou placas multipoço de cultura de tecido. As células estaminais placentárias podem ser também cultivadas utilizando um método de gota suspensa. Neste método, as células estaminais placentárias são suspensas a cerca de 1 x 104 células por mL em cerca de 5 mL de meio, e uma ou mais gotas do meio são colocadas dentro da tampa de um recipiente de cultura de tecidos, e.g., uma placa Petri de 100 mL. As gotas podem ser, e.g., gotas individuais, ou múltiplas gotas de, e.g., uma pipeta multicanal. A tampa é cuidadosamente invertida e colocada por cima do fundo da placa, que contém um volume de liquido, e.g., PBS estéril suficiente para manter o teor de humidade na atmosfera da placa, e as células estaminais são cultivadas.
Numa forma de realização, as células estaminais placentárias são cultivadas na presença de um composto que atua para manter um fenótipo indiferenciado na célula estaminal placentária. Numa forma de realização especifica, o composto é uma 3,4-di-hidropiridimol[4,5-d]pirimidina substituída. Numa forma de realização mais específica, o composto é um composto que tem a seguinte estrutura química:
0 composto pode ser posto em contacto com uma célula estaminal placentária, ou população de células estaminais placentárias, a uma concentração de, por exemplo, entre cerca de 1 μΜ a cerca de 10 μΜ. 5.3.2 Expansão e Proliferação de Células Estaminais Placentárias
Uma vez uma célula estaminal placentária isolada, ou população isolada de células estaminais (e.g., uma célula estaminal ou população de células estaminais separadas de pelo menos 50% das células placentárias com as quais a célula estaminal ou população de células estaminais está normalmente associada in vivo), a célula estaminal ou população de células estaminais pode ser proliferada e expandida in vitro. Por exemplo, uma população de células estaminais placentárias pode ser cultivada em recipientes de cultura de tecidos, e.g., placas, balões, placas multipoço, ou semelhantes, durante um tempo suficiente para que as células estaminais proliferem até 70-90% de confluência, isto é, até as células estaminais e a sua descendência ocupar 70-90% da área superficial da cultura do recipiente de cultura de tecidos.
As células estaminais placentárias podem ser inoculadas em vasos de cultura a uma densidade que permita o crescimento de células. Por exemplo, as células podem ser inoculadas a baixa densidade (e.g., cerca de 1 000 a cerca de 5 000 células/cm2) até alta densidade (e.g., cerca de 50 000 ou mais células/cm2) . Por exemplo, as células são cultivadas a cerca de 0 a cerca de 5 por cento em volume de CO2 em ar. Nalguns exemplos preferidos, as células são cultivadas a cerca de 2 a cerca de 25 por cento de O2 em ar, preferencialmente cerca de 5 a cerca de 20 por cento de O2 em ar. As células são preferencialmente cultivadas a cerca de 25 °C a cerca de 40 °C, preferencialmente 37 °C. As células são preferencialmente cultivadas numa incubadora. O meio de cultura pode ser estático ou agitado, por exemplo, utilizando um biorreator. As células estaminais placentárias são preferencialmente cultivadas sob baixo stress oxidativo (e.g., com adição de glutationa, ácido ascórbico, catalase, tocoferol, N-acetilcisteina, ou semelhantes).
Uma vez obtido 70%-90% de confluência, as células podem ser passadas. Por exemplo, as células podem ser tratadas enzimaticamente, e.g., tripsinizadas, utilizando técnicas bem conhecidas na matéria, para separá-las da superfície da cultura de tecido. Depois de retirar as células por pipetagem e contar as células, cerca de 20 000-100 000 células estaminais, preferencialmente cerca de 50 000 células estaminais, são passadas para um novo recipiente de cultura que contém meio de cultura fresco. Tipicamente, o novo meio é o mesmo tipo de meio de onde foram retiradas as células estaminais. A invenção abrange populações de células estaminais placentárias que foram passadas pelo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 vezes, ou mais. 5.3.3 Populações_de_Células_Estaminais
Placentárias A invenção refere-se a populações específicas de células estaminais placentárias. A população de células estaminais placentárias pode ser isolada diretamente de uma ou mais placentas; isto é, a população de células estaminais placentárias pode ser uma população de células placentárias que compreende células estaminais placentárias obtidas a partir de, ou contidas em, um perfusato, ou obtidas a partir de, ou contidas em, um tecido placentário rompido, e.g., produto de digestão de tecido placentário (isto é, a colheita de células obtidas por digestão enzimática de uma placenta ou parte da mesma). As células estaminais placentárias isoladas da invenção podem ser também cultivadas e expandidas para produzir populações de células estaminais placentárias. As populações de células placentárias que compreendem células estaminais placentárias podem ser também cultivadas e expandidas para produzir populações de células estaminais placentárias.
As populações de células estaminais placentárias aqui divulgadas compreendem células estaminais placentárias, por exemplo, células estaminais placentárias como aqui descritas. Em várias formas de realização, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% das células numa população isolada de células estaminais placentárias são células estaminais placentárias. Isto é, uma população de células estaminais placentárias pode compreender, e.g., tanto como 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de células não estaminais. A invenção proporciona métodos de produção de uma população isolada de células estaminais placentárias da invenção, e.g., através da seleção de células estaminais placentárias, quer derivadas de digestão enzimática ou perfusão, que expressam marcadores particulares e/ou caracteristicas de cultura ou morfológicas particulares. Num aspeto, por exemplo, a invenção proporciona um método de produção de uma população de células que compreende selecionar células placentárias que (a) aderem a um substrato, e (b) expressam CD200 e HLA-G; e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, é divulgado um método de produção de uma população de células que compreende a identificação de células placentárias que expressam CD200 e HLA-G, e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, o método de produção de uma população de células compreende selecionar as células placentárias que (a) aderem a um substrato, e (b) expressam CD73, CD105 e CD200; e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, é aqui divulgado um método de produção de uma população de células que compreende identificar as células placentárias que expressam CD73, CD105 e CD200, e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, o método de produção de uma população de células compreende selecionar células placentárias que (a) aderem a um substrato e (b) expressam CD200 e OCT-4; e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, é aqui divulgado um método de produção de uma população de células que compreende identificar células placentárias que expressam CD200 e OCT-4, e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, o método de produção de uma população de células compreende selecionar células placentárias que (a) aderem a um substrato, (b) expressam CD73 e CD105, e (c) facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a referida célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de um corpo de tipo embrioide; e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, é aqui divulgado um método de produção de uma população de células que compreende identificar células placentárias que expressam CD73 e CD105, e facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a referida célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de um corpo de tipo embrioide, e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, o método de produção de uma população de células compreende selecionar células placentárias que (a) aderem a um substrato, e (b) expressam CD73, CD105 e HLA-G; e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, é aqui divulgado um método de produção de uma população de células que compreende identificar células placentárias que expressam CD73, CD105 e HLA-G, e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, o método de produção de uma população de células compreende selecionar células placentárias que (a) aderem a um substrato, (b) expressam OCT-4, e (c) facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a referida célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de um corpo de tipo embrioide; e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. Noutro aspeto, é aqui divulgado um método de produção de uma população de células que compreende identificar células placentárias que expressam OCT-4, e facilitar a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a referida célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de um corpo de tipo embrioide, e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células.
Tais populações de células podem ser utilizadas para tratar qualquer uma das doenças ou condições listadas a seguir. Tais populações de células podem ser também utilizadas para avaliar as populações de células estaminais placentárias, e.g., como parte de um método de controlo de qualidade.
Em qualquer um dos aspetos anteriores, o método pode compreender adicionalmente a seleção de células placentárias que expressam ABC-p (uma proteína transportadora ABC específica da placenta; ver, e.g., Allikmets et al., Câncer Res. 58(23):5337-9 (1998)). 0 método pode compreender também a seleção de células que exibem pelo menos uma característica específica, e.g., paria uma célula estaminal mesenquimatosa, por exemplo, expressão de CD29, expressão de CD44, expressão de CD90, ou expressão de uma combinação dos anteriores.
Nas formas de realização anteriores, o substrato pode ser qualquer superfície onde se possa conseguir a cultura e/ou seleção de células, e.g., células estaminais placentárias. Tipicamente, o substrato é plástico, e.g., plástico da placa ou placa multipoço de cultura de tecidos. 0 plástico da cultura de tecidos pode ser revestido com um biomolécula, e.g., laminina ou fibronectina.
As células, e.g., células estaminais placentárias, podem ser selecionadas para uma população de células estaminais placentárias por qualquer meio conhecido na técnica de seleção de células. Por exemplo, as células podem ser selecionadas utilizando um anticorpo ou anticorpos para um ou mais marcadores da superfície celular, por exemplo, por citometria de fluxo ou FACS. A seleção pode ser conseguida utilizando anticorpos em conjunto com esférulas magnéticas. Os anticorpos que são específicos para certos marcadores relacionados com células estaminais são conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos contra OCT-4 (Abcam, Cambridge, MA), CD200 (Abcam), HLA-G (Abcam), CD73 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), CD105 (Abcam; BioDesign International, Saco, ME) , etc. Anticorpos contra outros marcadores estão também comercialmente disponíveis, e.g., CD34, CD38 e CD45 estão disponíveis de, e.g., StemCell Technologies ou BioDesign International. A população isolada de células estaminais placentárias pode compreender células placentárias que não são células estaminais, ou células que não são células placentárias.
As populações de células estaminais placentárias isoladas podem ser combinadas com uma ou mais populações de células não estaminais ou células não placentárias. Por exemplo, uma população isolada de células estaminais placentárias pode ser combinada com sangue (e.g., sangue placentário ou sangue do cordão umbilical) , células estaminais derivadas de sangue (e.g., células estaminais derivadas de sangue placentário ou sangue do cordão umbilical), células estaminais do cordão umbilical, populações de células nucleadas derivadas de sangue, células mesenquimatosas derivadas de medula óssea, populações de células estaminais derivadas de osso, medula óssea em bruto, células estaminais adultas (somáticas), populações de células estaminais contidas dentro de tecido, células estaminais cultivadas, populações de células totalmente diferenciadas (e.g., condrócitos, fibroblastos, células amnióticas, osteoblastos, células musculares, células cardíacas, etc.) e semelhantes. Num aspeto específico, é aqui divulgada, uma população de células estaminais que compreende células estaminais placentárias e células estaminais do cordão umbilical. As células numa população de células estaminais placentárias isoladas podem ser combinadas com uma multiplicidade de células de outro tipo em proporções de cerca de 100 000 000:1, 50 000 000:1, 20 000 000:1, 10 000 000:1, 5 000 000:1, 2 000 000:1, 1 000 000:1, 500 000:1, 200 000:1, 100 000:1, 50 000:1, 20 000:1, 10 000:1, 5 000:1, 2 000:1, 1 000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1,10:1,5:1,2:1,1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1 000; 1:2 000; 1:5 000; 1:10 000; 1:20 000; 1:50 000; 1:100 000; 1:500 000; 1:1 000 000; 1:2 000 000; 1:5 000 000; 1:10 000 000; 1:20 000 000; 1:50 000 000; ou cerca de 1:100 000 000, comparando o número de células nucleadas totais em cada população. As células numa população isolada de células estaminais placentárias podem ser também combinadas com uma multiplicidade de células de uma multiplicidade de tipos de células.
Num aspeto, uma população isolada de células estaminais placentárias é combinada com uma multiplicidade de células estaminais hematopoiéticas. Tais células estaminais hematopoiéticas podem estar, por exemplo, contidas dentro de sangue placentário, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico não processado; em células nucleadas totais de sangue placentário, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico; numa população isolada de células CD34+ de sangue placentário, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico; em medula óssea não processada; em células nucleadas totais de medula óssea; numa população isolada de células CD34+ de medula óssea, ou semelhantes.
5.4 PRODUÇÃO DE BANCO DE CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS
As células estaminais de placentas pós-parto podem ser cultivadas num número de maneiras diferentes para produzir um conjunto de lotes, e.g., um conjunto de doses que podem ser administradas individualmente, de células estaminais placentárias. Por exemplo, tais lotes podem ser obtidos a partir de células estaminais de perfusato placentário ou de tecido placentário digerido com enzimas. Os conjuntos de lotes de células estaminais placentárias, obtidos a partir de uma multiplicidade de placentas, podem ser organizados num banco de células estaminais placentárias, e.g., para conservação a longo prazo. Em geral, as células estaminais aderentes são obtidas a partir de uma cultura inicial de material placentário para formar uma cultura de inoculação, que é expandida sob condições controladas para formar populações de células com números de duplicação aproximadamente equivalentes. Os lotes são preferencialmente derivados do tecido de uma única placenta, mas podem ser derivados do tecido de uma multiplicidade de placentas.
Numa forma de realização, os lotes de células estaminais são obtidos como se segue. 0 tecido placentário é primeiro rompido, e.g., por trituração, digerido com uma enzima adequada, e.g., colagenase (ver Secção 5.2.3, acima). 0 tecido placentário compreende preferencialmente, e.g., o âmnio inteiro, cório inteiro, ou ambos, de uma única placenta, mas pode compreender apenas uma parte do âmnio ou cório. 0 tecido digerido é cultivado, e.g., durante cerca de 1-3 semanas, preferencialmente cerca de 2 semanas. Após remoção das células não aderentes, as colónias de alta densidade que se formam são recolhidas, e.g., por tripsinização. Estas células são recolhidas e ressuspensas num volume conveniente de meio de cultura, e definidas como células de Passagem 0.
As células de Passagem 0 são em seguida utilizadas para inocular culturas de expansão. As culturas de expansão podem ser qualquer arranjo de aparelhos de cultura de células separados, e.g., uma Fábrica de Células de NUNC™. As células na cultura de Passagem 0 podem ser subdivididas em qualquer grau de forma a inocular culturas de expansão com, e.g., 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 1 x 104, 1 x 104, 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104 ou 10 x 104 células estaminais.
Preferencialmente, desde cerca de 2 x 104 a cerca de 3 x 104 células de Passagem 0 são utilizadas para inocular cada cultura de expansão. O número de culturas de expansão pode depender do número de células de Passagem 0, e pode ser maior ou menor em número dependendo da(s) placenta(s) particular (es) de onde são obtidas as células estaminais.
As culturas de expansão são cultivadas até a densidade de células em cultura atingir um certo valor, e.g., cerca de 1 x 105 células/cm2. As células podem ser recolhidas e crioconservadas neste ponto, ou passadas para novas culturas de expansão como descrito acima. As células podem ser passadas, e.g., 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 vezes antes de se usar. Um registo do número acumulativo de duplicações da população é preferencialmente mantido durante a(s) cultura (s) de expansão. As células de uma cultura de Passagem 0 podem ser expandidas durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ou 40 duplicações, ou até 60 duplicações. No entanto, preferencialmente, o número de duplicações da população, antes de dividir a população de células para doses individuais, é entre cerca de 15 e cerca de 30, preferencialmente cerca de 20 duplicações. As células podem ser cultivadas continuamente ao longo do processo de expansão, ou podem ser congeladas em um ou mais pontos durante a expansão.
As células a serem utilizadas para doses individuais podem ser congeladas, e.g., crioconservadas para utilização posterior. As doses individuais podem compreender, e.g., cerca de 1 milhão a cerca de 100 milhões de células por mL, e podem compreender entre cerca de 106 e cerca de 109 células no total.
Numa forma de realização especifica do método, as células de Passagem 0 são cultivadas durante um primeiro número de duplicações, e.g., aproximadamente 4 duplicações, em seguida congeladas num primeiro banco de células. As células do primeiro banco de células são congeladas e utilizadas para inocular um segundo banco de células, cujas células são expandidas durante um segundo número de duplicações, e.g., cerca de mais oito duplicações. As células nesta etapa são recolhidas e congeladas e utilizadas para inocular novas culturas de expansão que são deixadas prosseguir durante um terceiro número de duplicações, e.g., cerca de oito duplicações adicionais, o que traz o número acumulativo de duplicações de células para cerca de 20. As células nos pontos intermédios de passagem podem ser congeladas em unidades de cerca de 100 000 a cerca de 10 milhões de células por mL, preferencialmente cerca de 1 milhão de células por mL para utilização numa cultura de expansão subsequente. As células a cerca de 20 duplicações podem ser congeladas em doses individuais entre cerca de 1 milhão a cerca de 100 milhões de células por mL para administração ou utilização na preparação de uma composição que contém células estaminais.
Portanto, numa forma de realização a invenção proporciona um método de preparação de um banco de células estaminais placentárias, que compreende: expandir células estaminais placentárias de cultura primária a partir de uma placenta humana pós-parto durante uma primeira multiplicidade de duplicações da população; crioconservar as referidas células estaminais placentárias para formar um Banco de Células Primárias; expandir uma multiplicidade de células estaminais placentárias do Banco de Células Primárias durante uma segunda multiplicidade de duplicações da população; crioconservar as referidas células estaminais placentárias para formar um Banco de Células de Trabalho; expandir uma multiplicidade de células estaminais placentárias do Banco de Células de Trabalho durante uma terceira multiplicidade de duplicações da população; e crioconservar as referidas células estaminais placentárias em doses individuais, em que as referidas doses individuais constituem coletivamente um banco de células estaminais placentárias. Numa forma de realização especifica, o número total de duplicações da população é de cerca de 20. Noutra forma de realização especifica, a referida primeira multiplicidade de duplicações da população é de cerca de quatro duplicações da população; a referida segunda multiplicidade de duplicações da população é de cerca de oito duplicações da população; e a referida terceira multiplicidade de duplicações da população é de cerca de oito duplicações da população. Noutra forma de realização especifica, as referidas células estaminais placentárias de cultura primária compreendem células estaminais placentárias de perfusato placentário. Noutra forma de realização especifica, as referidas células estaminais placentárias de cultura primária compreendem células estaminais placentárias de tecido placentário digerido. Noutra forma de realização especifica, as referidas células estaminais placentárias de cultura primária compreendem células estaminais placentárias de perfusato placentário e de tecido placentário digerido. Noutra forma de realização especifica, todas as referidas células estaminais placentárias na referida cultura primária de células estaminais placentárias são da mesma placenta. Num aspeto, o método compreende ainda o passo de seleção de células estaminais placentárias CD200+ ou HLA-G+ da referida multiplicidade das referidas células estaminais placentárias do referido Banco de Células de Trabalho para formar doses individuais. Noutro aspeto, as referidas doses individuais compreendem desde cerca de 104 a cerca de 105 células estaminais placentárias. Noutro aspeto, as referidas doses individuais compreendem desde cerca de 105 a cerca de 106 células estaminais placentárias. Noutro aspeto, as referidas doses individuais compreendem desde cerca de 106 a cerca de 107 células estaminais placentárias. Noutro aspeto, as referidas doses individuais compreendem desde cerca de 107 a cerca de 108 células estaminais placentárias.
Numa forma de realização preferida, o doador do qual é obtida a placenta (e.g., a mãe) é testado para pelo menos um agente patogénico. Se a mãe der um teste positivo para um agente patogénico testado, todo o lote da placenta é rejeitado. Um tal teste pode ser realizado em qualquer altura durante a produção dos lotes de células estaminais placentárias, incluindo antes ou após o estabelecimento das células de Passagem 0, ou durante a cultura de expansão. Os agentes patogénicos cuja presença é testada podem incluir, sem limitação, hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite D, hepatite E, virus da imunodeficiência humana (tipos I e II), citomegalovirus, herpesvírus, e semelhantes.
5.5 DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS 5.5.1 Indução da Diferenciação em Células Neuronais ou Neurogénicas A diferenciação neuronal de células estaminais placentárias pode ser conseguida, por exemplo, colocando células estaminais placentárias em condições de cultura de células que induzem diferenciação em neurónios. Num método ilustrativo, um meio neurogénico compreende DMEM/20% de FBS e betamercaptoetanol 1 mM; um tal meio pode ser substituído após cultivo durante cerca de 24 horas com meio que consiste em DMEM e betamercaptoetanol 1-10 mM. Noutra forma de realização, as células são postas em contacto com DMEM/2% de DMSO/hidroxianisole butilado 200 μΜ. Numa forma de realização específica, o meio de diferenciação compreende DMEMIF-12 sem soro, hidroxianisole butilado, cloreto de potássio, insulina, forscolina, ácido valproico, e hidrocortisona. Noutra forma de realização, a diferenciação neuronal é conseguida por plaqueamento de células estaminais placentárias sobre placas revestidas com laminina em meio Neurobasal-A (Invitrogen, Carlsbad CA) que contém suplemento B27 e L-glutamina, opcionalmente suplementado com bFGF e/ou EGF. As células estaminais placentárias podem ser também induzidas em diferenciação neuronal por co-cultura com células neuronais, ou cultura em meio condicionado com neurónios. A diferenciação neuronal pode ser avaliada, e.g., por deteção de morfologia do tipo neurónio (e.g., células bipolares que compreendem processos de extensão), deteção da expressão, e.g., do recetor do fator de crescimento de tecido nervoso e genes da cadeia pesada de neurofilamentos por RT-PCR; ou deteção da atividade elétrica, e.g., por contacto hermético. Considera-se que uma célula estaminal placentária se diferenciou numa célula neuronal quando a célula apresenta uma ou mais destas características. 5.5.2 Indução de Diferenciação em Células Adipogénicas A diferenciação adipogénica de células estaminais placentárias pode ser conseguida, por exemplo, colocando células estaminais placentárias em condições de cultura de células que induzem a diferenciação em adipócitos. Um meio adipogénico preferido compreende MSCGM (Cambrex) ou DMEM suplementado com 15% de soro de sangue do cordão. Numa forma de realização, as células estaminais placentárias são alimentadas com Meio de Indução de Adipogénese (Cambrex) e cultivadas durante 3 dias (a 37 °C, 5% de CO2) , seguido de 1-3 dias de cultura em Meio de Indução de Adipogénese (Cambrex). Após 3 ciclos completos de indução/manutenção, as células são cultivadas durante mais 7 dias em meio de manutenção de adipogénese, substituindo o meio a cada 2-3 dias.
