PT1835924E

PT1835924E - Tratamento da doença de parkinson e desordens relacionadas usando células derivadas do pós-parto

Info

Publication number: PT1835924E
Application number: PT58553801T
Authority: PT
Inventors: Sanjay Mistry; Darin J Messina; Klaudyne L S Hong; Brian C Kramer; Michael J Romanko
Original assignee: Ethicon Inc
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2013-11-19
Also published as: JP2014000094A; AU2005322068B2; JP2008525489A; CA2589063A1; WO2006071802A3; PL1835924T3; JP2014028836A; AU2005322133A1; EP1833496B1; DK1835924T3; WO2006071778A2; AU2005322068A1; JP5425399B2; CA2589063C; US20060233766A1; WO2006071778A3; US7875273B2; AU2005322133B2; WO2006071802A2; CA2592435C

Description

DESCRIÇÃO

TRATAMENTO DA DOENÇA DE PARKINSON E DESORDENS RELACIONADAS USANDO CÉLULAS DERIVADAS DO PÓS-PARTO

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se ao campo da terapia de base celular ou regenerativa para os pacientes que têm uma condição neurodegenerativa da substantia nigra ou estriado. Em particular, a invenção proporciona composições farmacêuticas e métodos para a utilização de células derivadas do tecido do pós-parto para regenerar, reparar e aumentar o tecido neural e para melhorar o comportamento e a função neurológica em pacientes que têm uma condição neurodegenerativa da substantia nigra ou estriado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As doenças neurológicas degenerativas e outras desordens do sistema nervoso central e periférico estão entre as mais debilitantes que podem ser sofridas por um individuo, não só devido aos seus efeitos fisicos, mas também por causa da sua permanência. No passado, um paciente sofrendo de uma condição neurodegenerativa do sistema nervoso central ou periférico, tais como a doença de Parkinson, doença de Alzheimer ou esclerose múltipla, para citar algumas, tinham pouca esperança de recuperação ou cura. A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa comum com nenhuma cura conhecida. 0 processo degenerativo da DP provoca uma perda preferencial dos neurónios de dopamina dentro da substantia nigra pars compacta (SNc). Na verdade, a substantia nigra é o principal local da patologia da doença de Parkinson. Os neurónios pigmentados do projeto da substantia nigra ampliam difudem para o 1 caudateputamen (corpo estriado) e são especializados para a síntese e libertação de dopamina. Os sintomas de parkinsonismo surgem quando 75-80% da inervação dopaminérgica é destruída, levando à disfunção motora que se apresenta como lentidão de movimentos, rigidez, tremor em repouso e instabilidade postural (Dawson TM et al. (2002) Nat. Neurosci. 5 Suppl:1058-1061).

Assim, ao nível celular, a DP é caracterizada por uma perda severa de neurónios de dopamina (DA) na substantia nigra, uma estrutura chave na regulação do circuito de gânglios da base complexa envolvida na produção do comportamento motor. Nos seres humanos, devido à degeneração combinado do SNC e do estriado, a terapia anti-parkinsoniano baseado na substituição de levadopa eventualmente falha em mais de 90% dos pacientes (Wenning et al. (1999) J. Nueral. Transm. Suppl. 55:103-113). Estratégias atuais de tratamento são baseadas em terapia de manutenção, uma vez que não há cura disponível para reverter o déficit neurodegenerativo observado em pacientes de Parkinson. A terapia de reposição de dopamina revelou algum sucesso em pacientes de Parkinson. Infelizmente, a eficácia da terapia de substituição de dopamina diminui progressivamente com a degeneração continuada da via dopaminérgica nigrostriatal.

Durante muito tempo pensou-se serem irreversíveis os dDanos neurológicos e as doenças neurodegenerativas, devido à incapacidade dos neurónios e outras células do sistema nervoso para se desenvolverem no corpo adulto. No entanto, a recente advento da terapia baseada em células estaminais para a reparação e regeneração do tecido proporciona tratamentos promissores para uma série de patologias neurodegenerativas e outras desordens neurológicas. As 2 células estaminais são capazes de autorrenovação e diferenciação para gerar uma variedade de linhagens de células neurais maduras. 0 transplante de tais células pode ser utilizado como uma ferramenta clinica para reconstituir um tecido alvo, restaurando assim a funcionalidade fisiológica e anatómica. A aplicação da tecnologia de células estaminais é ampla, incluindo a manipulação de tecidos, a entrega de terapia genética e terapêutica celular, ou seja, a entrega de agentes bioterapêuticos para um local alvo através do fornecimento exogenamente de células vivas ou componentes celulares que produzem ou contêm esses agentes (para uma revisão, ver Tresco, P.A. et al., (2000) Advanced Drug Delivery Reviwes 42:2-37). A identificação de células estaminais tem estimulado as pesquisas visando a geração seletiva de tipos específicos de células para a medicina regenerativa. O transplante de células para substituir neurónios perdidos é uma nova abordagem para o tratamento das doenças neurodegenerativas progressivas, como DP. Um obstáculo à realização do potencial terapêutico da tecnologia de células estaminais tem sido a dificuldade de obtenção de um número suficiente de células estaminais. 0 tecido embrionário ou fetal, é uma fonte de células estaminais. As células estaminais embrionárias e progenitoras têm sido isoladas a partir de um número de espécies de mamíferos, incluindo seres humanos, e vários destes tipos de células têm se mostrado capazes de autorrenovação e de expansão, bem como diferenciação em todas as linhagens de células neurológicas (Svendsen, C.V. et al. (1997) Exp. Neurol. 148:135-146; Freed, C.R. et al. (2001) New Engl J. Med. 344 (10) :—719; Burnstein, R.M. et al. (2003) Int. J. Biochem. Cell Biol. 36:702-713; Zhang, SC. et al. (2001) Nat. 3

Biotechnol. 19:1129-1133; Reubinoff, B.E. et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:1134-1140; Bjõrklund, L.M. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99(4):2344-2349). Mas a derivação de células estaminais de origem embrionária ou fetal tem levantado muitas questões éticas e morais que são desejáveis evitar identificando outras fontes de células multipotentes ou pluripotentes.

As células estaminais com potência neural também foram isoladas a partir de tecidos adultos. As células estaminais neurais existem no desenvolvimento do cérebro e no sistema nervoso adulto. Estas células podem sofrer expansão e podem diferenciar-se em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. No entanto, as células estaminais neurais adultas são raras, bem como podem somente ser obtidas através de procedimentos invasivos, e podem ter uma capacidade mais limitada de expansão em cultura do que as células estaminais embrionárias.

Outros tecidos adultos também podem produzir células progenitoras úteis para a terapia neural baseada em célula. Por exemplo, tem sido relatado recentemente que as células estaminais adultas provenientes da medula óssea e da pele podem ser expandidas em cultura e dar origem a várias linhagens, incluindo algumas linhagens neurais (Azizi, S.A. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:3908-3913; Li, Y. et al. (2001) Neurosci. Lett. 315:67-70). O enxerto intraestrial e intranigral de outros tipos de células, tais como os neurónios derivados de teratocarcinoma humano e as células mononucleares do sangue do cordão umbilical também foram testados em modelos animais da doença de Parkinson (Baker, K.A. et al. (2000) Exp. Neurol. 162:350-360; Ende, N. e R. Chen (2002) J. Med. Chem. 33 (1-4):173-180). 4

Os tecidos pós-parto, tal como o do cordão umbilical e da placenta, têm gerado interesse como uma fonte alternativa de células estaminais. Por exemplo, têm sido descritos métodos de recuperação de células estaminais por perfusão da placenta ou a recolha de sangue do cordão umbilical ou de tecido. Uma limitação de obtenção de células estaminais a partir destes métodos tem resultado num volume inadequado de sangue do cordão umbilical ou da quantidade de células obtidos, bem como a heterogeneidade em, ou ausência de caracterização, das populações de células obtidas a partir dessas fontes.

Embora tenham sido desenvolvidos protocolos para a diferenciação direta de células estaminais em tipos de células terapeuticamente relevantes, tais como os neurónios dopaminérgicos (DA) para o tratamento da doença de Parkinson (Isacson, 0. et al. (1996) Neurosci. 75:827-837; Kim, J.H. et al. (2002) Nature 418:50-56, Barbieri, T. et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21(10):1200-1207), a produção eficiente de um número substancial de neurónios DA não foi ainda relatada. A capacidade de gerar um número ilimitado de neurónios DA que expressam o conjunto completo de marcadores de neurónios DA do mesencéfalo constitui um contributo importante para uma cura para a doença de

Parkinson.

Assim, fontes alternativas de fornecimento adequado de células que possuem a capacidade de se diferenciar numa variedade de linhagens de células neurais permanecem em grande demanda. Além disso, não existe nenhum método satisfatório para a reparação de danos causados por neuropatias tais como a doença de Parkinson (parkinsonismo). Um fornecimento confiável, bem 5 caracterizado e abundante de populações substancialmente homogéneas de tais células com a capacidade de se diferenciar numa variedade de linhagens neurais seria uma vantagem numa variedade de aplicações de diagnóstico e terapêutica para a reparação neural, regeneração e melhoria, assim como aplicações em de melhorias no comportamento e na função neurológica, particularmente em pacientes com DP. A Patente US 2004/136967 refere-se a culturas, produtos e métodos que utilizam células estaminais. Medicetty et al. (2003) refere-se à redução das rotações induzidas por apomorfina em ratos parkinsonianos por transplante de células estaminais do cordão umbilical de matriz. A WO 03/089619 refere-se às células estaminais derivadas da placenta e suas utilizações. A WO 03/102151 refere-se a métodos de utilização de inibidores JNK ou MKK para modular a diferenciação celular e para o tratamento de doenças mieloproliferativas e sindromes mielodisplásicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona métodos aplicáveis às terapias à base de células ou regenerativas para doenças neurodegenerativas da substantia nigra ou estriado. Em particular, a invenção apresenta métodos para a regeneração e/ou reparação de tecido neural utilizando células derivadas do pós-parto.

Um aspecto da invenção caracteriza as células do pós-parto derivados obtidos por digestão enzimática da placenta humana ou do tecido do cordão umbilical substancialmente livre de sangue com colagenase, descarte e hialuronidase, 6 em que as células são capazes de autorrenovação e de expansão em cultura e têm o potencial de se diferenciar em células de pelo menos um fenótipo neuronal, em que as células necessitam de L-valina para o crescimento e podem crescer em pelo menos cerca de 5% de oxigénio, em que as células compreendem ainda as seguintes caracteristicas: a) a produção de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 e HLA-A,B,C; b) falta de produção de CD31, CD34, CD45, CD8 0, CD8 6, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G e HLA-DR, DP, DQ, tal como detectado por citometria de fluxo, para utilização no tratamento de um doente possuindo uma condição neurodegenerativa da substantia nigra ou do estriado, em que a condição é parkinsonismo, parkinsonismo pós-encefalitico, tremor essencial ou pseudo-parkinsonismo vascular.

Em certas formas de realização detalhadas, as células derivadas pós-parto são geneticamente modificadas para produzir um produto genético que promove o tratamento da doença neurodegenerativa, e as células podem ser induzidas in vitro, para se diferenciarem numa linhagem neural, antes da administração ao paciente. Em algumas concretizações preferidas, as células são administradas com pelo menos um outro tipo de célula, tal como um dos astrócitos, oligodendrócitos, neurónios, células progenitoras neurais, células estaminais neuronais, ou outras células estaminais multipotentes ou pluripotentes, e/ou um outro agente em simultâneo com, antes, ou depois da administração das células derivadas do pós-parto. De preferência, as células são administradas num local pré-determinado no sistema nervoso central ou periférico do paciente, e podem ser administradas através de injeção ou infusão, por implantação de uma matriz ou estrutura que contém as 7 células, ou por implantação de um dispositivo em que as células são encapsuladas. Em concretizações altamente preferidas, as células derivadas do pós-parto exercem um efeito trófico no sistema nervoso do paciente. A invenção também apresenta composições farmacêuticas para utilização no tratamento de um doente possuindo uma condição neurodegenerativa da substantia nigra ou estriado, compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável, e células derivadas de pós-parto, tal como definido nas reivindicações, em que a condição é parkinsonismo, parkinsonismo pós-encefalitico, tremor essencial ou pseudo-parkinsonismo vascular. Em certas formas de realização detalhadas, as células derivadas do pós-parto na composição farmacêutica podem ser geneticamente modificadas para produzir um produto genético que promove o tratamento da doença neurodegenerativa, e as células podem ser induzidas in vitro, para se diferenciarem numa linhagem neural, antes da administração ao paciente. Em algumas formas de realização preferidas, as composições farmacêuticas compreendem pelo menos um outro tipo de célula, tal como astrócitos, oligodendrócitos, neurónios, células progenitoras neurais, células estaminais neuronais, ou outras células estaminais multipotentes ou pluripotentes, e/ou um outro agente. De preferência, as composições farmacêuticas são formuladas para administração por injeção ou infusão. Em algumas concretizações preferidas, as células da composição farmacêutica são encapsuladas dentro de um dispositivo implantável, ou estão contidas dentro de uma matriz ou armação. Em concretizações altamente preferidas, as células derivadas do pós-parto da composição farmacêutica exercem um efeito trófico no sistema nervoso do paciente. 8

Outro aspecto da invenção apresenta uma preparação feita a partir das células derivadas do pós-parto possuindo as caracteristicas acima descritas, numa quantidade eficaz para tratar a doença neurodegenerativa, em que a preparação compreende um lisado de células das células derivadas do pós-parto, uma matriz extracelular das células derivadas do pós-parto, ou um meio condicionado, em que as células derivadas do pós-parto foram cultivadas para utilização no tratamento de um doente possuindo uma condição neurodegenerativa da substantia nigra ou estriado, em que a condição é parkinsonismo, parkinsonismo pós-encefalitico, tremor essencial ou pseudo-parkinsonismo vascular.

Outro aspecto da invenção caracteriza uma composição farmacêutica para utilização no tratamento de um doente possuindo uma condição neurodegenerativa da substantia nigra ou estriado, que compreende um veiculo farmaceuticamente aceitável e uma preparação feita a partir de células derivadas do pós-parto com as caracteristicas descritas acima em que a preparação compreende um lisado de células das células derivadas do pós-parto, uma matriz extracelular das células derivadas do pós-parto, ou um meio condicionado, em que as células derivadas do pós-parto foram cultivadas, em que a condição é parkinsonismo, parkinsonismo pós-encefalitico, tremor essencial ou pseudo-parkinsonismo vascular.

Igualmente caracterizado em conformidade com a presente invenção é uma preparação celular compreendendo células derivadas do pós-parto isoladas tal como definido nas reivindicações para o uso no tratamento de parkinsonismo, parkinsonismo pós-encefalitico, tremor essencial ou pseudo-parkinsonismo vascular num paciente. 9

Em concretizações preferidas, as células derivadas do pós-parto são geneticamente modificadas para produzir um produto genético que promove o tratamento do parkinsonismo, e as células podem ser induzidas in vitro, para se diferenciarem numa linhagem neural, antes da administração ao paciente. Em algumas concretizações preferidas, a preparação de células compreende ainda pelo menos um outro tipo de célula, tal como, astrócitos, oligodendrócitos, neurónios, células progenitoras neurais, células estaminais neuronais, ou outras células estaminais multipotentes ou pluripotentes, e/ou um outro agente. Em algumas concretizações preferidas, a preparação de células compreende um lisado celular não fraccionado. Em outras concretizações preferidas, a preparação de células compreende um lisado celular livre de membrana. De preferência, as preparações de células são formuladas para administração através de injeção ou infusão. Em algumas concretizações preferidas, as células são encapsuladas dentro de um dispositivo implantável. Em outras concretizações preferidas, a preparação celular é contida dentro de uma matriz ou armação. Em concretizações altamente preferidas, a preparação de células exerce um efeito trófico sobre o sistema nervoso do paciente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra o controlo do peso do animal durante a duração do estudo. A Figura 2 mostra a resposta dos diferentes grupos de células ao desafio amorfínico. A Figura 3 mostra o controlo da diferença entre o número de voltas da cabeça da esquerda e da direita ao longo da duração do estudo. 10 A Figura 4 mostra o controlo do consumo de alimentos pelos animais, ao longo de todo o periodo de duração do estudo, utilizando um desafio em escada. A Figura 5 mostra gráficos de barras que ilustram a avaliação qualitativa de (a) Iba-1; (b), ED-1; e (C) coloração DAPI realizada no enxerto de células de acordo com os seguintes critérios: 0 = Nenhum (ausência de células), 1 = coloração visivel; 2 = coloração abundante, 3 = coloração muito abundante; 4 = Densa. A Figura 6 mostra os gráficos de barras que ilustram a avaliação qualitativa de (a) e GFAP (b) coloração Vimentina realizada no enxerto de células de acordo com os seguintes critérios: 0 = Nenhum (ausência de células), 1 = coloração visivel, 2 = coloração abundante; 3 = coloração muito abundante; 4 = Densa.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE FORMAS DE REALIZAÇÃO ILUSTRATIVAS

Definições Vários termos relacionados com os métodos e outros aspectos da presente invenção são utilizados ao longo da especificação e reivindicações. Tais termos são para ser entendidos no seu significado normal na técnica, a menos que indicado de outra forma. Outros termos definidos especificamente, devem ser interpretadosa de uma maneira consistente com a definição aqui proporcionada.

As células estaminais são células indiferenciadas definidas pela capacidade de uma única célula tanto de se autorrenovar e de se diferenciar para produzir células descendentes, incluindo a autorrenovação de células progenitoras, células progenitores não-renovadoras e terminalmente diferenciadas. As células estaminais são 11 também caracterizadas pela sua capacidade de se diferenciarem in vitro em células funcionais de várias linhagens de células a partir de várias camadas germinativas (endoderme, mesoderme e ectoderme), bem como para dar origem a tecidos de várias camadas germinais após o transplante, e para contribuir substancialmente para a maioria, se não todos, os tecidos a seguir à injeção em blastocistos.

As células estaminais são classificadas de acordo com seu potencial de desenvolvimento como: (1) totipotentes; (2) pluripotentes; (3) multipotentes; (4) oligopotentes; e (5) unipotentes. Células totipotentes são capazes de dar origem a todos os tipos de células embrionárias e extraembrionárias. As células pluripotentes são capazes de dar origem a todos os tipos de células embrionárias. As células multipotentes incluem aquelas capazes de dar origem a um subconjunto de linhagens celulares, mas tudo dentro de um determinado tecido, órgão, ou sistema fisiológico (por exemplo, células estaminais hematopoiéticas (HSC) podem produzir descendência que incluem HSC (autorrenovação), células oligopotentes restritas progenitoras do sangue, e todos os tipos de células e elementos (por exemplo, plaquetas), que são componentes normais do sangue). As células que são oligopotentes podem dar origem a um subconjunto mais restrito de linhagens celulares do que as células estaminais multipotentes; e as células que são unipotentes são capazes de dar origem a uma única linhagem de células (por exemplo, células estaminais da espermatogénese.).

As células estaminais também são classificadas com base na fonte a partir da qual elas podem ser obtidas. Uma célula 12 estaminal adulta é geralmente uma célula multipotente indiferenciada encontrada no tecido compreendendo vários tipos de células diferenciadas. A célula estaminal adulta pode renovar-se. Sob circunstâncias normais, pode também diferenciar para produzir os tipos de células especializadas de tecido a partir do qual se originou e, possivelmente outros tipos de tecidos. Uma célula estaminal embrionária é uma célula pluripotente a partir da massa celular interna do embrião em fase de blastocisto. Uma célula estaminal fetal é aquela que se origina a partir de tecidos ou membranas fetais. Uma célula estaminal do pós-parto é uma célula pluripotente ou multipotente que se origina a partir de tecido substancialmente extraembrionário disponível após o nascimento, ou seja, a placenta e o cordão umbilical. Estas células têm sido encontradas possuir características de células estaminais pluripotentes, incluindo a rápida proliferação e o potencial para diferenciação em muitas linhagens de células. As células estaminais do pós-parto podem ser derivadas de sangue (por exemplo, obtidas a partir de sangue do cordão umbilical) ou não derivadas de sangue (por exemplo, obtidas a partir de tecidos que não o sangue do cordão umbilical e da placenta).

Tecido embrionário é geralmente definido como o tecido proveniente do embrião (que, em seres humanos refere-se ao período de fertilização a cerca de seis semanas de desenvolvimento). Tecido fetal refere-se a tecidos de origem a partir do feto, o que nos seres humanos refere-se ao período de cerca de seis semanas de desenvolvimento até ao parto. Tecido extraembrionário é o tecido associado, mas não proveniente do embrião ou feto. Os tecidos extraembrionários incluem membranas extraembrionárias 13 (córion, âmnio, saco vitelino e alantóide), cordão umbilical e placenta (que se forma a partir do córion e decidua materna basal). A diferenciação é o processo pelo qual uma célula não-especializada ("não comprometida") ou menos especializada adquire as caracteristicas de uma célula especializada, tal como uma célula nervosa ou uma célula do músculo, por exemplo. A célula diferenciada é aquela que tem assumido uma posição mais especializada ("compromisso") dentro da linhagem de uma célula. 0 termo comprometida, quando aplicada no processo de diferenciação, refere-se a uma célula que tenha procedido da via de diferenciação a um ponto em que, sob circunstâncias normais, irá continuar a diferenciar-se num tipo especifico de célula ou um subconjunto de tipos de células, e não pode, sob circunstâncias normais, diferenciar-se em células de um tipo diferente ou reverter para um tipo de células menos diferenciadas. A desdiferenciação refere-se ao processo pelo qual uma célula reverte para uma posição menos especializada (ou comprometida) dentro de uma linhagem celular. Tal como aqui utilizado, a linhagem de células define a hereditariedade da célula, isto é, de que células veio e a que células que pode dar origem. A linhagem de células coloca a célula dentro de um sistema hereditário de desenvolvimento e diferenciação.

Em sentido lato, uma célula progenitora é uma célula que tem a capacidade de criar descendência que é mais diferenciada do que ela própria, e ainda mantém a capacidade de reconstituir o conjunto de células progenitoras. Por essa definição, as próprias células estaminais também são células progenitoras, na medida em 14 que são os precursores imediatos para mais células terminalmente diferenciadas. Ao referir-se as células da presente invenção, tal como descrito em maior detalhe abaixo, pode ser utilizada esta definição ampla de células progenitoras. Num sentido mais restrito, uma célula progenitora é geralmente definida como uma célula que é intermediária da via de diferenciação, ou seja, que surge a partir de uma célula estaminal e é intermediária na produção de um tipo de células maduras ou um subconjunto de tipos de células. Este tipo de célula progenitora, geralmente não é capaz de se autorrenovar. Assim, se este tipo de células é aqui referido, será referido como uma célula progenitora de não renovação ou como células progenitoras intermediárias ou precursoras.

As células da presente invenção são geralmente referidas como células do pós-parto ou células derivadas do pós-parto (PPDCs). Podem, também, às vezes ser referidas mais especificamente como células derivadas do cordão umbilical (UDCs) ou células derivadas da placenta (PDCs). Além disso, as células podem ser descritas como sendo as células estaminais ou progenitoras, sendo este último termo usado no sentido lato. 0 termo derivado é utilizado para indicar que as células foram obtidas a partir da sua fonte biológica e cultivadas ou de outra forma manipuladas in vitro (por exemplo, cultivadas num meio de crescimento para expandir a população e/ou para produzir uma linha de células). As manipulações in vitro de células estaminais do cordão umbilical e as caracteristicas únicas das células umbilicais derivadas da presente invenção são descritas em detalhe abaixo. 15 Vários termos são usados para descrever as células em cultura. Cultura celular refere-se genericamente às células retiradas de um organismo vivo, e cultivadas sob condições controladas ("na cultura" ou "cultura"). Uma cultura celular primária é uma cultura de células, tecidos ou órgãos feita diretamente a partir de um organismo antes da primeira subcultura. As células foram expandidas em cultura, quando são colocados num meio de crescimento, sob condições que facilitam o crescimento celular e/ou a divisão, o que resulta numa maior população de células. Quando as células são expandidas em cultura, a taxa de proliferação de células é, por vezes, medida pela quantidade de tempo necessário para que as células dobrem em número. Isto é referido como o tempo de duplicação.

Uma linha celular é uma população de células formada por uma ou mais subculturas de uma cultura de células primárias. Cada ronda de subcultura é referida como uma passagem. Quando as células são subcultivadas, são referidas como tendo sido passadas. Uma população especifica de células ou uma linha celular, é referida às vezes ou caracterizada por o número de vezes que foi passada. Por exemplo, uma população de células cultivadas que foi passada dez vezes pode ser referida como uma cultura PIO. A cultura primária, ou seja, a primeira cultura após o isolamento de células de tecido, é designada por PO. Após a primeira passagem, as células são descritas como uma cultura secundária (PI ou passagem 1). Depois da segunda subcultura, as células tornam-se uma cultura terciária (P2 ou passagem 2), e assim por diante. Será entendido pelos especialistas na técnica que pode haver muitas duplicações da população durante o período de passagem, portanto, o número de duplicações da população de 16 uma cultura é maior do que o número de passagens. A expansão de células (isto é, o número de duplicações da população), durante o período entre passagens depende de muitos factores, incluindo, mas não limitado a densidade da cultura, substrato, meio, condições de crescimento e o tempo entre passagens.

Um meio condicionado é um meio no qual uma célula ou uma população específica de células foi cultivada e, em seguida removida. Quando as células são cultivadas num meio, são capazes de segregar factores celulares que podem fornecer suporte trófico para as outras células. Tais factores tróficos incluem, mas não estão limitados a hormonas, citoquinas, matriz extracelular (ECM), proteínas, vesículas, anticorpos e grânulos. 0 meio que contém os factores celulares é o meio condicionado.

Meio de crescimento geralmente refere-se a um meio suficiente para a cultura de PPDCs. Em particular, um presentemente preferido para o meio de cultura das células da invenção compreende um meio modificado de Eagle por Dulbecco (também conhecido como meio mínimo essencial de Dulbecco) (DMEM). Particularmente preferido é o DMEM de baixa glicose (também aqui DMEM-LG) (Invitrogen, Carlsbad, CA) . 0 DMEM de baixa glicose é, de preferência, suplementado com 15% (v/v) de soro fetal bovino (por exemplo, soro fetal de bovino definido, Hyclone, Logan UT.) , antibióticos e antimicóticos (de preferência, 50-100 unidades/ml de penicilina, 50-100 microgramas/ml de estreptomicina, e 0-0,25 microgramas/ml de anfotericina B, Invitrogen, Carlsbad, CA) e 0,001% (v/v) de 2- mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO). 17 0 termo condições de crescimento padrão refere-se à cultura de células a 37°C, numa atmosfera humidificada padrão compreendendo 5% de CO2. Enquanto essas condições são úteis para a cultura, é para ser entendido que tais condições são capazes de ser variadas pelo perito na técnica que irá apreciar as opções disponíveis na técnica para a cultura de células.

Geralmente, um factor trófico é definido como uma substância que promove a sobrevivência, crescimento, diferenciação, proliferação e/ou a maturação de uma célula, ou estimula um aumento da atividade de uma célula.

Quando se refere a células de vertebrados em cultura, o termo senescência (também senescência replicativa ou senescência celular,) refere-se a uma propriedade atribuível às culturas celulares finitas, ou seja, a sua incapacidade para crescer além de um número finito de duplicações da população (por vezes referido como limite de HayflickJ. Embora a senescência celular tenha sido descrita pela primeira vez utilizando células do tipo fibroblasto, tipos de células humanas mais normais podem ser cultivadas com êxito em cultura submetida a senescência celular. 0 tempo de vida in vitro de diferentes tipos de células varia, mas o tempo de vida máximo é tipicamente menos de 100 duplicações da população (isto é, o número de duplicações para todas as células na cultura tornadas senescentes e, assim, tornar a cultura incapaz de se dividir). A senescência não depende do tempo cronológico, mas sim é medida pelo número de divisões celulares, ou duplicações da população, a que a cultura foi sujeita. Assim, as células tornadas quiescentes por remoção de factores de crescimento essenciais são capazes de retomar o crescimento e divisão 18 quando os factores de crescimento são reintroduzidos, e, posteriormente, executar o mesmo número de duplicações de células equivalentes cultivadas continuamente. Do mesmo modo, quando as células são congeladas em azoto liquido, após vários números de duplicações da população e, em seguida descongeladas e cultivadas, passam substancialmente pelo mesmo número de duplicações de células mantidas em cultura descongelada. As células senescentes não estão mortas ou a morrer; são, na verdade, resistentes à morte celular programada (apoptose), e têm sido mantidas no seu estado não dividido durante até três anos. Estas células estão muito vivas e metabolicamente ativas, mas não se dividem. 0 estado de não divisão das células senescentes ainda não foi encontrado ser reversível por qualquer agente biológico, químico ou virai. 0 termo condição neurodegenerativa (ou desordem) é um termo abrangente que engloba condições, desordens ou doenças do sistema nervoso central ou periférico agudas e crónicas. Uma condição neurodegenerativa pode ser relacionada com a idade, ou pode resultar de uma lesão ou trauma, ou pode estar relacionada com uma doença ou distúrbio específico. Doenças neurodegenerativas agudas incluem, mas não estão limitadas a, doenças associadas com a morte celular neuronal ou comprometimento, incluindo insuficiência vascular cerebral, trauma cerebral focal ou difuso, lesão cerebral difusa, lesão da medula espinal ou traumatismo de nervo periférico, por exemplo, resultante de queimaduras físicas ou químicas, cortes profundos ou amputação do membro. Exemplos de doenças neurodegenerativas agudas são: isquemia ou enfarte cerebral, incluindo oclusão embólica e oclusão trombótica, reperfusão após isquemia aguda, lesão hipóxico-isquémica perinatal, paragem cardíaca, bem como 19 hemorragia intracraniana de qualquer tipo (como epidural, subdural, subaracnóide e intracerebral), e lesões intracranianas e intravertebrais (tais como contusão, penetração, corte, compressão e laceração) , bem como síndroma do lactente e criança sacudida. Doenças neurodegenerativas crónicas incluem, mas não estão limitadas a, doença de Alzheimer, doença de Pick, doença do corpo de Lewy difusa, paralisia supranuclear progressiva (síndroma Steel-Richardson), degeneração multissistémica (síndroma de Shy-Drager), condições epilépticas crónicas associadas à neurodegeneraçao, doenças dos neurónios motores, incluindo a esclerose lateral amiotrófica, ataxias degenerativas, degeneração cortical basal, complexo de Demência-ALS-Parkinson de Guam, panencefalite esclerosante subaguda, doença de Huntington, doença de Parkinson, sinucleinopatias (incluindo atrofia de sistemas múltiplos), afasia progressiva primária, degeneração estriatonigral, doença de Machado-Joseph/ataxia espinocerebelar tipo 3 e degenerações olivopontocerebelares, doença de Gilles De La Tourette, paralisia bulbar e pseudobulbar, atrofia muscular espinal e espinobulbar (doença de Kennedy), esclerose lateral primária, paraplegia espástica familiar, doença de Werdnig-Hoffmann, doença de Kugelberg-Welander, doença de Tay-Sach, doença de Sandhoff, doença espástica familiar, doença de Wohlfart-Kugelberg-Welander, paraparésia espástica, leucoencefalopatia multifocal progressiva, disautonomia familiar (síndroma de Riley-Day), doenças de priões (incluindo, mas não se limitando a doença de Creutzfeldt-Jakob, doença de Gerstmann-Stráussler-Scheinker, Kuru e insónia familiar fatal), doenças desmielinizantes e doenças incluindo esclerose múltipla e doenças hereditárias, tal como as leucodistrofias. 20

Os termos doença de Parkinson e parkinsonismo referem-se coletivamente a sindromes neurodegenerativos em que distúrbios do movimento relacionados com o parkinsonismo podem ser uma característica. Estes distúrbios, tanto genéticos e não-genéticos, são tipicamente caracterizados por quatro sintomas parkinsonianos principais: tremor, rigidez, instabilidade postural e bradicinesia, resultantes da perda ou disfunção dos neurónios produtores de dopamina na substantia nigra. 0 parkinsonismo pode resultar de doença de Parkinson idiopática, ou pode ser provocado, no todo ou em parte, por outros factores, incluindo, mas não limitando a, medicação, doença de Alzheimer, paralisia supranuclear progressiva, atrofia de sistemas múltiplos, sindrome de Shy-Drager, atrofia do ponto olivo-cerebelar, degeneração estriatonigral geral ou, mais comummente, hidrocefalia, doença de Wilson, degeneração córtico-basal, doença de Huntington, doença de Hallervorden-Spatz, parkinsonismo pós-encefalitico, envenenamento por manganês, exposição a pesticidas e envenenamento por monóxido de carbono. 0 termo parkinsonismo também pretende incluir desordens relacionadas, tais como tremor essencial e pseudo-parkinsonismo vascular.

Outras doenças neurodegenerativas incluem tumores e outras condições neoplásicas que afectam o SNC e SNP. Embora a doença subjacente seja considerada proliferativa (em vez de neurodegenerativa) , os tecidos circundantes podem estar comprometidos. Além disso, a terapia celular pode ser utilizada para entregar moléculas antineoplásicas apoptóticas ou outras para o local do tumor, por exemplo, através do fornecimento de células geneticamente modificadas que produzem esses agentes. 21

Outras doenças neurodegenerativas incluem várias neuropatias, tais como neuropatias multifocais, neuropatias sensoriais, neuropatias motoras, neuropatias sensório-motoras, neuropatias relacionadas com infecção, neuropatias autonômicas, neuropatias sensoriais-autonómicas, neuropatias desmielinizantes (incluindo, mas não limitados a, sindrome de Guillain-Barre e polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crónica), outras neuropatias inflamatórias e imunológicas, neuropatias induzidas por fármacos, neuropatias induzidas por tratamentos farmacológicos, neuropatias induzidas por toxinas, neuropatias traumáticas (incluindo, mas não limitado a, neuropatias de compressão, esmagamento, laceração e segmentação), neuropatias metabólicas, neuropatias endócrinas e paraneoplásicas, entre outras.

Outras doenças neurodegenerativas incluem demências, independentemente da etiologia subjacente, incluindo a demência relacionada com a idade e outras demências e condições com perda de memória incluindo a demência associada à doença de Alzheimer, demência vascular, doença difusa da substância branca (doença de Binswanger), demência de origem endócrina ou metabólica, demência de traumatismo craniano e lesão cerebral difusa, demência pugilistica e demência do lobo frontal.

Uma doença ou desordem neurodegenerativa da substantia nigra inclui parkinsonismo e condições relacionadas, tal como definido acima, bem como qualquer outra das condições acima listadas, doenças ou distúrbios que, pelo menos, parcialmente tem como alvo células da substantia nigra. 22 0 termo tratamento (ou tratamento de) de uma condição neurodegenerativa refere-se à melhoria dos efeitos de, ou retardar, parar ou reverter o progresso de, ou retardar ou prevenir o aparecimento de uma condição neurodegenerativa, tal como aqui definido. 0 termo quantidade eficaz refere-se à concentração ou quantidade de um composto, material, ou composição, tal como aqui descrito, que é eficaz para alcançar um resultado biológico particular. Esses resultados incluem, mas não estão limitados a, regeneração, reparação ou melhoria do tecido neural, e/ou melhoria do comportamento e função neurológica em pacientes com doença de Parkinson. Tal atividade eficaz pode ser alcançada, por exemplo, através da administração de células e/ou composições da presente invenção a pacientes com doença de Parkinson. No que diz respeito ao PPDCs como administrados a um paciente in vivo, uma quantidade eficaz pode variar de poucas como várias centenas ou menos ou vários milhões ou mais. Em concretizações especificas, uma quantidade eficaz pode variar de 103-1011, mais especificamente, pelo menos, cerca de 104 células. Será apreciado que o número de células a ser administrado irá variar dependendo das particularidades da doença a ser tratada, incluindo mas não se limitando a tamanho ou área total de volume/superficie a ser tratada, bem como a proximidade do local de administração para a localização da região a ser tratada, entre outros factores familiares ao biólogo.

Os termos do periodo de eficácia (ou tempo) e referem-se a condições eficazes num periodo de tempo ou outras condições controláveis (por exemplo, temperatura, humidade para os métodos in vitro) , necessárias ou preferidas para um agente 23 ou composição farmacêutica para conseguir o resultado pretendido. 0 termo paciente ou sujeito são aqui usados indiferentemente, e referem-se a animais, de preferência mamiferos, e mais preferencialmente seres humanos, que são tratados com as composições farmacêuticas ou terapêutico, ou de acordo com os métodos aqui descritos. 0 termo veiculo farmaceuticamente aceitável (ou meio) , que pode ser utilizado alternadamente com o termo transportador ou meio biologicamente compativel, refere-se a reagentes, células, compostos, materiais, composições e/ ou formas de dosagem que não são apenas compatíveis com as células e outros agentes a ser administrados terapeuticamente, mas que são também, no âmbito do julgamento médico, adequados para utilização em contacto com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outra complicação comensurável com uma razoável relação benefício/risco. Tal como descrito em maior pormenor aqui, os transportadores farmaceuticamente aceitáveis apropriados para utilização na presente invenção incluem líquidos, semissólidos (por exemplo, géis) e materiais sólidos (por exemplo, estruturas celulares e matrizes, tubos em folhas e outros materiais, tais como conhecidos na técnica descritos em maior pormenor) . Estes materiais sólidos e semissólidos podem ser concebidos para resistir à degradação no interior do corpo (não biodegradável) ou podem ser concebidos para se degradar no corpo (biodegradável ou reabsorvível). Um material biodegradável pode ainda ser reabsorvível ou bioabsorvível, ou seja, pode ser dissolvido e absorvido nos fluidos corporais (implantes solúveis em água, são um exemplo), ou 24 degradado e, finalmente eliminado do corpo, tanto por conversão em outros materiais como por degradação e eliminação através das vias naturais. A taxa de biodegradação pode variar de acordo com a taxa de libertação desejada, uma vez implantado no cérebro. A matriz, desejavelmente, também atua como uma estrutura temporária até que seja substituída por tecido neural recentemente crescido. Portanto, numa forma de realização, a matriz fornece uma libertação sustentada dos outros agentes utilizados em conjunto com as células derivadas do pós-parto e pode fornecer uma estrutura para desenvolver o crescimento de tecido no paciente. Em outras formas de realização, a matriz fornece simplesmente uma armação temporária para o tecido em desenvolvimento. A matriz pode estar sob a forma de partículas (macropartículas maiores do que 10 mícrones de diâmetro, ou micropartículas de menos de 10 mícrones de diâmetro) , ou pode estar na forma de um implante tridimensional estruturalmente estável (por exemplo, uma estrutura). O implante pode ser, por exemplo, um cubo, cilindro, tubo, bloco, película, folha, ou uma forma anatómica apropriada. "Comportamento" é aqui utilizado num sentido lato, e refere-se a qualquer coisa que faça um animal em resposta ou reação a uma determinada de estimulação ou conjunto de condições. Vários termos são usados aqui com respeito ao transplante de tecidos ou de células. Os termos transferência autóloga, transplante autólogo, autoenxerto e semelhantes referem-se a transplantes em que o dador do transplante é também o receptor do transplante. Os termos transferência alogénica, transplante alogénico, aloenxerto e semelhantes 25 referem-se a transplantes em que o dador do transplante é da mesma espécie que o receptor do transplante, mas não é o mesmo indivíduo. Um transplante de células em que as células do doador foram combinadas por histocompatibilidade com um receptor é por vezes referido como uma transferência singeneica. Os termos transferência xenogénica, transplante xenogénico, xenoenxerto e semelhantes referem-se a transplantes em que o dador do transplante é de uma espécie diferente do receptor do transplante.

Descrição

Condições neurodegenerativas, as quais englobam perturbações e doenças agudas, crónicas e progressivas tendo causas amplamente divergentes, têm como característica comum a disfunção e perda de um grupo específico ou vulneráveis de células neurais. Essa semelhança permite o desenvolvimento de abordagens terapêuticas semelhantes, para a reparação e regeneração do tecido neural vulnerável ou danificado, uma das quais é a terapia de base celular. Nas suas várias formas de realização aqui descrita, a presente invenção apresenta métodos e composições farmacêuticas para a reparação e regeneração neural que utilizam células progenitoras e populações de células derivadas de tecidos pós-parto. A invenção é aplicável a qualquer condição neurodegenerativa, mas espera-se ser particularmente adequada para o tratamento da doença de Parkinson e desordens neurológicas relacionadas.

Como resumido acima, a presente invenção, num dos seus aspectos é geralmente dirigida a derivados de células de pós-parto isoladas (PPDCs), que são derivadas a partir de tecido placentário ou cordão umbilical, que foi tornado 26 substancialmente isento de sangue. Os PPDCs são capazes de autorrenovação e de expansão em cultura e têm o potencial para se diferenciarem em células de fenótipos neurais. Certas formas de realização possuem populações compreendendo tais células, composições farmacêuticas que compreendem as células ou componentes ou produtos derivados, e métodos de utilização das composições farmacêuticas para o tratamento de pacientes com doença de Parkinson. As células derivadas do pós-parto foram caracterizadas pelas suas propriedades de crescimento em cultura, pelos seus marcadores de superfície celular, por meio de sua expressão de genes, através da sua capacidade para produzir determinados factores tróficos bioquímicos, bem como pelas suas propriedades imunológicas.

Preparação de PPDCs

De acordo com os métodos aqui descritos, a placenta e o cordão umbilical de mamíferos e são recuperados no momento ou logo após a cessação de qualquer uma gravidez de termo ou pré-termo, por exemplo, após a expulsão após o nascimento. 0 tecido pós-parto pode ser transportado a partir do local do nascimento até um laboratório num recipiente esterilizado, tal como um frasco, taça, disco de cultura ou saco. 0 recipiente pode ter uma solução ou meio, incluindo, mas não limitado, a uma solução salina, tal como, por exemplo, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (também conhecido como meio mínimo essencial de Dulbecco) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), ou qualquer solução utilizada para o transporte de órgãos para transplante, como por exemplo a solução da Universidade de Wisconsin ou solução perfluoronada. Um ou mais agentes antibióticos e/ou antimicóticos, tais como, mas não limitados a penicilina, estreptomicina, anfotericina B, gentamicina e nistatina, 27 podem ser adicionados ao meio ou tampão. 0 tecido pós-parto pode ser enxaguado com uma solução anticoagulante tal como uma solução contendo heparina. É preferível manter o tecido a cerca de 4-10°C, antes da extração do PPDCs. É ainda mais preferível que o tecido não seja congelado antes da extração de PPDCs. 0 isolamento de PPDCs ocorre preferivelmente num ambiente asséptico. 0 cordão umbilical pode ser separado a partir da placenta por meios conhecidos na técnica. Alternativamente, o cordão umbilical e a placenta são utilizados sem separação. 0 sangue e detritos são removidos de preferência a partir do tecido pós-parto antes do isolamento de PPDCs. Por exemplo, o tecido pós-parto pode ser lavado com uma solução tampão, tal como, mas não limitado a um tampão fosfato salino. 0 tampão de lavagem pode também incluir um ou mais agentes antifúngicos e/ou antibióticos, tais como, mas não limitados a penicilina, estreptomicina, anfotericina B, gentamicina e nistatina. 0 tecido pós-parto que compreende uma placenta inteira ou um fragmento ou parte da mesma é desagregado por força mecânica (forças de cisalhamento). Numa concretização presentemente preferida, o processo de isolamento também utiliza um processo de digestão enzimática. Muitas enzimas são conhecidas na técnica como sendo úteis para o isolamento de células individuais a partir de matrizes de tecido complexas, a fim de facilitar o crescimento em cultura. Variando de fracamente digestivo (por exemplo, deoxiribonucleases e protease neutra, dispase) a fortemente digestivo (por exemplo, papaína e tripsina), tais enzimas estão disponíveis comercialmente. Uma lista não exaustiva de enzimas compatíveis inclui atividades enzimáticas 28 mucolíticas, metaloproteases, proteases neutras, proteases de serina, (como tripsina, quimotripsina ou elastase) e deoxiribonucleases. Atualmente, são preferidas atividades enzimáticas selecionadas a partir de metaloproteases, proteases neutras e atividades mucolíticas. Por exemplo, as colagenases são conhecidas por serem úteis no isolamento de células a partir de vários tecidos. As deoxiribonucleases podem digerir ADN de cadeia simples e podem minimizar a aglutinação da célula durante o isolamento. Os métodos preferidos envolvem o tratamento enzimático com, por exemplo, colagenase e dispase, ou colagenase, dispase e hialuronidase, e tais métodos são proporcionados, em que em certas formas de realização preferidas, uma mistura de colagenase e a protease neutra dispase são usadas no passo de dissociação. Mais preferidos são os métodos que empregam a digestão, na presença de pelo menos uma colagenase de Clostridium histolyticum, e qualquer uma das atividades de protease, dispase e termolisina. Ainda mais preferidos são os métodos que utilizam a digestão com atividades enzimáticas tanto colagenase como de dispase. Também são preferidos os métodos que incluem digestão com uma atividade de hialuronidase para além das atividades de colagenase e dispase. 0 perito na técnica irá apreciar que muitos desses tratamentos enzimáticos são conhecidos na técnica para o isolamento de células a partir de várias fontes de tecido. Por exemplo, a série de combinações de enzimas LIBERASE Blendzyme (Roche), são adequados para utilização nos métodos instantâneos. Outras fontes de enzimas são conhecidas, e o perito na técnica pode também obter tais enzimas diretamente a partir das SUAS fontes naturais. 0 especialista na técnica também está bem equipado para avaliar enzimas novas, ou adicionais ou combinações de enzimas para a sua utilidade no isolamento das células da 29 invenção. Tratamentos enzimáticos preferidos têm a duração de 0,5, 1, 1,5, ou 2 horas ou mais. Em outras formas de realização preferidas, o tecido é incubado a 37°C durante o tratamento com enzima no passo de dissociação.

Em algumas formas de realização da invenção, o tecido pós-parto é separado em secções compreendendo diferentes aspectos do tecido, tais como os aspectos da placenta neonatais, neonatais/maternos, e maternos, por exemplo. As secções separadas, em seguida, são dissociadas por dissociação mecânica e/ou enzimática de acordo com os métodos aqui descritos. As células da linhagem materna ou neonatal podem ser identificadas por quaisquer meios conhecidos na técnica, por exemplo, por análise de cariótipo ou hibridação in situ para um cromossoma Y.

As células isoladas ou de tecido pós-parto a partir dos quais os PPDCs crescem podem ser utilizados para iniciar, ou semear, culturas de células. As células isoladas são transferidas para vasos de cultura de tecidos estéreis tanto não revestidos como revestidos com matriz extracelular ou ligantes, tais como laminina, colagénio (nativo, desnaturado ou reticulado), gelatina, fibronectina, e outras proteinas da matriz extracelular. Os PPDCs são cultivados em qualquer meio de cultura capaz de sustentar o crescimento das células, tais como, mas não se limitando a, meio DMEM (de alta ou baixa glicose) , MEMD avançado, DMEM/MCDB 201, meio basal de Eagle, meio de Ham FIO (FIO) , meio de Ham F-12 (F12), meio neurobasal, meio de Dulbecco modificado por Iscove, meio e crescimento de células estaminais mesenquimais (MSCGM), DMEM/F12, RPMI 1640, e CELL-GRO-FREE. O meio de cultura pode ser suplementado com um ou mais componentes, incluindo, por 30 exemplo, soro fetal de bovino (FBS), preferencialmente cerca de 2-15% (v/v) ; soro equino (ES) ; soro humano (HS) : beta-mercaptoetanol (BME ou 2-ME), de preferência cerca de 0,001% (v/v); um ou mais factores de crescimento, por exemplo, factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento de fibroblastos (FGF), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), factor-1 de crescimento semelhante a insulina (IGF-1), factor inibidor de leucócitos (LIF) e eritropoietina; aminoácidos, incluindo a L-valina; e um ou mais agentes antibióticos e/ou antimicóticos para controlar a contaminação microbiana, tal como, por exemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina e nistatina, isoladamente ou em combinação. O meio de cultura compreende de preferência meio de crescimento como definido nos Exemplos abaixo.

As células são semeadas em vasos de cultura a uma densidade para permitir o crescimento celular. Numa forma de realização preferida, as células são cultivadas a cerca de 0 a cerca de 5 por cento em volume de CO2 no ar. Em algumas concretizações preferidas, as células são cultivadas a cerca de 2 a cerca de 25 por cento de O2 no ar, de preferência cerca de 5 a cerca de 20 por cento de 02 no ar. As células são de preferência cultivadas a cerca de 25 até cerca de 40°C e mais preferencialmente são cultivadas a 37°C. As células são de preferência cultivadas num incubador. O meio de cultura no vaso pode ser estático ou agitado, por exemplo, utilizando um bio-reactor. Os PPDCs são de preferência cultivados em condições de baixa tensão oxidativa (por exemplo, com a adição de glutationa, vitamina C, catalase, vitamina E, N-acetilcisteína). "Baixa tensão oxidativa", como aqui utilizado, refere-se a 31 condições de nenhum ou um mínimo de danos por radicais livres nas células cultivadas.

Os métodos para a seleção do meio de cultura mais adequado, preparação do meio, e técnicas de cultura de células são bem conhecidos na técnica e são descritas numa variedade de fontes, incluindo Doyle et al, (eds.), 1995, CELL & TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley & Sons, Chichester; e Ho e Wang (eds.), 1991, ANIMAL CELL BIOREACTORS, Butterworth-Heinemann, Boston.

Após cultura das células isoladas ou fragmentos de tecido durante um período de tempo suficiente, os PPDCs terão crescido, quer como resultado de migração a partir do tecido pós-parto ou a divisão celular, ou ambas. Em algumas formas de realização da invenção, os PPDCs são passados ou removidos para um vaso de cultura separado contendo meio fresco, do mesmo ou de um tipo diferente, como o utilizado no início, em que a população de células pode ser mitoticamente expandida. As células da invenção podem ser usadas em qualquer ponto entre a passagem 0 e senescência. As células são passadas de preferência entre cerca de 3 e cerca de 25 vezes, mais preferencialmente, são passadas cerca de 4 a cerca de 12 vezes, e de preferência são passadas 10 ou 11 vezes. A clonagem e/ou a subclonagem podem ser realizados para confirmar que uma população clonal de células foi isolada.

Em alguns aspectos da invenção, os diferentes tipos de células presentes no tecido pós-parto são fraccionados em subpopulações a partir do qual os PPDCs podem ser isolados. Isto pode ser conseguido utilizando técnicas convencionais 32 de separação de células, incluindo, mas não limitado a, tratamento enzimático para dissociar o tecido pós-parto nas suas células componentes, seguido de clonagem e seleção de tipos de células especificas, por exemplo, mas não limitado a seleção baseada na morfologia e/ou marcadores bioquímicos; crescimento seletivo de células desejadas (seleção positiva), destruição seletiva de células indesejadas (seleção negativa); separação com base na capacidade de aglutinação de células diferenciais na população mista como, por exemplo, com aglutinina de soja; procedimentos de congelamento-descongelamento; de adesão diferencial propriedades das células na população mista; filtração, centrifugação convencional e zonal; elutriação centrífuga (centrifugação contra-fluxo); unidade de separação por gravidade; distribuição em contracorrente; electroforese; e separação de células ativadas por fluorescência (FACS). Para uma revisão das técnicas clonais de seleção e separação de células, consulte Freshney, 1994, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, 3a Ed, Wiley-Liss, Inc., New York. 0 meio de cultura é mudado como necessário, por exemplo, por aspiração cuidadosa do meio a partir do prato, por exemplo, com uma pipeta, e reabastecimento com meio fresco. A incubação é continuada até que um número suficiente de células ou densidade de células se acumule no prato. As secções de tecidos explantadas originais podem ser removidas e as células restantes tripsinizadas utilizando técnicas convencionais ou usando um raspador de células. Após a tripsinação, as células são colhidas, removidas para meio fresco e incubadas como acima. Em algumas formas de realização, o meio é substituído pelo menos uma vez em cerca de 24 horas pós- tripsinação para remover as células 33 flutuantes. As restantes células em cultura são considerados PPDCs.

Os PPDCs podem ser criopreservados. Por conseguinte, numa forma de realização preferida descrita em maior detalhe a seguir, os PPDCs para a transferência autóloga (tanto da mãe ou da criança) pode ser derivada a partir de tecidos pós-parto apropriados após o nascimento de uma criança, em seguida, crioconservados de modo a estarem disponíveis no caso de serem mais tarde necessários para transplante.