Noutra forma de realização, as células estaminais placentárias são cultivadas em meio que compreende dexametasona 1 μΜ, indometacina 0,2 mM, 0,01 mg/mL de insulina, IBMX 0,5 mM, DMEM-alta glicose, FBS e antibióticos. As células estaminais placentárias podem ser também induzidas para a adipogénese por cultura em meio que compreende um ou mais glicocorticoides (e.g., dexametasona, indometasona, hidrocortisona, cortisona), insulina, um composto que aumenta os níveis intracelulares de cAMP (e.g., dibutiril-cAMP; 8-CPT-cAMP (8-(4)clorofeniltio)-adenosina, 3',5'-monofosfato cíclico); 8-bromo-cAMP; dioctanoil-cAMP; forscolina) e/ou um composto que inibe a degradação de cAMP (e.g., um inibidor da fosfodiesterase tal como isobutilmetilxantina (IBMX), metilisobutilxantina, teofilina, cafeína, indometacina).
Uma marca distintiva de adipogénese é o desenvolvimento de múltiplas vesículas de lípidos intracitoplasmáticos que podem ser facilmente observadas utilizando o óleo de revelação lipófilo vermelho O. A expressão de genes de lipase e/ou proteína de ligação de ácidos gordos é confirmada por RT/PCR em células estaminais placentárias que começaram a diferenciar-se em adipócitos. Considera-se que uma célula estaminal placentária se diferenciou numa célula adipocítica quando a célula apresenta um ou mais destas características. 5.5.3 Indução da Diferenciação em Células
Condrocíticas A diferenciação condrogénica de células estaminais placentárias pode ser conseguida, por exemplo, colocando células estaminais placentárias em condições de cultura de células que induzem a diferenciação em condrócitos. Um meio condrocitico preferido compreende MSCGM (Cambrex) ou DMEM suplementado com 15% de soro de sangue do cordão. Numa forma de realização, as células estaminais placentárias são divididas em alíquotas num tubo de polipropileno estéril, centrifugadas (e.g., a 150 x g durante 5 minutos), e lavadas duas vezes em Meio de Condrogénese Incompleto (Cambrex). As células são ressuspensas em Meio de Condrogénese Completo (Cambrex) que contém 0,01 yg/mL de TGF-beta-3 a uma concentração de cerca de 1-20 x 105 células/mL. Noutras formas de realização, as células estaminais placentárias são postas em contacto com fatores de crescimento exógenos, e.g., GDF-5 ou fator de crescimento transformante beta3 (TGF-beta3), com ou sem ascorbato. O meio condrogénico pode ser suplementado com aminoácidos incluindo prolina e glutamina, piruvato de sódio, dexametasona, ácido ascórbico e insulina/transferrina/selénio. O meio condrogénico pode ser suplementado com hidróxido de sódio e/ou colagénio. As células estaminais placentárias podem ser cultivadas a alta ou baixa densidade. As células são preferencialmente cultivadas na ausência de soro. A condrogénese pode ser avaliada, e.g., por observação da produção de substância de base eosinofilica, revelação com safranina-0 para a expressão de glicosaminoglicano; revelação com hematoxilina/eosina, avaliação da morfologia das células e/ou confirmação por RT/PCR da expressão dos genes de colagénio 2 e colagénio 9. A condrogénese pode ser também observada cultivando as células estaminais num sedimento, que se forma, e.g., centrifugando suavemente células estaminais em suspensão (e.g., a cerca de 800 g durante cerca de 5 minutos) . Após cerca de 1-28 dias, o sedimento de células estaminais começa a formar uma matriz dura e demonstra uma integridade estrutural que não se encontra em linhas de células não induzidas, ou não condrogénicas, cujos sedimentos tendem a desagregar-se quando expostos. A condrogénese pode ser também demonstrada, e.g., nesses sedimentos celulares, por revelação com um corante que revela colagénio, e.g., Sirius Red, e/ou um corante que revela glicosaminoglicanos (GAGs), tal como, e.g., Azul de Alciano. Considera-se que uma célula estaminal placentária se diferenciou numa célula condrocitica quando a célula apresenta uma ou mais destas caracteristicas. 5.5.4 Indução de Diferenciação em Células
Osteocíticas A diferenciação osteogénica de células estaminais placentárias pode ser conseguida, por exemplo, colocando células estaminais placentárias em condições de cultura de células que induzem a diferenciação em osteócitos. Um meio osteocitico preferido compreende MSCGM (Cambrex) ou DMEM suplementado com 15% de soro de sangue do cordão, seguido de Meio de Indução Osteogénico (Cambrex) que contém dexametasona 0,1 μΜ, ácido ascórbico-2-fosfato 0,05 mM, beta-glicerofosfato 10 mM. Noutra forma de realização, as células estaminais placentárias são cultivadas em meio (e.g., DMEM-baixa glicose) que contém cerca de 10-7 a cerca de 10“9 M de dexametasona, cerca de 10-50 μΜ de sal de fosfato de ascorbato (e.g., ascorbato-2-fosfato) e cerca de 10 nM a cerca de 10 mM de β-glicerofosfato. O meio osteogénico pode incluir também soro, um ou mais agentes antibióticos/antimicóticos, fator de crescimento transformante-beta (e.g., TGF-βΙ) e/ou proteína morf ogenética do osso (e.g., BMP-2, BMP-4, ou uma combinação dos mesmos). A diferenciação pode ser analisada utilizando um corante específico para cálcio, e.g., corante de von Kossa, e deteção por RT/PCR, e.g., da expressão dos genes de fosfatase alcalina, osteocalcina, sialoproteína óssea e/ou osteopontina. Considera-se que uma célula estaminal placentária se diferenciou numa célula osteocítica quando a célula apresenta uma ou mais destas características. 5.5.5 Indução de Diferenciação em Células Pancreáticas A diferenciação de células estaminais placentárias em células pancreáticas produtoras de insulina pode ser conseguida, por exemplo, colocando células estaminais placentárias em condições de cultura de células que induzem a diferenciação em células pancreáticas.
Um exemplo de meio pancreagénico compreende DMEM/20% de CBS, suplementado com fator de crescimento de fibroblastos básico, 10 ng/mL; e fator de crescimento transformante beta-1, 2 ng/mL. Este meio é combinado com meios condicionados de culturas de células neuronais positivas para nestina a 50/50 v/v. Pode utilizar-se Substituição de Soro Inativado em vez de CBS. As células são cultivadas durante 14-28 dias, realimentadas a cada 3-4 dias. A diferenciação pode ser confirmada analisando, e.g., a produção da proteína insulina, ou a expressão do gene de insulina por RT/PCR. Considera-se que uma célula estaminal placentária se diferenciou numa célula pancreática quando a célula apresenta uma ou mais destas características. 5.5.6 Indução de Diferenciação em Células
Cardíacas A diferenciação miogénica (cardiogénica) de células estaminais placentárias pode ser conseguida, por exemplo, colocando células estaminais placentárias em condições de cultura de células que induzem a diferenciação em cardiomiócitos. Um meio cardiomiocítico preferido compreende DMEM/20% de CBS suplementado com ácido retinoico, 1 μΜ; fator de crescimento de fibroblastos básico, 10 ng/mL; e fator de crescimento transformante beta-1, 2 ng/mL; e fator de crescimento epidérmico, 100 ng/mL. Pode utilizar-se Substituição de Soro Inativado (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) em vez de CBS. Alternativamente, as células estaminais placentárias são cultivadas em DMEM/20% de CBS suplementado com 50 ng/mL de Cardiotrofina-1 durante 24 horas. Noutra forma de realização, as células estaminais placentárias podem ser cultivadas 10-14 dias em meio sem proteína durante 5-7 dias, em seguida estimuladas com extrato de miocárdio humano, e.g., produzido homogeneizando o miocárdio humano em tampão de HEPES a 1% suplementado com 1% de soro de sangue do cordão. A diferenciação pode ser confirmada através da demonstração da expressão do gene de actina cardíaca, e.g., por RT/PCR, ou por pancada visível da célula. Considera-se gue uma célula estaminal placentária se diferenciou numa célula cardíaca quando a célula apresenta uma ou mais destas características.
5.6 CONSERVAÇÃO DE CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS
As células estaminais placentárias podem ser conservadas, isto é, colocadas sob condições que permitem a conservação a longo prazo, ou condições que inibem a morte celular, e.g., por apoptose ou necrose.
As células estaminais placentárias podem ser conservadas utilizando, e.g., uma composição que compreende um inibidor de apoptose, inibidor de necrose e/ou um perfluorocarboneto portador de oxigénio, como descrito no Pedido Provisório U.S. N.° 60/754,969 relacionado, intitulado "Improved Médium for Collecting Placental Stem Cells and Preserving Organs," submetido em 25 de dezembro de 2 0 05. É aqui divulgado um método de conservação de uma população de células estaminais que compreende pôr em contacto a referida população de células estaminais com uma composição de colheita de células estaminais que compreende um inibidor de apoptose e um perfluorocarboneto portador de oxigénio, em que o referido inibidor de apoptose está presente numa quantidade e durante um tempo suficiente para reduzir ou prevenir a apoptose na população de células estaminais, em comparação com uma população de células estaminais que não é posta em contacto com o inibidor de apoptose. Num aspeto especifico, o referido inibidor de apoptose é um inibidor de caspase. Noutro aspeto especifico, o referido inibidor de apoptose é um inibidor de JNK. Num aspeto mais especifico, o referido inibidor de JNK não modula a diferenciação ou proliferação das referidas células estaminais. Noutro aspeto, a referida composição de colheita de células estaminais compreende o referido inibidor de apoptose e o referido perfluorocarboneto portador de oxigénio em fases separadas. Noutro aspeto, a referida composição de colheita de células estaminais compreende o referido inibidor de apoptose e o referido perfluorocarboneto portador de oxigénio numa emulsão. Noutro aspeto, a composição de colheita de células estaminais compreende adicionalmente um emulsionante, e.g., lecitina. Noutro aspeto, o referido inibidor de apoptose e o referido perfluorocarboneto estão entre cerca de 0 °C e cerca de 25 °C, no momento em que são postos em contacto com as células estaminais. Noutro aspeto mais especifico, o referido inibidor de apoptose e o referido perf luorocarboneto estão entre cerca de 2 °C e 10 °C, ou entre cerca de 2 °C e cerca de 5 °C, no momento em que são postos em contacto com as células estaminais. Noutro aspeto mais especifico, a referida colocação em contacto é realizada durante o transporte da referida população de células estaminais. Noutro aspeto mais especifico, a referida colocação em contacto é realizada durante a congelação e descongelação da referida população de células estaminais.
Além disso, é aqui divulgado um método de conservação de uma população de células estaminais placentárias que compreende pôr em contacto a referida população de células estaminais com um inibidor de apoptose e um composto de conservação de órgãos, em que o referido inibidor de apoptose está presente numa quantidade e durante um tempo suficiente para reduzir ou prevenir a apoptose na população de células estaminais, em comparação com uma população de células estaminais que não é posta em contacto com o inibidor de apoptose. Num aspeto especifico, o composto de conservação de órgãos é solução de UW (descrita na Patente U.S. N.° 4,798,824; também conhecida como ViaSpan; ver também Southard et al., Transplantation 49(2):251-257 (1990)) ou uma solução descrita em Stern et al., Patente U.S. N.° 5, 552,267. Noutro aspeto, o referido composto de conservação de órgãos é hidroxietilamido, ácido lactobiónico, rafinose, ou uma combinação dos mesmos. Noutro aspeto, a composição de colheita de células estaminais compreende adicionalmente um perfluorocarboneto portador de oxigénio, quer em duas fases ou como uma emulsão.
Noutro aspeto do método, as células estaminais placentárias são postas em contacto com uma composição de colheita de células estaminais que compreende um inibidor de apoptose e perfluorocarboneto portador de oxigénio, composto de conservação de órgãos, ou combinação dos mesmos, durante a perfusão. Noutro aspeto, as referidas células estaminais são postas em contacto durante um processo de rutura do tecido, e.g., digestão enzimática. Noutro aspeto, as células estaminais placentárias são postas em contacto com o referido composto de colheita de células estaminais após a colheita por perfusão, ou após a colheita por rutura do tecido, e.g., digestão enzimática.
Tipicamente, durante a colheita, enriquecimento e isolamento das células placentárias, é preferível minimizar ou eliminar o stress celular devido a hipoxia e tensão mecânica. Por conseguinte, noutro aspeto do método, uma célula estaminal, ou população de células estaminais, é exposta a uma condição hipóxica durante a colheita, enriquecimento ou isolamento durante menos de seis horas durante a referida conservação, em que uma condição hipóxica é uma concentração de oxigénio que é menor que a concentração de oxigénio no sangue normal. Num aspeto mais especifico, a referida população de células estaminais é exposta à referida condição hipóxica durante menos de duas horas durante a referida conservação. Noutro aspeto mais especifico, a referida população de células estaminais é exposta à referida condição hipóxica durante menos de uma hora, ou menos de trinta minutos, ou não é exposta a uma condição hipóxica, durante a colheita, enriquecimento ou isolamento. Noutro aspeto especifico, a referida população de células estaminais não é exposta a esforço de cisalhamento durante a colheita, enriquecimento ou isolamento.
As células estaminais placentárias da invenção podem ser crioconservadas, e.g., em meio de crioconservação em pequenos recipientes, e.g., ampolas. 0 meio de crioconservação adequado inclui, mas não está limitado a, meio de cultura incluindo, e.g., meio de crescimento, ou meio de congelação de células, for exemplo comercialmente disponível meio de congelação de células, e.g., C2695, C2639 ou C6039 (Sigma) . 0 meio de crioconservação compreende preferencialmente DMSO (dimetilsulfóxido), a uma concentração de, e.g., cerca de 10% (v/v) . O meio de crioconservação pode compreender agentes adicionais, por exemplo, metilcelulose e/ou glicerol. As células estaminais placentárias são preferencialmente arrefecidas a cerca de 1 °C/min durante a crioconservação. Uma temperatura de crioconservação preferida é de cerca de -80 °C a cerca de -180 °C, preferencialmente cerca de -125 °C a cerca de -140 °C. As células crioconservadas podem ser transferidas para azoto liquido antes da descongelação para utilização. Por exemplo, assim que as ampolas atinjam cerca de -90 °C, são transferidas para uma área de conservação em azoto liquido. A crioconservação pode ser também efetuada utilizando um congelador de velocidade controlada. As células crioconservadas são preferencialmente descongeladas a uma temperatura de cerca de 25 °C a cerca de 40 °C, preferencialmente a uma temperatura de cerca de 37 °C.
5.7 UTILIZAÇÕES DAS CÉLULAS ESTAMINAIS
PLACENTÁRIAS 5.7.1 Populações de Células Estaminais
Placentárias
As populações de células estaminais placentárias podem ser utilizadas para tratar qualquer doença, distúrbio ou condição que seja passível de tratamento pela administração de uma população de células estaminais. Como aqui utilizado, "tratar" abrange a cura, remediação, melhoria, atenuação da gravidade ou redução no curso de tempo de uma doença, distúrbio ou condição, ou qualquer parâmetro ou sintoma do mesmo.
As células estaminais placentárias, e as populações de células estaminais placentárias, podem ser induzidas a diferenciar-se num tipo de célula particular, quer ex vivo ou in vivo, na preparação para administração a um indivíduo que necessita de células estaminais, ou células diferenciadas a partir de células estaminais. Por exemplo, as células estaminais placentárias podem ser injetadas num órgão danificado, e para a neogénese de um órgão e a reparação de lesão in vivo. Tal lesão pode ser devida a tais condições e distúrbios que incluem, mas não se limitam a, enfarte do miocárdio, distúrbio apoplético, esclerose múltipla, acidente vascular cerebral, hipotensão, paragem cardíaca, isquemia, inflamação, tiroidite, perda de função cognitiva relacionada com a idade, dano por radiação, paralisia cerebral, doença neurodegenerativa, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Leigh, demência de SIDA, perda de memória, esclerose lateral amiotrófica, distrofia muscular, doença isquémica renal, traumatismo no cérebro ou medula espinal, ponte de coração-pulmão, glaucoma, isquemia retiniana ou traumatismo retiniano.
As células estaminais placentárias podem ser utilizadas para tratar condições autoimunes tais como diabetes juvenil, lúpus, distrofia muscular, artrite reumatoide, e semelhantes.
As populações isoladas de células estaminais placentárias podem ser utilizadas em terapia de reposição enzimática autóloga ou heteróloga para tratar doenças ou condições específicas, que incluem, mas não se limitam a doenças de depósito lisossómico, tais como doença de Tay-Sachs, Niemann-Pick, Fabry, Gaucher (e.g., deficiência de glucocerbrosidase), sindromes de Hunter e Hurler, sindrome de Maroteaux-Lamy, fucosidose (deficiência de fucosidase) , doença de Batten (CLN3), assim como outras gangliosidoses, mucopolissacaridoses e glicogenoses.
As populações isoladas de células estaminais placentárias, sozinhas ou em combinação com populações de células estaminais ou progenitoras, podem ser utilizadas sozinhas, ou como transportadores de transgenes autólogos ou heterólogos em terapia genética, para corrigir erros congénitos de metabolismo, fibrose quistica, adrenoleucodistrofia (e.g., deficiência co-A-ligase), leucodistrofia metacromática (deficiência de arilsulfatase A) (e.g., formas infantis tardias ou juvenis sintomáticas ou pré-sintomáticas), leucodistrofia de células globoides (doença de Krabbe; deficiência de galactocerebrosidase) , deficiência de lipase ácida (doença de Wolman), doença de armazenamento de glicogénio, hipotireoidismo, anemia (e.g., anemia aplástica, anemia falciforme, etc.), sindrome de Pearson, doença de Pompe, fenilcetonúria (PKU), porfirias, doença da urina do xarope de bordo, homocistinúria, mucopolissacaridose, doença granulomatosa crónica e tirosinemia e doença de Tay-Sachs ou para tratar cancro (e.g., um malignidade hematológica), tumores ou outras condições patológicas. As células estaminais placentárias podem ser utilizadas para tratar displasia esquelética. Num aspeto, as células estaminais placentárias transformadas para expressar ativador de plasminogénio tecidular (tPA) podem ser administradas a um indivíduo para tratar trombo.
As populações isoladas de células estaminais placentárias podem ser utilizadas na regeneração de tecido autólogo ou heterólogo ou terapias ou protocolos de substituição, incluindo, mas não se limitando a tratamento de defeitos epiteliais da córnea, tratamento de osteogénese imperfeita, reparação de cartilagem, dermoabrasão facial, membranas da mucosa, membranas do tímpano, revestimentos intestinais, estruturas neurológicas (e.g., retina, neurónios auditivos na membrana basilar, neurónios olfativos no epitélio olfativo), reparação de queimaduras e feridas para lesões traumáticas da pele, ou para a reconstrução de outros órgãos ou tecidos danificados ou doentes.
Uma população isolada de células estaminais placentárias é utilizada na reconstituição hematopoiética num indivíduo que sofreu uma perda parcial ou total das células estaminais hematopoiéticas, e.g., indivíduos exposto a doses letais ou subletais de radiação (quer seja industrial, médica ou militar); indivíduos que sofreram mieloablação como parte, e.g., de terapia de cancro, e semelhantes, no tratamento de, e.g., uma malignidade hematológica. As células estaminais placentárias podem ser utilizadas na reconstituição hematopoiética em indivíduos que têm anemia (e.g., anemia aplástica, anemia falciforme, etc.). Preferencialmente, as células estaminais placentárias são administradas a indivíduos com uma população de células estaminais hematopoiéticas. As populações isoladas de células estaminais derivadas da placenta podem ser utilizadas no lugar de, ou para suplementar, medula óssea ou populações de células estaminais derivadas de medula óssea. Tipicamente, aproximadamente 1 x 108 a 2 x 108 células mononucleares de medula óssea por quilograma de peso do doente são infundidas para enxerto num transplante de medula óssea (i.e., cerca de 7 0 mL de medula para um doador de 7 0 kg) . Para se obter 70 mL é necessária uma doação intensiva e perda significativa de sangue do doador no processo de doação. Uma população isolada de células estaminais placentárias para reconstituição hematopoiética pode compreender, cerca de, pelo menos, ou não mais de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 ou mais células estaminais placentárias.