Características dos PPDCs

Os PPDCs podem ser caracterizados, por exemplo, pelas características de crescimento (por exemplo, a capacidade de duplicação da população, o tempo de duplicação, passagens para a senescência), análise de cariótipo (por exemplo, cariótipo normal; linhagem materna ou neonatal), citometria de fluxo (por exemplo, análise FACS), imuno-histoquímica e/ou imunocitoquímica (por exemplo, para a detecção de epítopos), perfil de expressão genética (por exemplo, as matrizes do chip genético; reação em cadeia da polimerase (por exemplo, transcriptase reversa PCR, PCR em tempo real e PCR convencional)), matrizes de proteínas, secreção de proteínas (por exemplo, por ensaio de coagulação de plasma ou análise de meio de PDC condicionado, por exemplo, por ensaio imunoenzimático (ELISA)), reação de linfócitos mistos (por exemplo, como medida de estimulação de PBMCs), e/ou por outros métodos conhecidos na técnica.

Exemplos de PPDCs derivadas de tecido placentário foram depositados na American Type Culture Collection (ATCC, 34

Manassas, VA) e atribuídos os numeros de acesso ATCC, como se segue: (1) estirpe designada PLA 071003 (P8) foi depositada em 15 de Junho de 2004 e atribuído o n° de adesão PTA-6074; (2) estirpe designada PLA 071.003 (P11) foi depositada em 15 de Junho adesão PTA-6075; e (3) estirpe foi depositada em 16 de Junho adesão PTA-6079. Exemplos de umbilical foram depositados Collection em 10 de Junho de ^ de acesso ATCC, como se segue 022803 (P 7) foi atribuída o n estirpe designada UMB 022803 acesso PTA-6068. de 2004 e atribuído o n° de designada PLA 071.003 (P16) de 2004 e atribuído o n° de PPDCs derivados do tecido na American Type Culture !004 e atribuídos os números : (1) estirpe designada UMB 3 de acesso PTA-6067: e (2) (P17) foi atribuída o n de

Em várias concretizações, os PPDCs possuem uma ou mais das seguintes características de crescimento (1) necessitam de L-valina, para o crescimento em cultura; (2) são capazes de crescimento em atmosferas contendo oxigénio a partir de cerca de 5% a pelo menos cerca de 20%; (3) têm o potencial para pelo menos cerca de 40 duplicações em cultura antes de alcançarem a senescência; e (4) conferem e expandem num recipiente de cultura de tecido revestido ou não revestido, em que o vaso de cultura de tecido revestido compreende uma camada de gelatina, laminina, colágeno, poliornitina, vitronectina ou fibronectina.

Em certas concretizações os PPDCs possuem um cariótipo normal, que é mantido como as células são passadas. A cariotipagem é particularmente útil para identificar e distinguir as células neonatais das células maternas derivadas a partir da placenta. Métodos para a cariotipagem estão disponíveis e são conhecidos dos peritos na técnica. 35

Em outras formas de realização, os PPDCs podem ser caracterizados pela produção de certas proteínas, incluindo (1) a produção de pelo menos um factor de tecido, vimentina, actina de músculo liso; e (2) produção de pelo menos um dos marcadores da superfície celular CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, PD-L2 e HLA-A, B C, tal como detectado por citometria de fluxo. Em outras formas de realização, os PPDCs podem ser caracterizados pela falta de produção de pelo menos um dos marcadores de superfície celular CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, H2-B7, HLA-G, e HLA-DR, DP, DQ, tal como detectado por citometria de fluxo. Particularmente preferidas são as células que produzem, pelo menos, dois dos factores de tecido, vimentina, actina de músculo liso. Mais preferidas são as células produtoras de todas as três proteínas do factor de tecido, vimentina, actina de músculo liso.

Em outras formas de realização, os PPDCs podem ser caracterizados pela expressão genética, o que em relação a uma célula humana que é um fibroblasto, uma célula estaminal mesenquimal, ou uma célula de medula óssea da cristã ilíaca, é aumentada por um gene que codifica pelo menos uma interleucina 8; reticulon 1; ligando 1 da quimioquina (motivo C-X-C) (atividade estimuladora do crescimento do melonoma, alfa); ligando 6 da quimioquina (motivo C-X-C) (proteína quimiotática de granulócitos 2); ligando 3 da quimioquina (motivo C-X-C); factor de necrose tumoral, proteína alfa-3 induzida, membro 2 da superfamília da lectina tipo C; tumor de Wilms 1; membro da família A2 do aldeído desidrogenase; renina; receptor de lipoproteína 1 oxidado de baixa densidade; clone IMAGE: 4.179.671 de Homo sapiens; proteína quinase C zeta; proteína hipotética 36 DKFZp564F013; sub-regulação do cancro do ovário 1; e gene do Homo sapiens a partir do clone DKFZp547klll3.

Ainda noutras formas de realização, os PPDCs podem ser caracterizados pela expressão genética, o que em relação a uma célula humana que é um fibroblasto, uma célula estaminal mesenquimal, ou uma célula de medula óssea da cristã ilíaca, é reduzido por um gene que codifica pelo menos uma de: homeobox 2 de estatura curta; proteína 27 kDa 2 de choque térmico; ligante 12 de quimiocina (motivo C-X-C) (fator de célula do estroma derivado 1): elastina (estenose aórtica supravalvar, síndrome de Williams-Beuren); mARN do Homo sapiens; cADN DKFZp586M2022 (a partir do clone DKFZp586M2022), homeobox 2 do mesemquima (homeobox de crescimento específico); homeobox homólogo 1 sine oculis (Drosophila); cristalino, alfa B; ativador da morfogénese associada 2; proteína DKFZP586B2420; semelhante à neuralina 1; tetranectinas (proteína de ligação ao plasminogénio); homologia src três (SH3) e domínio rico em cisteína; colesterol 25 hidroxilase; nanico relacionado com o fator de transcrição 3; receptor de interleucina 11, alfa; potenciador do procolágeno de C-endopeptidase; homólogo frisado 7 (Drosophila); gene hipotético BC008967; colagénio tipo VIII, alfa 1; tenascina C (hexabraquion); proteína homeobox 5 de iroquois; hepaestina; integrina, beta 8; vesículas sinápticas de glicoproteína 2; neuroblastoma, supressão da tumorigenicidade 1, proteína 2 de ligação ao factor de crescimento do tipo de insulina, 36 kDa; cADN FLJ12280 fis de Homo sapiens, clone MAMMA1001744; receptor de citoquina como o fator 1; intermediário de potássio/ canal de pequena condutância de cálcio ativado, subfamília N, membro 4; integrina, beta 7; co-ativador transcricional com motivo de ligação PDZ (TAZ); homeobox homólogo 2 sine 37 oculis (Drosophila); proteína KIAA1034; proteína associada à membrana da vesícula 5 (miobrevin) ; proteína da matriz extracelular 1 contendo EGF como a fibulina; resposta inicial de crescimento 3; homeobox 5 sem distai; proteína hipotética FLJ20373; família 1 de redutase aldo-ceto, membro C3 (3-alfa desidrogenase hidroxiesteroide, tipo II); biglicam; co-ativador transcricional com motivo de ligação PDZ (TAZ); fibronectina 1; proenquefalina; integrina, semelhante a beta 1 (com domínios de repetição semelhantes a EGF); inserção do clone cADN EUROIMAGE 1968422 em mARN de comprimento total de Homo sapiens; EphA3; proteína KIAA0367; peptídeo natriurético receptor C/guanilato ciclase C (receptor atrionatriuretico do peptídeo C); proteína hipotética FLJ14054; mARN do Homo sapiens; cDNA DKFZp564B222 (a partir do clone DKFZp564B222); BCL2/adenovírus E1B 19 kDa com interação semelhante à proteína 3; proteína de ligação 1 AE; e subunidade 1 de oxidase do polipeptídeo do citocromo c Vila (músculo).

Em outras formas de realização, os PPDCs podem ser caracterizados pela secreção de pelo menos um de MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, ΗΒ-EGF, BDNF, TPO, MlPla, RANTES e TIMP1, bFGF, BMP-4, CK b 8-1, CNTF, CTACK, EGF, Eotaxina-3, Fas/TNFRSF6, FGF-6, ligando FIT-3, fractalcina, GCSF, ligando GITR, GM-CSF, 1-309, ICAM-1, IGFBP-1, IGFBP- 2, IGFBP- 3, IGFBP- 6, IL-10, IL-13, IL-la, IL-lRa, IL-3, IL- 5, 1—1 t"1 1 I-TAC, MIF, oncostatina M, PIGF, sgpl30, o TGF- ' β 3, TIMP-2, TNF-α, TNF -β, TRAIL-R3, TRAIL-R4, uPAR. Em concretizações alternativas, os PPDCs podem ser caracterizados pela falta de secreção de pelo menos um de TGF-beta2, ANG2, PDGFbb, MlPlb, 1309, MDC e VEGF, tal como detectado por ELISA. 38

Em concretizações preferidas, a célula compreende duas ou mais das caracteristicas acima listadas de crescimento, proteina/produção de marcador de superfície, expressão do gene ou secreção de substâncias. Mais preferidos são aquelas células compreendendo, três, quatro, ou cinco ou mais das caracteristicas. Ainda mais preferidos são os PPDCs que compreendem seis, sete, ou oito ou mais das caracteristicas. Ainda mais preferidos presentemente são aquelas células compreendendo todas as caracteristicas acima referidas.

Entre as células que são presentemente preferidas para utilização com a invenção, em vários dos seus aspectos, são células pós-parto, com as caracteristicas acima descritas e, mais particularmente, aquelas em que as células têm cariótipo normal e mantêm os cariótipos normais com passagens, e ainda em que as células expressam cada um dos marcadores CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, em que as células produzem as proteinas imunologicamente detectáveis que correspondem aos marcadores listados. Ainda mais preferidas são as células que, além do exposto não produzem proteinas correspondentes a qualquer um dos marcadores CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, ou HLA-DR, DP, DQ, tal como detectado por citometria de fluxo.

Certas células possuindo o potencial para se diferenciar ao longo das linhas que conduzem a vários fenótipos são instáveis e, portanto, podem diferenciar-se espontaneamente. Presentemente preferidos para utilização com a invenção são células que não se diferenciam espontaneamente, por exemplo ao longo de linhas neurais. As células preferidas são aquelas que, quando cultivadas em 39 meio de crescimento, são substancialmente estáveis em relação aos marcadores de células produzidos na sua superficie, e com respeito ao padrão de expressão de vários genes, por exemplo como determinado utilizando um Affymetrix GeneChip. As células permanecem substancialmente constante, por exemplo, nas suas caracteristicas de marcadoras de superfície ao longo das passagens, através de múltiplas duplicações da população.

No entanto, uma característica dos PPDCs é que podem ser deliberadamente induzidos a diferenciar-se em linhagens de fenótipos neurais, submetendo-os às condições de cultura de células de diferenciação induzida. Isto pode ser conseguido por um ou mais métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, como aqui exemplificado, os PPDCs podem ser semeados em frascos revestidos com laminina em meio Neurobasal-A (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo B27 (suplemento B27, Invitrogen), L-glutamina e penicilina/estreptomicina, a combinação dos quais é aqui referido como meio de expansão de progenitoras neurais (NPE). Meios NPE podem ser ainda suplementados com bFGF e/ou EGF. Alternativamente, os PPDCs podem ser induzidos a diferenciar-se in vitro por (1) co-cultura dos PPDCs com células progenitoras neurais, ou (2) crescimento dos PPDCs em meio condicionado de células progenitoras neurais. A diferenciação dos PPDCs pode ser demonstrada por uma morfologia das células bipolares com processos extensos. As populações de células induzidas podem colorir-se positivamente na presença de nestina. Os PPDCs diferenciados pode ser avaliados por detecção de nestina, TuJl (tubulina BIII), GFAP, tirosina hidroxilase, GABA, 04 e/ou MBP. Em algumas concretizações, os PPDCs exibiram a 40 capacidade de formar corpos tridimensionais caracteristicos da formação de neuroesferas de células estaminais neuronais.

Populações de PPDC, modificações, componentes e produtos

Outro aspecto da invenção caracteriza populações de PPDCs descritos acima. Em algumas concretizações, a população de células é heterogénea. Uma população de células heterogénea da invenção pode compreender pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% de PPDCs da invenção. As populações de células heterogéneas da invenção podem ainda compreender células estaminais ou outras células progenitoras, tais como células progenitoras neurais, ou podem ainda compreender células neurais totalmente diferenciadas. Em algumas concretizações, a população é substancialmente homogénea, isto é, compreende, substancialmente, apenas PPDCs (de preferência pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99% ou mais PPDCs). A população de células homogéneas da invenção pode compreender células derivadas do cordão umbilical ou da placenta. Populações homogéneas de células derivadas do cordão umbilical são preferencialmente livres de células da linhagem materna. Populações homogéneas de células derivadas da placenta podem ser de linhagem materna ou neonatal. A homogeneidade de uma população de células pode ser conseguida por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por separação de células (por exemplo, citometria de fluxo) ou através da expansão clonal de acordo com métodos conhecidos. Assim, as populações homogéneas PPDC preferidas podem compreender uma linha de células clonais derivadas de células pós-parto. Tais populações são particularmente úteis quando um clone celular com funcionalidade altamente desejável tiver sido isolado. 41

Também aqui fornecidas são populações de células incubadas na presença de um ou mais factores, ou sob condições, que estimulam a diferenciação de células estaminais por um caminho neurogénico. Tais factores são conhecidos na técnica e o perito na técnica irá apreciar que a determinação das condições adequadas para a diferenciação pode ser conseguida com experimentação de rotina. A optimização de condições pode ser conseguida por delineamento experimental e análise estatística, por exemplo, a metodologia de superfície de resposta permite a optimização simultânea de múltiplas variáveis, por exemplo, numa cultura biológica. Presentemente factores preferenciais incluem, mas não estão limitados a factores, tais como factores de crescimento ou tróficos, agentes demetilantes, co-cultura com células de linhagem neural ou cultura em meio condicionado de células de linhagem neural, bem como outras condições conhecidas na técnica, para estimular a diferenciação de células estaminais por uma via neurogénica ou linhagem (ver, por exemplo. Lang, KJD et al., 2004, J. Neurose. Res. 76:184-192; Johe, KK et al., (1996) Genes Devei. 10:3129-3140; Gottlieb, D., (2002) Ann. Rev. Neurosci. 25:381-407).

Os PPDCs podem também ser geneticamente modificados para produzir produtos genéticos neuroterapeuticamente úteis, por exemplo. A modificação genética pode ser realizada utilizando qualquer um de uma variedade de vectores, incluindo, mas não limitado a, vectores virais integrantes, por exemplo, vector retroviral, ou vectores virais adeno-associados; vectores replicantes não integrantes, por exemplo, vectores do vírus do papiloma, vectores SV40, vetores adenovírus ou vectores virais com replicação defeituosa. Outros métodos de introdução de ADN em células 42 incluem a utilização de lipossomas, electroporação, arma de partículas, ou por injeção direta de ADN. Células hospedeiras são preferivelmente transformadas ou transfectadas com ADN controlado por, ou em associação operativa com, um ou mais elementos adequados de controlo da expressão, tais como promotores ou sequências potenciadoras, terminadores de transcrição, sitios de poliadenilação, entre outros, e um marcador selecionável. Qualquer promotor pode ser usado para conduzir a expressão do gene inserido. Por exemplo, os promotores virais incluem, mas não estão limitados a, promotor de CMV/potenciador, SV 40, virus do papiloma, virus de Epstein-Barr ou promotor do gene da elastina. Em algumas formas de realização, os elementos de controlo utilizados para controlar a expressão do gene de interesse podem permitir a expressão regulada do gene de modo que o produto seja sintetizado apenas quando necessário in vivo. Se a expressão transiente for desejada, os promotores constitutivos são preferencialmente utilizados num vetor de não-integração e/ou replicação defeituosa.

Alternativamente, os promotores indutiveis poderão ser utilizados para conduzir a expressão do gene inserido quando necessário. Os promotores indutiveis incluem, mas não estão limitados a, aqueles associados com a metalotioneina e proteínas de choque térmico.

No seguimento da introdução do ADN estranho, as células manipuladas podem ser deixadas a crescer em meio enriquecido e depois mudadas para meio seletivo. O marcador selecionável no ADN estranho confere resistência à seleção e permite às células integrarem estavelmente o ADN 43 estranho, como, por exemplo, num plasmídeo nos seus cromossomas e crescer para formar focos que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhas de células. Este método pode ser vantajosamente utilizado para manipular linhagens de células que expressam o produto genético.

As células da invenção podem ser geneticamente modificadas para a expressão de factores "knock out" ou "knock down" que promovem a inflamação ou a rejeição no local do implante. Técnicas de modulação negativa para a redução dos niveis de expressão de genes alvo ou niveis de atividade do produto genético alvo são discutidas abaixo. "Modulação negativa", tal como é aqui utilizado, refere-se a uma redução no nivel e/ou atividade do produto genético alvo em relação ao nivel e/ou atividade do produto genético alvo na ausência de tratamento modulador. A expressão de um gene nativo de uma célula neuronal ou glial pode ser reduzida ou eliminada utilizando uma série de técnicas, incluindo, por exemplo, a inibição da expressão através da inativação do gene utilizando a técnica de recombinação homóloga. Tipicamente, um exão que codifica para uma região importante da proteina (ou um exão 5' para essa região) é interrompido por um marcador de seleção positiva, por exemplo, neo, impedindo a produção de mARN normal a partir do gene alvo, resultando na inativação do gene. Um gene pode também ser inativado através da criação de uma deleção em parte de um gene, ou por exclusão de todo o gene. Ao utilizar uma construção com duas regiões de homologia com o gene-alvo que estão distantes no genoma, as sequências intervenientes nas duas regiões podem ser eliminadas (Mombaerts et al., 1991, Proc. Nat. Acad.

Sei. USA 88:3084). Antessentido, ADNzimas, ribozimas, pequeno ARN de interferência (siARN) e outras moléculas que 44 inibem a expressão do gene alvo podem também ser utilizados para reduzir o nivel de atividade do gene alvo. Por exemplo, as moléculas de ARN antessentido que inibem a expressão de maior histocompatibilidade de genes complexos (HLA) têm mostrado ser mais versáteis no que diz respeito às respostas imunitárias. Ainda, outras moléculas de hélice tripla podem ser utilizadas na redução do nivel de atividade do gene alvo. Estas técnicas são descritas em detalhe por L.G. Davis et al. (Eds), 1994, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 2a ed., Appleton & Lange, Norwalk, CN.

Em outros aspectos, a invenção proporciona lisados celulares e fracções solúveis de células preparadas a partir de PPDCs ou populações de células heterogéneas ou homogéneas compreendendo PPDCs, assim como PPDCs ou suas populações, que foram geneticamente modificados, ou que tenham sido estimulados para diferenciar ao longo de uma via de neurogénica. Tais lisados, e respectivas fracções têm muitas utilidades. A utilização da fracção solúvel do PPDC lisado (isto é, substancialmente livre de membranas), in vivo, por exemplo, permite que o meio intracelular benéfico possa ser utilizado alogénicamente num paciente sem a introdução de uma quantidade apreciável de proteinas da superfície da célula mais prováveis de provocar rejeição, ou outras respostas imunológicas adversas. Os métodos de lise de células são bem conhecidos na técnica e incluem vários meios de ruptura mecânica, ruptura enzimática ou ruptura quimica, ou as suas combinações. Tais lisados celulares podem ser preparados a partir de células diretamente no seu meio de crescimento e contendo, assim, os factores de crescimento segregados e semelhantes, ou podem ser preparados a partir de células lavadas, livres 45 de meio, por exemplo, PBS ou outra solução. As células lavadas podem ser ressuspensas em concentrações maiores do que a densidade da população original, se preferido.

Numa concretização, os lisados de células inteiras são preparados, por exemplo, pela ruptura de células sem perturbar a separação subsequente de fracções de células. Numa outra forma de realização, uma fracção de membrana de células é separada de uma fracção solúvel das células por meio de métodos de rotina conhecidos na técnica, por exemplo, centrifugação, filtração, ou métodos semelhantes.

Os lisados celulares ou fracções solúveis de células preparadas a partir de populações de células derivadas do pós-parto podem ser usadas como tal, posteriormente concentradas, por exemplo, por ultrafiltração ou liofilização, ou mesmo secas, parcialmente purificadas, juntamente com transportadores farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes, como é conhecido na técnica, ou em combinação com outros compostos, tais como produtos biológicos, por exemplo, composições de proteínas farmaceuticamente úteis. Os lisados celulares ou fracções dos mesmos podem ser utilizados in vitro ou in vivo, por si só ou, por exemplo, com células vivas autólogas ou singeneicas. Os lisados, se introduzidos in vivo, podem ser introduzidos localmente no local de um tratamento, ou remotamente, para fornecer, por exemplo, factores de crescimento celular necessários para um paciente.

Numa outra forma de realização, os PPDCs podem ser cultivados in vitro, para produzir produtos biológicos, com elevado rendimento. Por exemplo, tais células, quer 46 produzam naturalmente um produto biológico particular de interesse (por exemplo, um factor trófico), ou que tenham sido geneticamente modificadas para produzir um produto biológico, podem ser clonalmente expandidas usando técnicas de cultura aqui descritas. Alternativamente, as células podem ser expandidas em meio que induz a diferenciação de uma linhagem neuronal. Em ambos os casos, os produtos biológicos produzidos pelas células e segregados para o meio podem ser facilmente isolados a partir de meio condicionado usando técnicas de separação padrão como, por exemplo, a precipitação diferencial de proteínas, cromatografia de troca iónica, cromatografia de filtração em gel, electrofores, e HPLC, para nomear apenas algumas. Um "biorreactor" pode ser usado para tirar vantagem do método de fluxo para alimentação, por exemplo, de uma cultura tridimensional in vitro. Essencialmente, como o meio fresco é passado através da cultura tri-dimensional, o produto biológico é lavado para fora da cultura e pode então ser isolado a partir da saída, como descrito acima.

Alternativamente, um produto biológico de interesse pode permanecer no interior da célula e, deste modo, a sua recolha pode requerer que as células sejam lisadas, como descrito acima. 0 produto biológico pode então ser purificado utilizando uma ou mais das técnicas anteriormente enumeradas.

Em outras concretizações, a invenção proporciona meio condicionado a partir de PPDCs cultivados para uso in vitro e in vivo como descrito abaixo. A utilização do meio condicionado de PPDC permite que os factores tróficos benéficos segregados pelos PPDCs sejam usados alogenicamente num paciente, sem a introdução de células 47 intactas que poderiam provocar rejeição, ou outras respostas imunológicas adversas. 0 meio condicionado é preparado por cultura de células num meio de cultura, em seguida, removendo as células do meio. 0 meio condicionado preparado a partir de populações de células derivadas do pós-parto pode ser usado como está, ainda mais concentrado, por exemplo, por, ultrafiltração ou liofilização, ou mesmo seco, parcialmente purificado, juntamente com transportadores farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes, como é conhecido na técnica, ou combinado com outros compostos, tais como produtos biológicos, por exemplo, composições de proteínas farmaceuticamente úteis. 0 meio condicionado pode ser utilizado in vitro ou in vivo, por si só ou, por exemplo, com células vivas autólogas ou singeneicas. 0 meio condicionado, se introduzido in vivo, pode ser introduzido localmente no local de um tratamento, ou remotamente, para fornecer, por exemplo, o crescimento celular necessário ou factores tróficos para um paciente.

Numa outra forma de realização, é preparada uma matriz extracelular (ECM) produzida por cultura de PPDCs em substratos líquidos, sólidos ou semissólidos, recolhida e utilizada como uma alternativa para a implantação de células vivas num sujeito com necessidade de reparação de tecidos ou substituição. Os PPDCs são cultivados in vitro, sobre uma estrutura tridimensional, como aqui descrito, em condições tais que uma quantidade desejada de ECM é segregada para a estrutura. Então, o novo tecido é removido, e o ECM processado para utilização posterior, por exemplo, como uma preparação injetável. Para conseguir isso, as células na estrutura são mortas e os detritos celulares removidos da estrutura. Este processo pode ser 48 realizado num certo número de maneiras diferentes. Por exemplo, o tecido vivo pode ser congelado rapidamente em azoto líquido sem criopreservação, ou o tecido pode ser imerso em água destilada estéril, de modo que as células rebentem em resposta à pressão osmótica.

Uma vez que as células foram mortas, as membranas celulares podem ser interrompidas e os restos celulares removidos por tratamento com um detergente de lavagem, tal como o EDTA, CHAPS ou um detergente zwiteriónico. Em alternativa, o tecido pode ser enzimaticamente digerido e/ou extraído com reagentes que quebram as membranas celulares e permitem a remoção do conteúdo da célula. Exemplo de tais enzimas incluem, mas não estão limitados a, hialuronidase, dispase, proteases e nucleases. Como exemplos de detergentes incluem-se os detergentes não-iónicos tais como, por exemplo, o álcool de poliéter de alquilarilo (Triton X-100), octilfenoxi polietoxi-etanol (Rohm and Haas, Filadélfia, PA), Brij-35, éter de lauril polietoxietanol (Atlas Chemical Co., San Diego, CA), polissorbato 20 (Tween 20), polietoxi sorbitano monolaureato (Rohm and Haas), polietileno de lauril éter (Rohm and Haas), e detergentes iónicos, tais como, por exemplo, dodecil sulfato de sódio, álcoois alifáticos superiores sulfatados, alcanos e alquilarenos sulfonados contendo 7 a 22 átomos de carbono numa cadeia ramificada ou não ramificada. A recolha da ECM pode ser realizada numa variedade de formas, dependendo, por exemplo, se o novo tecido foi formado numa estrutura tridimensional que é biodegradável ou não biodegradável. Por exemplo, se a estrutura não é biodegradável, a ECM pode ser removida por sujeição da estrutura à sonicação, jactos de água de alta pressão, 49 raspagem mecânica ou tratamento suave com detergentes ou enzimas, ou qualquer combinação dos anteriores.

Se a estrutura é biodegradável, a ECM pode ser recolhida, por exemplo, permitindo que a estrutura se degrade ou dissolva na solução. Alternativamente, se a estrutura biodegradável é constituída por um material que por si só pode ser injetado juntamente com a ECM, a estrutura e a ECM podem ser processadas in toto por injeção subsequente. Alternativamente, a ECM pode ser removida da estrutura biodegradável por qualquer um dos métodos descritos acima para a recolha de ECM a partir de uma estrutura não biodegradável. Todos os processos de recolha são preferencialmente concebidos de modo a não desnaturar a ECM.

Depois de ter sido recolhida, a ECM pode ser processada. Por exemplo, a ECM pode ser homogeneizada em partículas finas utilizando técnicas bem conhecidas na técnica, tais como por sonicação, de modo que possa passar através de uma agulha cirúrgica. Os componentes da ECM podem ser reticulados, se se desejar, por meio de irradiação gama. De preferência, a ECM pode ser irradiada entre 0,25-2 mega rads para esterilizar e reticular a ECM. A utilização de agentes de reticulação química que são tóxicos, tais como o glutaraldeído, é possível, mas não é geralmente preferida.

As quantidades e/ou proporções de proteínas, tais como os vários tipos de colagénio presentes na ECM, podem ser ajustadas por mistura da ECM produzida pelas células da invenção com a ECM de um ou mais outros tipos de células. Além disso, as substâncias biologicamente ativas, tais como 50 proteínas, factores de crescimento e/ou fármacos, podem ser incorporadas na ECM. Exemplos de substâncias biologicamente ativas incluem factores de crescimento de tecidos, tais como TGF-beta, factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) , e semelhantes, que promovem a cura e reparação dos tecidos no local da injeção. Tais agentes adicionais podem ser utilizados em qualquer das formas de realização aqui descritas, por exemplo, com lisados de células inteiras, fracções celulares solúveis, ou, ainda, por componentes purificados e produtos produzidos pelos PPDCs.

Composições farmacêuticas compreendendo PPDCs, componentes ou produtos PPDC

Num outro aspecto, a invenção proporciona composições farmacêuticas que utilizam os PPDCs, populações de PPDCs, componentes e produtos de PPDCs em vários métodos para o tratamento da doença de Parkinson e desordens relacionadas. Certas formas de realização abrangem as composições farmacêuticas compreendendo células vivas (PPDCs isoladamente ou misturados com outros tipos de células). Outras formas de realização abrangem as composições farmacêuticas que compreendem componentes celulares de PPDCs (por exemplo, lisados celulares, fracções celulares solúveis, meio condicionado, matriz extracelular, ou componentes de qualquer destes materiais) ou produtos (por exemplo, factores tróficos e outros factores biológicos produzidos naturalmente por PPDCs ou através de modificação genética, meio condicionado de cultura PPDC). Em qualquer caso, a composição farmacêutica pode ainda conter outros agentes ativos, tais como agentes anti-inflamatórios, agentes anti-apoptóticos, antioxidantes, factores de crescimento, factores neurotróficos ou fármacos 51 neuroregenerativos neuroprotectores como conhecido na técnica.

Exemplos de outros componentes que podem ser adicionados às composições farmacêuticas de PPDC incluem, mas não estão limitados a: (1) outros fármacos neuroprotectores ou neurobeneficiais; (2) selecção de componentes da matriz extracelular, tais como um ou mais tipos de colagénio conhecidos na técnica e/ou factores de crescimento, plasma rico em plaquetas, e fármacos (em alternativa, os PPDCs podem ser geneticamente modificados para expressar e produzir os factores de crescimento); (3) agentes anti-apoptóticos (por exemplo, eritropoetina (EPO), EPO mimetibody, trombopoietina, factor de crescimento semelhante à insulina (IGF)-I, IGF-II, factor de crescimento de hepatócitos, inibidores de caspase); (4) compostos anti-inflamatórios (por exemplo, inibidores da quinase MAP p38, inibidores de TGF-beta, estatinas, inibidores de IL-6 e IL-1, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS, e fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (NSAIDs) (tais como TEPOXALINA, TOLMETINA, e SUPROFENO); (5) , agentes imunossupressores ou imunomoduladores, tais como inibidores de calcineurina, inibidores de mTOR, antiproliferativos, corticosteróides e vários anticorpos; (6) anti-oxidantes tais como probucol, vitaminas C e E, conenzima Q-10, glutationa, L-cisteina e N-acetilcisteina; (6) anestésicos locais; e (7), factores neurotróficos tais como GDF5, BMP-14, CDMP-1, MP52, BMP7, sonic hedgehog (SHH), e factor 8 de crescimento de fibroblastos (FGF8), para nomear alguns.

As composições farmacêuticas da invenção compreendem PPDCs, ou componentes ou produtos derivados, formulados com um 52 transportador ou meio farmaceuticamente aceitável.

Transportadores farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, água, solução salina (tal como solução de Ringer), álcoois, óleos, gelatinas, e hidratos de carbono, tais como lactose, amilose ou amido, ésteres de ácidos gordos, hidroximetilcelulose, e pirrolidina de polivinilo. Tais preparações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, tais como lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes molhantes, emulsionantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões e corantes. Os transportadores farmacêuticos adequados para utilização na presente invenção são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Pharmaceutical Sciences (17a ed., Mack Pub. Co., Easton, PA) e WO 96/05309.

Geralmente, mas não exclusivamente, as composições farmacêuticas que compreendem os componentes ou produtos PPDC, mas não células vivas, são formuladas na forma de liquidos (ou na forma de comprimidos sólidos, cápsulas e semelhantes, quando a administração oral é adequada). Estes podem ser formulados para administração por qualquer via aceitável conhecida na técnica para conseguir a entrega de fármacos e moléculas biológicas ao tecido neural alvo, incluindo, mas não limitado a, oral, nasal, oftálmica ou parentérica, incluindo a administração intravenosa. Vias particulares de administração parentérica incluem, mas não estão limitadas a, vias de administração intramusculares, subcutâneas, intraperitoneais, intracerebrais, intraventriculares, intracerebroventriculares, intratecais, intracisternais, intraespinais e/ou peri-espinais por distribuição através de agulhas intracranianas ou 53 intravertebrais e/ou cateteres ou microcatéteres com ou sem dispositivos de bomba.

As composições farmacêuticas compreendendo células vivas de PPDC são tipicamente formuladas na forma de líquidos, semissólidos (por exemplo, géis) ou sólidos (por exemplo, matrizes, estruturas e afins, conforme adequado para a manipulação de tecido neural). As composições líquidas são formuladas para administração por qualquer via aceitável conhecida na técnica para conseguir a entrega de células vivas nos tecidos neuronais alvos. Normalmente, estes incluem injeção ou infusão no SNC ou SNP, quer de uma forma difusa ou orientada para o local da doença ou condição neurológica, por uma via de administração, incluindo, mas não limitado a, intraocular, intracerebral, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal, intracisternal, intra-espinhal e/ou peri-espinhal mediante a entrega através de agulhas intracranianas ou intervertebrais e/ou cateteres com ou sem dispositivos de bomba.

As composições farmacêuticas compreendendo células vivas num transportador semissólido ou sólido são tipicamente formuladas para implantação cirúrgica no local do dano neurológico ou sofrimento. Será apreciado que as composições líquidas também podem ser administradas por meio de procedimentos cirúrgicos. Em concretizações particulares, as composições farmacêuticas semissólidas ou sólidas podem compreender géis semipermeáveis, reticulados, estruturas celulares e outros semelhantes, que podem ser não biodegradáveis ou biodegradáveis. Por exemplo, em certas concretizações, pode ser desejável ou apropriado sequestrar as células exógenas do seu ambiente, mas 54 permitir que as células segreguem e entreguem as moléculas biológicas (por exemplo, factores neurotróficos) às células neurais envolventes. Nestas formas de realização, as células podem ser formuladas como implantes autónomos compreendendo PPDCs vivos ou população de células compreendendo PPDCs rodeados por uma barreira seletivamente permeável, não-degradável, que separa fisicamente as células transplantadas do tecido hospedeiro. Tais implantes são muitas vezes referidos como "imunoprotectores", uma vez que têm a capacidade de impedir que as células do sistema imunológico e macromoléculas matem as células transplantadas na ausência de imunossupressão induzida farmacologicamente (para uma revisão de tais dispositivos e métodos, ver, por exemplo, P.A. Tresco et al., (2000) Adv. Drug Delivery Rev. 42:3-27).

Em outras formas de realização, são utilizadas diferentes variedades de géis degradáveis e redes para as composições farmacêuticas da invenção. Por exemplo, os materiais degradáveis, particularmente adequados para as formulações de libertação controlada incluem polímeros biocompatíveis, tais como o poli (ácido láctico), poli (ácido láctico-co-glicólico), metilcelulose, ácido hialurónico, colagénio, e similares. A estrutura, seleção e utilização de polímeros degradáveis em veiculos de distribuição de fármacos têm sido revistos em diversas publicações, incluindo, A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3:279.

Em outras formas de realização, por exemplo, para reparação de grandes lesões neurais, pode ser desejável ou apropriado entregar as células sobre ou dentro de uma matriz ou estrutura biodegradável, de preferência bioreabsorvivel ou bioabsorvivel. Estes biomateriais geralmente 55 tridimensionais contêm células vivas ligadas à estrutura, dispersas na estrutura ou incorporadas numa matriz extracelular retida na estrutura. Uma vez implantados na região alvo do corpo, estes implantes integram-se com o tecido do hospedeiro, em que as células transplantadas se vão progressivamente estabelecendo (ver, por exemplo, Tresco PA, et al. (2000) supra; ver também Hutmacher, DW (2001) J. Biomater. Sei. Polymer Edn. 12:107-174). A matriz biocompativel pode ser constituída por polímeros biodegradáveis, naturais, naturais modificados ou sintéticos, incluindo homopolimeros, copolimeros e polímeros em bloco, assim como as suas combinações. Note-se que um polimero é geralmente nomeado com base no monómero a partir do qual é sintetizado.

Exemplos de polímeros biodegradáveis ou classes de polímeros adequados incluem fibrina, colagénio, elastina, gelatina, vitronectina, fibronectina, laminina, matrizes de membrana basal reconstituída, amidos, dextranos, alginatos, hialoron, quitina, quitosana, agarose, polissacáridos, ácido hialurónico, poli (ácido láctico), poli (ácido glicólico) , polietileno glicol, tecidos descelularizados, peptideos auto-montados, polipeptídeos, glicosaminoglicanos, seus derivados e suas misturas. Tanto para o ácido glicólico como para o ácido láctico, é tipicamente preparado um dimero ciclico intermediário e purificado antes da polimerização. Estes dimeros intermediários são chamados de lactido e glicolido, respectivamente. Outros polímeros biodegradáveis úteis ou classes de polímeros incluem, sem limitação, polidioxanonas, policarbonatos, polioxalatos, poli (alfa-ésteres), polianidridos, policaprolactonas, poliacetatos, 56 poli (ortoésteres), poliaminoácidos, poliamidas, e suas misturas e copolímeros. Os polímeros biodegradáveis úteis incluem, sem limitação estereopolímeros de ácido láctico L-e D-, copolímeros de bis-(para-carboxifenoxi) propano e ácido sebácico, copolímeros de ácido sebácico, copolímeros de caprolactona, poli (ácido láctico)/poli (ácido glicólico)/copolímeros de polietilenoglicol, copolímeros de poliuretano e poli (ácido láctico), copolímeros de poliuretano e de poli (ácido láctico), copolímeros de alfa-aminoácidos, copolímeros de alfa-aminoácidos e ácido caproico, copolímeros de alfa-benzilo glutamato e polietileno glicol, copolímeros de succinato e poli (glicóis), polifosfazeno, poli-hidroxi-alcanoatos de etilo e suas misturas. Os sistemas binários e ternários, também são contemplados.

Em geral, um polímero biodegradável adequado para utilização como matriz é, desejavelmente, configurado de tal modo que possua propriedades mecânicas que são adequadas para a aplicação pretendida, permaneça suficientemente intacto até que o tecido tenha crescido e curados, não invoque uma resposta inflamatória ou tóxica, seja metabolizado no organismo após a cumprir o seu objectivo, seja facilmente transformado no produto final a ser formado desejado, demonstre aceitável período de vida útil e possa ser facilmente esterilizado.

Num aspecto da invenção, o polímero biocompatível utilizado para formar a matriz está na forma de um hidrogel. Em geral, os hidrogéis são materiais poliméricos com ligações cruzadas, que podem absorver mais de 20% do seu peso em água, mantendo uma estrutura tridimensional distinta. Esta definição inclui polímeros reticulados a seco que vão 57 inchar em ambientes aquosos, bem como materiais que incham na água. Uma série de polímeros hidrofílicos podem ser reticulados para produzir hidrogéis, quer o polímero seja de origem biológica, semissintética ou totalmente sintética. 0 hidrogel pode ser produzido a partir de um material polimérico sintético. Tais polímeros sintéticos podem ser adaptados para uma gama de propriedades previsíveis e com homogeneidade de lote para lote, e representam uma fonte fiável de material que é geralmente livre de preocupações de imunogenicidade. As matrizes podem incluir hidrogéis formados a partir de péptidos de automontagem, tal como aqueles discutidos nas Patentes US 5670483 e 5955343, no Pedido de Patente US 2002/0160471, Pedido PCT WO02/062969.

As propriedades que tornam os hidrogéis valiosos em aplicações de entrega de fármacos incluem o grau de inchamento de equilíbrio, a cinética de absorção, a permeabilidade do soluto, e as suas características de desempenho in vivo. A permeabilidade aos compostos depende em parte do grau de intumescimento ou teor de água e a taxa de biodegradação. Uma vez que a resistência mecânica de um gel diminui na proporção direta com o grau de inchaço, também está bem dentro da contemplação da presente invenção, que o hidrogel pode ser ligado a um substrato de modo a que o sistema composto aumente a resistência mecânica. Em concretizações alternativas, o hidrogel pode ser impregnado dentro de um substrato poroso, de modo a obter a resistência mecânica do substrato, juntamente com as propriedades úteis de entrega do hidrogel.

Exemplos de materiais de estrutura ou matriz não limitativos (por vezes referidos colectivamente como 58 "estrutura") que podem ser utilizados na presente invenção incluem esteiras não tecidas, espumas porosas, sistemas de micropartícuias, ou péptidos de automontagem. Esteiras não tecidas podem ser, por exemplo, formadas usando fibras compostas de um copolimero absorvivel sintético de ácido poli (ácido glicólico-co-láctico) (10/90 PLGA), doravante referido como VNW. Espumas, compostas por, por exemplo, copolimero poli (e-caprolactona) poli (ácido glicólico) (PCL/PGA), formado por processos tais como secagem por congelação, ou liofilizado, como discutido na Patente US 6355699, podem também ser utilizados. Hidrogéis tais como péptidos de automontagem (por exemplo, RAD16) podem também ser utilizados. Redes degradáveis formadas in situ são também adequadas para uso na invenção (ver, por exemplo, Anseth, KS et al. (2002) J. Controlled Release 78:199-209;

Wang, D. et al., (2003) Biomaterials 24:3969-3980;

Publicação de Patente US 2002/0022676 para He et al.). Estes materiais são formulados como líquidos adequados para injeção, em seguida, podem ser induzidos por uma variedade de meios (por exemplo, alteração da temperatura, pH, exposição à luz) para formar redes de hidrogel degradáveis in situ ou in vivo.

Numa outra forma de realização, a estrutura é um feltro, que pode ser composto por um fio de multifilamentos feito de um material bioabsorvível, por exemplo, copolímeros ou misturas de PGA, PLA, PCL, ou ácido hialurónico. O fio é feito em feltro utilizando técnicas de processamento de têxteis padrão consistindo em prensagem, corte, cardação e agulhamento. Noutra concretização, as células são semeadas em estruturas e espuma que podem ser estruturas compostas. 59

Em muitas das formas de realização acima mencionadas, a estrutura pode ser moldada numa forma útil, tal como a da medula espinal com colunas segregadas para a reparação do trato nervoso, por exemplo, (Friedman, JA et al., (2002) Neurosurgery 51:742-751). Além disso, será apreciado que os PPDCs podem ser cultivados em dispositivos pré-formados, cirúrgicos não-degradáveis ou implantáveis, por exemplo, de uma maneira correspondente à utilizada para a preparação de fibroblastos contendo bobinas endovasculares GDC, por exemplo (Marx, WF et al., (2001) Am. J. Neuroradiol. 22:323-333). Podem também ser utilizados sistemas de micropartícuias, grânulos, esferas, fibras revestidas com células ou derivados de células. A matriz, estrutura ou dispositivo podem ser tratados antes da inoculação das células, a fim de melhorar a fixação celular. Por exemplo, antes da inoculação, as matrizes de nylon podem ser tratados com 0,1 molar de ácido acético e incubadas em polilisina, PBS, e/ou colagénio para revestir o nylon. O poliestireno pode ser tratado de forma semelhante, utilizando ácido sulfúrico. As superficies externas da estrutura podem também ser modificadas para melhorar a fixação ou o crescimento das células e diferenciação do tecido, tais como por revestimento da estrutura com plasma, ou a adição de uma ou mais proteinas (por exemplo, colagénio, fibras elásticas, fibras reticulares), glicoproteinas, glicosaminoglicanos (por exemplo, sulfato de heparina, sulfato de condroitina-4, sulfato de condroitina-6, sulfato de dermatan, sulfato de queratina) , uma matriz celular e/ou outros materiais, tais como, mas não limitados a, gelatina, alginatos, agar, agarose e gomas de planta, entre outros. 60

As estruturas contendo de PPDC são preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas livremente num vaso de cultura para a sub-confluência ou a confluência, levantada a partir da cultura e inoculada na estrutura. Os fatores de crescimento podem ser adicionados ao meio de cultura antes de, durante, ou após a inoculação das células para desencadear a diferenciação e a formação de tecido, se se desejar. Alternativamente, as próprias estruturas podem ser modificadas de modo a que o crescimento de células seja aumentado, ou de modo que o risco de rejeição do implante é reduzido. Assim, um ou mais compostos biologicamente ativos, incluindo, mas não limitado a, anti-inflamatórios, imunossupressores, ou fatores de crescimento, podem ser adicionados à estrutura para libertação local. Métodos de tratamento de Parkinsonismo e condições relacionadas PPDCs, partes de PPDCs, ou populações de células que compreendem PPDCs, ou componentes ou produtos produzidos por PPDCs, podem ser utilizadas numa variedade de formas para suportar e facilitar a reparação e regeneração das células neurais e tecidos, e para melhorar a função neurológica e comportamento, especialmente em pacientes com doença de Parkinson. Tais utilidades englobam métodos in vitro, ex vivo e in vivo. Métodos in vitro e ex vivo:

Numa concretização, os PPDCs podem ser cultivadas in vitro, para produzir produtos biológicos, que são produzidos naturalmente pelas células ou produzidos pelas células quando induzidas a diferenciar-se em linhagens neuronais, ou produzidas pelas células através de modificação 61 genética. Por exemplo, TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MlPlb, MCP1, RANTES, 1309, TARC, MDC, e IL-8 foram encontradas ser segregadas a partir de células derivadas do cordão umbilical cultivadas em meio de crescimento. TIMP1, TPO, KGF, HGF, HBEGF, BDNF, MlPla, MCP-1, RANTES, TARC, Eotaxina e IL-8 foram encontradas ser segregadas a partir de PPDCs derivados da placenta cultivadas em meio de crescimento (ver Exemplos). Alguns destes fatores tróficos, tais como BDNF e IL-6, têm papéis importantes na regeneração neural. Outros fatores tróficos, ainda não detetados ou não examinados, de utilização na reparação e regeneração neural, são suscetíveis de serem produzidos por PPDCs e possivelmente segregados para o meio.

Neste sentido, uma outra forma de realização da invenção, utiliza as caracteristicas dos PPDCs para a produção de meio condicionado, a partir PPDCs indiferenciados ou de PPDCs incubados sob condições que estimulam a diferenciação na linhagem neural. Tais meios condicionados são contemplados para utilização em cultura in vitro ou ex vivo, de células percursoras neurogénicas, ou in vivo para suportar células transplantadas compreendendo populações homogéneas de PPDCs ou populações heterogéneas que compreendem PPDCs e progenitores neuronais, por exemplo.

Ainda outra forma de realização compreende a utilização de lisados celulares de PPDC, frações celulares solúveis ou seus componentes, ou ECM ou componentes dos mesmos, para uma variedade de propósitos. Como mencionado acima, alguns destes componentes podem ser utilizados em composições farmacêuticas. Em outras formas de realização, um lisado celular, meio condicionado, outros derivados de células, ou ECM é utilizado para o revestimento ou de outra forma 62 tratar substâncias ou dispositivos a serem utilizados cirurgicamente, ou por implante, ou para fins ex vivo, para promover a cura ou a sobrevivência das células ou tecidos contactados no decurso de tais tratamentos.

Como descrito nos Exemplos abaixo, os PPDCs demonstraram a capacidade para suportar a sobrevivência, crescimento e diferenciação de células progenitoras neurais adultas quando cultivadas em co-cultura com estas células. Deste modo, noutra concretização, os PPDCs são utilizados vantajosamente em co-culturas in vitro para fornecer suporte trófico para outras células, em particular células neurais e progenitores neuronais. Para a co-cultura, pode ser desejável que os PPDCs e as outras células desejadas sejam co-cultivadas sob condições nas quais os dois tipos de células estejam em contacto. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por inoculação de células, como uma população heterogénea de células em meio de cultura, ou sobre um substrato de cultura adequado. Alternativamente, os PPDCs podem primeiro ser cultivados até à confluência e, em seguida, servir como um substrato para o segundo tipo de célula desejado em cultura. Nesta última forma de realização, as células podem ainda ser fisicamente separadas, por exemplo, por uma membrana, ou outro dispositivo semelhante, de tal modo que o outro tipo de células possa ser removido e usado separadamente após o período de co-cultura. Utilização de PPDCs em co-cultura para promover a expansão e diferenciação dos tipos de células neurais pode encontrar aplicação na pesquisa e em áreas clínicas/terapêuticas. Por exemplo, pode ser utilizado a co-cultura de PPDC para facilitar o crescimento e diferenciação de células neuronais em cultura, para fins de pesquisa de base ou para utilização em ensaios de 63 rastreio de fármacos, por exemplo, a co-cultura de PPDC pode também ser utilizada para a expansão ex vivo de células progenitoras neurais para posterior administração para fins terapêuticos. Por exemplo, as células progenitoras neurais podem ser colhidas a partir de uma co-cultura com PPDCs individual, ex vivo expandida, e depois retornar para esse indivíduo (transferência autóloga) ou outro indivíduo (transferência singeneica ou alogénica). Nestas formas de realização, faz-se observar que, após a expansão ex vivo, a população mista de células compreendendo as PPDCs e progenitores neurais podem ser administrados a um paciente com necessidade de tratamento. Em alternativa, nas situações em que a transferência autóloga é adequada ou desejável, as populações de células co-cultivadas podem ser separadas fisicamente em cultura, permitindo a remoção dos progenitores neurais autólogos para administração ao paciente. Métodos in vivo:

Como apresentado nos Exemplos 16-19, os PPDCs demonstraram ser eficazmente transplantadas para o corpo, e fornecer perda da função neural num modelo animal aceite pela sua previsibilidade da eficácia em seres humanos. Estes resultados suportam as concretizações preferidas da invenção, em que PPDCs são utilizados em terapia celular para o tratamento da doença de Parkinson através da reparação de tecido neural num paciente com doença de Parkinson, em que os PPDCs são utilizados em terapia celular para o tratamento da doença de Parkinson através da regeneração dum tecido neural num paciente com doença de Parkinson e em que os PPDCs são utilizados em terapia celular para o tratamento da doença de Parkinson mediante a melhoria da função neurológica e/ou o comportamento de um paciente com doença de Parkinson. Como apresentado no 64

Exemplo 18, os PPDCs podem ser utilizados para permitir a produção de L-DOPA através da via de tirosinage ou os PPDCs podem permitir o processamento do plasma DOPA em dopamina após uma refeição de aminoácido enriquecido com DOPA. Numa concretização, os PPDCs são transplantadas para um local de destino neuronal no corpo, onde os PPDCs podem diferenciar-se em um ou mais fenótipos neurais ou os PPDCs podem fornecer suporte trófico para os progenitores neuronais e células neurais in situ, ou os PPDCs podem exercer um efeito benéfico em ambas as formas, entre outros.

As concretizações especificas da invenção são dirigidas ao suporte, regeneração ou substituição de neurónios dopaminérgicos (DA) para o tratamento da doença de Parkinson e outras condições que afetam a regiões ricas em DA do cérebro.

Os PPDCs podem ser administrados isoladamente (por exemplo, como populações substancialmente homogéneas), ou como misturas com outras células. Como descrito acima, os PPDCs podem ser administrados como formulado numa preparação farmacêutica com uma matriz ou estrutura, ou com transportadores farmaceuticamente aceitáveis convencionais. Onde os PPDCs são administrados com uma matriz ou estrutura, o agente terapêutico pode ser administrado através de um sistema fechado de GMP manufaturado, que permite a absorção e troca de material. Onde PPDCs são administrados com outras células, podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente com as outras células (quer antes quer depois das outras células). As células que podem ser administrados em conjunto com os PPDCs incluem, mas não estão limitados a, neurónios, astrócitos, oligodendrócitos, células progenitoras neurais, células 65 estaminais neuronais e/ou outras células estaminais multipotentes ou pluripotentes. As células de diferentes tipos podem ser misturadas com os PPDCs imediatamente ou pouco tempo antes da sua administração, ou podem ser co-cultivadas em conjunto durante um periodo de tempo antes da administração.

Os PPDCs podem ser administrados com outros fármacos neuro-benéficos ou moléculas biológicas, ou outros agentes ativos, tais como agentes anti-inflamatórios, agentes anti-apoptóticos, antioxidantes, fatores de crescimento, fatores neurotróficos ou fármacos neuroregenerativos ou neuroprotectores como conhecido na técnica. Quando os PPDCs são administrados com outros agentes, podem ser administrados em conjunto numa única composição farmacêutica ou em composições farmacêuticas separadas, simultânea ou sequencialmente com os outros agentes (quer antes ou depois da administração de outros agentes). Os outros agentes podem ser parte de um regime de tratamento que se inicia antes do transplante e continuando ao longo do curso da recuperação, ou podem ser iniciados no momento da transplantação, ou mesmo após a transplantação, tal como um médico perito na técnica considere apropriado. 0 regime de tratamento pode incluir a estimulação elétrica, antes, durante ou após o transplante.