Por conseguinte, as células estaminais placentárias podem ser utilizadas para tratar doentes que têm um cancro sanguíneo, tal como um linfoma, leucemia (tal como leucemia mielógena crónica ou aguda, leucemia linfocítica aguda, doença de Hodgkin, etc.), mielodisplasia, síndrome mielodisplásica, e semelhantes. Noutro aspeto, a doença, distúrbio ou condição é doença granulomatosa crónica.
Uma vez que a reconstituição hematopoiética pode ser utilizada no tratamento de anemias, é ainda aqui divulgado o tratamento de um indivíduo com uma combinação de células estaminais aqui divulgada, em que o indivíduo tem uma anemia ou distúrbio da hemoglobina do sangue. A anemia ou distúrbio pode ser natural (e.g., provocada por genética ou doença), ou pode ser induzido artificialmente (e.g., por envenenamento acidental ou deliberado, quimioterapia, e semelhantes). Noutro aspeto, a doença ou distúrbio é uma síndrome de insuficiência de medula (e.g., anemia aplástica, síndrome de Kostmann, anemia de Diamond-Blackfan, trombocitopenia amegacariocítica, e semelhantes), um distúrbio da medula óssea ou uma doença ou distúrbio hematopoiético.
As células estaminais placentárias podem ser também utilizadas para tratar doença de imunodeficiência combinada grave, incluindo, mas não se limitando a, doença de imunodeficiência combinada (e.g., síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de DiGeorge grave, e semelhantes).
As células estaminais placentárias aqui divulgadas, sozinhas ou em combinação com outras populações de células estaminais ou células progenitoras, podem ser utilizadas no fabrico de um tecido ou órgão in vivo. Os métodos aqui divulgados abrangem a utilização das células obtidas a partir da placenta, e.g., células estaminais ou células progenitoras, para inocular uma matriz e para ser cultivadas nas condições apropriadas para permitir que as células se diferenciem e povoem a matriz. Os tecidos e órgãos obtidos pelos métodos aqui divulgados podem ser utilizados para uma variedade de fins, incluindo fins de investigação e terapêuticos.
As células estaminais placentárias e populações de células estaminais placentárias podem ser utilizadas para transplantes autólogos e alogénicos, incluindo transplantes hematopoiéticos do tipo HLA condizentes e não condizentes. Num aspeto de utilização das células estaminais placentárias como transplantes hematopoiéticos alogénicos, o hospedeiro é tratado para reduzir a rejeição imunológica das células doadoras, ou para gerar imunotolerância (ver, e.g., Patentes U.S. N.° 5,800,539 e 5,806,529). Noutro aspeto, o hospedeiro não é tratado para reduzir a rejeição imunológica ou gerar imunotolerância.
As células estaminais placentárias, quer sozinhas ou em combinação com uma ou mais outras populações de células estaminais, podem ser utilizadas em protocolos de transplante terapêuticos, e.g., para aumentar ou substituir as células estaminais ou progenitoras do fígado, pâncreas, rim, pulmão, sistema nervoso, sistema muscular, osso, medula óssea, timo, baço, tecido da mucosa, gónadas ou cabelo. Adicionalmente, as células estaminais placentárias podem ser utilizadas em vez de classes específicas de células progenitoras (e.g., condrócitos, hepatócitos, células hematopoiéticas, células parenquimatosas pancreáticas, neuroblastos, células progenitoras musculares, etc.) em protocolos terapêuticos ou de investigação onde seriam tipicamente utilizadas células progenitoras.
As células estaminais placentárias, particularmente células estaminais placentárias CD200+ podem ser utilizadas como um auxiliar para a terapia de substituição de cabelo. Por exemplo, as células estaminais placentárias, e.g., células estaminais placentárias CD200 + , são injetadas por via subcutânea ou intradérmica num sitio onde é desejado o crescimento ou recrescimento de cabelo. 0 número de células estaminais injetadas pode ser, e.g., entre cerca de 100 e cerca de 10 000 por injeção, num volume de cerca de 0,1 a cerca de 1,0 yL, embora se possa também utilizar mais ou menos células num volume maior ou menor. A administração de células estaminais placentárias para facilitar o recrescimento de cabelo pode compreender uma única injeção ou múltiplas injeções, e.g., um padrão regular ou aleatório numa área onde é desejado o recrescimento de cabelo. Podem ser utilizadas terapias de recrescimento de cabelo conhecidas em conjunto com as células estaminais placentárias, e.g., minoxidil tópico. A perda de cabelo que pode ser tratada utilizando células estaminais placentárias pode ser natural (e.g., calvície de padrão masculino) ou induzida (e.g., resultante de exposição a substância química tóxica).
As células estaminais placentárias e populações de células estaminais placentárias da invenção podem ser utilizadas para aumentar, reparar ou substituir cartilagem, tendão ou ligamentos. Por exemplo, em certos aspetos, as próteses (e.g., próteses da anca) podem ser revestidas com construções de tecido da cartilagem de substituição desenvolvido a partir de células estaminais placentárias. Noutros aspetos, as articulações (e.g., joelho) podem ser reconstruídas com construções de tecido da cartilagem desenvolvidas a partir de células estaminais placentárias. As construções de tecido da cartilagem podem ser também utilizadas em grandes cirurgias reconstrutivas para diferentes tipos de articulações (ver, e.g., Resnick & Niwayama, eds., 1988, Diagnosis of Bone and Joint
Disorders, 2d ed., W. B. Saunders Co.).
As células estaminais placentárias podem ser utilizadas para reparar danos a tecidos e órgãos resultantes de, e.g., traumatismo, distúrbios metabólicos ou doença. 0 traumatismo pode ser, e.g., traumatismo de cirurgia, e.g., cirurgia cosmética. Num tal exemplo, um doente pode ser administrado com células estaminais placentárias, sozinhas ou combinadas com outras populações de células estaminais ou progenitoras, para regenerar ou restabelecer tecidos ou órgãos que foram danificados como uma consequência de doença. 5.7.2 Composições que Compreendem Células Estaminais Placentárias São aqui divulgadas composições que compreendem células estaminais placentárias, ou biomoléculas das mesmas. As células estaminais placentárias da presente invenção podem ser combinadas com qualquer composto, composição ou dispositivo fisiolóqica ou medicamente aceitável para ser utilizado, e.g., em investigação ou terapêutica. 5.7.2.1 Células Estaminais Placentárias Crioconservadas
As populações de células estaminais placentárias da invenção podem ser conservadas, por exemplo, crioconservadas para utilização posterior. Os métodos de crioconservação de células, tais como células estaminais, são bem conhecidos na técnica. As populações de células estaminais placentárias podem ser preparadas numa forma que pode ser facilmente administrada a um indivíduo. Por exemplo, a invenção refere-se a uma população de células estaminais placentárias que está contida num recipiente que é adequado para utilização médica. Um tal recipiente pode ser, por exemplo, um saco de plástico, balão, frasco, ou outro recipiente estéril a partir do qual se pode distribuir facilmente a população de células estaminais placentárias. Por exemplo, o recipiente pode ser um saco de sangue ou outro saco de plástico, medicamente aceitável, adequado para a administração intravenosa de um líquido a um recetor. 0 recipiente é preferencialmente um que permite a crioconservação da população de células estaminais combinadas. A população de células estaminais placentárias crioconservada pode compreender células estaminais placentárias derivadas de um único doador ou de múltiplos doadores. A população de células estaminais placentárias pode ser completamente condizente para a HLA com um recetor pretendido, ou parcial ou completamente não condizente para HLA.
Assim, é aqui divulgada uma composição que compreende uma população de células estaminais placentárias num recipiente. Num aspeto, a população de células estaminais é crioconservada. Noutro aspeto, o recipiente é um saco, balão ou frasco. Num aspeto mais especifico, o referido saco é um saco de plástico estéril. Num aspeto mais especifico, o referido saco é adequado, permite ou facilita a administração intravenosa da referida população de células estaminais placentárias. 0 saco pode compreender múltiplos canais internos ou compartimentos que estão interconectados para permitir a mistura das células estaminais placentárias e uma ou mais outras soluções, e.g., um fármaco, antes ou durante a administração. Noutro aspeto, a composição compreende um ou mais compostos que facilitam a crioconservação da população de células estaminais combinadas. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias está contida numa solução aquosa fisiologicamente aceitável. Num aspeto mais especifico, a referida solução aquosa fisiologicamente aceitável é uma solução de NaCl a 0,9%. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais placentárias compreende células placentárias que são condizentes para HLA com um recetor da referida população de células estaminais. Noutro aspeto, a referida população de células estaminais combinadas compreende células placentárias que são pelo menos parcialmente não condizentes para HLA com um recetor da referida população de células estaminais. Noutro aspeto, as referidas células estaminais placentárias são derivadas de uma multiplicidade de doadores. 5.7.2.2 Composições Farmacêuticas
As populações de células estaminais placentárias, ou populações de células que compreendem células estaminais placentárias, podem ser formuladas em composições farmacêuticas para utilização in vivo. Tais composições farmacêuticas compreendem uma população de células estaminais placentárias, ou uma população de células que compreende células estaminais placentárias, num veiculo farmaceuticamente aceitável, e.g., um soro fisiológico ou outra solução fisiologicamente aceitável aceite para administração in vivo. As composições farmacêuticas podem compreender qualquer uma das populações de células estaminais placentárias, ou tipos de células estaminais placentárias, descritas aqui noutra parte. As composições farmacêuticas podem compreender células estaminais placentárias fetais, maternas, ou ambas fetais e maternas. As composições farmacêuticas podem ainda compreender células estaminais placentárias obtidas a partir de um único indivíduo ou placenta, ou a partir de uma multiplicidade de indivíduos ou placentas.
As composições farmacêuticas podem compreender um número qualquer de células estaminais placentárias. Por exemplo, uma única dose unitária de células estaminais placentárias podem compreender cerca de, pelo menos, ou não mais de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 ou mais células estaminais placentárias.
As composições farmacêuticas compreendem populações de células que compreendem 50% de células viáveis ou mais (isto é, pelo menos 50% das células na população são funcionais ou estão vivas) .
Preferencialmente, pelo menos 60% das células na população são viáveis. Mais preferencialmente, pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% das células na população na composição farmacêutica são viáveis.
As composições farmacêuticas podem compreender um ou mais compostos que, e.g., facilitam o enxerto (e.g., anticorpos anti-recetor de células T, um imunossupressor, ou semelhantes) ; estabilizantes tais como albumina, dextrano 40, gelatina, hidroxietilamido, e semelhantes.
Quando formulada como uma solução injetável, numa forma de realização, a composição farmacêutica da invenção compreende cerca de 1,25% de HSA e cerca de 2,5% de dextrano. Podem ser utilizadas outras formulações injetáveis, adequadas para a administração de produtos celulares.
Num aspeto, a composição aqui divulqada compreende células estaminais placentárias que são substancialmente, ou completamente, de origem não materna. Por exemplo, é aqui divulgada uma composição que compreende uma população de células estaminais placentárias que são CD200+ e HLA-G+; CD73+, CD105+ e CD200 + ; CD200+ e 0CT-4+; CD73+, CD105+ e HLA-G+; CD73+ e CD105+ e que facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a referida população de células estaminais placentárias quando a referida população de células placentárias é cultivada sob condições que permitem a formação de um corpo de tipo embrioide; ou 0CT-4+ e que facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a referida população de células estaminais placentárias quando a referida população de células placentárias é cultivada sob condições que permitem a formação de um corpo de tipo embrioide; ou uma combinação das anteriores, em que pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% das referidas células estaminais placentárias são de origem não materna. Num aspeto especifico, a composição compreende adicionalmente uma célula estaminal que não é obtida a partir de uma placenta. 5.7.2.3 Meios Condicionados com Células Estaminais Placentárias
As células estaminais placentárias da invenção podem ser utilizadas para produzir um meio condicionado, isto é, um meio que compreende uma ou mais biomoléculas segregadas ou excretadas pelas células estaminais. Em vários aspetos, o meio condicionado compreende o meio onde as células estaminais placentárias foram cultivadas durante pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais dias. Noutros aspetos, o meio condicionado compreende o meio onde as células estaminais placentárias foram cultivadas até pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de confluência, ou até 100% de confluência. Um tal meio condicionado pode ser utilizado para suportar a cultura de uma população separada de células estaminais placentárias, ou células estaminais de outro tipo. Noutro aspeto, o meio condicionado compreende o meio onde as células estaminais placentárias foram diferenciadas num tipo de células adultas. Noutro aspeto, o meio condicionado da invenção compreende o meio onde foram cultivadas as células estaminais placentárias e as células estaminais não placentárias. 5.7.2.4 Matrizes que Compreendem Células Estaminais Placentárias São também aqui divulgadas matrizes, hidrogeles, estruturas e semelhantes que compreendem uma célula estaminal placentária, ou uma população de células estaminais placentárias.
As células estaminais placentárias podem ser inoculadas numa matriz natural, e.g., um biomaterial placentário tal como um material da membrana amniótica. Um tal material da membrana amniótica pode ser, e.g., membrana amniótica dissecada diretamente de uma placenta de mamifero; membrana amniótica fixa ou tratada termicamente, membrana amniótica substancialmente seca (i.e., <20% de H2O), membrana coriónica, membrana coriónica substancialmente seca, membrana amniótica e coriónica substancialmente seca, e semelhantes. Os biomateriais placentários preferidos onde podem ser inoculadas as células estaminais placentárias são descritos em Hariri, Publicação de Pedido U.S. N.° 2004/0048796.
As células estaminais placentárias podem ser suspensas numa solução de hidrogel adequada para, e.g., injeção. Os hidrogeles adequados para essas composições incluem péptidos de automontagem, tais como RAD16. Num aspeto, uma solução de hidrogel que compreende as células pode ser deixada endurecer, por exemplo num molde, para formar uma matriz com células dispersas na mesma para implantação. As células estaminais placentárias podem ser também cultivadas numa tal matriz para que as células sejam expandidas mitoticamente antes da implantação. O hidrogel é, e.g., um polímero orgânico (natural ou sintético) que é reticulado através de ligações covalentes, iónicas ou de hidrogénio para criar uma estrutura de matriz aberta tridimensional que retém as moléculas de água para formar um gel. Os materiais que formam hidrogeles incluem polissacáridos tais como alginato e sais dos mesmos, péptidos, polifosfazinas e poliacrilatos, os quais são reticulados ionicamente, ou polímeros em bloco tais como copolímeros de bloco de poli(óxido de etileno)-polipropileno glicol que são reticulados pela temperatura ou pH, respetivamente. Nalguns aspetos, o hidrogel ou matriz da invenção é biodegradável.
Nalguns aspetos, a formulação compreende um gel polimerizável in situ (ver., e.g., Publicação de Pedido de Patente U.S. 2 0 02/0022676; Anseth et al., J. Control Release, 78(1-3):199-209 (2002); Wang et al., Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003).
Nalguns aspetos, os polímeros são pelo menos parcialmente solúveis em soluções aquosas, tais como água, soluções salinas tamponadas ou soluções aquosas de álcool, que têm grupos laterais carregados, ou um sal iónico monovalente dos mesmos. Os exemplos de polímeros com grupos laterais ácidos que podem ser feitos reagir com catiões são poli(fosfazenos), poli(ácidos acrílicos), poli(ácidos metacrílicos), copolímeros de ácido acrílico e ácido metacrílico, poli(acetato de vinilo), e polímeros sulfonados, tais como poliestireno sulfonado. Os copolímeros com grupos laterais ácidos formados por reação de ácido acrílico ou metacrílico e monómeros ou polímeros de éter vinílico podem ser também utilizados. Os exemplos de grupos ácidos são os grupos de ácido carboxilico, grupos de ácido sulfónico, grupos álcool halogenados (preferencialmente fluorados), grupos OH fenólicos e grupos OH ácidos.
As células estaminais placentárias ou as coculturas das mesmas podem ser inoculadas numa armação ou estrutura tridimensional e implantadas in vivo. Uma tal estrutura pode ser implantada em combinação com qualquer um ou mais fatores de crescimento, células, fármacos ou outros componentes que estimulam a formação de tecido ou, de outro modo, aumentam ou melhoram a prática da invenção.
Os exemplos de estruturas que podem ser utilizadas incluem tapetes não-tecidos, espumas porosas ou péptidos de automontagem. Os tapetes não-tecidos podem ser preparados utilizando fibras constituídas por um copolímero absorvível sintético dos ácidos glicólico e láctico (e.g., PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, N.J.). As espumas, constituídas por, e.g., copolímero de ροϋ(ε-caprolactona)/poli(ácido glicólico) (PCL/PGA), preparados por processos tais como secagem por congelação, ou liofilização (ver, e.g., Pat. U.S. N.° 6, 355, 699), podem ser também utilizados como estruturas.
As células estaminais placentárias podem ser também inoculadas sobre, ou postas em contacto com, um material cerâmico fisiologicamente aceitável que inclui, mas não se limita a, mono-, di-, tri-, alfa-tri-, beta-tri-e tetra-fosfato de cálcio, hidroxiapatite, fluoroapatites, sulfatos de cálcio, fluoretos de cálcio, óxidos de cálcio, carbonatos de cálcio, fosfatos de magnésio e cálcio, vidros biologicamente ativos tais como BIOGLASS®, e misturas dos mesmos. Os materiais cerâmicos porosos biocompatíveis comercialmente disponíveis na atualidade incluem SURGIBONE® (CanMedica Corp., Canadá), ENDOBON® (Merck Biomaterial France, França), CEROS® (Mathys, AG, Bettlach, Suíça) , e produtos de enxerto de osso de colagénio mineralizado tais como HEALOS™ (DePuy, Inc., Raynham, MA) e VITOSS®, RHAKOSS™, e CORTOSS® (Orthovita, Malvern, Pa.). A estrutura pode ser uma mistura, combinação ou compósito de materiais naturais e/ou sintéticos.
Noutra forma de realização, as células estaminais placentárias podem ser inoculadas sobre, ou postas em contacto com, um feltro, o qual pode ser, e.g., constituído por um fio multifilamento feito de um biomaterial absorvível tal como PGA, PLA, copolímeros ou misturas de PCL, ou ácido hialurónico.
As células estaminais placentárias podem ser inoculadas sobre estruturas de espuma que podem ser estruturas de compósitos. Tais estruturas de espuma podem ser moldadas numa forma útil, tal como aquela de uma porção de uma estrutura específica no corpo que vai ser reparada, substituída ou melhorada. Nalguns exemplos, a estrutura é tratada, e.g., com ácido acético 0,1 M, seguido de incubação em polilisina, PBS e/ou colagénio, antes da inoculação das células para melhorar a fixação das células. As superfícies externas de uma matriz podem ser modificadas para melhorar a fixação ou crescimento de células e a diferenciação do tecido, tal como por revestimento com plasma da matriz, ou adição de uma ou mais proteínas (e.g., colagénios, fibras elásticas, fibras reticulares), glicoproteínas, glicosaminoglicanos (e.g., sulfato de heparina, condroitina-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, sulfato de dermatano, sulfato de queratina, etc.), uma matriz celular e/ou outros materiais tais como, mas não se limitando a, gelatina, alginatos, ágar, agarose e gomas vegetais, e semelhantes.
Nalguns exemplos, a estrutura compreende, ou é tratada com, materiais que a tornam não trombogénica. Estes tratamentos e materiais podem promover também e sustentar o crescimento endotelial, a migração, e a deposição de matriz extracelular. Os exemplos destes materiais e tratamentos incluem, mas não se limitam a, materiais naturais tais como proteínas da membrana basal tais como laminina e colagénio Tipo IV, materiais sintéticos tais como EPTFE, e silicones de poliuretanoureia segmentados, tais como PURSPAN™ (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif.). A estrutura pode compreender também agentes antitrombóticos, tais como heparina; as estruturas podem ser também tratadas para alterar a carga superficial (e.g., revestimento com plasma) antes da inoculação com células estaminais placentárias. 5.7.3 Linhas de Células Estaminais Placentárias Imortalizadas
As células placentárias de mamífero podem ser imortalizadas condicionalmente por transfeção com qualquer vetor adequado que contém um qene promotor do crescimento, isto é, um qene que codifica uma proteína que, sob condições apropriadas, promove o crescimento da célula transfetada, de forma que a produção e/ou atividade da proteína promotora do crescimento seja regulável por um fator externo. Numa forma de realização preferida o gene promotor do crescimento é um oncogene tal como, mas que não está limitado a, v-myc, N-myc, c-myc, p53, antigénio T grande de SV40, antigénio T grande de polioma, adenovírus Ela ou proteína E7 de papilomavírus humano. A regulação externa da proteína promotora do crescimento pode ser conseguida colocando o gene promotor do crescimento sob o controlo de um promotor que pode ser regulado externamente, e.g., um promotor cuja atividade pode ser controlada, por exemplo, modificando a temperatura das células transfetadas ou a composição do meio em contacto com as células. Pode ser utilizado um sistema de expressão de genes controlado por tetraciclina (tet) (ver Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5547-5551, 1992; Hoshimaru et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 93:1518-1523, 1996). Na ausência de tet, um transativador controlado por tet (tTA) neste vetor ativa fortemente a transcrição de phciw*-i, um promotor minimo do citomegalovírus humano fundido com as sequências do operador tet. 0 tTA é uma proteína de fusão do repressor (tetR) do operam de resistência a tet derivado de transposão-10 de Escherichia coli e o domínio ácido de VP16 do vírus herpes simplex. Concentrações baixas, não tóxicas de tet (e.g., 0,01-1,0 yg/mL) anularam quase completamente a transativação por tTA. O vetor contém ainda um gene que codifica um marcador selecionável, e.g., uma proteína que confere resistência a fármacos. O gene de resistência a neomicina bacteriano (neoR) é um marcador desse tipo que pode ser aqui utilizado. As células portadoras de neo podem ser selecionadas por meios conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria, tal como a adição de, e.g., 100-200 yg/mL de G418 ao meio de crescimento. A transfeção pode ser conseguida por qualquer um de uma variedade de meios conhecidos pelos especialistas com conhecimentos médios na matéria incluindo, mas não se limitando a, infeção retroviral. Em geral, uma cultura de células pode ser transfetada por incubação com uma mistura de meio condicionado recolhido da linha celular produtora para o vetor e DMEM/F12 que contém suplementos de N2. Por exemplo, uma cultura de células placentárias preparadas como descrito anteriormente podem ser infetadas após, e.g., cinco dias in vitro por incubação durante cerca de 20 horas em um volume de meio condicionado e dois volumes de DMEM/F12 que contém suplementos de N2. As células transfetadas portadoras de um marcador selecionável podem ser em seguida selecionadas como descrito anteriormente.
Após transfeção, as culturas são passadas sobre uma superfície que permite a proliferação, e.g., permite que pelo menos 30% das células dupliquem num período de 24 horas. Preferencialmente, o substrato é um substrato de poliornitina/laminina, que consiste em plástico de cultura de tecidos revestido com poliornitina (10 pg/mL) e/ou laminina (10 pg/mL), um substrato de polilisina/laminina ou uma superfície tratada com fibronectina. As culturas são em seguida alimentadas a cada 3-4 dias com meio de crescimento, que pode estar ou pode não estar suplementado com um ou mais fatores de intensificação da proliferação. Os fatores de intensificação da proliferação podem ser adicionados ao meio de crescimento quando as culturas estão menos de 50% confluentes.
As linhas de células estaminais placentárias imortalizadas condicionalmente podem ser passadas utilizando técnicas convencionais, tais como tripsinização, quando estão 80-95% confluentes. Até aproximadamente à vigésima passagem, é, em alguns exemplos, benéfico manter a seleção (por exemplo, pela adição de G418 para células que contêm um gene de resistência a neomicina). As células podem ser também congeladas em azoto líquido para conservação a longo prazo.
As linhas de células clonais podem ser isoladas a partir de uma linha de células estaminais placentárias humanas imortalizadas condicionalmente preparadas como descrito anteriormente. Em geral, essas linhas de células clonais podem ser isoladas utilizando técnicas convencionais, tais como diluição limitante ou utilizando anéis de clonagem, e expandidas. As linhas de células clonais podem ser geralmente alimentadas e passadas como descrito anteriormente.
As linhas de células estaminais placentárias humanas imortalizadas condicionalmente, as quais podem ser, mas não precisam de ser, clonais, podem ser geralmente induzidas a diferenciar, suprimindo a produção e/ou atividade da proteína promotora do crescimento sob condições de cultura que facilitam a diferenciação. Por exemplo, se o gene que codifica a proteína promotora do crescimento está sob o controlo de um promotor que pode ser regulado externamente, as condições, e.g., temperatura ou composição do meio, podem ser modificadas para suprimir a transcrição do gene promotor do crescimento. Para o sistema de expressão de genes controlado por tetraciclina discutido acima, a diferenciação pode ser conseguida pela adição de tetraciclina para suprimir a transcrição do gene promotor do crescimento. Em geral, 1 yg/mL de tetraciclina durante 4-5 dias é suficiente para iniciar a diferenciação. Para promover ainda mais a diferenciação, podem ser incluídos agentes adicionais no meio de crescimento. 5.7.4 Ensaios
As células estaminais placentárias podem ser utilizadas em ensaios para determinar a influência das condições de cultura, fatores ambientais, moléculas (e.g., biomoléculas, moléculas inorgânicas pequenas. etc.) e semelhantes sobre a proliferação, expansão e/ou diferenciação de células estaminais, em comparação com células estaminais placentárias não expostas a essas condições.
Num aspeto preferido, as células estaminais placentárias são analisadas para alterações na proliferação, expansão ou diferenciação após contacto com uma molécula. É aqui divulgado um método de identificação de um composto que modula a proliferação de uma multiplicidade de células estaminais placentárias, que compreende pôr em contacto a referida multiplicidade de células estaminais com o referido composto sob condições que permitem a proliferação, em que se o referido composto provoca uma alteração detetável na proliferação da referida multiplicidade de células estaminais em comparação com uma multiplicidade de células estaminais que não é posta em contacto com o referido composto, o referido composto é identificado como um composto que modula a proliferação de células estaminais placentárias. Num aspeto especifico, o referido composto é identificado como um inibidor de proliferação. Noutro aspeto específico, o referido composto é identificado como um potenciador de proliferação. É aqui ainda divulgado um método de identificação de um composto que modula a expansão de uma multiplicidade de células estaminais placentárias, que compreende pôr em contacto a referida multiplicidade de células estaminais com o referido composto sob condições que permitem a expansão, em que se o referido composto provoca uma alteração detetável na expansão da referida multiplicidade de células estaminais em comparação com uma multiplicidade de células estaminais que não é posta em contacto com o referido composto, o referido composto é identificado como um composto que modula a expansão de células estaminais placentárias. Num aspeto especifico, o referido composto é identificado como um inibidor de expansão. Noutro aspeto especifico, o referido composto é identificado como um potenciador de expansão. É também aqui divulgado um método de identificação de um composto que modula a diferenciação de uma célula estaminal placentária, que compreende pôr em contacto as referidas células estaminais com o referido composto sob condições que permitem a diferenciação, em que se o referido composto provoca uma alteração detetável na diferenciação das referidas células estaminais em comparação com uma célula estaminal que não é posta em contacto com o referido composto, o referido composto é identificado como um composto que modula a proliferação de células estaminais placentárias. Num aspeto especifico, o referido composto é identificado como um inibidor de diferenciação. Noutro aspeto especifico, o referido composto é identificado como um potenciador de diferenciação.
6. EXEMPLOS
6.1 EXEMPLO 1: CULTURA DE CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS
As células estaminais placentárias são obtidas a partir de uma placenta de mamífero pós-parto por perfusão ou por rutura física, e.g., digestão enzimática. As células são cultivadas num meio de cultura que compreende 60% de DMEM-LG (Gibco) , 40% de MCDB-201 (Sigma) , 2% de soro fetal de vitelo (FCS) (Hyclone Laboratories), lx insulina-transferrina-selénio (ITS), lx ácido linolénico-albumina de soro bovino (LA-BSA), dexametasona 10-9 M (Sigma), ácido ascórbico 2-fosfato IO-4 M (Sigma), 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF) (R&amp;D Systems), 10 ng/mL de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) (R&amp;D Systems), e 100 U de penicilina/1000 U de estreptomicina. O balão de cultura no qual as células são cultivadas é preparado como se segue. Balões T75 são revestidos com fibronectina (FN), adicionando 5 mL de PBS que contém 5 ng/mL de FN humana (Sigma F0895) ao balão. Os balões com solução de FN são deixados a 37 °C durante 30 min. A solução de FN é em seguida retirada antes da cultura de células. Não é necessário secar os balões após tratamento. Alternativamente, os balões são deixados em contacto com a solução de FN a 4 °C de um dia para o outro ou mais; antes da cultura, os balões são aquecidos e a solução de FN é eliminada. Células Estaminais Placentárias Isoladas por
Perfusão
As culturas de células estaminais placentárias do perfusato placentário são estabelecidas como se segue. As células de um gradiente de Ficoll são inoculadas em balões T75 revestidos com FN, preparados como acima, a 50-100xl06 células/balão em 15 mL meio de cultura. Tipicamente, são inoculados 5 a 10 balões. Os balões são incubados a 37 °C durante 12-18 h para permitir a fixação de células aderentes. São adicionados 10 mL de PBS quente a cada balão para remover as células em suspensão, e misturado suavemente. Em seguida são retirados 15 mL do meio e substituídos por 15 mL de meio de cultura fresco. Todo o meio é trocado 3-4 dias após o inicio da cultura. São realizadas trocas do meio de cultura subsequentes, durante as quais é retirado 50% ou 7,5 mL do meio.
Começando aproximadamente no dia 12, a cultura é verificada sob um microscópio para examinar o crescimento das colónias de células aderentes. Quando as culturas de células se tornam aproximadamente 80% confluentes, tipicamente entre o dia 13 ao dia 18 após o inicio da cultura, as células aderentes são colhidas por digestão com tripsina. As células colhidas a partir destas culturas primárias são designadas passagem 0 (zero). Células Estaminais Placentárias Isoladas por Rutura Física e Digestão Enzimática São estabelecidas culturas de células estaminais placentárias a partir do tecido placentário digerido como se segue. A placenta perfundida é colocada sobre uma folha de papel estéril com o lado materno para cima. Aproximadamente 0,5 cm da camada superficial do lado materno da placenta é raspado com uma lâmina, e a lâmina é utilizada para remover um bloco de tecido placentário que mede aproximadamente 1x2x1 cm. Este tecido da placenta é em seguida picado em pedaços de aproximadamente 1 mm3. Estes pedaços são recolhidos para um tubo Falcon de 50 mL e digeridos com colagenase IA (2 mg/mL, Sigma) durante 30 minutos, seguido de tripsina-EDTA (0,25%, GIBCO BRL) durante 10 minutos, a 37 °C em banho-maria. A solução resultante é centrifugada a 400 g durante 10 minutos à temperatura ambiente, e a solução de digestão é retirada. O sedimento é ressuspenso até aproximadamente 10 volumes com PBS (por exemplo, um sedimento de 5 mL é ressuspenso com 45 mL de PBS), e os tubos são centrifugados a 400 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sedimento de tecido/células é ressuspenso em 130 mL de meio de cultura, e as células são aplicadas a 13 mL por balão T-75 revestido com fibronectina. As células são incubadas a 37 °C com uma atmosfera humidificada com 5% de CO2 · As células estaminais placentárias são opcionalmente crioconservadas a esta etapa.
Subcultura e Expansão de Células Estaminais Placentárias
As células crioconservadas são descongeladas rapidamente num banho-maria a 37 °C. As células estaminais placentárias são imediatamente retiradas do frasco criogénico com 10 mL de meio quente e transferidas para um tubo estéril de 15 mL. As células são centrifugadas a 400 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células são ressuspensas suavemente em 10 mL de meio de cultura quente por pipetagem, e as contagens de células viáveis são determinadas por exclusão com Azul de tripano. As células são em seguida inoculadas a cerca de 6000-7000 células por cm2 sobre balões revestidos com FN, preparados como acima (aproximadamente 5xl05 células por balão T-75). As células são incubadas a 37 °C, 5% de CO2 e 90% de humidade. Quando as células atingem 75-85% de confluência, todos os meios gastos são retirados asseticamente dos balões e rejeitados. São adicionados 3 mL de solução de tripsina/EDTA (p/v) a 0,25% para tapar a camada de células, e as células são incubadas a 37 °C, 5% de CO2 e 90% de humidade durante 5 minutos. O balão é tapado uma vez ou duas vezes para agilizar o desprendimento das células. Assim que >95% das células são arredondadas e desprendidas, são adicionados 7 mL de meio de cultura quente a cada balão T-75, e a solução é dispersa pipetando várias vezes sobre a superfície da camada de células.
Depois de contar as células e determinar a viabilidade como acima, as células são centrifugadas a 1000 RPM durante 5 minutos à temperatura ambiente. As células são passadas ressuspendendo suavemente o sedimento celular de um balão T-75 com meio de cultura, e plaqueando uniformemente as células em dois balões T-75 revestidos com FN.
Utilizando os métodos anteriores, são identificadas populações de células estaminais placentárias aderentes ilustrativas que expressam os marcadores CD105, CD33, CD73, CD29, CD44, CD10 e CD90. Estas populações de células tipicamente não expressam CD34, CD45, CD117 ou CD133. Algumas, mas nem todas as culturas destas células estaminais placentárias expressavam HLA-ABC e/ou HLA-DR.
6.2 EXEMPLO 2: ISOLAMENTO DE CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS A PARTIR DE ESTRUTURAS PLACENTÁRIAS 6.2.1 Materiais &amp; Métodos 6.2.1.1 Isolamento de Populações de Células Placentárias que Compreendem Células Estaminais Placentárias
Foram obtidas várias populações de células placentárias a partir das placentas de gravidezes normais, de termo completo. Todos os doadores forneceram termo de consentimento completo para utilizar as suas placentas para efeitos de investigação. As células estaminais placentárias foram obtidas a partir das seguintes fontes: (1) perfusato placentário (de perfusão da vasculatura placentária); e digestões enzimáticas de (2) âmnio, (3) cório, (4) placa corioamniótica e (5) cordão umbilical. Os vários tecidos placentários foram limpos em PBS estéril (Gibco-Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) e colocados em placas Petri estéreis separadas. Os vários tecidos foram picados utilizando um bisturi cirúrgico estéril e colocados em tubos cónicos Falcon de 50 mL. Os tecidos picados foram digeridos com IX Colagenase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 20 minutos num banho-maria a 37 °C, centrifugados e, em seguida, digeridos com 0,25% de Tripsina-EDTA (Gibco-Invitrogen Corp) durante 10 minutos num banho-maria a 37 °C. Os vários tecidos foram centrifugados após digestão e lavados uma vez com PBS estéril (Gibco-Invitrogen Corp). As células reconstituídas foram em seguida filtradas duas vezes, uma vez com crivos celulares de 100 ym e uma vez com filtros de separação de 30 ym, para eliminar qualquer matriz extracelular residual ou detritos celulares. 6.2.1.2 Avaliação da Viabilidade Celular e Contagens de Células 0 método de exclusão de azul de tripano manual foi utilizado após a digestão para calcular as contagens de células e avaliar a viabilidade celular. As células foram misturadas com o Corante Azul de Tripano (Sigma-Aldrich) numa proporção de 1:1 e as células foram lidas no hemocitómetro. 6.2.1.3 Caracterização dos Marcadores da Superfície Celular
As células que eram HLA ABC“/CD45“/CD34~/CD133+ foram selecionadas para caracterização. As células com este fenótipo foram identificadas, quantificadas e caracterizadas por dois citómetros de fluxo Becton-Dickinson, o FACSCalibur e o FACS Aria (Becton-Dickinson, San Jose, CA, EUA). As várias células placentárias foram reveladas, numa proporção de cerca de 10 yL de anticorpo por 1 milhão de células, durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador. Foram utilizados os seguintes anticorpos anti-humanos: anticorpos monoclonais conjugados com Isotiocianato de Fluoresceina (FITC) contra HLA-G (Serotec, Raleigh, NC) , CD10 (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA) , CD44 (BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA) e CD105 (R&amp;D Systems Inc., Minneapolis, MN); anticorpos monoclonais conjugados com Ficoeritrina (PE) contra CD44, CD200, CD117 e CD13 (BD Biosciences Pharmingen); Estreptavidina e anticorpos monoclonais conjugados com Ficoeritrina-Cy5 (PE Cy5) contra CD117 (BD Biosciences
Pharmingen); anticorpos monoclonais conjugados com Ficoeri trina-Cy7 (PE Cy7) contra CD33 e CD10 (BD Biosciences); estreptavidina e anticorpos monoclonais conjugados com Aloficocianina (APC) contra CD38 (BD Biosciences Pharmingen); e CD90 Biotinilado (BD Biosciences Pharmingen). Após incubação, as células foram lavadas uma vez para remover anticorpos não ligados e foram fixas de um dia para o outro com paraformaldeido a 4% (USB, Cleveland, OH) a 4 °C. No dia seguinte, as células foram lavadas duas vezes, filtradas através de um filtro de separação de 30 ym e foram corridas no(s) citómetro(s) de fluxo.
As amostras que revelaram com anticorpos anti-IgG de murganho (BD Biosciences Pharmingen) foram utilizadas como controlos negativos e foram utilizadas para ajustar os tubos fotomultiplicadores (PMTs). As amostras que revelaram de forma simples com anticorpos anti-humanos foram utilizadas como controlos positivos e foram utilizadas para ajustar as sobreposições/compensações espetrais. 6.2.1.4 Separação e Cultura de Células
Um conjunto de células placentárias (de perfusato, âmnio ou cório), antes de qualquer cultura, foi revelado com 7-Amino-Actinomicina D (7AAD; BD Biosciences Pharmingen) e os anticorpos monoclonais específicos para o fenótipo de interesse. As células foram reveladas a uma proporção de 10 yL de anticorpo por 1 milhão de células, e foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador. Estas células foram em seguida classificadas positivamente como células vivas que expressam o fenótipo de interesse no BD FACS Aria e plaqueadas em cultura. As populações de células placentárias separadas (população de interesse) e "todas" (não separadas) foram plaqueadas para comparações. As células foram plaqueadas sobre uma placa de 96 poços revestida com fibronectina (Sigma-Aldrich) às densidades celulares listadas na Tabela 1 (células/cm2) . A densidade celular, e se o tipo de células foi plaqueado em duplicado ou triplicado, foi determinado e governado pelo número de células que expressam o fenótipo de interesse.
Tabela 1: Densidades de
plaqueamento das células
Meio completo (60% de DMEM-LG (Gibco) e 40% de MCDB-201 (Sigma); 2% de soro fetal de vitelo (Hyclone
Labs.); lx insulina-transferrina-selénio (ITS); lx ácido linoleico-albumina de soro bovino (LA-BSA); dexametasona 10~9 M (Sigma) ; ácido ascórbico 2-fosfato IO-4 M (Sigma) ; 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (R&amp;D Systems); e 10 ng/mL de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) (R&amp;D Systems)) foram adicionados a cada poço da placa de 96 poços e a placa foi colocada numa incubadora com 5% de C02/37 °C. No dia 7, foram adicionados 100 yL de meio completo a cada um dos poços. A placa de 96 poços foi monitorizada durante cerca de duas semanas e foi concluída uma avaliação final da cultura no dia 12. Isto é muito cedo na cultura de células estaminais placentárias, e representa as células de passagem 0. 6.2.1.5 Análise de Dados
Os dados de FACSCalibur foram analisados no FlowJo (Tree star, Inc) utilizando técnicas de ativação padrão. Os dados de BD FACS Aria foram analisados utilizando o software FACSDiva (Becton-Dickinson). Os dados de FACS Aria foram analisados utilizando ativação de discriminação de dupleto para minimizar os dupletos, assim como, técnicas de ativação padrão. Todos os resultados foram compilados no Microsoft Excel e todos os valores, aqui, são representados como a média ± desvio padrão (número, erro padrão da média). 6.2.2 Resultados 6.2.2.1 Viabilidade Celular A viabilidade pós-digestão foi avaliada utilizando o método de exclusão de azul de tripano manual (FIG 1) . A viabilidade média das células obtidas a partir da maioria do tecido digerido (de âmnio, cório ou placa corioamniótica) foi de cerca de 70%. O âmnio tinha uma viabilidade média de 74,35% ± 10,31% (n=6, EPM=4,21), o cório tinha uma viabilidade média de 78,18% ± 12,65% (n=4, EPM=6,32) , a placa corioamniótica tinha uma viabilidade média de 69,05% ± 10,80% (n=4, EPM=5,40), e o cordão umbilical tinha uma viabilidade média de 63,30% ± 20,13% (n=4, EPM=10,06). As células de perfusão, que não sofreram digestão, conservaram a viabilidade média mais alta, 89, 98 ± 6,39% (n=5, EPM=2,86). 6.2.2.2 Quantificação das Células
As populações de células placentárias e as células do cordão umbilical foram analisadas para determinar os números de células HLA ABC~/CD45“/CD34-/CD133+. A partir da análise dos dados de BD FACSCalibur, foi observado que o âmnio, perfusato e cório continham o maior número total destas células, 30,72 ± 21,80 células (n=4, EPM=10, 90) , 26, 92 ± 22,56 células (n=3, EPM=13,02) e 18,39 ± 6,44 células (n=2, EPM=4,55), respetivamente (dados não apresentados). A placa corioamniótica e o cordão umbilical continham o menor número total de células que expressam o fenótipo de interesse, 4,72 = 4,16 células (n=3, EPM=2,40) e 3,94 ± 2,58 células (n=3, EPM=1,49), respetivamente (dados não apresentados).