Exemplos de outros componentes que podem ser administradas com os PPDCs incluem, mas não estão limitados a: (1) ou outros fármacos neuroprotectores ou neurobeneficiais; (2), componentes da matriz extracelular selecionados, tais como um ou mais tipos de colagénio conhecidos na técnica, e/ou fatores de crescimento, plasma rico em plaquetas, e fármacos (em alternativa, os PPDCs podem ser geneticamente 66 modificados para expressar e produzir fatores de crescimento); (3) agentes anti-apoptóticos (por exemplo, eritropoetina (EPO), EPO mimetibody, trombopoietina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF)-I, IGF-II, fator de crescimento de hepatócitos, inibidores de caspase); (4) compostos anti-inflamatórios (por exemplo, inibidores de quinase p38 ΜΔΡ, inibidores de TGF-beta, estatinas, inibidores de IL-6 e IL-1, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS, e fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (NSAIDs) (tais como TEPOXALINA, TOLMETINA, e SUPROFENO); (5) , agentes imunossupressores ou imunomoduladores, tais como os inibidores de calcineurina, inibidores de mTOR, antiproliferativos, corticosteroides e vários anticorpos; (6) antioxidantes tais como o probucol, vitaminas C e E, conenzima Q-10, glutationa, L-cisteina e N-acetilcisteina; e (6) anestésicos locais, para citar apenas alguns.

Numa forma de realização, os PPDCs são administrados como células indiferenciadas, ou seja, como em cultura em meio de crescimento. Alternativamente, os PPDCs podem ser administrados após a exposição à cultura em condições que estimulam a diferenciação para um fenótipo neuronal desejado, por exemplo, astrócitos, oligodendrócitos, ou neurónios, e mais especificamente, neurónios serotoninérgicos, dopaminérgicos, colinérgicos, GABA-érgicos ou glutamatérgicos (ver, por exemplo, Isacson, 0., (2003) The Lancet (Neurology) 2:417-424).

As células da invenção podem ser implantadas cirurgicamente, injetadas, entregues (por exemplo, por meio de um cateter ou seringa), ou administradas direta ou indiretamente para o local do dano neurológico ou sofrimento. As vias de administração das células da 67 invenção ou composições destes incluem, mas não estão limitadas à via de administração, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intranasal, intracerebral, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal, intracisternal, intra-ocular, intra-espinal e/ou peri-espinal pela entrega através de agulhas intracranianas ou intervertebrais e/ou cateteres com ou sem dispositivos de bomba.

Quando as células são administradas em dispositivos semissólidos ou sólidos, a implantação cirúrgica num local exato no corpo é tipicamente uma forma de administração adequada. As composições farmacêuticas liquidas ou de fluido, no entanto, podem ser administradas num local mais geral, no SNC ou SNP (por exemplo, ao longo de uma área difusa afetada, tal como seria o caso na doença de Parkinson ou a lesão isquémica difusa), na medida em as células progenitoras neurais têm mostrado ser capazes de vasta migração de um ponto de entrada para o sistema nervoso a um determinado local, por exemplo, seguindo a glia radial ou através da resposta a sinais químicos.

As células derivadas de pós-parto ou as composições e/ou matrizes compreendendo as células derivados pós-parto podem ser entregues no local através de um micro-cateter, intracateterização, shunt, cânula, ou através de uma minibomba. As composições e/ou matrizes, também poderiam ser indiretamente entregues à substancia nigra ou estriado através da entrega intratecal, ou intracerebroventricular, ou por administração intranasal. 0 veículo excipiente ou transportador pode ser qualquer um dos conhecidos como sendo farmaceuticamente aceitáveis para administração a um paciente, particularmente localmente no local em que a 68 diferenciação celular é para ser induzida. Exemplos incluem meios liquidos, por exemplo, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (MEMD), solução salina estéril, solução salina estéril tamponada com fosfato, meio de Leibovitz (L15, Invitrogen, Carlsbad, CA), dextrose em água estéril, ou qualquer outro liquido fisiologicamente aceitável.

Um método preferido de entrega para a substantia nigra ou estriado é intratecal ou intracerebroventricular, por exemplo, um reservatório Ommaya de acordo com técnicas conhecidas, tais como as ensinadas em F. Balis e D. Poplack (1989) Am. J. Pediatric Hematol. Oncol. 11 (1):74-86. Um método ainda mais preferido de entrega na substantia nigra ou estriado é por injeção direta intraparenquimatosa através de um micro-cateter.

Outras formas de realização abrangem métodos de tratamento da doença de Parkinson por administração de composições terapêuticas que compreendem um veiculo farmaceuticamente aceitável e componentes celulares PPDC (por exemplo, lisados celulares ou componentes destes) ou produtos (por exemplo, fatores tróficos e outros fatores biológicos produzidos naturalmente por PPDCs ou através de modificação genética, meio condicionado de cultura PPDC), ou meio de crescimento PPDC ou produtos purificados a partir do meio de crescimento. De novo, esses métodos podem compreender ainda a administração de outros agentes ativos, tais como fatores de crescimento, fatores neurotróficos ou fármacos neuroregenerativos ou neuroprotectores tal como é conhecido na técnica. 69

As formas de dosagem e os regimes para a administração de PPDCs ou qualquer das outras composições terapêuticas ou farmacêuticas aqui descritas são elaboradas de acordo com a boa prática médica, tendo em conta a condição individual do paciente, por exemplo, natureza e extensão do dano neurológico da doença de Parkinson, idade, sexo, peso corporal e condição médica geral, e outros fatores conhecidos dos praticantes médicos. Assim, a quantidade eficaz de uma composição farmacêutica a ser administrada a um paciente é determinada por estas considerações, como conhecido na técnica.

Porque o SNC é um tecido ligeiramente immunoprivilegiado pode não ser necessário ou desejável imunossuprimir um paciente antes do inicio da terapia celular com PPDCs. Além disso, tal como estabelecido no Exemplo 11, os PPDCs não foram mostrados estimular PBMC alogénicas na reação mista de linfócitos. Por conseguinte, com o transplante alogénico ou mesmo xenogénico, os PPDCs podem ser tolerados em algumas circunstâncias. Em algumas concretizações, os próprios PPDCs proporcionam um efeito imunossupressor, impedindo assim a rejeição do hospedeiro aos PPDCs transplantados e permitindo que as células transplantadas se mantenham vivas durante pelo menos dois meses após a administração. Em tais casos, a imunossupressão farmacológica durante o tratamento de células pode não ser necessária.

No entanto, noutras situações, pode ser desejável ou apropriado imunossuprimir farmacologicamente um paciente antes de se iniciar a terapia celular. Isto pode ser conseguido através do uso de agentes imunossupressores sistémicos ou locais, ou pode ser conseguido por entrega de 70 células num dispositivo encapsulado, como descrito acima. Estes e outros meios para reduzir ou eliminar uma resposta imunitária às células transplantadas são conhecidos na técnica. Como uma alternativa, os PPDCs podem ser geneticamente modificados para reduzir a sua imunogenicidade, conforme mencionado acima. A sobrevivência de PPDCs transplantados num paciente vivo pode ser determinada através da utilização de uma variedade de técnicas, por exemplo, a tomografia axial computadorizada (TAC ou TC) , imagiologia por ressonância magnética (MRI) ou tomografia de emissão de positrões (PET) de digitalização. A determinação da sobrevivência do transplante também pode ser feita post-mortem através da remoção do tecido neural e examinando-o visualmente ou por meio de um microscópio. Alternativamente, as células podem ser tratadas com as manchas que são específicos para as células neuronais ou os produtos derivados, por exemplo, os neurotransmissores. As células transplantadas podem também ser identificadas através da incorporação prévia de corantes marcadores, tais como a rodamina ou microesferas de marcação de fluoresceina, azul rápido, microparticulas férricos, bisbenzamide ou produtos de genes repórter introduzidos geneticamente, tais como a beta-galactosidase ou beta-glucuronidase. A integração funcional de PPDCs transplantadas no tecido neural de um sujeito pode ser avaliada por exame da restauração da função que foi danificada ou que se encontra doente. Tais funções incluem, mas não estão limitados a funções motoras, cognitivas, sensoriais e do sistema endócrino, em conformidade com procedimentos bem conhecidos dos neurobiologistas e médicos. 71

Kits e bancos que compõem PPDCs, componentes ou produtos PPDCs

Num outro aspeto, a invenção proporciona kits que utilizam os PPDCs, populações de PPDCs, componentes e produtos da PPDCs em vários métodos para a regeneração e reparação neural, e em métodos para o tratamento de parkinsonismo e condições relacionadas, como descrito acima. Quando utilizado para o tratamento da doença de Parkinson ou outro tratamento programado, os kits podem incluir uma ou mais populações de células, incluindo, pelo menos, PPDCs e um transportador farmaceuticamente aceitável (liquido, sólido ou semissólido). Os kits também podem incluir, opcionalmente, um meio de administração das células, por exemplo por injeção. Os kits podem ainda incluir instruções para a utilização das células.

Os exemplos que se seguem descrevem vários aspetos de formas de realização da invenção em maior detalhe. Estes exemplos destinam-se a ilustrar adicionalmente, não a limitar, os aspetos da invenção aqui descrita.

As seguintes abreviaturas podem ser utilizadas na especificação e exemplos: células pós-parto PPDC; UDC, células derivadas do cordão umbilical; PDC, as células derivadas da placenta; ANG2 (ou Ang2) para angiopoietina 2; APC para as células apresentadoras de antigénio; BDNF para fator neurotrófico derivado do cérebro; bFGF para fator básico de crescimento de fibroblastos; bid (BID) para o "bis in die" (duas vezes por dia); CK18 para citoqueratina 18; CNS para sistema nervoso central; ligante 3 CXC para o ligante receptor de quimiocinas 3; DMEM para Meio essencial minimo de Dulbecco; DMEM: lg (ou DMEM: Lg, DMEM: LG) para DMEM com baixa glicose; EDTA para ácido 72 etilenodiaminotetracético; EGF (ou E) para o fator de crescimento epidérmico; FACS para seleção de células cativadas fluorescentes; FBS soro fetal de bovino; FGF (ou F) para fator de crescimento de fibroblastos; GCP-2 para proteina quimiotáctica de granulócitos-2; GFAP para proteina ácida fibrilar glial, HB-EGF para fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina; HCAEC para células endoteliais coronárias humanas; HGF para fator de crescimento de hepatócitos; hMSC para células estaminais mesenquimais humanas; HNF-lalfa para o factor de transcrição 1 alfa especifico de hepatócitos; HUVEC para células endoteliais da veia umbilical humana; 1309 para uma quimiocina e o ligando para o receptor CCR8; IGF-1 fator 1 de crescimento semelhante à insulina; IL-6 para interleucina-6, IL-8 para interleucina 8; K19 para queratina 19; K8 para queratina 8; KGF para o fator de crescimento de queratinócitos; LIF para o fator inibidor de leucemia; MBP para proteina básica de mielina; MCP-1 para proteina quimiotática de monócitos 1; MDC para macrófagos derivados de quimiocinas; MlPlalpha para macrófago inflamatório proteina alfa 1; MlPlbeta para proteina beta de macrófago inflamatório; MMP para matriz de metaloproteases (MMP); MSC para células estaminais mesenquimais; NHDF para fibroblastos dérmicos humanos normais; NPE para meio de expansão de progenitoras neurais; 04 para marcador de diferenciação de oligodendrócitos ou glial 04; PBMC para células mononucleares do sangue periférico; PBS para tampão fosfato salino; PDGFbb para fator de crescimento derivado das plaquetas; PO para "per os" (pela boca) ; PNS para sistema nervoso periférico; Rantes (ou RANTES) para regular a ativação de células T normais expressas e segregadas; rhGDF-5 para crescimento humano recombinante e fator de diferenciação 5; SC por via subcutânea; SDF-1 alfa fator 73 estromal derivado de alfa-1; SHH para hedgehog sónico; POP procedimento operacional padrão; TARC para timo e ativação regulamentada de quimiocinas; TCP para cultura de tecidos em plástico; TCPS para cultura de tecidos em poliestireno; TGFbeta2 para fator transformador de crescimento beta 2; TGF-beta 3 para o fator transformador de crescimento beta-3; TIMP1 para o tecido inibidor da matriz de metaloproteinase 1; TPO para trombopoietina; TuJl para BetalII Tubulina; VEGF para o fator de crescimento endotelial vascular; vWF para o fator de von Willebrand; e alphaFP para alfa-fetoproteina.

Tal como utilizados nos exemplos seguintes e em todo a descrição, o termo Meio de Crescimento refere-se geralmente a um meio suficiente para a cultura de PPDCs. Em particular, presentemente um meio preferido para a cultura de células da invenção compreende, meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM, também abreviado aqui). Particularmente preferido é DMEM de baixa glicose (também aqui DMEM-LG) (Invitrogen, Carlsbad, CA) . 0 DMEM de baixa glucose é, de preferência, suplementado com 15% (v/v) de soro fetal bovino (por exemplo, soro de bovino fetal definido, Hyclone, Logan UT) , antibiótico/antimicótico ((de preferência 50-100 unidades/ml de penicilina, 50-100 microgramas/ml de estreptomicina, e 0-0,25 microgramas/ml de anfotericina B, Invitrogen, Carlsbad, CA)), e 0,001% (v/v) de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO). Tal como utilizado nos Exemplos a seguir, Meio de Crescimento refere-se a DMEM de baixa glucose com 15% de soro fetal bovino e antibióticos/antimicóticos (quando a penicilina/ estreptomicina estão incluídas, é de preferência 50 U/ml e 50 microgramas/ml, respectivamente, quando a penicilina/ estreptomicina/anfotericina B são utilizadas, esta é de 74 preferência 100 U mililitro, 100 microgramas/mililitro e 0,25 microgramas/ml, respectivamente). Em alguns casos, são utilizados meios de crescimento diferentes, ou são fornecidas diferentes suplementações, e estas são normalmente indicadas no texto como suplementação do Meio de Crescimento.

Também relacionados com os seguintes exemplos e usado em outras partes da especificação, o termo condições de crescimento padrão refere-se à cultura de células a 37°C, numa atmosfera padrão compreendendo 5% de CO2. Enquanto precede as condições são úteis para a cultura, é para ser entendido que tais condições são capazes de ser variadas pelo perito na técnica que irá apreciar as opções disponíveis na técnica para cultura de células. EXEMPLO 1

Derivação de células a partir de tecido pós-parto

Este exemplo descreve a preparação de células derivados do pós-parto a partir de tecidos da placenta e do cordão umbilical. Cordões umbilicais e placentas pós-parto foram obtidos após o nascimento quer de uma gravidez de termo quer de uma gravidez de pré-termo. As células foram colhidas a partir de 5 dadores separados de tecido umbilical e placenta. Diferentes métodos de isolamento de células foram testados quanto à sua capacidade para produzir células com: 1) o potencial para se diferenciarem em células com diferentes fenótipos, uma característica comum às células estaminais, ou 2) o potencial de fornecer factores tróficos úteis para outras células e tecidos. 75 Métodos e Materiais

Isolamento das células umbilicais. Os cordões umbilicais foram obtidos a partir de National Disease Research Interchange (NDRI, Filadélfia, PA) . Os tecidos foram obtidos após partos normais. 0 protocolo de isolamento de células foi realizado assepticamente numa câmara de fluxo laminar. Para remover o sangue e os detritos, o cordão foi lavado em solução salina tamponada com fosfato (PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) na presença de antibiótico e antimicótico (100 unidades/ml de penicilina, 100 microgramas/ml de estreptomicina, 0,25 microgramas/ml de anfotericina B) . Os tecidos foram então dissociados mecanicamente em placas de cultura de tecidos de 150 cm2, na presença de 50 ml de meio (DMEM de baixa concentração de glucose ou DMEM de alta concentração de glucose, Invitrogen), até que o tecido ser picado numa pasta fina. Os tecidos picados foram transferidos para tubos cónicos de 50 mililitros (aproximadamente 5 gramas de tecido por tubo). O tecido foi então digerido em qualquer meio DMEM de baixa glucose ou meio DMEM meio de elevada glucose, cada um contendo antimicótico e antibióticos, como descrito acima. Em algumas experiências, foi utilizada uma mistura de enzimas de colagenase e dispase ("C: D;" colagenase (Sigma, St. Louis, MO), 500 Unidades/mililitro, e dispase (Invitrogen), 50 unidades/mililitro em meio DMEM: - meio de baixa glucose). Em outras experiências uma mistura de colagenase, dispase e hialuronidase, ("C: D: H") foi usada (colagenase, 500 Unidades/mililitro, dispase, 50 unidades/ mililitro, e hialuronidase (Sigma), 5 unidades/mililitro, em meio DMEM:-baixa glucose). Os tubos cónicos contendo o tecido, o meio e as enzimas de digestão foram incubados a 37°C num agitador orbital (Environ, Brooklyn, NY) a 225 rpm durante 2 horas. 76

Após a digestão, os tecidos foram centrifugadas a 150 x g durante 5 minutos, o sobrenadante foi aspirado. O sedimento foi ressuspenso em 20 ml de Meio de Crescimento (DMEM: baixa glucose (Invitrogen) , 15 por cento (v/v) de soro fetal bovino (FBS; soro bovino definido; Lote # AND18475; Hyclone, Logan, UT), 0,001% (v/v) de 2-mercaptoetanol (Sigma) , 1 ml por 100 ml de antibiótico/antimicótico, como descrito acima. A suspensão celular foi filtrada através de um coador de células de nylon de 70 micrómetros (BD Biosciences). Um adicional de enxaguamento de 5 mililitros compreendendo Meio de Crescimento foi passado através do filtro. A suspensão de células foi então passada através de um filtro de células de nylon de 40 micrómetros (BD Biosciences) e lavadas com um enxaguamento adicional de 5 ml de Meio de Crescimento. 0 filtrado foi ressuspenso em Meio de Crescimento (volume total de 50 ml) e centrifugado a 150 x g durante 5 minutos. 0 sobrenadante foi aspirado e as células foram ressuspensas em 50 ml de Meio de Crescimento fresco. Este processo foi repetido mais duas vezes.

Após a centrifugação final, o sobrenadante foi aspirado e o sedimento celular foi ressuspenso em 5 ml de Meio de Crescimento fresco. 0 número de células viáveis foi determinado utilizando coloração com azul de tripano. As células foram então cultivadas sob condições padrão.

As células isoladas a partir de cordões umbilicais foram semeadas a 5000 células/cm 2 frascos T-75 cm2 revestidos com gelatina (Corning Inc., Corning, NY, EUA) em Meio de Crescimento com antibióticos/antimicóticos, como descrito 77 acima. Após 2 dias (em várias experiências, as células foram incubadas 2-4 dias) , o meio gasto foi aspirado dos frascos. As células foram lavadas três vezes com PBS para remover os detritos e as células derivadas do sangue. As células foram então colocadas com Meio de Crescimento e deixadas crescer até à confluência (aproximadamente 10 dias após a passagem 0) para a passagem 1. Em passagens subsequentes (da passagem de 1 a 2 e assim por diante) , as células atingiram a sub-confluência (75-85 por cento de confluência) em 4-5 dias. Para estas passagens subsequentes, as células foram semeadas a 5000 células/cm2. As células foram cultivadas numa incubadora humidificada com 5 por cento de dióxido de carbono e oxigénio atmosférico, a 37°C.

Isolamento de células da placenta. O tecido foi obtido a partir da placenta NDRI (Philadelphia, PA). Os tecidos eram de uma gravidez e foram obtidos no momento do parto cirúrgico normal. As células foram isoladas da placenta, como descrito para o isolamento de células umbilicais. O exemplo que se segue aplica-se ao isolamento de populações distintas de células derivadas maternas e derivadas neonatais a partir do tecido placentário. O protocolo de isolamento de células foi realizado assepticamente numa câmara de fluxo laminar. O tecido placentário foi lavado em solução salina tamponada com fosfato (PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) na presença de antibiótico e antimicótico (como descrito acima) para remover o sangue e detritos. O tecido placentário foi então dissecado em três seções: linha de topo (lado neonatal ou 78 aspecto), linha central (isolamento de células mistas neonatais e maternas) e linha de fundo (lado materno ou aspecto).

As secções separadas foram lavadas individualmente várias vezes em PBS com antibiótico/antimicótico para remover mais sangue e detritos. Cada secção foi então dissociada mecanicamente em placas de cultura de tecidos de 150 cm2, na presença de 50 ml de DMEM/baixa glucose, numa pasta fina. A pasta foi transferida para tubos cónicos de 50 mililitros. Cada tubo continha, aproximadamente, 5 gramas de tecido. O tecido foi digerido quer em meio DMEM de baixa glucose quer em meio DMEM de elevada glucose contendo antimicótico e antibiótico (100 U/ml de penicilina, 100 micrograma/ml de estreptomicina, 0,25 microgramas/ml de anfotericina B) e as enzimas de digestão. Em algumas experiências foi utilizada uma mistura enzimática de colagenase e dispase ("C: D") contendo colagenase (Sigma,

St. Louis, MO) a 500 unidades/ml e dispase (Invitrogen) a 50 unidades/mililitro em meio DMEM de baixa glucose. Em outras experiências, foi utilizada uma mistura de colagenase, dispase e hialuronidase (C: D: H) (colagenase, 500 unidades/mililitro; dispase, 50 unidades/mililitro, e hialuronidase (Sigma), 5 unidades/mililitro em DMEM-baixa glucose) . Os tubos cónicos contendo o tecido, o meio e as enzimas de digestão foram incubadas durante 2 h a 37°C num agitador orbital (Environ, Brooklyn, NY) a 225 rpm.

Após a digestão, os tecidos foram centrifugados a 150 x g durante 5 minutos, o sobrenadante resultante foi aspirado. O sedimento foi ressuspenso em 20 ml de Meio de Crescimento com penicilina/estreptomicina/anfotericina B. A suspensão de células foi filtrada através de coador de células de 79 nylon de 70 micrómetros (BD Biosciences), enxaguadas com uma lavagem com um adicional de 5 ml de Meio de Crescimento. A suspensão celular total foi passada através de um coador de células de nylon de 40 micrómetros (BD Biosciences), seguido de um enxaguamento adicional de 5 ml de Meio de Crescimento. O filtrado foi ressuspenso em Meio de Crescimento (volume total de 50 ml) e centrifugado a 150 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi aspirado e o sedimento de células foi ressuspenso em 50 ml de Meio de Crescimento fresco. Este processo foi repetido mais duas vezes. Após a centrifugação final, o sobrenadante foi aspirado e o sedimento celular foi ressuspenso em 5 ml de Meio de Crescimento fresco. Uma contagem de células foi determinada utilizando o teste de exclusão com azul de tripano. As células foram então cultivadas em condições padrão.

Isolamento celular LIBERÀSE. As células foram isoladas a partir de tecidos umbilicais em meio DMEM de baixa glucose com LIBERÀSE (Boehringer Mannheim Corp, Indianapolis, IN) (2,5 miligramas por mililitro, Blendzyme 3; Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN) e hialuronidase (5 unidades/ mililitro, Sigma). A digestão do tecido e o isolamento das células foi como descrito acima para outras digestões com protease, utilizando a mistura de LIBERASE/hialuronidase no lugar da mistura de enzimas C:D ou C: D: Η. A digestão do tecido com LIBERÀSE resultou no isolamento de populações de células a partir de tecidos pós-parto que expandiram prontamente. 80

Isolamento das células utilizando outras combinações de enzimas. Os procedimentos foram comparados para as células isoladas provenientes do cordão umbilical utilizando combinações de enzimas diferentes. Enzimas comparadas para a digestão incluiram: i) colagenase; ii) dispase; iii) hialuronidase; iv) mistura colagenase:dispase (C, D); v) mistura colagenase:hialuronidase (C: H) ; vi) mistura dispase:hialuronidase (D: H) ; e vii) mistura colagenase: dispase:hialuronidase (C: D: H). Foram observadas diferenças no isolamento de células que utilizam estas diferentes condições de digestão com enzima (Tabela 1-1).

Tabela 1-1: Isolamento de células do tecido do cordão umbilical usando várias combinações de enzimas

Enzimas de digestão Células isoladas Expansão celular Colagenase X X Dispase + (>10 h) + Hialuronidase X X Colagenase:dispase ++ (<3 h) ++ Colagenase:hialuronidase ++ (<3 h) + Dispase:hialuronidase + (>10 h) + colagenase: dispase:hialuronidase +++ (<3 h) +++ Chave: + = bom, ++ = muito bom, +++ = excelente, X = sem sucesso nas condições testadas O isolamento de células de sangue residual nos cordões.

Outras tentativas foram feitas para isolar a partir de bancos de células do cordão umbilical por diferentes abordagens. Num exemplo o cordão umbilical foi cortado e lavado com meio de crescimento para desalojar os coágulos de sangue e material gelatinoso. A mistura de sangue, o 81 material gelatinoso e o Meio de Crescimento foi recolhido e centrifugado a 150 x g. O sedimento foi ressuspenso e semeado em frascos revestidos de gelatina em Meio de Crescimento. A partir destas experiências uma população de células foi isolada facilmente expandida.

Isolamento de células do sangue do cordão umbilical. As células foram também isoladas a partir de amostras de sangue de cordão obtidas a partir DE NDRI. 0 protocolo de isolamento aqui utilizado foi o do Pedido de Patente Internacional US0229971 de Ho et al (Ho, TW et al., W02003025149 A2) As amostras (50 ml e 10,5 ml, respectivamente) de sangue de cordão umbilical (NDRI, Filadélfia, PA) foram misturadas com um tampão de lise (esterilizado por filtração, 155 mM de cloreto de amónio, 10 milimolar de bicarbonato de potássio, 0,1 milimolar de EDTA tamponado a pH 7,2 (todos os componentes de Sigma, St. Louis, MO)) . As células foram lisadas numa razão de 1:20 sangue do cordão umbilical para tampão de lise. A suspensão de células resultante foi agitada em vórtex durante 5 segundos e incubada durante 2 minutos à temperatura ambiente. O lisado foi centrifugado (10 minutos a 200 x g). O sedimento celular foi ressuspenso em meio essencial minimo completo (Gibco, Carlsbad CA), contendo 10 por cento de soro fetal bovino (Hyclone, Logan UT) , 4 milimolar de glutamina (Mediatech Herndon, VA) , 100 unidades de penicilina por 100 ml e 100 microgramas de estreptomicina por 100 mililitros (Gibco, Carlsbad, CA). As células ressuspensas foram centrifugadas (10 minutos a 200 x g), o sobrenadante foi aspirado e o sedimento celular foi lavado em meio completo. As células foram semeadas directamente guer em frascos T75 (Corning, Nova Iorque) , quer em frascos 82 Τ75 revestidos de laminina ou frascos T175 revestidos de fibronectina (ambos da Becton Dickinson, Bedford, MA).