De forma semelhante, quando a percentagem de células totais que expressa o fenótipo de interesse foi analisada, foi observado que o âmnio e o perfusato placentário continham as percentagens mais altas de células que expressam este fenótipo (0,0319% ± 0,0202% (n=4, EPM=0,0101) e 0,0269% ± 0,0226% (n=3, EPM=0,0130), respetivamente (FIG. 2) . Embora o cordão umbilical contivesse um pequeno número de células que expressam o fenótipo de interesse (FIG. 2), este continha a terceira percentagem mais alta de células que expressam o fenótipo de interesse, 0,020 ± 0,0226% (n=3, EPM=0,0131) (FIG. 2). O cório e a placa corioamniótica continham as percentagens mais baixas de células que expressam o fenótipo de interesse, 0,0184 ± 0,0064% (n=2, EPM=0,0046) e 0,0177 ± 0,0173% (n=3, EPM=0,010), respetivamente (FIG. 2).
Coerente com os resultados da análise por BD FACSCalibur, os dados de BD FACS Aria também identificaram o âmnio, o perfusato e o cório como proporcionando números mais altos de células HLA ABC“/CD45“/CD34“/CD133+ que as restantes fontes. O número total médio de células que expressam o fenótipo de interesse entre o âmnio, perfusato e cório foi de 126,47 ± 55,61 células (n=15, EPM=14,36), 81,65 ± 34,64 células (n=20, EPM=7,75) e 51,47 ± 32,41 células (n=15, EPM=8,37), respetivamente (dados não apresentados). A placa corioamniótica e o cordão umbilical continham o menor número total de células que expressam o fenótipo de interesse, 44,89 ± 37,43 células (n=9, EPM=12,48) e 11,00 ± 4,03 células (n=9, EPM=1,34), respetivamente (dados não apresentados).
Os dados de BD FACS Aria revelaram que o perfusato e o âmnio produziram as percentagens mais altas de células HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+, 0,1523 ± 0,0227% (n=15, EPM=0,0059) e 0,0929 ± 0,0419% (n=20, EPM=0,0094), respetivamente (FIG. 3). A placa corioamniótica continha a terceira percentagem mais alta de células que expressam o fenótipo de interesse, 0,0632 ± 0,0333% (n=9, EPM-0,0111) (FIG. 3). O cório e o cordão umbilical continham as percentagens mais baixas de células que expressam o fenótipo de interesse, 0,0623 ± 0,0249% (n=15, EPM=0,0064) e 0,0457 ± 0,0055% (n=9, EPM=0,0018), respetivamente (FIG. 3) .
Depois de as células HLA ABC-/CD45-/CD34-/CD133+ terem sido identificadas e quantificadas de cada fonte celular, as suas células foram adicionalmente analisadas e caracterizadas quanto à sua expressão de marcadores da superfície celular HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200 e CD105. 6.2.2.3 Células Derivada de Perfusato Placentário
As células derivadas de perfusato foram consistentemente positivas para HLA-G, CD33, CD117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105 e CD13 (FIG. 4) . A expressão média de cada marcador para as células derivadas de perfusato foi a seguinte: 37,15% ± 38,55% (n=4, EPM=19,28) das células expressavam HLA-G; 36,37% ± 21,98% (n=7, EPM=8,31) das células expressavam CD33; 39,39% ± 39,91% (n=4, EPM=19,96) das células expressavam CD117; 54,97% ± 33,08% (n=4, EPM=16,54) das células expressavam CD10; 36,79% ± 11,42% (n=4, EPM=5,71) das células expressavam CD44; 41,83% ± 19,42% (n=3, EPM=11,21) das células expressavam CD200; 74,25% ± 26,74% (n=3, EPM=15,44) das células expressavam CD90; 35,10% ± 23,10% (n=3, EPM=13,34) das células expressavam CD38; 22,87% ± 6,87% (n=3, EPM=3,97) das células expressavam CD105; e 25,49% ± 9,84% (n=3, EPM=5,68) das células expressavam CD13. 6.2.2.4 Células Derivadas de Âmnio
As células derivadas de âmnio foram consistentemente positivas para HLA-G, CD33, CD 117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105 e CD13 (FIG 5) . A expressão média de cada marcador para as derivadas de âmnio foi a seguinte: 57,27% ± 41,11% (n=3, EPM=23,73) das células expressavam HLA-G; 16,23% ± 15,81% (n=6, EPM=6,46) das células expressavam CD33; 62,32% ± 37,89% (n=3, EPM=21,87) das células expressavam CD117; 9,71% ± 13,73% (n=3, EPM=7,92) das células expressavam CD10; 27,03% ± 22,65% (n=3, EPM=13,08) das células expressavam CD44; 6,42% ± 0,88% (n=2, EPM=0,62) das células expressavam CD200; 57,61% ±22,10% (η=2, ΕΡΜ=15,63) das células expressavam CD90; 63,76% ± 4,40% (n=2, EPM=3,11) das células expressavam CD38; 20,27% ± 5,88% (n=2, EPM=4,16) das células expressavam CD105; e 54,37% ± 13,29% (n=2, EPM=9,40) das células expressavam CD13. 6.2.2.5 Células Derivadas de Cório
As células derivadas de cório foram consistentemente positivas para HLA-G, CD117, CD10, CD44, CD200, CD90, CD38 e CD13, enquanto a expressão de CD33 e CD105 variou (FIG. 6) . A expressão média de cada marcador para as células de cório foi a seguinte: 53,25% ± 32,87% (n=3, EPM=18,98) das células expressavam HLA-G; 15,44% ± 11,17% (n=6, EPM=4,56) das células expressavam CD33; 70,76% ± 11,87% (n=3, EPM=6,86) das células expressavam CD117; 35,84% ± 25,96% (n=3, EPM=14,99) das células expressavam CD10; 28,76% ± 6,09% (n=3, EPM=3,52) das células expressavam CD44; 29,20% ± 9,47% (n=2, EPM=6,70) das células expressavam CD200; 54,88% ± 0,17% (n=2, EPM=0,12) das células expressavam CD90; 68,63% ± 44,37% (n=2, EPM=31,37) das células expressavam CD38; 23,81% ± 33,67% (n=2, EPM=23,81) das células expressavam CD105; e 53,16% ± 62,70% (n=2, EPM=44,34) das células expressavam CD13. 6.2.2.6 Células Derivadas da Placa Corioamniótica
As células da placa corioamniótica foram consistentemente positivas para HLA-G, CD33, CD117, CD10,
CD44, CD200, CD90, CD38, CD105 e CD 13 (FIG. 7). A expressão média de cada marcador para as células derivadas da placa corioamniótica foi a seguinte: 78,52% ± 13,13% (n=2, EPM=9,29) das células expressavam HLA-G; 38,33% ± 15,74% (n=5, EPM=7,04) das células expressavam CD33; 69,56% ± 26,41% (n=2, EPM=18,67) das células expressavam CD117; 42,44% ± 53,12% (n=2, EPM=37,56) das células expressavam CDl0; 32,47% ± 31,78% (n=2, EPM=22,47) das células expressavam CD44; 5,56% (n=l) das células expressavam CD200; 83,33% (n=l) das células expressavam CD90; 83,52% (n=l) das células expressavam CD38; 7,25% (n=l) das células expressavam CD105; e 81,16% (n=l) das células expressavam CDl3 . 6.2.2.7 Células Derivadas do Cordão Umbilical
As células derivadas do cordão umbilical foram consistentemente positivas para HLA-G, CD33, CD90, CD38, CD105 e CD13, enquanto a expressão de CD117, CD10, CD44 e CD2 0 0 variou (FIG. 8) . A expressão média de cada marcador para células derivadas do cordão umbilical foi a seguinte: 62,50% ± 53,03% (n=2, EPM=37,50) das células expressavam HLA-G; 25,67% ± 11,28% (n=5, EPM=5,04) das células expressavam CD33; 44,45% ± 62,85% (n=2, EPM=44,45) das células expressavam CD117; 8,33% ± 11,79% (n=2, EPM=8,33) das células expressavam CD10; 21,43% ± 30,30% (n=2, EPM=21,43) das células expressavam CD44; 0,0% (n=l) das células expressavam CD200; 81,25% (n=l) das células expressavam CD90; 64,29% (n=l) das células expressavam CD38; 6,25% (n=l) das células expressavam CD105; e 50,0% (n=l) das células expressavam CD 13.
Um resumo de todas as médias de expressão dos marcadores é mostrado na FIG. 9. 6.2.2.8 Relatório de Separação por BD FACS Aria
As três populações de células placentárias distintas que expressavam as maiores percentagens de HLA ABC, CD45, CD34 e CD 133 (células derivadas de perfusato, âmnio e cório) foram reveladas com 7AAD e os anticorpos para estes marcadores. As três populações foram classificadas positivamente para células vivas que expressam o fenótipo de interesse. Os resultados da separação por BD FACS Aria são listados na tabela 2.
Tabela 2:
As três populações distinta de células classificadas positivamente ("separadas") e as suas células não separadas correspondentes foram plaqueadas e os resultados da cultura foram avaliados no dia 12 (Tabela 3). As células derivadas de perfusato separadas, plaqueadas a uma densidade celular de 40 600/cm2, resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes. Dois dos três conjuntos de células derivadas de perfusato não separadas, cada um plaqueado a uma densidade celular de 40 600/cm2, resultaram em células essencialmente pequenas, redondas, não aderentes com várias células aderentes localizadas em torno da periferia do poço. As células derivadas de perfusato não separadas, plaqueadas a uma densidade celular de 93 800/cm2, resultaram em células essencialmente pequenas, redondas, não aderentes com várias células aderentes localizadas em torno das periferias dos poços.
As células derivadas de âmnio separadas, plaqueadas a uma densidade celular de 6 300/cm2, resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes. As células derivadas de âmnio não separadas, plaqueadas a uma densidade celular de 6 300/cm2, resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes. As células derivadas de âmnio não separadas plaqueadas a uma densidade celular de 62 500/cm2 resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes.
As células derivadas de cório separadas, plaqueadas a uma densidade celular de 6 300/cm2, resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes. As células derivadas de cório não separadas, plaqueadas a uma densidade celular de 6 300/cm2, resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes. As células derivadas de cório não separadas plaqueadas a uma densidade celular de 62 500/cm2, resultaram em células pequenas, redondas, não aderentes.
Posteriormente ao desempenho das experiências relacionadas acima, e à cultura adicional das células estaminais placentárias, determinou-se que a marcação dos anticorpos para CD117 e CD133, onde um anticorpo conjugado com estreptavidina foi marcado com ficoeritrina (PE) conjugada com biotina, produzia um valor de base suficientemente significativo para se assemelhar a uma leitura positiva. Este valor de base resultou inicialmente na classificação das células estaminais placentárias como positivas para ambos os marcadores. Quando foi utilizada uma etiqueta diferente, APC ou PerCP, o valor de base foi reduzido e as células estaminais placentárias foram corretamente determinadas como sendo negativas tanto para CD117 como para CD133.
6.3 EXEMPLO 3: CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS E CÉLULAS ESTAMINAIS DO CORDÃO UMBILICAL
Este exemplo demonstra um perfil de marcadores da superfície celular ilustrativo de células estaminais placentárias.
As células estaminais placentárias ou células estaminais do cordão umbilical, obtidas por digestão enzimática, em meio de cultura foram lavadas uma vez adicionando 2 mL de 2% a FBS-PBS e centrifugando a 400 g durante 5 minutos. O sobrenadante foi decantado, e o sedimento foi ressuspenso em 100-200 yL de 2% de FBS-PBS. Foram preparados 4 tubos com BD™ CompBeads (Cat# 552843) adicionando 100 yL de 2% de FBS-PBS a cada tubo, adicionando 1 gota completa (aproximadamente 60 yL) do Controlo Negativo de BD™ CompBeads e 1 gota das esférulas Anti-Murganho BD™ CompBeads para cada tubo, e agitando em vórtice. Aos 4 tubos de BD™ CompBeads foram adicionados os seguintes anticorpos:
Os tubos de controlo foram preparados como se segue:
Os seguintes anticorpos foram adicionados aos tubos das amostras:
Os tubos de controlo e amostra foram incubados no escuro à temperatura ambiente durante 30 minutos. Após incubação, os tubos foram lavados adicionando 2 mL de 2% de FBS-PBS e centrifugando a 400 g durante 5 minutos. O sobrenadante foi decantado, e o sedimento foi ressuspenso em 100-200 yL de 2% de FBS-PBS e analisado no citómetro de fluxo. Todos os outros anticorpos foram utilizados seguindo este procedimento.
As células estaminais placentárias condizentes das células estaminais da membrana amniótica e cordão umbilical foram analisadas utilizando anticorpos marcados de forma fluorescente e citometria de fluxo para identificar marcadores da superfície celular que estavam presentes ou ausentes. Os marcadores analisados incluíram CD105 (marcador específico endotelial relacionado com a proliferação); CD200 (marcador associada a função reguladora); CD34 (expressado em células endoteliais e em células estaminais hematopoiéticas); CD10 (marcador de células estaminais/células precursoras); citoqueratina K (marcador epitelial); CD44 (migração de células, linfócito doméstico, hematopoiese); CD45 (marcador de linhagem); CD133 (marcador para células progenitoras hematopoiéticas); CD117 (fator de células estaminais (c-Kit)); CD90 (expressado em células estaminais hematopoiéticas primitivas em medula óssea normal, sangue do cordão e células hepáticas fetais); HLA ABC (pan MHC I, apresentação de antigénio, imunogenicidade) ; microglobulina β-2 (associa-se a MHC I, apresentação de antigénio, imunogenicidade); HLA DR,DQ,DP (pan MHC II, antigénio apresentação, imunogenicidade); e CD80/86 (moléculas coestimuladoras para apresentação de antigénio).
Os resultados da citometria de fluxo mostraram que para as células estaminais placentárias que foram testadas, 93,83% das células eram CD105+, 90,76% das células eram CD200+, e 86,93% das células eram CD105+ e CD200+. 99,97% das células eram CD10+; 99,15% das células eram CD34~ e 99,13% das células eram CD10+ e CD34~. 98,71% das células eram positivas para citoqueratina, 99, 95% das células eram CD44+, e 98,71% das células eram positivas para citoqueratina e CD44. 99,51% das células eram CD45~, 99,78% das células eram negativas para CD133, e 99,39% das células eram negativas para CD45 e CD133. 99,31% das células eram positivas para CD90, 99,7% eram negativas para CD117, e 99,01% eram positivas para CD90 e negativas para CD117. 95,7% das células eram negativas para CD80 e CD86.
Os resultados da citometria de fluxo para as células estaminais do cordão umbilical mostraram que 95, 95% das células eram CD200+, 94,71% eram CD105+ e 92,69% eram CD105+ e CD200 + . 99,93% das células eram CD10+, 99,99% das células eram CD34- e 99,6% das células eram CD10+ e CD34~. 99,45% das células eram positivas para citoqueratina, 99,78% das células eram CD44+ e 99,3% das células eram positivas para citoqueratina e CD44. 99,33% das células eram CD45~, 99,74% eram CD133- e 99,15% das células eram CD45- e CD133-. 99,84% das células eram CD117-, 98,78% das células eram CD90+ e 98,64% das células eram CD90+ e CD117-.
Um fenótipo (CD200 + , CD105+, CD10 + , CD34~) parece ser consistente num grande número dessas análises. Este fenótipo é adicionalmente positivo para CD90, CD44, HLA ABC (fraco), microglobulina β-2 (fraco) e citoqueratina K, e negativo para HLA DR,DQ,DP, CD117, CD133 e CD45.
6.4 EXEMPLO 4: DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE ALDEÍDO-DESIDROGENASE EM CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS 0 nivel de atividade de aldeido-desidrogenase (ALDH), um marcador potencial da capacidade de enxerto das células estaminais, foi determinado utilizando um Kit de Ensaio ALDEFLUOR® de Stem Cell Technologies, Inc. Tipicamente, células estaminais indiferenciadas mais primitivas demonstram menos atividade de ALDH que as células estaminais mais diferenciadas. 0 ensaio utiliza ALDEFLUOR®, um substrato fluorescente de ALDH (Aldagen, Inc., Durham, North Carolina). Foi seguido o protocolo do fabricante. 0 reagente ALDEFLUOR® seco é proporcionado numa forma inativa estável. 0 ALDEFLUOR® foi ativado dissolvendo o composto seco em dimetilsulfóxido (DMSO) e adicionando HC1 2N, e foi adicionado imediatamente às células. Foi também estabelecido um tubo de controlo combinando as células com ALDEFLUOR® mais DEAB, um inibidor especifico de ALDH.
As células analisadas incluíram quatro linhas de células estaminais do cordão umbilical e três linhas de células estaminais placentárias da placa corioamniótica, uma linha de células estaminais mesenquimatosas derivadas de medula óssea (BM-MSC), uma linha de células estaminais derivadas de adiposo (ADSC), uma linha de células de trofoblasto viloso humano (HVT), e células estaminais CD34 + purificadas de sangue do cordão.
0 ensaio prosseguiu como se segue. A concentração da amostra foi ajustada a 1X106 células /mL com tampão de ensaio proporcionado com o Kit de Ensaio ALDEFLUOR®. 1 mL da suspensão celular ajustada no tubo experimental e de controlo para cada uma das linhas de células testadas, e 5 pL de DEAB foram agregados adicionalmente ao tubo de controlo marcado como controlo. 0 substrato de ALDEFLUOR® foi ativado adicionando 25 pL de DMSO ao Reagente ALDEFLUOR® seco, e deixou-se repousar 1 minuto à TA. Foram adicionados 25 pL de HC1 2N e bem misturados. Esta mistura foi incubada durante 15 min à TA. Foram adicionados 360 pL de tampão de ensaio de ALDEFLUOR® ao frasco e misturados. A mistura resultante foi armazenada a 2-8 °C até à utilização.
Foram adicionados 5 pL do reagente ALDEFLUOR® ativado por 1 mililitro de amostra aos tubos experimentais, e 0,5 mL desta mistura foram imediatamente transferidos para os tubos de controlo. Os tubos experimentais e de controlo para cada linha de células foram incubados durante 30 minutos a 37 °C. Após incubação, os tubos foram centrifugados a 400 x g, e o sobrenadante foi rejeitado. As células no sedimento resultante foram ressuspensas em 0,5 mL de Tampão de Ensaio e analisadas por citometria de fluxo. Os dados foram analisados utilizando o software FLOWJO™ (Tree Star, Ashland, Oregon). Foram gerados gráficos de SSC vs FSC e SSC vs FLl no espaço de trabalho do FLOWJO™. Foram abertos ficheiros de dados de controlo e experimentais para cada amostra e foram determinados os controlos apropriados com base nas amostras de controlo. As células positivas foram calculadas como uma percentagem de eventos positivos para ALDEFLUOR® do número total de eventos contados.
As linhas de células estaminais placentárias demonstraram atividade de ALDH desde cerca de 3% a cerca de 25% (3,53%, 8,76% e 25,26%). As linhas de células estaminais do cordão umbilical demonstraram atividade de ALDH desde cerca de 16% a cerca de 20% (16,59%, 17,01%, 18,44% e 19,83%). Pelo contrário, as BM-MSC e os HVT foram negativos e 1,5% respetivamente para ALDH, mas as MSC derivadas de adiposo são cerca de 30% ALDH+. As células CD34+ purificadas de sangue do cordão umbilical de controlo positivo foram, como esperado, altamente positivas (75%) para ALDH.
6.5 EXEMPLO 5: COLHEITA DAS CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS POR PERFUSÃO EM CIRCUITO FECHADO
Este exemplo demonstra um método de colheita de células estaminais placentárias por perfusão.
Uma placenta pós-parto é obtida dentro de 24 horas depois do parto. O cordão umbilical é fixo com uma pinça de cordão umbilical aproximadamente 3 a 4 polegadas do disco placentário, e o cordão é cortado acima da pinça. O cordão umbilical é rejeitado ou processado para recuperar, e.g., as células estaminais do cordão umbilical, e/ou para processar a membrana do cordão umbilical para a produção de um biomaterial. O excesso de membrana amniótica e cório é cortado da placenta, ficando aproximadamente Ή de polegada em torno do bordo da placenta. O material cortado é rejeitado.