Isolamento de células utilizando diferentes combinações de enzimas e condições de crescimento. Para determinar se as populações de células podem ser isoladas em condições diferentes e expandidas sob uma variedade de condições, imediatamente após o isolamento, as células foram digeridas em Meio de Crescimento com ou sem 0,001 por cento (v/v) de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO), usando a combinação de enzimas de C: D: H, de acordo com os procedimentos fornecidos acima. As células derivadas da placenta assim isoladas foram semeadas sob uma variedade de condições. Todas as células foram cultivadas na presença de penicilina/estreptomicina. (Tabela 1-2). 83

Tabela 1-2: Isolamento e expansão da cultura de células do pós-parto sob várias condições

Condição Meio 15% FBS BME Gelatina 20% 02 Factores de crescimento 1 DMEM- Lg Y Y Y Y N 2 DMEM- Lg Y Y Y N (5%) N 3 DMEM- Lg Y Y N Y N 4 DMEM- Lg Y Y N N (5%) N 5 DMEM- Lg N (2%) Y N (Laminina) Y EGF/FGF (20ng/mL) 6 DMEM- Lg N (2%) Y N (Laminina) N (5%) EGF/FGF (20ng/mL) 7 DMEM- Lg N (2%) Y N (Fibrone) Y PDGF/VEGF 8 DMEM- Lg N (2%) Y N (Fibrone) N (5%) PDGF/VEGF 9 DMEM- Lg Y N Y Y N 10 DMEM- Lg Y N Y N (5%) N 84

Condição Meio 15% FBS BME Gelatina 20% 02 Factores de crescimento 11 DMEM- Lg Y N N Y N 12 DMEM- Lg Y N Y N (5%) N 13 DMEM- Lg N (2%) N N (Laminina) Y EGF/FGF (20 ng/mL) 14 DMEM- Lg N (2%) N N (Laminina) N (5%) EGF/FGF (20 ng/mL) 15 DMEM- Lg N (2%) N N (Fibrone) Y PDGF/VEGF 16 DMEM- Lg N (2%) N N (Fibrone) N (5%) PDGF/VEGF Isolamento de células usanc o diferentes com binações de enzimas e condições de crescimento. Em todas as condições AS células associaram e expandiram bem entre a passagem 0 e 1 (Tabela 1-2) . Células em condições 5-8 e 13-16 foram demonstradas proliferar bem até quatro passagens após a cultura no ponto em que foram criopreservadas e depositadas.

Resultados

Isolamento de células utilizando diferentes combinações de enzimas. A combinação de C: D: H, proporcionou o melhor rendimento celular após o isolamento, e as células geradas cresceram por muitas mais gerações em cultura do que as outras condições (Tabela 1). Uma população de células expansíveis não foi atingida usando colagenase ou hialuronidase isoladamente. Nenhuma tentativa foi feita 85 para determinar se foi testado o resultado especifico para o colagénio.

Isolamento de células utilizando diferentes combinações de enzimas e condições de crescimento. As células ligaram-se e expandiram-se bem entre a passagem 0 e 1, sob todas as condições testadas para a digestão enzimática e crescimento (Tabela 2) . As células em condições experimentais, 5-8 e 13-16 proliferaram bem até quatro passagens após a cultura, em cujo ponto foram criopreservadas. Todas as células foram depositadas para uma investigação mais aprofundada.

Isolamento de células de sangue residual nos cordões. As células nucleadas ligaram-se e cresceram rapidamente. Estas células foram analisadas por citometria de fluxo e eram semelhantes às células obtidas por digestão enzimática. O isolamento de células do cordão umbilical. As preparações continham glóbulos vermelhos e plaquetas. Não foram ligadas células nucleadas e divididas, durante as primeiras 3 semanas. 0 meio foi mudado de 3 semanas após a cultura e não foram observadas células a ligarem-se e a crescer.

Resumo. As populações de células podem ser derivadas a partir de tecido do cordão umbilical e da placenta de forma eficiente usando a combinação de enzimas colagenase (uma matriz de metaloprotease), dispase (de uma protease neutra) e hialuronidase (uma enzima mucolitica que decompõe o ácido hialurónico). LIBERASE, o qual é um Blendzyme, pode também ser utilizado. Especificamente, Blendzyme 3, que é colagenase (4 unidades Wunsch/g) e termolisina (1714 unidades/g de caserna) foi também usada em conjunto com hialuronidase para isolar as células. Estas células 86 expandiram-se prontamente ao longo das ditas passagens, quando cultivadas em Meio de Crescimento de plástico revestido de gelatina.

As células também foram isoladas a partir de sangue residual nos cordões, mas não de sangue do cordão umbilical. A presença de células nos coágulos sanguíneos lavados a partir do tecido, que aderem e crescem sob as condições utilizadas, pode ser devido às células libertadas durante o processo de dissecção. EXEMPLO 2

Caracteristicas de crescimento das células derivadas do pós-parto 0 potencial de expansão das células derivadas do pós-parto (PPDCs) das células foi comparado a outras populações de células estaminais isoladas. 0 processo de expansão das células até à senescência é conhecido como limite de Hayflick (Hayflick L. 1974a, 1974b). As células derivadas do pós-parto são altamente adequadas para utilização terapêutica, porque podem ser facilmente expandidas para um número de células suficiente.

Materiais e Métodos

Frascos revestidos de gelatina. Frascos plásticos de cultura de tecidos foram revestidas por adição de 20 ml de 2% (p/v) de gelatina porcina (Tipo B: 225 Bloom, Sigma, St. Louis, MO) para um balão T75 (Corning, Corning, NY) durante 20 minutos à temperatura ambiente. Após a remoção da solução de gelatina, foi adicionado 10 ml de fosfato tamponado salino (PBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) e em seguida aspirado. 87

Comparação do potencial de expansão de PPDCs com outras populações de células Para a comparação do potencial de expansão do crescimento das seguintes populações de células foi utilizada: i) células estaminais mesenquimais (MSC; Cambrex, Walkersville, MD); ii) células derivadas de tecido adiposo (Patente US 6555374 Bl, Pedido de Patente US 20040058412); iii) fibroblastos normais da pele (cc-2509 lote # 9F0844; Cambrex, Walkersville, MD); iv) células umbilicais derivadas; e v) células derivadas da placenta. As células foram inicialmente semeadas a 5000 células/cm2 sobre frascos T75 revestidos com gelatina em Meio de Crescimento com penicilina/estreptomicina/ anfotericina B. Para as passagens subsequentes, as culturas de células foram tratadas como se segue. Após a tripsinação, as células viáveis foram contadas após coloração com azul de tripano. A suspensão celular (50 microlitros) foi combinada com azul de tripano (50 ml, Sigma, St. Louis, MO) . Os números de células viáveis foram calculados utilizando um hemocitómetro.

Após a contagem, as células foram semeadas a 5000 células/cm2 em frascos T 75 revestidos de gelatina em 25 ml de Meio de Crescimento fresco. As células foram cultivadas sob condições padrão, a 37°C. O Meio de Crescimento foi mudado duas vezes por semana. Quando as células atingiram cerca de 85 porcento de confluência foram passadas; o processo foi repetido até as células atingirem a senescência.

Em cada passagem, as células foram tratadas com tripsina e contadas. Foram calculados o rendimento de células viáveis, duplicação da população [In (célula final/célula inicial)/ln 2], e tempo de duplicação (tempo em cultura 88 (h)/duplicação da população) . Para efeitos de determinação da expansão celular óptima, o rendimento total de células por passagem foi determinado multiplicando o rendimento total pela passagem prévia pelo factor de expansão para cada passagem (isto é, factor de expansão = célula final/ célula inicial).

Potencial de expansão dos bancos de células de baixa densidade. 0 potencial de expansão das células depositadas na passagem 10 também foi testado, utilizando-se um conjunto diferente de condições. Foram testados fibroblastos dérmicos de pele normal (CC-2509 Lote # 9F0844; Cambrex, Walkersville, MD), células derivadas do umbigo e células derivadas da placenta. Estas populações celulares foram depositadas na passagem 10 anteriormente, tendo sido cultivadas em 5000 células/cm2 e cresidas até à confluência em cada passagem até esse ponto. O efeito da densidade celular nas populações de células após descongelamento das células na passagem 10 foi determinado. As células foram descongeladas em condições padrão e contadas utilizando coloração com azul de tripano. As células descongeladas foram então semeadas a 1000 células/cm2 em DMEM: Meio de Crescimento de baixa glucose com antibiótico/antimicótico, como descrito acima. As células foram cultivadas sob condições atmosféricas normais, a 37 °C. O Meio de Crescimento foi mudado duas vezes por semana e as células foram passadas até que atingiram cerca de 85% de confluência. As células foram subsequentemente passadas até à senescência, ou seja, até que não poderem ser mais expandidas. As células foram tratadas com tripsina e contadas em cada passagem. 0 rendimento das células, a duplicação da população (In (célula inicial/célula final/In 2) e duplicação do tempo (o tempo em cultura (h)/duplicação da população). O rendimento 89 total de células por passagem foi determinado multiplicando-se a produção total para a passagem anterior pelo fator de expansão para cada passagem (ou seja, fator de expansão = célula final/célula inicial).

Expansão da PPDCs a baixa densidade da cultura de células inicial. 0 potencial de expansão de PPDCs recém-isolados sob condições cultura baixa de células foi testado. Os PPDCs foram preparados tal como aqui descrito. As células foram semeadas a 1000 células/cm2 e passadas como descrito acima, até à senescência. As células foram cultivadas sob condições atmosféricas normais, a 37°C. O Meio de Crescimento foi mudado duas vezes por semana. As células foram passadas quando atingiram cerca de 85% de confluência. A cada passagem, as células foram tratadas com tripsina e contadas por coloração com azul de tripano. O rendimento das células, a duplicação da população (In (célula final/célula inicial)/In 2) e o tempo de duplicação (tempo em cultura (h)/duplicação da população) foram calculados para cada passagem. O rendimento total de células por passagem foi determinado multiplicando o rendimento total para a passagem prévia pelo factor de expansão para cada passagem (isto é, factor de expansão = celular final/célula inicial). As células foram cultivadas em frascos revestidos de gelatina e não revestidos de gelatina.

Expansão das células neonatais clonais derivadas da placenta. A clonagem foi utilizada a fim de expandir uma população de células neonatais a partir de tecido placentário. Após o isolamento de três populações de células diferenciadas a partir da placenta (como aqui descrito) , estas populações de células foram expandidas sob condições de crescimento padrão e, em seguida cariotipadas para revelar a identidade das populações de células 90 isoladas. Como as células foram isoladas de uma mãe que deu à luz um menino, era fácil distinguir entre os cromossomos masculinos e femininos através da realização de metáfase. Estas experiências demonstraram que o aspecto das células fetais era de cariótipo positivo para o fenótipo neonatal, as células da camada média eram de cariótipo positivo para ambos os fenótipos neonatal e materno e células de aspecto maternal eram de cariótipo positivo para as células maternas.

Expansão de células em condições de cultura de baixo oxigénio. Demonstrou-se que a cultura de células em condições de baixo oxigénio pode melhorar a expansão das células, em certas circunstâncias (US20040005704). Para determinar se a expansão das células de PPDCs poderia ser melhorada, alterando as condições de cultura de células, culturas de células derivadas do cordão umbilical foram cultivadas em condições de baixa de oxigénio. As células foram semeadas em 5000 células/cm2 em meio de crescimento em frascos revestidos de gelatina. As células foram inicialmente cultivadas em condições atmosféricas normais através da passagem 5, em cujo ponto foram transferidas para condições de cultura de baixo oxigénio (5% O2) ·

Outras condições de crescimento. Em outros protocolos, as células foram expandidas em placas não-revestidas, revestidos com colagénio, revestidas com fibronectina, revestidos com laminina e revestidas com proteínas de matriz extracelular. As culturas foram demonstradas expandir bem nessas diferentes matrizes.

Resultados

Comparação do potencial de expansão de PPDCs com outras populações de células estaminais e não estaminais. Ambas as 91 células derivada do cordão umbilical e da placenta foram expandidas para mais de 40 passagens gerando colheitas de células de >1E17 células em 60 dias. Em contraste, as MSCs e os fibroblastos senesceram após <25 dias e <60 dias, respectivamente. Embora as células derivadas do tecido adiposo tenham expandido por quase 60 dias e gerado rendimentos totais de células de 4.5E12. Assim, quando semeadas a 5000 células/cm2, nas condições experimentais utilizadas, as células derivadas do pós-parto expandiram muito melhor do que os outros tipos de células cultivadas sob as mesmas condições (Tabela 2-1).

Tabela 2-1: Caracteristicas de crescimento para diferentes populações de células cultivadas até à senescência

Tipo de células Senescência Total de duplicações da população Rendimento total das células MSC 24 d 8 4,72 E7 Adiposo 57 d 24 4,5 E12 Fibroblastos 53 d 26 2,82 E13 Umbilicais 65 d 42 6,15 E17 Placenta 80 d 46 2,49 EI9 92

Potencial de expansão dos bancos de células de baixa densidade. Células derivadas umbilicais, células derivadas da placenta e células de fibroblastos expandidos durante mais de 10 passagens geraram rendimentos de células de >IE11 células em 60 dias (Tabela 2-2) . Após 60 dias, sob estas condições, os fibroblastos tornaram-se senescentes enquanto as populações de células derivadas do cordão umbilical e da placenta senesceram após 80 dias, completando >50 e >40 duplicações da população, respectivamente.

Tabela 2-2: Caracteristicas de crescimento para populações de células diferentes, utilizando expansão do crescimento de baixa densidade da passagem 10 até a senescência

Tipo de células Senescência Total de duplicações da população Rendimento total das células Fibroblastos (P10) 80 d 43, 68 2,59 Eli Umbilicais (P10) 80 d 53, 6 1,25 E14 Placenta (P10) 60 d 32, 96 6,09 E12

Expansão da PPDCs a baixa densidade a partir da cultura inicial de células. Os PPDCs foram expandidos a baixa densidade (1000 células/cm2) em placas ou frascos revestidos de gelatina e não revestidos. O potencial de crescimento destas células sob estas condições foi bom. As 93 células expandiram prontamente numa fase de crescimento logarítmico. A taxa de expansão das células foi semelhante à observada quando as células derivadas da placenta foram semeadas a 5000 células/cm2 em frascos revestidos de gelatina em Meio de Crescimento. Não foram observadas diferenças no potencial de expansão celular entre a cultura quer em frascos não revestidos ou frascos revestidos de gelatina. No entanto, as células apareceram fenotipicamente muito menores em frascos revestidos de gelatina e muito maiores fenótipos celulares foram observados em frascos revestidos.

Expansão de células clonais neonatais ou derivadas da placenta materna. Uma população de células clonais neonatais ou maternais pode ser expandida a partir de células derivadas da placenta isoladas a partir do aspecto neonatal ou do aspecto maternal, respectivamente, da placenta. As células são diluídas em série e seguidamente semeadas em placas revestidas com gelatina em meio de crescimento para a expansão de uma célula/poço em placas revestidas de gelatina de 96 poços. Desta clonagem inicial, os clones expansivos são identificados, tripsinizados e re-semeadas em placas revestidas com gelatina de 12 poços em meio de crescimento e, em seguida, subsequentemente passadas para frascos T25 revestidas com gelatina a 5000 células/cm2 em meio de crescimento. A subclonagem é realizada para assegurar que uma população clonal de células tenha sido identificada. Para as experiências de subclonagem, as células são tratadas com tripsina e re-semeadas a 0,5 células/poço. Os subclones que crescem bem são expandidos em frascos T25 revestidos com gelatina a 5000 células/cm2/frasco. As células são passadas a 5000 células cm2/frascos T75. As características de crescimento de um clone podem ser representadas para demonstrar a 94 expansão das células. A análise de cariótipo pode confirmar que o clone é maternal ou neonatal.

Expansão de células em condições de cultura de baixo oxigénio. As células expandem-se bem sob as condições de oxigénio reduzido, no entanto, a cultura sob condições de baixo oxigénio não parece ter um efeito significativo sobre a expansão das células de PPDCs sob as condições utilizadas.

Resumo. As condições de expansão de células compreendendo o crescimento de células derivadas de pós-parto isoladas a densidades de cerca de 5000 células/cm2, em meio de crescimento em frascos revestidos com gelatina ou não revestidos, sob oxigénio atmosférico normal, são suficientes para gerar grandes números de células na passagem 11. Além disso, os dados sugerem que as células podem ser prontamente expandidas usando as condições de cultura de densidade mais baixa (por exemplo, 1000 células/ cm2) . A expansão de células derivadas do pós-parto em condições de baixo oxigénio também facilita a expansão celular, embora nenhuma melhoria incremental no potencial de expansão das células tenha sido, ainda, observado quando se utiliza essas condições para o crescimento. Atualmente, a cultura de células derivados do pós-parto sob condições atmosféricas padrão é o preferido para a geração de grandes quantidades de células. No entanto, quando as condições de cultura são alteradas, a expansão das células derivadas do pós-parto pode, também, ser alterada. Esta estratégia pode ser utilizada para aumentar a capacidade proliferativa e a capacidade diferencial destas populações de células.

Nas condições utilizadas, enquanto o potencial de expansão de MSC e células derivadas de tecido adiposo é limitada, as 95 células derivadas do pós-parto expandem-se rapidamente a um grande número.

Referências para o Exemplo 2 1) Hayflick L. 1974a. J Am Geriatr. Soc. 22:1-12. 2) L. Hayflick 1974b. Gerontologist. 14:37-45. 3) Publicação de Patente US US20040058412 4) Publicação de Patente US US20040048372 5) Publicação de Patente US US20040005704 EXEMPLO 3

Avaliação do meio de crescimento para células derivadas da placenta Vários meios de cultura de células foram avaliados quanto à sua capacidade para suportar o crescimento de células derivadas da placenta. 0 crescimento das células derivadas da placenta em condições normais (20%) e baixo oxigénio (5%) foi avaliado após 3 dias utilizando o ensaio colorimétrico MTS. Métodos e Materiais Células derivadas da placenta da passagem 8 (P 8) foram

semeadas a 1 x 103 células/poço em placas de 96 poços em meio de crescimento com penicilina/estreptomicina. Após 8 horas, o meio foi mudado como descrito abaixo e as células foram incubadas em condições normais (atmosférica) ou baixo oxigénio (5%, v/v) a 37°C, 5% de C02 durante 48 horas. O MTS foi adicionado ao meio de cultura (ensaio de proliferação celular CellTiter 96 Aqueous One Solution, 96

Promega, Madison, WI) durante 3 horas e a absorvância medida a 490 nm (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Tabela 3-1. Meios de Cultura

Meio de cultura Fornecedor 5 de adição de soro fetal bovino(v/v) DMEM baixa glucose Gibco Carlsbad CA 0,2 10 DMEM glucose elevada Gibco 0,2 10 RPMI 40 Mediatech, Inc. Herndon, VA 0,2 10 Livre de células (livre de soro, livre de proteínas) Mediatech, Inc. Ham's FIO Mediatech, Inc. 0,2 10 MSCGM (completado com soro) Cambrex, Walkersville, MD 0,2 10 Livre completamente de soro com albumina Mediatech, Inc. - Meio de crescimento NA - 97

Meio de cultura Fornecedor 5 de adição de soro fetal bovino(v/v) Ham's F12 Mediatech, Inc. 0,2 10 Iscove's Mediatech, Inc. 0,2 10 Meio basal de Eagle Mediatech, Inc. DMEM/F12 (1.1) Mediatech, Inc. 0,2 10

Resultados

As curvas padrão para o ensaio MTS estabeleceram uma correlação linear entre o aumento na absorvância e um aumento no número de células. Os valores de absorvância obtidos foram convertidos em números de células e foi calculado o número estimado de alteração (%) em relação à propagação inicial.

Efeito do soro. A adição de soro ao meio de oxigénio, em condições normais, resultou num aumento dependente da dose na absorvância reprodutível e, portanto, no número de células viáveis. A adição de soro para completar o MSCGM resultou numa diminuição dependente da dose da absorvância. Nos meios sem soro adicionado, as células só creseram sensivelmente em Cellgro-FREE, Ham FIO e DMEM.

Efeito do oxigénio. A redução do oxigénio pareceu fazer aumentar a taxa de crescimento das células em meio de 98 crescimento, Ham FIO e MSCGM. Em ordem decrescente de crescimento, os meios que resultaram no melhor crescimento das células foram o Meio de Crescimento > MSCGM> Iscove + 10% de FBS = Ham F12 + 10% de FBS = RPMI 1640 + 10% de FBS.

Resumo. As células derivadas da placenta podem ser cultivadas numa variedade de meios de cultura em oxigénio normal ou baixo. O crescimento a curto prazo das células derivadas da placenta foi determinado em doze meios basais com 0,2 e 10% (v/v) de soro em 5% ou oxigénio atmosférico.

Em geral, as células derivadas da placenta não cresceram, em condições isentas de soro, com a excepção de Ham F10 e Cellgro-Free, que também são livres de proteínas. O crescimento nestes meios isentos de soro foi cerca de 25-33% do crescimento máximo observado em meios contendo 15% de soro. EXEMPLO 4

Crescimento das células derivadas do pós-parto em meio contendo D-valina

Tem sido relatado que o meio contendo D-valina em vez do normal L-valina isoforma pode ser usado para inibir selectivamente o crescimento de células semelhantes a fibroblastos em cultura (Hongpaisan, 2000; Sordillo et al., 1988). Não era previamente conhecido se as células derivadas do pós-parto podiam crescer em meio contendo D-valina. Métodos e Materiais Células derivadas da placenta (P3), fibroblastos (P 9) e células derivadas umbilicais (P5) foram semeadas a 5 x 103 células/cm2 em frascos T75 revestidos de gelatina (Corning, Corning, NY) . Após 24 horas o meio foi removido e as 99 células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) para remover o meio residual. 0 meio foi substituído com um meio de crescimento modificadoo (DMEM com D-valina (encomenda especial Gibco), 15% (v/v) de soro fetal bovino dialisado (Hyclone, Logan, UT) , 0,001% (v/v) de beta-mercaptoetanol (Sigma), penicilina/estreptomicina (Gibco)).

Resultados Células derivadas da placenta, derivadas do cordão umbilical e fibroblastos semeados em meio contendo valina-D não proliferam, ao contrário das células semeadas em meio de crescimento contendo soro dializado. As células de fibroblastos aleraram-se morfologicamente, aumentando de tamanho e mudando de forma. Todas as células morreram e, eventualmente, separaram-se da superfície do frasco depois de 4 semanas. Estes resultados indicam que o meio contendo D-valina não é adequado para o crescimento selectivo de células derivadas do pós-parto.

Referências para o Exemplo 4 1) Hongpaisan J. 2000. Cell Biol Int. 24:1-7. 2) Sordillo LM, Oliver SP, Akers RM. 1988. Cell Biol Int Rep. 12:355-64. EXEMPLO 5

Meio de criopreservação de células derivadas da placenta

Foram avaliados meios de criopreservação para a criopreservação de células derivadas da placenta. 100 Métodos e Materiais Células derivadas da placenta cultivadas em Meio de Crescimento num frasco T75 revestido com gelatina foram lavadas com PBS e tripsinizadas usando um mililitro de Tripsina/EDTA (Gibco). A tripsinização foi parada por adição de 10 ml de Meio de Crescimento. As células foram centrifugadas a 150 x g, o sobrenadante removido, e o sedimento celular foi ressuspenso em 1 ml de Meio de Crescimento. Uma aliquota da suspensão de células, 60 microlitros, foi removida e adicionada a 60 microlitros de azul de tripano (Sigma). O número de células viáveis foi estimado utilizando um hemocitómetro. A suspensão de células foi dividida em quatro alíquotas iguais cada uma contendo 88 x 104 células cada. A suspensão celular foi centrifugada e ressuspensa em 1 mililitro de cada um dos meios abaixo e transferida para criotubos (Nalgene). 1) Meio de Crescimento + 10% (v/v) de DMSO (Hybrimax, Sigma, St. Louis, MO) 2) Meio de congelamento celular com DMSO, metil celulose, isento de soro (C6295, Sigma, St. Louis, MO) 3) Meio de congelamento celular isento de soro (C2639, Sigma, St. Louis, MO) 4) Meio de congelamento celular com glicerol (C6039, Sigma, St. Louis, MO)

As células foram arrefecidas a cerca de -l°C/min, durante a noite num congelador -80°C usando um contentor de congelação "Mr Frosty" de acordo com as instruções do fabricante (Nalgene, Rochester, NY). Frascos de células foram transferidos para azoto liquido durante 2 dias antes de descongelarem rapidamente num banho de água a 37°C. As células foram adicionadas a 10 ml de Meio de Crescimento e 101 centrifugadas antes de ser estimado o número de células e a viabilidade. As células foram semeadas em frascos revestidos de gelatina a 5000 células/cm2 para determinar se as células proliferam e se ligam.

Resultados A viabilidade inicial das células a serem criopreservadas foi avaliada por coloração com azul de tripano para ser 100%.

Houve uma redução proporcional no número de células com viabilidade para C6295 devido a células de lise. As células criopreservadas viáveis em todas as quatro soluções ligaram-se, dividiram-se e produziram uma monocamada confluente dentro de 3 dias. Não havia diferença discernivel na taxa de crescimento estimado.

Resumo. A criopreservação das células é um procedimento disponível para a preparação de um banco de células ou de um produto celular. Quatro misturas de criopreservação foram comparadas quanto à sua capacidade de proteger as células derivadas da placenta humana contra danos de congelação. Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO), é a forma preferida desta comparação para a criopreservação de células derivadas da placenta. EXEMPLO 6

Análise do cariótipo de células pós-parto Derivados

As linhas de células utilizadas em terapia celular são, de preferência, homogéneas e livres de qualquer tipo de células contaminantes. As células utilizadas em terapia celular devem ter um número normal de cromossomas (46) e 102 estrutura. Para identificar linhas celulares derivadas da placenta e umbilicais que são homogéneas e isentas de células de tecidos de origem não pós-parto, foram analisadas amostras de células de cariótipo.

Materiais e Métodos PPDCs a partir do tecido pós-parto de um recém-nascido do sexo masculino foram cultivados em meio de crescimento contendo penicilina/estreptomicina. 0 tecido pós-parto de um recém-nascido do sexo masculino (X, Y) , foi seleccionado para permitir distinguir entre as células derivadas neonatais e células derivadas maternas (X, X) . As células foram semeadas a 5000 células por centímetro quadrado em Meio de Crescimento num frasco T25 (Corning, Corning, NY) e expandidas para 80% de confluência. Um frasco T25 contendo células foi preenchido até ao gargalo com Meio de Crescimento. As amostras foram entregues a um laboratório de citogenética clínica por correio (tempo de transporte estimado de laboratório para o laboratório é de uma hora). As células foram analisadas durante a metáfase, quando os cromossomos são melhor visualizados. De vinte células em contadas em metáfase, cinco foram analisados para o número de cariótipo homogéneo normal (dois). Uma amostra de células foi caracterizada como homogénea se forEm observados dois cariótipos. Uma amostra de células foi caracterizada como heterogénea se foram observados mais de dois cariótipos. Células em metáfases adicionais foram contadas e analisadas quando foi identificado um número de cariótipo heterogéneo (quatro).

Resultados

Todas as amostras de células enviadas para análise cromossómica foram interpretadas como exibindo uma 103 aparência normal. Três das dezasseis linhas celulares analisadas exibiram um fenótipo heterogéneo (XX e XY) indicando a presença de células derivadas tanto de origem materna como neonatal (Tabela 6-1). As células derivadas de tecido da placenta-N foram isoladas a partir do aspecto neonatal da placenta. Na passagem zero, esta linha celular aparentou ser homogénea XY. No entanto, na passagem nove, a linha celular era heterogénea (XX/XY), indicando a presença de células anteriormente não detectadas de origem materna.

Tabela 6-1. Resultados da análise de cariótipos de PPDC

Tecido Passagem Células contadas em metáfase Células analisadas em metáfase Número de cariótipos Cariótipo ISCN Placenta 22 20 5 2 46, XX Umbilical 23 20 5 2 46, XX Umbilical 6 20 5 2 46, XY Placental 2 20 5 2 46, XX Umbilical 3 20 5 2 46, XX Placenta-N 0 20 5 2 46, XY Placenta-V 0 20 5 2 46, XY Placenta-M 0 21 5 4 4 6, XY [18]/46, XX [3] Placenta-M 4 20 5 2 4 6, XX Placenta-N 9 25 5 4 4 6, XY [5] /4 6, XX [20] Placenta-N Cl 1 20 6 4 4 6, XY Placenta-N C3 1 20 6 4 4 6, XY [ 2 ] /4 6, XX [18] Placenta-N C4 1 20 5 2 4 6, XY Placenta-N C15 1 20 5 2 46, XY 104

Tecido Passagem Células contadas em metáfase Células analisadas em metáfase Número de cariótipos Cariótipo ISCN Placenta-N C20 1 20 5 2 46, XY Chave: N - aspecto neonatal; V - região vilosa ; M - aspecto maternal; C - clone

Resumo. A análise de cromossoma identificou células derivadas da placenta e umbilicais cujos cariótipos pareciam normais tal como interpretado por um laboratório clinico citogenético. A análise do cariótipo também identificou linhas de células livres de células maternas, conforme determinado pelo cariótipo homogéneo. EXEMPLO 7

Avaliação de marcadores da superfície celular de células derivadas do pós-parto humanas por citometria de fluxo A caracterização de proteínas de superfície celular ou "marcadores", por citometria de fluxo pode ser utilizada para determinar a identidade de uma linha celular. A consistência da expressão pode ser determinada a partir de vários dadores, e em células expostas a diferentes condições de transformação e de cultura. Linhas de células derivadas do pós-parto (PPDC) isoladas a partir da placenta e do cordão umbilical foram caracterizadas (por citometria de fluxo), proporcionando um perfil para a identificação dessas linhas celulares.

Materiais e Métodos

Meios e vasos de cultura. As células foram cultivadas em Meio de Crescimento (Gibco Carlsbad, CA) com penicilina/ estreptomicina. As células foram cultivadas em frascos de cultura de tecidos tratados com plasma T75, T150 e T225 (Corning, Corning, NY) até à confluência. As superfícies de 105 crescimento dos frascos foram revestidas com gelatina por incubação de 2% (p/v) de gelatina (Sigma, St. Louis, MO) durante 20 minutos à temperatura ambiente.

Coloração de anticorpos e análise de citometria de fluxo.

As células aderentes em frascos foram lavadas em PBS e isoladas com tripsina/EDTA. As células foram recolhidas, centrifugadas e ressuspensas em 3% (v/v) de FBS em PBS a uma concentração de células de 1 x 107 por mililitro. De acordo com as especificações do fabricante, o anticorpo para o marcador de superfície celular de interesse (ver abaixo) foi adicionado a cem microlitros de suspensão de células e a mistura foi incubada no escuro durante 30 minutos a 4°C. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover o anticorpo não ligado. As células foram ressuspensas em 500 microlitros de PBS e analisadas por citometria de fluxo. A análise de citometria de fluxo foi realizada com um instrumento FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA).

Foram usados os seguintes anticorpos para marcadores de superfície celular. 106

Anticorpo CD10 BD Pharmingen CD13 BD Pharmingen CD31 BD Pharmingen CD34 BD Pharmingen CD44 BD Pharmingen CD45RA BD Pharmingen CD7 3 BD Pharmingen CD90 BD Pharmingen CD117 BD Pharmingen CD141 BD Pharmingen PDGFr-alfa BD Pharmingen HLA-A,B,C BD Pharmingen HLA-DR,DP,DQ BD Pharmingen IgC-FITC Sigma (St. Lo1 IgC-PE Sigma

Fabricante N° de catálogo (San Diego, CA) 555375 555394 555446 555821 555478 555489 550257 555596 340529 559781 556002 555553 555558 MO) F-6522 P-4685

Comparação placenta e umbilical. Células derivadas da placenta foram comparadas com células derivadas umbilicais na passagem 8.

Comparação passagem para passagem. Células derivadas da placenta e umbilicais foram analisadas nas passagens 8, 15 e 20.

Comparação dador para dador. Para comparar as diferenças entre os dadores, as células derivadas da placenta de diferentes dadores foram comparadas umas com as outras, e as células derivadas do cordão umbilical de diferentes dadores foram comparadas umas com as outras.

Comparação do revestimento de superfície. Células derivadas da placenta cultivadas em frascos revestidos de gelatina 107 foram comparadas com as células derivadas da placenta cultivadas em frascos não revestidos. Células derivadas umbilicais foram cultivadas em frascos revestidos de gelatina foram comparadas com células derivadas umbilicais cultivadas em frascos não revestidos.

Comparação da digestão enzimática. Foram comparadas quatro tratamentos utilizados para o isolamento e preparação de células. Foram comparadas as células isoladas a partir da placenta, por tratamento com 1) colagenase; 2) colagenase/ dispase; 3) colagenase/hialuronidase; e 4) colagenase/ hialuronidase/dispase.

Comparação da camada placentária. Células derivadas do aspecto maternal de tecido placentário foram comparadas com células derivadas a partir da região de vilosidades do tecido placentário e células derivadas a partir do aspecto fetal neonatal da placenta.

Resultados

Comparação placenta vs umbilical. As células derivadas da placenta e umbilicais analisadas por citometria de fluxo mostraram expressão positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, indicado pelos valores elevados de fluorescência relativa ao controlo de IgG. Estas células foram negativos para a expressão detectável de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 e HLA-DR, DP, DQ, indicada por valores de fluorescência comparável com o controlo de IgG. As variações dos valores de fluorescência das curvas positivas foram contabilizadas. A média (ou seja CD13) e a gama (ou seja CD90) das curvas positivas mostrou alguma variação, mas as curvas pareciam normais, 108 confirmando uma população homogénea. Ambas as curvas exibiram individualmente valores maiores do que o controlo de IgG.

Comparação passagem para passagem - células derivadas da placenta. Células derivadas da placenta nas passagens 8, 15 e 20 analisadas por citometria de fluxo, todas foram positivas para a expressão de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa e HLA- A, B, C, que se reflete no aumento do valor de fluorescência em relação ao controle de IgG. As células foram negativos para a expressão de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, e HLA-DR, DP, DQ tendo valores de fluorescência de acordo com o controlo de IgG.

Comparação passagem para passagem - células derivadas umbilicais. Células derivadas umbilicais nas passagens 8, 15 e 20 analisadas por citometria de fluxo, todas expressaram CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, indicado pelo aumento de fluorescência em relação ao controlo de IgG. Estas células foram negativas para CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, e HLA-DR, DP, DQ, indicado por valores de fluorescência compatíveis com a IgG de controlo.

Comparação dador para dador - células derivadas da placenta. As células derivadas da placenta isoladas de dadores separados analisadas por citometria de fluxo, cada qual expressa CD10, CD 13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, com o aumento dos valores da fluorescência relativa para a IgG de controlo. As células foram negativas para a expressão de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, e HLA- 109 DR, DP, DQ, tal como indicado pelo valor de fluorescência de acordo com o controlo de IgG.

Comparação dador para dador - células derivadas umbilicais. Células derivadas umbiliucais isoladas de dadores separados analisadas por citometria de fluxo cada uma mostrou expressão positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, que se reflecte no aumento nos valores de fluorescência relativa ao controlo de IgG. Estas células foram negativas para a expressão de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, e HLA-DR, DP, DQ com valores de fluorescência compativeis com a IgG de controlo.

Efeito da superfície de revestimento com gelatina em células derivadas da placenta. Células derivadas da placenta expandidas tanto em frascos revestidos de gelatina como não revestidos analisadas por citometria de fluxo, todas expressaram CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, que se reflecte no aumento dos valores de fluorescência relativa ao controlo de IgG. Estas células foram negativas para a expressão de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, e HLA-DR, DP, DQ indicado pelos valores de fluorescência compatíveis com a IgG de controlo.

Efeito da superfície de revestimento com gelatina em células derivadas umbilicais. Células derivadas umbilicais expandidas em frascos revestidos de gelatina e não revestidos analisadas por citometria de fluxo, todas foram positivas para a expressão de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, com um aumento dos valores de fluorescência relativa ao controlo de IgG. Estas células foram negativas para a expressão de CD31, CD34, CD45, 110 CD117, CD141, e HLA-DR, DP, DQ, com valores de fluorescência compatíveis com a IgG de controlo.

Efeito do procedimento de digestão com enzimas usadas para a preparação das células sobre o perfil de marcadores de superfície celular. Células derivadas da placenta isoladas utilizando várias enzimas de digestão analisadas por citometria de fluxo, todas expressaram CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, tal como indicado pelos valores elevados de fluorescência relativa ao controlo de IgG. Estas células foram negativas para a expressão de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, e HLA-DR, DP, DQ conforme indicado pelos valores de fluorescência compatíveis com a IgG de controlo.

Comparação da camada da placenta. Células isoladas a partir das camadas da placenta maternas, vilosidades, e neonatais, respectivamente, analisadas por citometria de fluxo mostraram expressão positiva de CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, tal como indicado pelo aumento do valor da fluorescência relativa ao controlo de IgG. Estas células foram negativas para a expressão de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141, e HLA-DR, DP, DQ conforme indicado pelos valores de fluorescência compatíveis com a IgG de controlo.

Resumo. Análise de células derivadas da placenta e do cordão umbilical por citometria de fluxo, estabeleceu uma identidade destas linhas celulares. As células derivadas da placenta e do cordão umbilical são positivas para CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, HLA-A, B, C e negativas para CD31, CD34, CD45, CD117, CD141and HLA-DR, DP, DQ. Esta 111 identidade foi consistente entre as variações variáveis, incluindo o dador, a passagem, vaso de cultura e revestimento de superfície, as enzimas de digestão e a camada da placenta. Foi observada alguma variação no valor do meio das curvas e faixas do histograma de fluorescência indivuidual, mas todas as curvas positivas em todas as condições testadas foram normais e expressaram valores de fluorescência maiores do que o controle de IgG, confirmando, assim, que as células constituem uma população homogénea que tem expressão positiva dos marcadores. EXEMPLO 8

Caracterização imuno-histoquimica de fenótipos de tecido pós-parto

Os fenótipos de células encontradas nos tecidos humanos pós-parto, ou seja, no cordão umbilical e placenta, foram analisados por imuno-histoquimica.

Materiais e Métodos

Preparação do tecido. 0 tecido do cordão umbilical humano e da placenta foi colhido por imersão e fixado em 4% (p/v) de paraformaldeido durante a noite a 4°C. A imuno-histoquimica foi realizada utilizando anticorpos dirigidos contra os seguintes epitopos: vimentina (1:500, Sigma, St. Louis, MO), desmina (1:150, criado contra coelho; Sigma; ou 1:300, criado contra rato; Chemicon, Temecula, CA), alfa-actina do músculo liso (SMA; 1:400; Sigma), citoqueratina 18 (CK18; 1:400; Sigma), factor de von Willebrand (FvW; 1:200;

Sigma), e CD34 (CD34 humano Classe III; 1:100; DakoCytomation, Carpinteria, CA). Além disso, os seguintes marcadores foram testados: GROalpha anti-humano - PE (1:100, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) , GCP-2 anti-humano (1:100, Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), 112 receptor 1 de LDL oxidado anti-humano (ox-LDL Rl; 1:100; Santa Cruz Biotech), e NOGO-A anti-humano (1:100, Santa Cruz Biotech). Espécimes fixados foram cortados com um bisturi e colocados dentro de um composto embebido em OCT (Tissue-Tek OCT; Sakura, Torrance, CA) , num banho de gelo seco contendo etanol. Os blocos congelados foram seccionados (10 pm de espessura), utilizando um criostato padrão (Leica Microsystems) e montados em lâminas de vidro para coloração.

Imuno-histoquímica. Imuno-histoquímica foi realizada de acordo com estudos anteriores (por exemplo, Messina et al., (2003) Exper. Neurol. 184:816-829). As secções de tecido foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e expostas a uma solução de bloqueio de proteína contendo PBS, 4% (v/v) de soro de cabra (Chemicon, Temecula, CA) e 0,3% (v/v) de Triton (Triton X-100, Sigma) durante 1 hora para aceder aos antigénios intracelulares. Nos casos em que o epítopo de interesse poderia ser localizado na superfície celular (CD34, ox-LDL Rl), o Triton foi omisso em todos os passos do processo a fim de evitar a perda do epítopo. Além disso, nos casos em que o anticorpo primário foi levantado contra o de cabra (GCP-2, ox-LDL Rl, NOGO-A), foi usado 3% (v/v) de soro de burro no lugar do soro de cabra durante todo o procedimento. Os anticorpos primários, diluídos em solução de bloqueio, foram então aplicados às secções durante um período de 4 horas à temperatura ambiente. As soluções de anticorpo primário foram removidos, e as culturas lavadas com PBS, antes da aplicação das soluções de anticorpos secundários (1 hora à temperatura ambiente) contendo bloco, juntamente com anticorpos de cabra de anti-IgG de ratinho - vermelho do Texas (1:250, Molecular Probes, Eugene, OR) e/ou de 113 cabra anti-IgG de coelho - Alexa 488 (1:250, Molecular Probes) ou de burro anti-IgG de cabra - FITC (1:150; Santa Cruz Biotech). As culturas foram lavadas, e 10 micromolar de DAPI (Molecular Probes) foi aplicada durante 10 minutos para visualizar os núcleos das células.

Após a imunocoloração, a fluorescência foi visualizada usando um filtro de fluorescência apropriado num microscópio de epi-fluorescência invertida Olympus (Olympus, Melville, NY). A coloração positiva foi representada pelo sinal de fluorescência acima da coloração de controlo. Imagens representativas foram capturadas usando uma câmera de video digital a cores e software ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA) . Para amostras triplamente coradas, cada imagem foi tirada usando apenas um filtro de emissão de cada vez. Montagens de camadas foram preparadas utilizando o software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA).

Resultados

Caracterização do cordão umbilical. Os marcadores vimentina, desmina, SMA, CK18, vWF, e CD34 foram expressos num subgrupo de células encontradas no cordão umbilical. Em particular, a expressão de vWF e de CD34 foi restringida aos vasos sanguíneos contidos dentro do cordão. As células CD34+ estavam na camada mais interna (lado do lúmen). A expressão de vimentina foi encontrada ao longo da matriz e dos vasos sanguíneos do cordão. SMA foi limitada às paredes da matriz e externas da artéria e veia, mas não contida nos próprios vasos. CK18 e desmina foram observados apenas no interior dos vasos, a desmina sendo restrita às camadas média e externa. 114

Caracterização da placenta. Vimentina, desmina, SMA, CK18, FvW e CD34 foram todos observados dentro da placenta e região específica.

Expressão tecidual de GROalpha, GCP-2, ox-LDL RI e NOGO-A.

Nenhum destes marcadores foi observado dentro do cordão umbilical ou do tecido placentário.

Resumo. Vimentina, desmina, alfa-actina do músculo liso, citoqueratina 18, factor de von Willebrand e CD 34 são expressos em células dentro do cordão umbilical e da placenta humana. EXEMPLO 9

Análise de células derivadas do tecido pós-parto utilizando matrizes de oliponucleotídeos

Foram usadas matrizes Affymetrix GeneChip para comparar os perfis de expressão genética das células derivadas umbilicais e da placenta com fibroblastos, células estaminais mesenquimais humanas e outra linhagem de células derivadas da medula óssea humana. Essa análise possibilitou uma caracterização das células derivadas do pós-parto e identificou marcadores moleculares únicos para estas células.

Materiais e Métodos

Isolamento e cultura de células. Cordão umbilical e placenta humana foram obtidos a partir de National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) de partos de termo, normais, com o consentimento do paciente. Os tecidos foram recebidos e as células foram isoladas como descrito no Exemplo 1. As células foram cultivadas em Meio de 115

Crescimento (com DMEM-LG) em frascos de cultura de tecidos plásticos revestidos com gelatina. As culturas foram incubadas a 37°C com 5% de C02.

Fibroblastos dérmicos humanos foram adquiridos a Cambrex Incorporated (Walkersville, MD, número do lote 9F0844) e ATCC CRL-1501 (CCD39SK). Ambas as linhas foram cultivadas em meio DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) com 10% (v/v) de soro fetal bovino (Hyclone) e penicilina/estreptomicina (Invitrogen). As células foram cultivadas em tecido plástico tratado padrão.

As células estaminais mesenquimais humanas (hMSC) foram adquiridas da Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; números de lote 2F1655, 2F1656 e 2F1657) e cultivadas de acordo com as especificações do fabricante em meio MSCGM (Cambrex). As células foram cultivadas em plástico de cultura de tecidos padrão, a 37°C com 5% de C02.

Cristã iliaca da medula óssea humana foi recebida da NDRI com o consentimento do paciente. A medula foi processada de acordo com o método descrito por Ho, et al. (W003/025149). A medula foi misturada com tampão de lise (155 mM de NH4C1, 10 mM de KHCO3 e 0,1 mM de EDTA, pH 7,2) numa proporção de 1 parte de medula óssea, para 20 partes de tampão de lise. A suspensão celular foi agitada em vórtice, incubada durante 2 minutos à temperatura ambiente, e centrifugada durante 10 minutos a 500 x g. O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento de células foi ressuspenso em meio essencial minimo alfa (Invitrogen) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino e 4 mM de glutamina. As células foram novamente centrifugadas e o sedimento celular 116 foi ressuspenso em meio fresco. As células mononucleares viáveis foram contadas utilizando exclusão de azul de tripano (Sigma, St. Louis, MO). As células mononucleares foram semeadas em frascos de cultura de tecido de plástico de 5 x 104 células/cm2. As células foram incubadas a 37°C com 5% de CO2 tanto em 02 atmosférico padrão ou em 5% de 02. As células foram cultivadas durante 5 dias sem mudar o meio. Meio e células não-aderentes foram removidos após 5 dias de cultura. As células aderentes foram mantidas em cultura.

Isolamento de mARN e análise GeneChip. Culturas de células de crescimento ativo foram retiradas dos frascos com um raspador de células em PBS frio. As células foram centrifugadas durante 5 minutos a 300 x g. O sobrenadante foi removido e as células foram ressuspensas em PBS fresco e centrifugadas de novo. O sobrenadante foi removido e o sedimento celular foi imediatamente congelado e armazenado a -80°C. Extraiu-se o mARNcelular e transcrito em cADN, o qual foi, em seguida, transcrito em cARN marcado com biotina. O cARNmarcado com biotina foi hibridado com matriz oligonucleótido HG-U133A GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA) . A hibridação e coleção de dados foram realizadas de acordo com as especificações do fabricante. As análises foram realizadas utilizando a "análise da significância das micromatrizes" (SAM) software versão 1.21 (Universidade de Stanford, www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM; Tusher, VG et al, (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:5116-5121).

Resultados

Foram analisados catorze populações de células diferentes. As células juntamente com informações de passagem, 117 substrato de cultura, meio de cultura estão listadas na Tabela 9-1.

Tabela 9-1. Células analisadas pelo estudo de micromatriz. As linhas de células estão listadas pelo código de identificação juntamento com a passagem no periodo em análise, substrato de crescimento celular e meio de crescimento

População celular Passagem Substrato Meio Umbilical (022803) 2 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME Umbilical (042103) 3 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME Umbilical (071003) 4 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME Placenta (042203) 12 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME Placenta (042903) 4 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME Placenta (071003) 3 Gelatina DMEM, 15% FBS, 2-ME ICBM (070203) (5% 02) 3 Plástico MEM, 10% FBS ICBM (062702) (std 02) 5 Plástico MEM, 10% FBS ICBM (062703) (5% 02) 5 Plástico MEM, 10% FBS hMSC (Lote 2F1655) 3 Plástico MSCGM hMSC (Lote 2F1656) 3 Plástico MSCGM hMSC (Lote 2F1657) 3 Plástico MSCGM hFibroblasto (9F0844) 9 Plástico DMEM-F12, 10% FBS hFibroblasto (CCD39SK) 4 Plástico DMEM-F12, 10% FBS

Os dados foram avaliados por uma Análise de Componentes Principais, analisando os 290 genes que foram diferencialmente expressos nas células. Esta análise permite fazer uma comparação relativa para as semelhanças entre as populações. A Tabela 9-2 mostra as distâncias euclidianas que foram calculadas pela comparação entre os pares de células. As distâncias euclidianas foram baseadas na comparação das células com base num total de 290 genes que foram diferencialmente expressos entre os tipos de 118 células. A distância euclidiana é inversamente proporcional à semelhança entre a expressão dos 290 genes (isto é, maior é a distância, menor semelhança existe).