Começando desde o bordo da membrana placentária, a membrana amniótica é separada do cório utilizando dissecção romba com os dedos. Quando a membrana amniótica está completamente separada do cório, a membrana amniótica é cortada em torno da base do cordão umbilical com umas tesouras, e desprendida do disco placentário. A membrana amniótica pode ser rejeitada, ou processada, e.g., para obter células estaminais por digestão enzimática, ou para produzir, e.g., um biomaterial da membrana amniótica. 0 lado fetal do material placentário remanescente é limpo de todos os coágulos de sangue e sangue residual visíveis utilizando uma gaze estéril, e é em seguida esterilizado limpando com uma zaragatoa com iodo, do que com uma zaragatoa com álcool. 0 cordão umbilical é sem seguida fixo transversalmente com um hemostático estéril por baixo da pinça do cordão umbilical, e o hemostático é rodado, puxando o cordão sobre a pinça para criar uma dobra. 0 cordão é então parcialmente cortado por baixo do hemostático para expor uma secção transversal do cordão suportado pela pinça. Alternativamente, o cordão é fixo com um hemostático estéril. 0 cordão é em seguida colocado em gaze estéril e mantido com o hemostático a proporcionar tensão. 0 cordão é em seguida cortado de forma linear imediatamente abaixo do hemostático, e o bordo do cordão próximo do vaso é novamente fixo.
Os vasos expostos como descrito anteriormente, geralmente uma veia e duas artérias, são identificados, e abertos como se segue. Uma pinça crocodilo fechada é introduzida através da extremidade cortada de cada vaso, tendo cuidado de não perfurar as paredes do vaso com a pinça. A inserção é parada quando a ponta da pinça está ligeiramente acima da base do cordão umbilical. A pinça é então aberta ligeiramente e retirada lentamente do vaso para dilatar o vaso.
Em cada uma das artérias placentárias é inserido um tubo de plástico, conectado a um dispositivo de perfusão ou bomba peristáltica. 0 tubo de plástico, conectado a um saco de colheita de 250 mL, é inserido na veia placentária. O tubo é fixo com fita-cola em posição.
Um pequeno volume de solução de NaCl 0, 9% para injeção estéril para verificar as fugas. Se não houver fugas, a velocidade da bomba é aumentada e são bombeados cerca de 750 mL da solução de NaCl de 0, 9% para injeção através da vasculatura placentária. A perfusão pode ser auxiliada massajando suavemente o disco placentário desde os bordos exteriores para o cordão. Quando um saco de colheita fica cheio, o saco é removido do acoplador que conecta o tubo até ao saco, e é conectado um novo saco ao tubo.
Quando a colheita é terminada, os sacos de colheita são pesados e equilibrados para centrifugação. Após centrifugação, cada saco é colocado dentro de extrator de plasma sem perturbar o sedimento de células. O sobrenadante dentro dos sacos é em seguida removido e rejeitado. O saco é então massajado suavemente para ressuspender as células no sobrenadante remanescente. Utilizando uma seringa de 1 mL estéril são retirados cerca de 300-500 yL de células do saco de colheita, através de um acoplador de sítio de amostragem, e transferidos para um tubo de centrifugadora de 1,5 mL. São determinados o peso e o volume do perfusato remanescente, e é adicionado 1/3 de volume de hetamido ao perfusato e misturado exaustivamente. É determinado o número de células por mL. Os glóbulos vermelhos são removidos do perfusato utilizando um extrator de plasma.
As células placentárias são em seguida cultivadas imediatamente para isolar as células estaminais placentárias, ou são crioconservadas para utilização posterior.
6.6 EXEMPLO 6: DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS
ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS 6.6.1 Indução de Diferenciação em Neurónios A diferenciação neuronal de células estaminais placentárias pode ser também conseguida como se segue: 1. Células estaminais placentárias são cultivadas durante 24 h em meio de pré-indução que consiste em DMEM/20% de FBS e beta-mercaptoetanol 1 mM. 2. O meio de pré-indução é removido e as células são lavadas com PBS. 3. É adicionado meio de indução neuronal que consiste em DMEM e betamercaptoetanol 1-10 mM às células. Alternativamente, pode ser utilizado um meio de indução que consiste em DMEM/2% de DMSO/hidroxianisole butilado 200 μΜ. 4. Em certas formas de realização, podem ocorrer alterações morfológicas e moleculares tão cedo como aos 60 minutos após exposição a meios sem soro e betamercaptoetanol. Pode utilizar-se RT/PCR para avaliar a expressão, e.g., dos genes do recetor do fator de crescimento de tecido nervoso e da cadeia pesada de neurofilamentos. 6.6.2 Indução de Diferenciação em Adipócitos Várias culturas de células estaminais placentárias derivadas da digestão enzimática de âmnios, a 50-70% de confluência, foram induzidas num meio que compreende (1) DMEM/MCDB-201 com 2% de FCS, 0,5% de hidrocortisona, isobutilmetilxantina 0,5 mM (IBMX), indometacina 60 μΜ; ou (2) DMEM/MCDB-201 com 2% de FCS e 0,5% de ácido linoleico. As células foram examinadas quanto às alterações morfológicas; após 3-7 dias, surgiram goticulas de óleo. A diferenciação foi também avaliada por PCR quantitativa em tempo real para examinar a expressão de genes específicos associados à adipogénese, i.e., PPAR-y2, aP-2, lipoproteína-lipase e osteopontina. Duas culturas de células estaminais placentárias exibiram um aumento de 6,5 vezes e 24,3 vezes na expressão de genes específicos de adipócitos, respetivamente. Quatro outras culturas exibiram um aumento moderado (1,5-2,0 vezes) na expressão de ΡΡΑϊ1-γ2 após indução da adipogénese.
Noutra experiência, as células estaminais placentárias obtidas a partir do perfusato foram cultivadas em DMEM/MCDB-201 (Meio basal de fibroblastos de pinto) com 2% de FCS. As células foram tripsinizadas e centrifugadas. As células foram ressuspensas em meio de indução de adipócitos (AIM) 1 ou 2. O AIMl compreendia Meio Basal MesenCult para células estaminais mesenquimatosas humanas (StemCell Technologies) suplementado com Suplementos Adipogénicos para Células Estaminais Mesenquimatosas (StemCell Technologies). 0 AIM2 compreendia DMEM/MCDB-201 com 2% de FCS e LA-BSA (1%) . Cerca de 1,25 x 105 células estaminais placentárias foram cultivadas em 5 mL de AIMl ou AIM2 em balões T-25. As células foram cultivadas em incubadoras durante 7-21 dias. As células desenvolveram vacúolos de goticulas de óleo no citoplasma, como foi confirmado por revelação com vermelho de óleo, o que sugere a diferenciação das células estaminais em adipócitos. A diferenciação adipogénica de células estaminais placentárias pode ser também conseguida como se segue: 1. Células estaminais placentárias são cultivadas em MSCGM (Cambrex) ou DMEM suplementado com 15% de soro de sangue do cordão. 2. São utilizados três ciclos de indução/manutenção. Cada ciclo consiste em alimentar as células estaminais placentárias com Meio de Indução de Adipogénese (Cambrex) e cultivar as células durante 3 dias (a 37 °C, 5% de CO2) , seguido de 1-3 dias de cultura em Meio de Indução de Adipogénese (Cambrex). Um meio de indução alternativo que pode ser utilizado contém dexametasona 1 μΜ, indometacina 0,2 mM, 0,01 mg/mL de insulina, IBMX 0,5 mM, DMEM-alta glicose, FBS e antibióticos. 3. Após 3 ciclos completos de indução/manutenção, as células são cultivadas durante mais 7 dias em meio de manutenção de adipogénese, substituindo o meio a cada 2-3 dias. 4. Uma marca distintiva de adipogénese é o desenvolvimento de múltiplas vesículas de lípidos intracitoplasmáticas que podem ser facilmente observadas utilizando o óleo de revelação lipófilo vermelho O. A expressão dos genes de lipase e/ou proteína de ligação de ácidos gordos é confirmada por RT/PCR em células estaminais placentárias que começaram a diferenciar-se em adipócitos. 6.6.3 Indução de Diferenciação em Osteócitos O meio osteogénico foi preparado a partir de 185 mL de Meio Basal de Diferenciação Cambrex - Osteogénico e SingleQuots (um de cada um de dexametasona, 1-glutamina, ascorbato, pen/estrep, MCGS e β-glicerofosfato). As células estaminais placentárias do perfusato foram plaqueadas a cerca de 3 x 103 células por cm2 de área superficial de cultura de tecido em 0,2-0,3 mL de MSCGM por cm2 de área de cultura de tecido. Tipicamente, todas as células aderiram à superfície de cultura durante 4-24 horas em MSCGM a 37 °C em 5% de CO2. A diferenciação osteogénica foi induzida substituindo o meio por Meio de Diferenciação Osteogénica. A morfologia celular começou a mudar do aspeto em forma de fuso típico das células estaminais placentárias aderentes, para um aspeto de tipo cubo, acompanhada de mineralização. Algumas células deslaminaram da superfície de cultura de tecido durante a diferenciação. A diferenciação osteogénica pode ser também conseguida como se segue: 1. Culturas aderentes de células estaminais placentárias são cultivadas em MSCGM (Cambrex) ou DMEM suplementado com 15% de soro de sangue do cordão. 2. As culturas são cultivadas durante 24 horas em balões de cultura de tecido. 3. A diferenciação osteogénica é induzida substituindo o MSCGM por Meio de Indução Osteogénica (Cambrex) que contém dexametasona 0,1 μΜ, ácido ascórbico-2-fosfato 0,05 mM, beta-glicerofosfato 10 mM. 4. As células são alimentadas a cada 3-4 dias durante 2-3 semanas com Meio de Indução Osteogénica. 5. A diferenciação é analisada utilizando um corante específico para cálcio e RT/PCR para a expressão de genes de fosfatase alcalina e osteopontina. 6.6.4 Indução de Diferenciação em Células
Pancreáticas A diferenciação pancreática é conseguida como se segue: 1. Células estaminais placentárias são cultivadas em DMEM/20% de CBS, suplementado com fator de crescimento de fibroblastos básico, 10 ng/mL; e fator de crescimento transformante beta-1, 2 ng/mL. Pode ser utilizada
Substituição de Soro Inativado em vez de CBS. 2. É adicionado meio condicionado de culturas de células neuronais positivas para nestina ao media a uma concentração de 50/50. 3. As células são cultivadas durante 14-28 dias, realimentando a cada 3-4 dias. 4. A diferenciação é caracterizada por doseamento da proteína insulina ou expressão do gene de insulina por RT/PCR. 6.6.5 Indução de Diferenciação em Células
Cardíacas A diferenciação miogénica (cardiogénica) é conseguida como se segue: 1. Células estaminais placentárias são cultivadas em DMEM/20% de CBS, suplementado com ácido retinoico, 1 μΜ; fator de crescimento de fibroblastos básico, 10 ng/mL; e fator de crescimento transformante beta-1, 2 ng/mL; e fator de crescimento epidérmico, 100 ng/mL. Pode ser utilizada
Substituição de Soro Inativado (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) em vez de CBS. 2. Alternativamente, as células estaminais placentárias são cultivadas em DMEM/20% de CBS suplementado com 50 ng/mL de Cardiotrofina-1 durante 24 horas. 3. Alternativamente, as células estaminais placentárias são mantidas em meio sem proteína durante 5-7 dias, em seguida estimuladas com extrato do miocárdio humano (análise de dose crescente). O extrato de miocárdio é produzido homogeneizando 1 g de miocárdio humano em tampão de HEPES a 1% suplementado com 1% de soro de sangue do cordão. A suspensão é incubada durante 60 minutos, em seguida centrifugada e o sobrenadante recolhido. 4. As células são cultivadas durante 10-14 dias, realimentando a cada 3-4 dias. 5. A diferenciação é confirmada através da demonstração da expressão do gene de actina cardíaca por RT/PCR. 6.6.6 Indução de Diferenciação em Condrócitos 6.6.6.1 Método Geral A diferenciação condrogénica de células estaminais placentárias é geralmente conseguida como se segue: 1. Células estaminais placentárias são mantidas em MSCGM (Cambrex) ou DMEM suplementado com 15% de soro de sangue do cordão. 2. As células estaminais placentárias são divididas em alíquotas para um tubo de polipropileno estéril. As células são centrifugadas (150 x g durante 5 minutos) e lavadas duas vezes em Meio de Condrogénese Incompleto (Cambrex) . 3. Após a última lavagem, as células são ressuspensas em Meio de Condrogénese Completo (Cambrex) que contém 0,01 yg/mL de TGF-beta-3 a uma concentração de 5 x 10(5) células/mL. 4. 0,5 mL de células são divididos em alíquotas para um tubo de cultura de 15 mL em polipropileno. As células são sedimentadas a 150 x g durante 5 minutos. O sedimento é deixado intacto no meio. 5. Os tubos tapados frouxamente são incubados a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 horas. 6. Os sedimentos celulares são alimentados a cada 2-3 dias com meio de condrogénese completo recém-preparado. 7. Os sedimentos são mantidos suspensos no meio por agitação diária utilizando uma agitação em vórtice de baixa velocidade. 8. Os sedimentos celulares condrogénicos são colhidos após 14-28 dias em cultura. 9. A condrogénese é caracterizada, e.g., pela observação da produção de substância de base eosinofílica, avaliando a morfologia celular, e/ou confirmação por RT/PCR da expressão dos genes de colagénio 2 e/ou colagénio 9 e/ou pela produção de mucopolissacáridos ácidos da matriz da cartilagem, como se confirma por revelação citoquimica com Azul de Alciano. 6.6.6.2 Diferenciação de Células Estaminais Placentárias e do Cordão Umbilical em Células Condrogénicas 0 Exemplo demonstra a diferenciação de células estaminais placentárias em células condrogénicas e o desenvolvimento de tecido do tipo cartilagem a partir dessas células. A cartilagem é um tecido avascular, alinfático que carece de um fornecimento nervoso. A cartilagem tem uma baixa densidade de condrócitos (<5%) , contudo estas células são surpreendentemente eficientes na manutenção da matriz extracelular em torno das mesmas. No corpo há três tipos principais de cartilagem: (1) cartilagem articular, que facilita a lubrificação da articulação nas articulações; (2) fibrocartilagem, que proporciona absorção de choque, e.g., no menisco e disco intervertebral; e (3) cartilagem elástica, que proporciona uma estrutura anatómica, e.g., no nariz e orelhas. Todos os três tipos de cartilagem são semelhantes em estrutura bioquímica. A dor articular é uma causa principal de incapacidade e proporciona uma necessidade não satisfeita de alívio na área da ortopedia. A osteoartrite primária (que pode originar degeneração da articulação), e o traumatismo são duas causas comuns de dor. Aproximadamente 9% da população dos E.U.A. tem osteoartrite da anca ou joelho, e são realizadas mais de 2 milhões de cirurgias ao joelho por ano. Infelizmente, os tratamentos atuais estão mais focados no tratamento de sintomas do que na reparação da cartilagem. A reparação natural ocorre quando células análogas a fibroblastos invadem a área e preenchem-na com tecido fibroso que não é tão resiliente nem tão elástico como o tecido normal, originando assim mais dano. As opções de tratamento incluíram historicamente enxertos de tecido, perfuração subcondral ou substituição total da articulação. No entanto, os tratamentos mais recentes incluem CARTICEL®, uma injeção autóloga de condrócitos; SYNVISC® e ORTHOVISC®, que são injeções de ácido hialurónico para alivio temporário da dor; e CHONDROGEN™, uma injeção de células estaminais mesenquimatosas adultas para reparação do menisco. Em geral, a tendência parece situar-se mais para as terapias celulares e/ou produtos de tecidos modificados geneticamente que envolvem condrócitos ou células estaminais.
Materiais e Métodos.
Foram utilizadas duas linhas de células estaminais placentárias, designadas AC61665, P3 (passagem 3) e AC63919, P5, e duas linhas de células estaminais do cordão umbilical, designadas UC67249, P2 e UC67477, P3 nos estudos delineados a seguir. Foram utilizadas células estaminais mesenquimatosas (MSC) humanas como controlos positivos, e foram utilizados uma linha de células de osteossarcoma, MC3T3, e fibroblastos dérmicos humanos (HDF) como controlos negativos. Células estaminais placentárias e do cordão umbilical foram isoladas e purificadas a partir de placenta humana de termo completo por digestão enzimática. As células MSC humanas e as células HDF foram adquiridas de Cambrex, e as células MC3T3 foram adquiridas de American Type Culture Collection. Todas as linhas de células utilizadas foram centrifugadas em sedimentos em tubos de centrifugadora de polipropileno a 800 RPM durante 5 minutos e cultivadas tanto em meio de indução condrogénica (Cambrex) e meio MSC basal não indutor (Cambrex). Os sedimentos foram colhidos e analisados histologicamente aos 7, 14, 21 e 28 dias por revelação para glicosaminoglicanos (GAGs) com Azul de Alciano, e/ou para colagénios com Sirius Red. O tipo de colagénio foi ainda avaliado com imunorrevelação. Foi realizada a análise de ARN para genes específicos da cartilagem aos 7 e 14 dias.
Resultados
Experiência 1: Os estudos de condrogénese foram concebidos para conseguir três objetivos principais: (1) demonstrar que as células estaminais placentárias e do cordão umbilical podem diferenciar-se e formar tecido da cartilagem; (2) demonstrar que as células estaminais placentárias e do cordão umbilical podem diferenciar-se funcionalmente em condrócitos; e (3) validar os resultados obtidos com as células estaminais, avaliando linhas de células de controlo.
Para o objetivo 1, num estudo preliminar, uma linha de células estaminais placentárias foi cultivada em meio de indução condrogénica na forma de sedimentos celulares, quer com ou sem proteína morfogenética do osso (BMP) a uma concentração final de 500 ng/mL. Os sedimentos foram avaliados para a evidência de indução condrogénica a cada semana durante 4 semanas. Os resultados indicaram que os sedimentos aumentam de tamanho ao longo do tempo. No entanto, não foram observadas diferenças visuais entre as amostras BMP+ e BMP". Os sedimentos foram também analisados histologicamente quanto a GAG, um indicador de tecido da cartilagem, por revelação com Azul de Alciano. As células BMP+ pareceram geralmente mais ativas metabolicamente com vacúolos pálidos, enquanto as células BMP" eram mais pequenas com núcleos revelados de forma densa e menos citoplasma (reflete baixa atividade metabólica). Aos 7 dias, as células BMP+ revelaram fortemente azuis, enquanto as BMP" revelaram apenas fracamente. Aos 28 dias de indução, tanto as células BMP+ como as BMP" foram reveladas de forma quase equivalente com Azul de Alciano. Na globalidade, a densidade celular diminuiu ao longo do tempo, e a matriz substituiu o sedimento. Pelo contrário, a linha de células negativa MC3T3 não demonstrou qualquer presença de GAG quando revelada com Azul de Alciano.
Experiência 2: Com base nos resultados da Experiência 1, foi concebido um estudo mais detalhado para avaliar o potencial de diferenciação condrogénica de duas linhas de células estaminais placentárias e duas linhas de células estaminais do cordão umbilical. Além da histologia com Azul de Alciano, as células foram também reveladas com Sirius Red, o qual é especifico para colagénio de tipo II. Foram preparados sedimentos múltiplos para cada linha de células, com e sem meio de indução.
As linhas de células cultivadas, sedimentadas foram primeiro avaliadas por observação macroscópica para a geração macroscópica de cartilagem. Na globalidade, foi observado que as linhas de células estaminais faziam sedimentos tão cedo como o dia 1. Estes sedimentos cresciam ao longo do tempo e formavam uma matriz dura, de aspeto branco, brilhante e semelhante a cartilagem, e tornaram-se mecanicamente duros. Por inspeção visual, os sedimentos das células estaminais placentárias ou células estaminais do cordão umbilical foram muito maiores que os controlos de MSC. Os sedimentos do controlo no meio sem indução começaram a desagregar-se pelo Dia 11, e estavam muito mais pequenos aos 28 dias do que os sedimentos desenvolvidos por células cultivadas em meio de indução condrogénica. Visualmente, não havia diferenças entre os sedimentos formados pelas células estaminais placentárias ou do cordão umbilical. No entanto, a linha de células estaminais UC67249, que foi iniciada em meio sem dexametasona, formou sedimentos maiores. As células MC3T3 de controlo negativo não formaram sedimentos; contudo, os HDFs formaram sedimentos.
Os sedimentos representativos de todos os grupos de ensaio foram em seguida submetidos a análise histológica para GAG e colagénio. Em geral, os sedimentos formados pelas células estaminais sob condições de indução foram muito maiores e permaneceram melhor intactos que os sedimentos formados sob condições não indutoras. Os sedimentos formados nas condições de indução apresentaram produção de GAG e teor crescente de colagénio ao longo do tempo, e tão cedo como sete dias, enquanto os sedimentos formados nas condições não indutoras exibiram pouca a nenhuma produção de colagénio, como evidenciado pela revelação fraca com Azul de Alciano. Em geral, as células estaminais placentárias e as células estaminais do cordão umbilical pareceram, por inspeção visual, produzir sedimentos mais duros, maiores e pareciam estar a produzir mais colagénio ao longo do tempo, que as hMSCs. Além do mais, durante o curso do estudo, o colagénio pareceu espessar, e o tipo de colagénio pareceu mudar, como evidenciado por alterações nas cores da fibra sob luz polarizada (as cores correlacionam com a espessura da fibra, o que pode ser indicativo do tipo de colagénio) . As células estaminais placentárias não induzidas produziram muito menos colagénio tipo II, se é que algum, em comparação com as células estaminais induzidas. Ao longo do período de 28 dias, a densidade celular diminuiu à medida que a produção de matriz aumentava, uma caracteristica de tecido da cartilagem.
Estes estudos confirmam que as células estaminais placentárias e do cordão umbilical se podem diferenciar ao longo de uma via condrogénica, e podem ser facilmente induzidas a formar tecido da cartilagem. As observações iniciais indicam que essas células estaminais são preferíveis às MSCs para a formação de tecido da cartilagem.
6.7 EXEMPLO 7: CULTURA EM GOTA SUSPENSA DE CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS Células estaminais aderentes placentárias em cultura são tripsinizadas a 37 °C durante cerca de 5 minutos e soltas da placa de cultura com pancadas ligeiras. É adicionado 10% de FBS à cultura para parar a tripsinização. As células são diluídas a cerca de 1 x 104 células por mL em cerca de 5 mL de meio. As gotas (quer uma única gota ou as gotas de uma micropipeta multicanal) são colocadas dentro da tampa de uma placa de Petri de 100 mL. A tampa é cuidadosamente invertida e colocada por cima do fundo da placa, que contém cerca de 25 mL de PBS estéril para manter o teor de humidade na atmosfera da placa. As células são cultivadas durante 6-7 dias.
6.8 EXEMPLO 8: DIGESTÃO DE TECIDO PLACENTÁRIO PARA OBTER CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS
Este exemplo demonstra um isolamento a uma escala maior de células estaminais placentárias por digestão enzimática.
Aproximadamente 10 gramas de tecido placentário (âmnio e cório) são obtidos, macerados e digeridos utilizando volumes iguais de colagenase A (1 mg/mL) (Sigma) e Tripsina-EDTA (0,25%) (Gibco-BRL) num volume total de cerca de 30 mL durante cerca de 30 minutos a 37 °C. As células libertadas pela digestão são lavadas 3X com meio de cultura, distribuídas em quatro balões T-225 e cultivadas como descrito no Exemplo 1. O rendimento das células estaminais placentárias é entre cerca de 4 x 108 e 5 x 108 células por 10 g de material de partida. As células, caracterizadas na passagem 3, são predominantemente CD10+, CD90 + , CD105+, CD200 + , CD34“ e CD45-.
6.9 EXEMPLO 9: PRODUÇÃO DE PRODUTO DE CÉLULAS ESTAMINAIS CRIOCONSERVADAS E BANCO DE CÉLULAS ESTAMINAIS
Este exemplo demonstra o isolamento de células estaminais placentárias e a produção de um produto à base de células estaminais congeladas.
Resumo: O tecido placentário é dissecado e digerido, seguido de culturas primárias e de expansão para conseguir um produto celular expandido que produz muitas doses de células. As células são armazenadas num banco de células de dois níveis e são distribuídas como um produto celular congelado. Todas as doses celulares derivadas de uma placenta de um único doador são definidas como um lote, e um lote de placenta é processado um de cada vez utilizando uma técnica estéril numa sala dedicada e hote de fluxo laminar Classe 100. O produto celular é definido como sendo CD105+, CD200 + , CD10+ e CD34~, com um cariótipo normal e nenhum ou substancialmente nenhum conteúdo de células maternas. 6.9.1 Obtenção de Células Estaminais
Dissecção e Digestão de Tecido: A placenta é obtida menos de 24 horas após expulsão. O tecido placentário é obtido a partir de âmnio, uma combinação de âmnio e cório, ou cório. O tecido é picado em pequenos pedaços, com cerca de 1 mm de tamanho. O tecido picado é digerido em 1 mg/mL de Colagenase IA durante 1 hora a 37 °C seguido de Tripsina-EDTA durante 30 minutos a 37 °C. Após três lavagens em 5% de FBS em PBS, o tecido é ressuspenso em meio de cultura.
Cultura Primária: O fim da cultura primária é estabelecer células de tecido placentário digerido. 0 tecido digerido é suspenso em meio de cultura e colocado em balões T Corning, que são incubados numa câmara humidificada mantida a 37 °C com 5% de CO2. Metade do meio é reabastecida após 5 dias de cultura. Formam-se colónias de alta densidade de células às 2 semanas de cultura. As colónias são colhidas com Tripsina-EDTA, que é em seguida desativada com 2% de FBS em PBS. As células são centrifugadas e ressuspensas em meio de cultura para a inoculação de culturas de expansão. Estas células são definidas como células de Passagem 0 com 0 vezes de duplicação.
Cultura de Expansão: Células colhidas da cultura primária, colhidas da cultura de expansão ou descongeladas do banco de células são utilizadas para inocular culturas de expansão. As Fábricas de Células (NUNC™) são tratadas com 5% de CO2 em ar a 50 mL/min/tabuleiro durante 10 min através de um filtro estéril e aquecidas numa incubadora humidificada mantida a 37 °C com 5% de CO2. As sementes celulares são contadas num hemocitómetro com azul de tripano, e são registados o número de células, a viabilidade, o número de passagens e o número acumulativo de duplicações. As células são suspensas em meio de cultura a cerca de 2,3 X 104 células/mL e são inoculados 110 mL/tabuleiro nas Fábricas de Células. Após 3-4 dias e novamente aos 5-6 dias de cultura, o meio de cultura é removido e substituído por meio fresco, seguido de outro tratamento com 5% de CO2 em ar. Quando as células atingem aproximadamente 105 células/cm2, as células são colhidas com Tripsina-EDTA, seguido de desativação com 2% de FBS em PBS. As células são em seguida centrifugadas e ressuspensas em meio de cultura.
Crioconservação: As células a ser congeladas são colhidas da cultura com Tripsina-EDTA, desativadas com 2% de FBS em PBS, e contadas num hemocitómetro. Após centrifugação, as células são ressuspensas com 10% de DMSO em FBS a uma concentração de cerca de 1 milhão de células/mL para as células que vão ser utilizadas na preparação de um banco de células, e 10 milhões de células/mL para doses de células congeladas individuais. A solução de células é transferida para um recipiente de congelação, o qual é colocado num banho de álcool isopropilico num congelador a -80 °C. No dia seguinte, as células são transferidas para azoto liquido. 6.9.2 Conceção de um Banco de Células Estaminais
Um "lote" é definido como todas as doses de células derivadas de uma placenta de um único doador. As células mantiveram um crescimento, cariótipo e fenótipo de marcadores da superfície celular normais por mais de 8 passagens e 30 duplicações durante a cultura de expansão. Dada esta limitação, as doses compreendem células de 5 passagens e cerca de 20 duplicações. Para gerar um fornecimento de células equivalentes, um único lote é expandido em cultura e é armazenado num banco de células de dois níveis e as doses congeladas. Em particular, as células colhidas da cultura primária, que são definidas como células de Passagem 0 que sofreram 0 duplicações, são utilizadas para iniciar uma cultura de expansão. Após a primeira passagem, ocorrem aproximadamente 4 duplicações, e as células são congeladas num Banco de Células Primárias (MCB) . Os frascos do MCB são utilizados para inocular culturas de expansão adicionais. Após duas passagens adicionais de células descongeladas do MCB, as células são congeladas num Banco de Células de Trabalho (WCB), aproximadamente 12 duplicações acumulativas. Os frascos do WCB são utilizados para inocular uma cultura de expansão para mais 2 passagens, resultando em células de Passagem 5 a aproximadamente 20 duplicações que são congeladas em doses individuais. 6.9.3 Descongelação de Células para Cultura
Os recipientes congelados de células são colocados num saco de plástico selado e mergulhados num banho-maria a 37 °C. Os recipientes são agitados suavemente em espiral até que todo o conteúdo tenha fundido exceto para um pequeno pedaço de gelo. Os recipientes são retirados do saco de plástico selado e um volume de 10X de meio de cultura é adicionado lentamente às células com mistura suave. Uma amostra é contada no hemocitómetro e inoculada nas culturas de expansão. 6.9.4 Descongelação de Células para Injeção
Os recipientes congelados de células são transferidos para o sitio de administração num expedidor de azoto seco. Antes da administração, os recipientes são colocados num saco de plástico selado e mergulhados num banho-maria a 37 °C. Os recipientes são agitados suavemente em espiral até que todo o conteúdo tenha fundido exceto para um pequeno pedaço de gelo. Os recipientes são retirados do saco de plástico selado e é adicionado um volume igual de 2,5% de HSA/5% de Dextrano. As células são injetadas sem mais lavagem. 6.9.5 Avaliação e Especificações
Uma amostra de sangue materno acompanha todas as placentas de doador. A amostra é pesquisada para o antigénio de superfície e o anticorpo contra a nucleocápside de Hepatite B, o ácido nucleico e o anticorpo contra Vírus da Hepatite C, e o ácido nucleico e anticorpo contra HIV I e II. 0 processamento placentário e a cultura primária começam antes da receção dos resultados dos testes, mas prosseguem apenas para as placentas associadas a amostras de sangue materno que testaram negativas para todos os vírus. Um lote é rejeitado se o doador der um teste positivo para qualquer agente patogénico. Além disso, os testes descritos na Tabela 3 são realizados no MCB, no WCB, e uma amostra do material de dose celular derivado de um frasco do WCB. Um lote é libertado apenas quando são cumpridas todas as especificações.
Tabela 3: Avaliação das
células e especificações
6.9.6 Análise do Fenótipo de Marcadores Superficiais
As células são colocadas em paraformaldeído a 1% (PFA) em PBS durante 20 minutos e armazenadas num frigorífico até revelarem (até uma semana) . As células são lavadas com 2% de FBS, 0,05% de azida de sódio em PBS (Tampão de Revelação) e, em seguida, ressuspensas em tampão de revelação. As células são reveladas com os seguintes conjugados de anticorpos: CD105-FITC, CD200-PE, CD34-PECy7, CD10-APC. As células são também reveladas com controlos de isotipo. Após 30 minutos de incubação, as células são lavadas e ressuspensas com Tampão de Revelação, seguido de análise num citómetro de fluxo. As células que têm uma fluorescência aumentada em comparação com os controlos de isotipo são contadas como positivas para um marcador.
6.10 EXEMPLO 10: IDENTIFICAÇÃO DE GENES ESPECÍFICOS DE CÉLULAS ESTAMINAIS PLACENTÁRIAS
Os padrões de expressão de genes de células estaminais placentárias de âmnio-cório (AC) e cordão umbilical (UC) foram comparados com os padrões de expressão de genes de células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea (BM) multipotentes e fibroblastos dérmicos (DF), os últimos dos quais se consideram estar diferenciados terminalmente. As células foram cultivadas durante uma única passagem, um número intermédio de passagens e um grande número de passagens (incluindo até à senescência). Os resultados indicam que o número de duplicações da população tem um impacto importante na expressão de genes. Foi identificado um conjunto de genes que estão regulados positivamente em AC e UC, e regulados negativamente ou ausentes em BM e DF, e que são expressos independente do número de passagens. Este conjunto de genes específicos de células estaminais placentárias ou células estaminais do cordão umbilical codificam um número de proteínas do citoesqueleto e da adesão célula a célula associadas a células epiteliais e uma proteína de superfície do tipo imunoglobulina, CD200, implicada na tolerância imunológica materno-fetal. As células estaminais placentárias e as células estaminais do cordão umbilical serão referidas coletivamente a seguir neste exemplo como células estaminais de AC/UC. 6.10.1 Métodos e Materiais 6.10.1.1 Células e Cultura de Células BM (Cat# PT-2501) e DF (Cat# CC-2511) foram adquiridos de Cambrex. AC e UC tiveram origem nos balões de cultura de tecido de passagem 0. AC e UC nos balões foram obtidas por digestão de uma placenta de doador designada 2063919. Os balões de cultura T-75 foram inoculados a 6000 células/cm2 e as células foram passadas quando se tornaram confluentes. As duplicações da população foram estimadas a partir das contagens de células com azul de tripano. As culturas foram analisadas para a expressão de genes após 3, 11-14 e 24-38 duplicações da população. 6.10.1.2 ARN, Micromatrizes e Análise
As células foram sujeitas a lise diretamente nos seus balões de cultura de tecido, com a exceção de uma cultura que foi tripsinizada antes da lise. O ARN total foi isolado com o kit RNeasy da QIAGEN. A integridade e as concentrações de ARN foram determinadas com um
Bioanalisador Agilent 2100. Dez microgramas de ARN total de cada cultura foram hibridados numa plataforma Affymetrix GENECHIP®. O ARN total foi convertido em ARNcs marcados e hibridados com matrizes oligonucleotidicas U133A 2.0 do
Genoma Humano de acordo com os métodos do fabricante. Os ficheiros de imagem foram processados com o software Affymetrix MAS 5.0, e normalizados e analisados com o software Agilent GeneSpring 7.3. 6.10.2 Resultados 6.10.2.1 Seleção de Pontos no Tempo de Culturas de BM-MSCr Células Estaminais de AC/UC, e DF para Análises de Micromatriz A fim de estabelecer um padrão de expressão de genes único para células estaminais de AC/UC, duas linhas de células estaminais, AC(6) e UC(6), foram cultivadas em paralelo com BM-MSC e DF. Para maximizar a identificação de um perfil de expressão de genes que pode ser atribuído à origem celular e minimizar a influencia exógena todas as células foram cultivadas no mesmo meio, inoculadas e subcultivadas utilizando os mesmos critérios. As células foram colhidas após 3 duplicações da população, 11-14 duplicações, ou 35 duplicações ou senescência, o que ocorrer primeiro. Os genes cuja expressão em células estaminais de AC/UC permanece inalterada pelo tempo em cultura e são regulados positivamente relativamente a BM e DF são candidatos a genes específicos de células estaminais de AC/UC. A FIG. 10 mostra os perfis de crescimento para as quatro linhas de células no estudo; os círculos indicam que culturas foram colhidas para isolamento de ARN. No total foram colhidas doze amostras. Foram colhidos BM, AC(6) e UC(6) após três duplicações da população; estas amostras foram consideradas como estando em cultura durante um intervalo de tempo "curto". Uma amostra de DF de curto prazo não foi recolhida. Foram colhidas culturas de duração intermédia, 11 a 14 duplicações, para todos os tipos de células. Foram colhidas culturas de longo prazo de todas as linhas de células a cerca de 35 duplicações da população ou imediatamente antes da senescência, o que ocorreu primeiro. A senescência ocorreu antes das 15 duplicações para BM e às 25 duplicações para DF. As células BM e DF adquiridas foram expandidas muitas vezes antes da análise de genes e não podem ser consideradas de etapa precoce. No entanto, operacionalmente, as BM cultivadas durante três duplicações (BM-03) são consideradas como uma cultura de curto prazo. Do mesmo modo, a BM-11 é referida operacionalmente como uma cultura de duração intermédia, mas uma vez que a senescência ocorreu às 14 duplicações, a BM-11 é muito provavelmente uma cultura de longo prazo biologicamente.
6.10.2.2 Agrupamento Hierárquico Mostra Relação entre BM, Células Estaminais de AC/UC e DF A análise de micromatriz identifica padrões de expressão de genes, e o agrupamento hierárquico (HC) tenta encontrar semelhanças no contexto de duas dimensões - genes na primeira dimensão e diferentes condições (diferentes amostras de ARN) na segunda. 0 GeneChips utilizado nesta experiência continha mais de 22 000 conjuntos de sondas (referido como a "lista de todos os genes"), mas muito destes conjuntos consultam genes que não são expressos em qualquer condição. Para reduzir a lista de todos os genes, os genes não expressados ou expressados a níveis baixos (valores brutos abaixo de 250) em todas as amostras foram eliminados para produzir uma lista de 8 215 genes. 6.10.2.3 Análise de Expressão de Genes Utilizando a Vista de Gráficos de Linhas
Os padrões de expressão de genes dos 8 215 genes foram apresentados utilizando a vista de gráficos de linhas no GeneSpring (FIG. 11) . O eixo dos X mostra as doze condições experimentais e o eixo dos Y mostra os valores de expressão do conjunto de sondas normalizado numa escala logarítmica. 0 eixo dos y cobre uma gama de 10 000 vezes, e os genes que não são expressos ou são expressos a níveis muito baixos são fixos a um valor de 0,01. Por defeito o valor normalizado é fixo em 1. Cada linha representa um único gene (na realidade um conjunto de sondas, alguns genes têm múltiplos conjuntos de sondas) e corre através de todas as doze condições como uma única cor. As cores representam níveis de expressão relativos, como descrito para os mapas térmicos, mas o padrão de cor é determinado ao selecionar uma condição. AC-03 é a condição selecionada na FIG. 11. Os genes regulados positivamente em relação ao valor normalizado são apresentados pelo software como vermelhos, e aqueles que são regulados negativamente, são apresentados como azuis. Os picos que apontam para cima e para baixo óbvios em AC-03 até UC-11 indicam que muitos genes são expressos de forma diferenciada ao longo destas condições. A semelhança impressionante nos padrões de cor entre AC-03 e UC-03 mostra que muitos dos mesmos genes são regulados positiva ou negativamente nestas duas amostras. Os segmentos de linha horizontais indicam que o nível de expressão de um gene permanece inalterado através de um número de condições. Isto é mais evidente ao comparar UC-36, UC-38 e UC-38-T. Não há picos óbvios, mas há uma tendência subtil na medida em que um número de linhas vermelhas entre UC-36 e UC-38-T está abaixo do valor normalizado de 1. Isto indica que estes genes, os quais são regulados positivamente em AC-03 e UC-03, são regulados negativamente nas culturas posteriores. 0 facto de que os padrões de expressão entre UC-38 e UC-38-T são tão semelhantes indica que a tripsinização de células imediatamente antes do isolamento do ARN tem pouco efeito sobre a expressão de genes.
Além do método HC computacionalmente intensivo, por inspeção visual as duas amostras de BM são mais semelhantes entre si que às outras condições. 0 mesmo é verdadeiro para as duas culturas de DF. E apesar do grande número de genes expressados de forma diferenciada presentes nas amostras de BM e DF, o aspeto geral sugere que as duas BMs e as duas DFs são mais semelhante entre si que às células estaminais de AC/UC. Isto é confirmado pelos resultados de HC descritos acima.
Quando o processo anterior é aplicado utilizando AC-11 como a condição selecionada, é evidente que a AC-11 e a UC-11 compartilham muitos dos mesmos genes expressados de forma diferenciada, mas o número total de genes em comum entre estas duas condições parece menor que o número de genes expressados de forma diferenciada compartilhados por AC-03 e UC-03. A FIG. 12 mostra os genes sobreexpressados de forma diferenciada, em seis vezes ou mais relativamente ao valor de base, em AC-03. A maioria dos genes regulados positivamente em AC-03 é também regulada positivamente em UC-03, e mais divergente em BM e DF. 6.10.2.4 Métodos de Filtração Utilizados para identificar Genes Específicos das Células Estaminais de
AC/ UC
Os genes que permanecem constantes ao longo de todas as amostras de AC/UC, e são regulados negativamente em BM e DF, são considerados específicos para células estaminais de AC/UC. Os dois métodos de filtração foram combinados para criar uma lista de 58 genes específicos das células estaminais de AC/UC (Tabela 4).
Tabela 4: 58 genes específicos de Células estaminais placentárias ou Células estaminais do cordão umbilical
Em primeiro lugar, foram identificados 58 genes selecionando aqueles genes sobreexpressados ^ três vezes em pelo menos sete das oito condições das células estaminais de AC/UC relativamente a todas as amostras de BM e DF (FIG. 13) . A filtração em oito das oito condições de células estaminais de AC/UC produziu uma lista semelhante. 0 segundo método de filtração utilizou chamadas "ausentes" e "presentes" proporcionadas pelo software Affymetrix MAS 5.0. Foi criada uma lista que identificava os genes ausentes em todas as condições de BM e DF e presentes em AC-03, AC-11, UC-03 e UC-11. Não foram estipuladas chamadas de genes nas últimas condições das células estaminais de AC/UC.
As duas listas sobrepõem-se significativamente e foram combinadas. A lista combinada foi cortada ainda mais eliminando (1) vários genes expressados em niveis muito baixos na maioria ou em todas as condições das células estaminais de AC/UC, e (2) genes transportados no cromossoma Y. As células de AC e UC utilizadas neste estudo foram confirmadas como sendo masculinas através de análise FISH, e as BM e DF foram derivadas de um doador feminino. A lista resultante de 46 genes específicos de células estaminais de AC/UC é mostrada na Tabela 5.
Tabela 5. Genes Específicos de AC/UC Listados por Ontologia
Esta lista de 46 genes codifica uma coleção de proteínas que apresentam um número de grupos de ontologia. 0 grupo mais altamente representado, adesão celular, contém oito genes. Nenhum gene codifica proteínas envolvidas na replicação de ADN ou divisão celular. São também listados dezasseis genes com referências específicas aos epitélios. 6.10.3 Discussão
Foi identificado um padrão de expressão específico para células estaminais placentárias e que se pode distinguir das células mesenquimatosas derivadas de medula óssea. Operacionalmente, este padrão inclui 46 genes que estão sobreexpressados em todas as amostras de células estaminais placentárias relativamente a todas as amostras de BM e DF. A conceção experimental comparou células cultivadas durante intervalos de tempo curtos, médios e longos em cultura. Para as células de AC e UC, cada período de cultura tem um conjunto característico de genes expressados de forma diferenciada. Durante o curto prazo ou fase inicial (AC-03 e UC-03) duzentos genes regulados positivamente regressam à media após oito duplicações da população. Sem se ficar limitado pela teoria, é provável que este padrão de expressão de genes na etapa inicial se assemelhe ao perfil de expressão de AC e UC, enquanto no ambiente placentário natural. Na placenta, estas células não se dividem ativamente, elas encontram-se a metabolizar nutrientes, a sinalizar entre si mesmas e a garantir a sua localização por remodelação do ambiente extracelular. A expressão de genes pelas culturas de duração intermédia é definida pela rápida divisão celular e os genes expressados de forma diferenciada nesta altura são muito diferentes daqueles expressados de forma diferenciada durante a fase inicial. Muitos dos genes regulados positivamente em AC-11 e UC-11, juntamente com BM-03 e DF-14, estão envolvidos na replicação de cromossomas e divisão celular. Com base na expressão de genes, a BM-03 parece ser biologicamente uma cultura de médio termo. Nesta etapa média, a expressão de genes especifica do tipo de células é ofuscada pela proliferação celular. Além disso, quase todos os genes sobreexpressados nas culturas de AC ou UC de curto prazo estão regulados negativamente nas condições da etapa média e posterior. 143 genes estavam regulados positivamente > cinco vezes durante esta fase altamente proliferativa, o que constitui aproximadamente 1,7% dos genes expressados.
As culturas a longo prazo representam a fase final ou senescente. Nesta fase, as células esgotaram a sua capacidade para se dividir e, especialmente, para as AC e UC, o número absoluto de genes expressados de forma diferenciada é acentuadamente reduzido. Isto pode ser o resultado das células estarem totalmente adaptadas ao seu ambiente de cultura e serem uma carga consequentemente reduzida a biossintetizar. Surpreendentemente, as culturas de BM e DF tardias não apresentam este mesmo comportamento; um grande número de genes é expressado de forma diferenciada em BM-11 e DF-24 relativamente a AC e UC e o valor normalizado de 1. As AC e UC podem ser distinguidas das BM e DF muito especialmente nas culturas de longo prazo. A lista de genes específicos das células estaminais placentárias aqui descrita é variada. C0L4A1 e COL4A2 são regulados de forma coordenada, e KRT18 e KRT8 também parecem ser coexpressados. Oito dos genes codificam proteínas envolvidas no contacto célula a célula, três dos quais (DSC3, DSG2 e PKP2) estão localizados nos desmossomas, pontos de contacto intercelular ancorados a proteínas do citoesqueleto de filamento intermédio tais como queratina 18 e queratina 8. 0 contacto estreito célula a célula é característico de células epiteliais e endoteliais e não está tipicamente associado a fibroblastos. A tabela 3 lista 16 genes, do total de 46, característicos para células epiteliais. As células estaminais placentárias são geralmente descritas como células pequenas em forma de fuso semelhantes a fibroblastos. Esta morfologia é tipicamente distinta das BM e DF, especialmente a densidades celulares mais baixas. É também de assinalar o padrão de expressão de CD200, o qual está presente em células estaminais de AC/UC e ausente em todas as amostras de BM e DF. Além do mais, foi demonstrado que o CD200 está associado a tolerância imunológica na placenta durante o desenvolvimento fetal (ver, e.g., Clark et al.,Am. J. Reprod. Immunol. 50(3):187-195 (2003)).
Este subconjunto de genes de 46 genes constitui um conjunto de biomarcadores moleculares que distingue as células estaminais de AC/UC das células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea ou fibroblastos.
Aspetos adicionais aqui divulgados apenas para efeitos de referência: 1. Um método de produção de uma população de células que compreende identificar células placentárias que aderem a um substrato e: expressam CD200 e HLA-G; expressam CD73, CD105 e CD200; expressam CD200 e OCT-4; expressam CD73, CD 105 e HLA-G; expressam CD73 e CD105, e facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide; ou expressam OCT-4, e (c) facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide; e isolar as referidas células de outras células para formar uma população de células. 2. 0 método do item 1, em que o referido substrato compreende fibronectina. 3. 0 método do item 1, em que a referida identificação é conseguida utilizando um anticorpo. 4. 0 método do item 1, em que a referida identificação é conseguida utilizando citometria de fluxo. 5. 0 método do item 1, em que o referido isolamento é conseguido utilizando esférulas magnéticas. 6. 0 método do item 1, em que o referido isolamento é conseguido por separação de células ativadas por fluorescência. 7. 0 método do item 1, em que a referida população de células é expandida após o referido isolamento. 8. Um método de produção de uma linha de células estaminais, que compreende transformar uma célula estaminal com uma sequência de ADN que codifica uma proteína promotora do crescimento; e expor a referida célula estaminal a condições que promovem a produção da referida proteína promotora do crescimento. 9. 0 método do item 8, em que a referida proteína promotora do crescimento é v-myc, N-myc, c-myc, p53, antigénio T grande de SV40, antigénio T grande de polioma, proteína E7 do papilomavírus humano ou adenovírus Ela. 10. O método do item 8, em que a referida sequência de ADN é regulável. 11. O método do item 8, em que a referida sequência de ADN é regulável por tetraciclina. 12. O método do item 8, em que a referida proteína promotora do crescimento tem uma atividade regulável. 13. O método do item 8, em que a referida proteína promotora do crescimento é uma mutante sensível à temperatura. 14. Um método de produção de uma população de células estaminais, que compreende identificar células estaminais placentárias aderentes que expressam um ou mais genes, em que os referidos genes são ACTG2, ADARBl, AMIG02, ATRS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, ILlA, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAKl, PCDH7, PDLIM33, PJP2, RTNl, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, e ZC3H12A, a um nível mais alto de forma detetável que uma célula estaminal mesenquimatosa derivada de medula óssea que sofreu o mesmo número de passagens em cultura que a referida célula estaminal placentária, e isolar as referidas células placentárias. 15. 0 método do item 14, em que a referida célula aderente placentária expressa cinco ou mais dos referidos genes a um nível mais alto de forma detetável que uma célula estaminal mesenquimatosa derivada de medula óssea que sofreu o mesmo número de passagens em cultura que a referida célula estaminal placentária. 16. 0 método do item 14, em que a referida célula aderente placentária expressa dez ou mais dos referidos genes a um nível mais alto de forma detetável que uma célula estaminal mesenquimatosa derivada de medula óssea que sofreu o mesmo número de passagens em cultura que a referida célula estaminal placentária. 17. 0 método do item 14, em que a referida célula aderente placentária expressa vinte ou mais dos referidos genes a um nível mais alto de forma detetável que uma célula estaminal mesenquimatosa derivada de medula óssea que sofreu o mesmo número de passagens em cultura que a referida célula estaminal placentária. 18. 0 método do item 14, em que a referida célula aderente placentária expressa cada um dos referidos genes a um nível mais alto de forma detetável que uma célula estaminal mesenquimatosa derivada de medula óssea que sofreu o mesmo número de passagens em cultura que a referida célula estaminal placentária. 19. Um método de preparação de um banco de células estaminais placentárias, que compreende: expandir células estaminais placentárias de cultura primária a partir de uma placenta humana pós-parto durante uma primeira multiplicidade de duplicações da população; crioconservar as referidas células estaminais placentárias para formar um Banco de Células Primárias; expandir uma multiplicidade de células estaminais placentárias do Banco de Células Primárias durante uma segunda multiplicidade de duplicações da população; crioconservar as referidas células estaminais placentárias para formar um Banco de Células de Trabalho; expandir uma multiplicidade de células estaminais placentárias do Banco de Células de Trabalho durante uma terceira multiplicidade de duplicações da população; e crioconservar as referidas células estaminais placentárias em doses individuais, em que as referidas doses individuais constituem coletivamente um banco de células estaminais placentárias. 20. O método do item 19, em que o número total de duplicações da população é de cerca de 20. 21. O método do item 19, em que a referida primeira multiplicidade de duplicações da população é de cerca de quatro duplicações da população; a referida segunda multiplicidade de duplicações da população é de cerca de oito duplicações da população; e a referida terceira multiplicidade de duplicações da população é de cerca de oito duplicações da população. 22. O método do item 19, em que as referidas células estaminais placentárias de cultura primária compreendem células estaminais placentárias de perfusato placentário. 23. O método do item 19, em que as referidas células estaminais placentárias de cultura primária compreendem células estaminais placentárias de tecido placentário digerido. 24. O método do item 19, em que as referidas células estaminais placentárias de cultura primária compreendem células estaminais placentárias de perfusato placentário e de tecido placentário digerido. 25. O método do item 19, em que todas as referidas células estaminais placentárias na referida cultura primária de células estaminais placentárias são da mesma placenta. 26. 0 método do item 19, que compreende ainda o passo de seleção de células estaminais placentárias CD200+ ou HLA-G+ da referida multiplicidade das referidas células estaminais placentárias do referido Banco de Células de Trabalho para formar doses individuais. 27. 0 método do item 19, em que as referidas doses individuais compreendem desde cerca de 104 a cerca de 105 células estaminais placentárias. 28. 0 método do item 19, em que as referidas doses individuais compreendem desde cerca de 105 a cerca de 106 células estaminais placentárias. 29. 0 método do item 19, em que as referidas doses individuais compreendem desde cerca de 106 a cerca de 107 células estaminais placentárias. 30. O método do item 19, em que as referidas doses individuais compreendem desde cerca de 107 a cerca de 108 células estaminais placentárias. 31. Uma composição que compreende meio condicionado, em que o referido é condicionado por células estaminais placentárias que são: CD200+ e HLA-G+; CD73+, CD105+. e CD200 + ; CD200+ e 0CT-4+; CD73+, CD105+ e HLA-G+; CD73+ e CD105+ e facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a referida célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de um corpo de tipo embrioide; ou 0CT-4+ e facilita a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide. 32. A composição do item 31, em que as referidas células estaminais placentárias foram cultivadas no referido meio durante pelo menos um dia. 33. A composição do item 31, em que as referidas células estaminais placentárias foram cultivadas no referido meio durante pelo menos três dias. 34. Uma composição que compreende uma população de células estaminais placentárias que são: CD20 0+ e HLA-G+; CD73+, CD105+, e CD200 + ; CD200+ e 0CT-4 + ; CD73 + , CD105+ e HLA-G+; CD73+ e CD105+ e facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a referida população de células estaminais placentárias quando a referida população de células placentárias é cultivada sob condições que permitem a formação de um corpo de tipo embrioide; ou 0CT-4+ e facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a referida população de células estaminais placentárias quando a referida população de células placentárias é cultivada sob condições que permitem a formação de um corpo de tipo embrioide; ou uma combinação dos anteriores; e uma célula estaminal que não é obtida a partir de uma placenta, em que pelo menos 70% das referidas células estaminais placentárias são de origem não materna. 35. A composição do item 34, em que a referida célula estaminal que não é obtida a partir de uma placenta é uma célula estaminal embrionária. 36. A composição do item 34, em que a referida célula estaminal que não é obtida a partir de uma placenta é uma célula estaminal mesenquimatosa. 37. A composição do item 34, em que a referida célula estaminal que não é obtida a partir de uma placenta é uma célula estaminal derivada de medula óssea. 38. A composição do item 34, em que a referida célula estaminal que não é obtida a partir de uma placenta é uma célula progenitora hematopoiética. 39. A composição do item 34, em que a referida célula estaminal que não é obtida a partir de uma placenta é uma célula estaminal somática. 40. A composição do item 39, em que a referida célula estaminal somática é uma célula estaminal nervosa, uma célula estaminal hepática, uma célula estaminal pancreática, uma célula estaminal endotelial, uma célula estaminal cardíaca ou uma célula estaminal muscular. 41. Um método de isolamento de uma população de células estaminais placentárias, que compreende cultivar uma porção de uma placenta durante um tempo suficiente para que uma multiplicidade de células estaminais placentárias prolifere a partir do referido tecido, e isolar as referidas células estaminais placentárias do referido tecido. 42. O método do item 41, em que o referido tecido é membrana amniótica, cório, uma combinação de âmnio e cório, ou uma porção de qualquer um destes, ou uma combinação de qualquer um dos anteriores. 43. Uma célula estaminal placentária aderente isolada, em que a referida célula estaminal é: CD200+ e HLA-G+; CD73 + , CD105+, e CD200 + ; CD200+ e 0CT-4+; CD73 + , CD105+ e HLA-G+; CD73+ e CD 105+ e facilita a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a referida célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de um corpo de tipo embrioide; ou 0CT-4+ e facilita a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide, ou uma combinação das mesmas; e em que a referida célula estaminal placentária é de origem não materna. 44. Uma população de células estaminais placentárias aderentes isoladas, em que as referidas células estaminais são: CD200+ e MLA-G+; CD73 + , CD105+, e CD200 + ; CD200+ e 0CT-4 + ; CD73 + , CD105+ e HLA-G+; CD73 + e CD105+ e facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a referida célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de um corpo de tipo embrioide; ou 0CT-4+ e facilitam a formação de um ou mais corpos de tipo embrioide numa população de células placentárias que compreende a célula estaminal quando a referida população é cultivada sob condições que permitem a formação de corpos de tipo embrioide; e em que pelo menos 70% das referidas células estaminais placentárias são de origem não materna. 45. A população do item 44, em que pelo menos 90% das referidas células estaminais placentárias são de origem não materna. 46. A população do item 44, em que pelo menos 99% das referidas células estaminais placentárias são de origem não materna. 47. Uma composição que compreende a célula estaminal placentária isolada do item 43. 48. Uma composição que compreende a população isolada de células estaminais placentárias da reivindicação 44 . 49. A composição do item 47 que está numa forma adequada para administração intravenosa. 50. A composição do item 48 que está numa forma adequada para administração intravenosa. 51. A composição do item 47 em que a referida composição está num recipiente adequado para administração intravenosa da referida composição. 52. A composição do item 48 em que a referida composição está num recipiente adequado para administração intravenosa da referida composição. 53. Um método de colheita de células estaminais placentárias, que compreende: perfundir uma placenta de mamífero que foi drenada de sangue do cordão e perfundida para remover sangue residual; perfundir a referida placenta com uma solução de perfusão através da vasculatura placentária; recolher a referida solução de perfusão apenas a partir da referida vasculatura, em que a referida solução de perfusão após perfusão compreende uma população de células que compreende células estaminais placentárias, em que pelo menos 95% das referidas células estaminais placentárias são de origem fetal; e isolar uma multiplicidade das referidas células estaminais placentárias a partir da referida população de células. 54. 0 método do item 53, em que a solução de perfusão é feita passar através da veia umbilical e recolhida das artérias umbilicais. 55. 0 método do item 53, em que a solução de perfusão é feita passar através das artérias umbilicais e recolhida da veia umbilical. 56. Uma população isolada de células estaminais placentárias aderentes recolhidas pelo método do item 53, em que pelo menos 95% da referida população isolada de células estaminais placentárias é de origem fetal. 57. A população isolada do item 51, em que mais de 99% das referidas células estaminais placentárias são de origem fetal. 58. A população isolada do item 51, em que as células estaminais placentárias são pelo menos 50% da referida população de células placentárias. 59. A população isolada do item 51, em que as células estaminais placentárias são pelo menos 95% da referida população de células placentárias.
Lisboa, 14 de maio de 2018

Claims (16)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. População de células estaminais corioamnióticas aderentes isoladas, em que as referidas células estaminais corioamnióticas expressam o gene TCF21 a um nivel pelo menos duas vezes superior a um número equivalente de células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea (BM-MSCs) que foram cultivadas sob condições equivalentes e sofreram o mesmo número de passagens em cultura que as referidas células estaminais corioamnióticas, e em que as referidas células estaminais corioamnióticas são: CD200 + , CD10 + , CD105+, e CD34-; ou CD200 + , CD10 + , CD105+, CD34“, CD90+ e CD45“.
  2. 2. População de células da reivindicação 1, em que pelo menos 90% ou pelo menos 99% das referidas células estaminais corioamnióticas são de origem não materna.
  3. 3. População de células das reivindicações 1-2, em que as referidas células estaminais corioamnióticas estão numa forma adequada para administração intravenosa.
  4. 4. População de células das reivindicações 1-3, em que as referidas células estaminais corioamnióticas têm a capacidade para diferenciar-se em células com caracteristicas de células neuronais, células adipogénicas, células pancreáticas ou células cardíacas.
  5. 5. População de células das reivindicações 1-4, em que as referidas células estaminais corioamnióticas expressam o referido gene a um nível mais alto de forma detetável que um número equivalente de BM-MSCs ao longo de 3, ao longo de 11-14, ou ao longo de 24-38 duplicações da população.
  6. 6. População de células das reivindicações 1-5, em que a referida população compreende pelo menos 1 x 108 ou pelo menos 1 x 109 células.
  7. 7. População de células das reivindicações 1-6, em que a referida população sofreu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 ou 40, ou mais, duplicações da população.
  8. 8. População de células das reivindicações 1-7, em que as referidas células estaminais corioamnióticas têm a capacidade para se replicar 10 a 40 vezes em cultura.
  9. 9. População de células das reivindicações 1-8, em que as referidas células estaminais corioamnióticas foram passadas 5 a 10 vezes.
  10. 10. População de células das reivindicações 1-9, em que as referidas células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma característica de células condrogénicas quando cultivadas em DMEM que compreende 15% de soro de sangue do cordão e 0,01 yg/mL de fator de crescimento transformante beta-3 (TGFp3) ; e em que a referida caracteristica de células condrogénicas é a revelação positiva com corante Azul de Alciano.
  11. 11. População de células das reivindicações Ι-ΙΟ, em que as referidas células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma caracteristica de células osteogénicas quando cultivadas em DMEM que compreende 15% de soro de sangue do cordão, dexametasona 0,1 μΜ, ácido ascórbico-2-fosfato 0,05 mM, e beta-glicerofosfato 10 mM; e em que a referida caracteristica de células osteogénicas é demonstrada pela revelação com corante de von Kossa ou pela produção de ARNm para fosfatase alcalina como determinada por RT-PCR.
  12. 12. População de células das reivindicações Ι-ΙΟ, em que as referidas células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma caracteristica de células adipogénicas quando cultivadas em: DMEM ou MCDB-201 que compreende 2% de soro fetal de vitelo, 0,5% de hidrocortisona, isobutilmetilxantina (IBMX) 0,5 mM e indometacina 60 μΜ; ou DMEM ou MCDB-201 que compreende 2% de soro fetal de vitelo e 0,5% de ácido linoleico; e em que a referida caracteristica de células adipogénicas é demonstrada pela revelação com óleo de revelação lipófilo vermelho O ou pela expressão de lipase ou proteína de ligação de ácidos gordos como determinada por RT-PCR.
  13. 13. População de células das reivindicações Ι-ΙΟ, em que as referidas células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma caracteristica de células cardíacas quando cultivadas em: DMEM que compreende 2 0% de soro de sangue do cordão, ácido retinoico 1 μΜ, 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básico, 2 ng/mL de fator de crescimento transformante beta-1 e 100 ng/mL de fator de crescimento epidérmico; ou DMEM que compreende 2 0% de soro de sangue do cordão e 50 ng/mL de Cardiotrofina-1; e em que a referida caracteristica de células cardíacas é demonstrada pela expressão de actina cardíaca como determinada por TA-PCT.
  14. 14. População de células das reivindicações Ι-ΙΟ, em que as referidas células estaminais corioamnióticas diferenciam-se em células com uma caracteristica de células pancreáticas quando cultivadas em DMEM que compreende 20% de soro de sangue do cordão, 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básico e 2 ng/mL de fator de crescimento transformante beta-1; e em que a referida característica de células pancreáticas é demonstrada pela produção de insulina como determinada pelo ensaio de insulina ou RT-PCR.
  15. 15. População de células das reivindicações 1-14, em que as referidas células estaminais corioamnióticas expressam os referidos genes pelo menos a um nível três vezes mais alto que um número equivalente de BM-MSCs.
  16. 16. Método de produção de uma população de células estaminais corioamnióticas da reivindicação 1, que compreende identificar células estaminais corioamnióticas aderentes que expressam o gene TCF21 a um nível pelo menos duas vezes superior a um número equivalente de células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea que foram cultivadas sob condições equivalentes e sofreram o mesmo número de passagens em cultura que as referidas células estaminais corioamnióticas, e isolar as referidas células estaminais corioamnióticas, em que as referidas células estaminais corioamnióticas são CD200+, CD10+, CD105+ e CD34-; ou CD200 + , CD10+, CD105+, CD34~, CD90+ e CD45-. Lisboa, 14 de maio de 2018
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