Tabela 9-2. Distâncias euclidianas para os pares de células

Par de células Distância euclidiana ICBM-hMSC 24,71 Placenta-umbilical 25, 52 ICBM-Fibroblasto 36, 44 Fibroblasto-placenta 37,09 Fibroblasto-MSC 36, 93 ICBM-umbilical 40,15 Fibroblasto-umbilical 41,59 MSC-placenta 42,84 MSC-umbilical 46, 86 ICBM-placenta 48,41

As Tabelas 9-3, 9-4, e 9-5 mostram a expressão de genes aumentada nas células derivadas da placenta (Tabela 9-3) , o aumento em células derivadas umbilicais (Tabela 9-4) e a redução em células derivadas umbilicais e placenta (Tabela 9-5) . A coluna intitulada "ID do conjunto de sonda" refere-se ao código de identificação do fabricante, para os conjuntos de várias sondas de oligonucleótidos localizadas num local particular no chip, que hibridam com o gene nomeado (coluna "nome do gene"), compreendendo uma sequência que pode ser encontrada dentro da base de dados do NCBI (GenBank) para o número de adesão especifico (coluna "Número de Acesso do NCBI") . 119

Tabela 9-4. Genes mostrados como tendo expressão especificamente aumentada nas células derivadas da placenta comparada com outras linhas de células testadas

Aumento de genes em células derivadas de placenta ID do conjunto de sonda Nome do gene N° de acesso NCBI 2 0 97 32_at Lectina tipo C (dependente de cálcio, dominio de reconhecimento de carbohidrato) membro da superfamilia 2 (ativação induzida) AF070642 206067 s at Tumor de Wills 1 NM 024426 207016 s at Família de aldeído dehidrogenase 1, membro A2 AB 015228 206367_at Renina NM 000537 210004_at Receptor de lipoproteína oxidizada de baixa densidade 1 (semelhante a lectina) AF03577 6 214993_at Homo Sapiens, clone IMAGE:4179671, mARN, cds parcial AF070642 202178_at Proteína quinase C, zeta NM 002744 2 0 978 0_at Proteína hipotética DKFZp564F013 AL136883 204135_at Subregulação em cancro do ovário 1 NM 014890 213542_at mARN de Homo Sapiens; CADN DKFZp547K1113 (do clone DKFZp547K1113) AI246730 120

Tabela 9-5. Genes mostrados como tendo expressão especlflcamente aumentada nas células derivadas umbilicais comparada com outras linhas de células testadas

Aumento de genes em células derivadas de placenta ID do conjunto de sonda Nome do gene N° de acesso NCBI 202859 x at Interleucina 8 NM_0 00584 211506 s_at Interleucina 8 AF043337 210222_s_at Reticulom 1 BC000314 204470 at Ligando 1 de quimiocina (motivo C-X-C) (atividade estimuladora do crescimento do melanoma) NM 001511 206336 at Ligando 6 de quimiocina (motivo C-X-C) (proteina quimiotática 2 de granulócito) NM_002993 207850_at Ligando 3 de quimiocina (motivo C-X-C) NM_002090 203485_at Reticulom 1 NM 021136 202644_s_at Factor de necrose tumoral, proteina 3 alfa induzida NM 006290 121

Tabela 9-6. Genes mostrados como tendo expressão reduzida nas células derivadas umbilicais e da placenta comparada com outras linhas de células testadas

Diminuição de genes em células derivadas umbilicais e da placenta ID do conjunto de sonda Nome do gene N° de acesso NCBI 210135 s at Homeobox 2 de pequena estatura AF022654.1 205824 at Proteína 2 de choque térmico 27kDa N_001541.1 209687 at Ligando 12 de quimiocina (motivo C-X-C) (célula derivada do factor estromal 1) UI 94 95.1 203666 at Ligando 12 de quimiocina (motivo C-X-C) (célula derivada do factor estromal 1) NM_0 0 0 609.1 212670 at Elastina (estenose aórtica supravalvular, síndroma de Williams-Beuren) AA479278 213381_at mARN de Homo Sapiens; CADN DKFZp586M2022 (do clone DKFZp586M2022) N91149 206201 s at Homeobox 2 do mesenquima (homeobox de crescimento específico) NM_005924.1 205817_at Homeobox sino oculis homólogo 1 (Drosophila) NM_005982.1 209283_at Cristalino, alfa B AF007162.1 212793_at Ativador associado de morfogénese 2 BF513244 213488_at Proteína DKFZP586B2420 AL050143.1 2 0 97 63_at Similar à neuralina 1 ALO4 917 6 205200 at Tetranectina (proteína de ligação ao plasminogénio) NM 003278.1 122

Diminuição de genes em células derivadas umbilicais e da placenta ID do conjunto de sonda Nome do gene N° de acesso NCBI 205743_at Homologia src três (SH3) e domínio rico em cisterna NM 003149.1 200921 s at Translocação do gene 1 de célula B, anti proliferativa NM 001731.1 206932 at Hidroxilase 25 do colesterol N_003956.1 204198 s at Factor de transcrição 3 relacionado AA541630 219747 at Proteína hipotética FLJ23191 NM 024574.1 204773 at Receptor de interleucina 11, alfa NM 004512.1 202465 at Ativador da endopeptídase de procolagénio C N 002593.2 203706 s at Homólogo 7 frisado (Drosophila) NM 003507.1 212736 at Gene hipotético BC008967 BE299456 214587 at Colagénio, tipo VIII, alfa 1 BE8777 9 6 201645_at Tenascina C (hexabraquião) NM 002160.1 210239 at Proteína homeobox 5 iroquois U90304.1 203903 s at Hepaestina NM 014799.1 205816 at Integrina, beta 8 NM 002214.1 203069 at Glicoproteína 2 da vesícula sináptica NM 014849.1 213909_at cADN de Homo sapiens FLJ12280 fis, clone MAMMA1991744 AU14 7 7 9 9 206315 at Factor semelhante ao receptor de citoquina 1 NM 004750.1 204401 at Intermediário de potássio/canal de cálcio ativado de pequena conductância, subfamília N, membro 4 NM 002250.1 216331_at Integrina, alfa 7 AK022548.1 209663 s at Integrina, alfa 7 AF0722132.1 123

Diminuição de genes em células derivadas umbilicais e da placenta ID do conjunto de sonda Nome do gene N° de acesso NCBI 213125_at Proteína DKFZP586L151 AW 0 0757 3 202133_at Co-ativador transcricional com motivo de ligação PDZ (TAZ) AA08184 206511 s at Homeobox homólogo 2 de sine oculis (Drosophila) NM 016932.1 213435_at Proteína KIAA1034 AB 02 8 957.1 206115_at Resposta de crecimento precoce 3 NM_004430.1 213707_s_at Homeobox 3 menos distai NM_005221.3 218181 s at Proteína hipotética FLJ20373 NM 017792.1 209160 at Família aldo-keto redutase 1, membro C3 (3-alfa hidroxiesteroide dehidrogenase, tipo II) AB 01858 0.1 213905 x at Biglicano AA845258 201262 x at Biglicano BC02416.1 202132_at Co-ativador transcricional com motivo de ligação PDZ (TAZ) AA081084 214701_s_at Fibronectina 1 AJ276395.1 2137 91_at Proenquefalina NM 006211.1 204422_s_at Integrina, semelhante a beta 1 (domínios de repetição semelhantes a EGF) NM 004791.1 214927_at mARN de Homo Sapiens de comprimento total insero no clone de cADN EUROIMAGE 1968422 AL359052.1 206070 s at EphA3 AF213459.1 212805_at Proteína KIA0367 ABO02365.1 219789 at Receptor do péptido natriuretico C/guanilato ciclase C (receptor do péptido atrionatriuretico C) AI628360 219054_at Proteína hipotética FLJ14054 NM_024563.1 124

Diminuição de genes em células derivadas umbilicais e da placenta ID do conjunto de sonda Nome do gene N° de acesso NCBI 213429_at mARN de Homo Sapiens; cADN DKFZp5 64B222 (do clone DKFZp5 64B222) AW 02557 9 204929_s_at Proteína de membrana associada à vesícula 5 NM 006634.1 201843_s_at Matriz de proteína extracelular 5 contendo EGF semelhante a fibulina NM 004105.2 221478_at BCL2/adenovírus E1B 19kDa interagindo com semelhante à proteína 3 AL132 665.1 2017 92_at Proteína 1 de ligação AE NM 001129.2 204570 at Polipeptídeo 1 de oxidade de citócromo C subunidade Vila NM 001864.1 20162l_at Neuroblastoma, supressão de tumorigenicidade 1 NM_005380.1 202718_at Proteína 2 de ligação ao factor de crescimento semelhante à insulina, 36 kDa NM 000597.1

As Tabelas 9-6, 9-7 e 9-8 mostram a expressão dos genes aumentados em fibroblastos humanos (Tabela 9-6), células ICBM (Tabela 9-7), e MSCs (Tabela 9-8). 125

Tabela 9-6. Genes mostrados como tendo expressão aumentada em fibroblastos comparada com outras linhas de células testadas

Genes aumentados em fibroblastos Fosfatase 2 de dupla especificidade Proteína KIAA0527 cADN de Homo Sapiens; FLJ23224 fis, clone ADSU02206 Polipeptídeo dineino 1 intermediário, citoplásmico Anquirina 3, nó de Ranvier (anquirina G) Inibina, beta A (activina A, polipeptídeo de activina AB alfa) Ectonucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase 4 (função putativa) Proteína KIAA1053 Proteína IA associada a microtúbulo Proteína de zinco 41 Proteína HSPC019 cADN de Homo Sapiens; FLJ23564 fis, clone LNG10773 mARN de Homo Sapiens; cADN DKFZp564A072 (do clone DKFZp564A072) Proteína LIM (similar ao enigma de ligação à proteína quinase C de rato) Inibidor do polipeptídeo estimulador do gene kapa leve em células B, proteína associada ao complexo de quinase Proteína hipotética FLJ22004 Sequência de mARN humana (clone CTG-A4) ESTs, moderadamente similar ao receptor do factor 2 semelhante à citoquina; receptor de citoquina do percursor CRL2 [Homo Sapiens] Factor de crescimento transformante, beta 2 Proteína hipotética MGC29643 Antigénio identificado pelo anticorpo monoclonal MRC OX-1 Proteína de retinopatia ligada a X putativo 126

Tabela 9-7. Genes mostrados como tendo expressão aumentada em células derivadas ICBM comparada com outras linhas de células testadas

Genes aumentados em células ICBM * Proteína de repetição de anquirina cardíaca

* Região ORF de MHC classe I * Integrina, alfa 10 * Prote+ina hipotética FLJ22362 * UDP-N-actil-alfa-D-galactosamina; polipeptídeo N- acetilgalactosaminiltransferase 3 (GaiNAc-T3) * Proteína 44 de indução de interferão SRY (região Y de determinação do sexo)-box 9 (displasia campolmélica; reversão do sexo autosomal) * Proteína 1-1 associada à queratina * Semelhante à hipocalcina 1 * Denticulado 1 (síndroma de Alagille) * Proteoglicano 1, grânulo secretório 127

Tabela 9-8. Genes mostrados como tendo expressão aumentada em células MSC comparada com outras linhas de células testadas

Genes aumentados em células MSC ★ Interleucina 26 * Maltase-glucoamilase (alfa-glucosidase) * Receptor nuclear subfamilia 4, grupo A, membro 2 * Homólogo oncogéneo do osteossarcoma virai murino v-fos FBJ ★ Proteina hipotética DC42 * Receptor nuclear subfamilia 4, grupo A, membro 2 * Homólogo oncogéneo do osteossarcoma virai murino FBJ * Proteina 1 de via de sinalização inducível WNT1 * Sequência de transformação da linha celular derivada MCF. 2 ★ Canal de potássio, subfamilia K, membro 15 * Homeoproteina 1 de cartilagem de classe emparelhada * cADN de Homo Sapiens; FLJ12232 fis, clone MAMMA1001206 * cADN de Homo Sapiens; FLJ34668 fis, clone LIVER2000775 * Proto-oncogene jun B * Célula B CLL/linfoma 6 (proteina 51 de zinco) * Proteina 36 de zinco, tipo C3H, homólogo (rato)

Resumo. 0 presente exame foi realizado para proporcionar uma caracterização molecular das células derivadas do pós-parto, do cordão umbilical e da placenta. Esta análise incluiu células derivadas de três cordões umbilicais diferentes e três placentas diferentes. 0 exame também incluiu duas linhas diferentes de fibroblastos dérmicos, três linhas de células estaminais mesenquimais, e três linhas de células da medula óssea da cristã iliaca. 0 mARN que foi expresso por estas células foi analisado usando uma matriz de oligonucleótidos que continha sondas para 22000 128 genes. Os resultados mostraram que 290 genes são expressos diferencialmente nestas cinco tipos de células diferentes. Estes genes incluem dez genes que são especificamente aumentados nas células derivadas da placenta e sete genes especificamente aumentados nas células derivadas do cordão umbilical. Em cinquenta e quatro genes foram detectados niveis baixos de expressão especifica na placenta e no cordão umbilical, em comparação com os outros tipos de células. A expressão de genes seleccionados foi confirmada por PCR (ver o exemplo que se segue) . Estes resultados demonstram que as células derivadas do pós-parto têm um perfil de expressão do gene distinto, por exemplo, em comparação com as células derivadas da medula óssea e fibroblastos. EXEMPLO 10

Marcadores celulares em células derivadas do pós-parto

No exemplo anterior, as semelhanças e as diferenças em células derivadas da placenta humana e do cordão umbilical humano, foram avaliadas comparando os perfis de expressão de genes com os de células derivadas a partir de outras fontes (usando uma matriz de oligonucleótidos). Seis genes "assinatura" foram identificados: receptor 1 de LDL oxidada, interleucina-8, renina, reticulon, ligando 3 do receptor de quimiocina (ligando 3 CXC), e proteína quimiotática 2 de granulócitos (GCP-2). Estes genes "assinatura" foram expressos em níveis relativamente elevados nas células derivadas pós-parto.

Os procedimentos descritos neste exemplo foram realizados para verificar os dados da micromatriz e encontrar concordância/discordância entre o gene e a expressão da proteína, bem como para estabelecer uma série de ensaios 129 fiáveis para a detecção de identificadores únicos para células derivadas da placenta e umbilicais. Métodos e Materiais Células. Células derivadas da placenta (três isolados, incluindo um isolado predominantemente neonatal identificado pela análise do cariótipo), células derivadas do cordão umbilical (quatro isolados) e fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF; neonatal e adulto) cultivadas em Meio de Crescimento com penicilina/ estreptomicina num frasco T75 revestido com gelatina. Células estaminais mesenquimais (MSCs) foram cultivadas em kit Mesenchymal Stem Cell Growth Médium Bullet (MSCGM; Cambrex, Walkerville, MD).

Para o protocolo de IL-8, as células foram descongeladas a partir de azoto liquido e plaqueadas em frascos revestidos de gelatina a 5000 células/cm2, cultivadas durante 48 horas em Meio de Crescimento e então cultivadas durante mais 8 horas, em 10 ml de meio de privação de soro [DMEM de baixa glucose (Gibco, Carlsbad, CA), penicilina/estreptomicina (Gibco, Carlsbad, CA) e 0,1% (ρ/v) de albumina sérica bovina (BSA; Sigma, St. Louis, MO)]. Após este tratamento o ARN foi extraído e os sobrenadantes foram centrifugados a 150 x g durante 5 minutos para remover os restos celulares. Os sobrenadantes foram então congelados a -80°C para análise de ELISA.

Cultura de células para ensaio ELISA. Células derivadas do pós-parto a partir de placenta e cordão umbilical, bem como fibroblastos humanos derivados do prepúcio neonatal humano foram cultivadas em meio de crescimento em frascos T75 130 revestidos com gelatina. As células foram congeladas na passagem 11 em azoto liquido. As células foram descongeladas e transferidas para tubos de centrifugação de 15 mililitros. Após s centrifugação a 150 x g durante 5 minutos, o sobrenadante foi descartado. As células foram ressuspensas em 4 ml meio de cultura e contadas. As células foram cultivadas em frascos de 75 cm2 contendo 15 ml de Meio de Crescimento a 375000 células/frasco, durante 24 horas. O meio foi mudado para um meio de privação de soro, durante 8 horas. 0 meio de privação de soro foi recolhido no final da incubação, centrifugou-se a 14000 x g durante 5 minutos (e armazenado a -20°C).

Para estimar o número de células em cada frasco, foi adicionado 2 ml de tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, CA) a cada frasco. Após as células se destacarem do frasco, a actividade da tripsina foi neutralizada com 8 ml de Meio de Crescimento. As células foram transferidas para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugadas a 150 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e foi adicionado 1 ml de Meio de Crescimento a cada tubo para ressuspender as células. O número de células foi estimado utilizando um hemocitómetro.

Ensaio ELISA. A quantidade de IL-8 segregada pelas células para o meio de privação de soro foi analisada pelo ensaio ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) . Todos os ensaios foram testados de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.

Isolamento de ARN total. O ARN foi extraído a partir de células confluentes derivadas do pós-parto e fibroblastos 131 ou para a expressão de IL-8 a partir de células tratadas tal como descrito acima. As células foram lisadas com 350 microlitros de tampão de RLT contendo beta-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO) de acordo com as instruções do fabricante (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Valência, CA) . Extraiu-se o ARN de acordo com as instruções do fabricante (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Valência, CA) e submeteu-se a tratamento com DNase (2,7 U/amostra) (Sigma St. Louis, MO). O ARN foi eluido com 50 microlitros de água tratada com DEPC e armazenado a -80°C.

Transcrição reversa. O ARN também foi extraído a partir de placenta humana e cordão umbilical. O tecido (30 mg) foi suspenso em 700 microlitros de tampão de RLT contendo 2-mercaptoetanol. As amostras foram homogeneizadas mecanicamente e a extração de ARN processou-se de acordo com a especificação do fabricante. O ARN foi extraído com 50 microlitros de água tratada com DEPC e armazenado a -80°C. O ARN foi inversamente transcrito usando hexâmeros aleatórios com os reagentes de transcrição reversa TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) a 25°C durante 10 minutos, 37°C durante 60 minutos, e 95°C durante 10 minutos. As amostras foram armazenadas a -20°C.

Os genes identificados por micromatriz de cADN como regulados exclusivamente nas células pós-parto (genes de assinatura - incluindo receptores de LDL oxidada, interleucina-8, renina e reticulon), foram investigados utilizando PCR em tempo real e convencional. PCR em tempo real. A PCR foi realizada em amostras de cADN usando produtos de expressão de genes Assays-on-Demand™: o receptor de LDL oxidada (Hs00234028); renina (Hs00166915); 132 reticulon (Hs00382515) ; ligando 3 CXC (Hs00171061) ; GCP-2 (Hs00605742) ; IL-8 (Hs00174103); e GAPDH (Applied Biosystems, Foster City, CA), foram misturados com o cADN e mistura TaqMan PCR Master Universal de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA), utilizando um sistema de detecção de sequência de 7000 com o software ABI Prism 7000 SDS (Applied Biosystems, Foster City, CA) . As condições de ciclos térmicos foram, inicialmente, de 50°C durante 2 min e 95°C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95°C durante 15 seg e 60°C durante 1 min. Os dados de PCR foram analisados de acordo com as especificações do fabricante (Boletim do Utilizador n° 2 da Applied Biosystems para ABI Prism 7700 Sequence Detection System). PCR convencional. PCR convencional foi realizada utilizando um ABI Prism 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Cambridge, Massachusetts, EUA) para confirmar os resultados da PCR em tempo real. A PCR foi realizada utilizando dois microlitros de solução de cADN, 1 x de mistura tampão de reacção de PCR AmpliTaq Gold Universal (Applied Biosystems, Foster City, CA) e desnaturação inicial a 94°C durante 5 minutos. A amplificação foi otimizada para cada conjunto de iniciadores. Para IL-8, ligando 3 CXC, e reticulon (94°C durante 15 segundos, 55°C durante 15 segundos e 72°C durante 30 segundos durante 30 ciclos); para renina (94°C durante 15 segundos, 53°C durante 15 segundos e 72°C durante 30 segundos para 38 ciclos), para receptores de LDL oxidada e GAPDH (94°C durante 15 segundos, 55°C durante 15 segundos e 72°C durante 30 segundos para 33 ciclos). Os iniciadores utilizados para a amplificação estão listados na Tabela 1. A concentração dos iniciadores na reacção de PCR final foi de 1 micromolar excepto para GAPDH, que foi 133 de 0,5 micromolar. Os iniciadores de GAPDH foram os mesmos que para a PCR em tempo real, com excepção de que a sonda TaqMan do fabricante não foi adicionada à reacção de PCR final. As amostras foram corridas em 2% (p v) de gel de agarose e coradas com brometo de etidio (Sigma, St. Louis, MO). As imagens foram capturadas usando um filme Twinpack 667 Universal (VWR International, South Plainfield, NJ) , utilizando uma câmara Polaroid de distância focal (VWR International, South Plainfield, NJ).

Tabela 10-1: Iniciadores utilizados

Primer name Primers Oxidized LDL receptor S: 5’ -GAGAAATCCAAAGAGCAAATGG-3' A: 5’ -AGAATGGAAAACTGGAATAGG-3’ (SEQÍD NO:1) (SEQ !D NO:2) Renin S: 5’ -TCTTGGATGCTTCGGATTCC-3’ A: 5' ~GAATTCTC GGAATCTCTG TTG-3* (SEG iD NO:3) (SEQ ÍD NO;4) Reticuion S: 5' -TTACAAGCAGTGCAGAAAACC-3’ A: 5’ -AGTAAACÀTTGAAACCACAGCC-3' (SEQ ID NO:5) (SEQ !D NO:6) lnterieukin-8 S: 5' -TCTGCAGCTCTGTGTGAAGG-3 ' A: 5' -CTTCAAAAAGTTCTCCACAACC- 3’ (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:8) Chemokine (CXC) ligand 3 S: 5' -CCCACGCCACGCTCTCC-3' A: 5' -TCCTGTCAGTTG GTGCTCC -3’ (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO: 10)

Imunofluorescência. Os PPDCs foram fixados com 4% (p/v) de paraformaldeido a frio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 10 minutos à temperatura ambiente. Foram utilizados um isolado de cada uma das células derivadas de placenta e umbilicais na passagem 0 (PO) (logo após o isolamento) e na passagem 11 (Pll) (dois isolados de células derivadas da placenta, dois isolados de células derivadas umbilicais) e fibroblastos (Pll). Imunocitoquimica foi efectuada utilizando anticorpos dirigidos contra os seguintes epítopos: vimentina (1:500, Sigma, St. Louis, MO), desmina (1:150, Sigma - gerado contra coelho; ou 1:300, Chemicon, Temecula, CA - gerado contra rato, ), alfa-actina do músculo liso (SMA; 1:400, Sigma), citoqueratina 18 (CK18; 1:400, Sigma), fator de von Willebrand (vWF; 1:200, Sigma) e CD34 (CD34 humano Classe III; 1:100; DakoCytomation, 134

Carpinteria, CA). Além disso, os seguintes marcadores foram testados em células do pós-parto da passagem 11: GRO alfa anti-humano - PE (1:100, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) , GCP-2 anti-humano (1:100, Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA) , receptor de LDL oxidado anti-humano 1 (ox-LDL Rl; 1:100, Santa Cruz Biotech), e NOGA-A anti-humano (1:100, Santa Cruz Biotech).

As culturas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e expostas a uma solução de bloqueio de proteina contendo PBS, 4% (v/v) de soro de cabra (Chemicon, Temecula, CA) e 0,3% (v/v) de Triton (Triton X -100, Sigma, St. Louis, MO) durante 30 minutos para aceder aos antigénios intracelulares. Onde o epítopo de interesse estava localizado na superfície celular (CD34, ox-LDL Rl) , o Triton X-100 foi omisso em todos os passos do processo a fim de evitar a perda do epítopo. Além disso, nos casos em que o anticorpo primário foi gerado contra cabra (GCP-2, ox-LDL Rl, NOGO-A) , foi usado 3% (v/v) de soro de burro no lugar de soro de cabra durante todo. Os anticorpos primários, diluídas em solução de bloqueio, foram então aplicadas às culturas por um período de 1 hora à temperatura ambiente. As soluções de anticorpo primário foram removidos e as culturas foram lavadas com PBS, antes da aplicação das soluções de anticorpo secundário (1 hora à temperatura ambiente) contendo bloco, juntamente com anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho - vermelho do Texas (1:250, Molecular Probes, Eugene, OR) e/ou de cabra anti-IgG de coelho - Alexa 488 (1:250, Molecular Probes) ou de burro anti-cabra IgG - FITC (1:150, Santa Cruz Biotech). As culturas foram então lavadas e 10 micromolar de DAPI (Molecular Probes), aplicado durante 10 minutos para visualizar os núcleos das células. 135

Após imunocoloração, a fluorescência foi visualizada usando um filtro de fluorescência apropriado num microscópio invertido de epi-fluorescência Olympus (Olympus, Melville, NY) . Em todos os casos, a coloração positiva representa o sinal de fluorescência de coloração acima do controlo, onde todo o processo descrito acima foi seguido com a excepção da aplicação de uma solução de anticorpo primário. Imagens representativas foram capturadas usando uma câmara de video digital a cores e software ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA). Para amostras com tripla mancha, cada imagem foi tirada usando apenas um filtro de emissão de cada vez. Montagens em camadas foram preparadas utilizando o software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA).

Preparação de células para análise de FACS. As células aderentes em frascos foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) e isoladas com tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, CA). As células foram recolhidas, centrifugadas, re-suspensas e 3% (v/v) de FBS em PBS a uma concentração de células de 1 x 107 por mililitro. Alíquotas de cem microlitros foram entregues aos tubos cónicos. As células coradas para antigénios intracelulares foram permeabilizadas com Perm/ tampão de lavagem (BD Pharmingen, San Diego, CA). 0 anticorpo foi adicionado às aliquotas de acordo com as especificações do fabricante e as células foram incubadas no escuro durante 30 minutos a 4°C. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover o excesso de anticorpos. As células que requerem um anticorpo secundário foram ressuspensas em 100 microlitros de 3% de FBS. O anticorpo secundário foi adicionado conforme especificação do fabricante e as células foram incubadas no escuro durante 30 minutos a 4°C. Após a 136 incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover o excesso de anticorpo secundário. As células lavadas foram ressuspensas em 0,5 ml de PBS e analisadas por citometria de fluxo. Foram utilizados os seguintes anticorpos: um receptor de LDL oxidada (sc-5813, Santa Cruz Biotech), GROa (555042, BD Pharmingen, Bedford, MA) , IgGl kappa de rato, (P-4685 e M-5284, Sigma), burro contra IgG de cabra (sc-3743; Santa Cruz, Biotech). A análise de citometria de fluxo foi realizada com o FACSCalibur (Becton Dickinson San Jose, CA).

Resultados

Os resultados da PCR em tempo real para genes "assinatura" selecionados realizados em cADN de células derivadas de placentas humanas, fibroblastos neonatais e adultos e células estaminais mesenquimais (MSCs) indicam que tanto o receptor LDL oxidado e renina foram expressos em nivel superior nas células derivadas da placenta em relação a outras células. Os dados obtidos a partir de PCR em tempo real foram analisados pelo método AACT e expressos numa escala logarítmica. Os níveis de Reticulon e expressão do receptor de LDL oxidada eram mais elevados em células derivadas umbilicais em relação a outras células. Não houve diferença significativa nos níveis de expressão do ligando 3 CXC e GCP-2 entre as células derivadas do pós-parto e os controlos. Os resultados de PCR em tempo real foram confirmados por PCR convencional. A sequenciação de produtos de PCR validou, também, estas observações. Não foi encontrada diferença significativa no nível de expressão do ligante 3 CXC entre as células derivadas do pós-parto e os controlos utilizando PCR convencional dos iniciadores do ligante CXC 3 listados acima. 137 A produção da citoquina IL-8 no pós-parto foi elevada em ambas as células derivadas do pós-parto cultivadas em meio de crescimento e privadas de soro. Todos os dados de PCR em tempo real foram validados com PCR convencional e por sequenciamento de produtos de PCR.

Quando os sobrenadantes de células cultivadas em meio isento de soro foram examinados quanto a presença de IL-8, os valores mais elevados foram detectados em meios derivadas de células umbilicais e alguns isolados de células da placenta (Tabela 10-1). Nenhuma IL-8 foi detectada em meio derivado a partir de fibroblastos dérmicos humanos.

Tabela 10-1: Quantidade de proteína IL-8 medida por ELISA

Tipo de célula IL-8 hFibro ND Isolado de placenta 1 ND Isolado de umbilical 1 2058,42 ± 144,67 Isolado de placenta 2 ND Isolado de umbilical 2 2368,86 ± 22,73 Isolado de placenta 3 (O2 normal) 17,27 ± 8,63 Isolado de placenta 3 (baixo 02, W/0 BME) 264, 92 ± 9,88 Resultados do ensaio ELISA para interleucina-8 (IL-8) realizados em células derivadas da placenta e umbilicais bem como em fibroblastos dérmicos humanos. Os valores são apresentados em picogramas/milhão de células, n=2, sem. ND: Não detectado 138

As células derivadas da placenta também foram examinadas para a produção de receptores de LDL oxidada, GCP-2 e GROalfa por análise FACS. As células testaram positivamente para GCP-2. 0 receptor de LDL oxidada e GRO não foram detectados por este método.

As células derivadas da placenta foram também testadas para a produção de proteínas seleccionadas por imunocitoquímica. Imediatamente após o isolamento (passagem 0), as células derivadas da placenta humana foram fixadas com 4% de paraformaldeído e expostas a anticorpos para seis proteínas: Factor de von Willebrand, CD34, citoqueratina 18, desmina, actina do músculo liso e vimentina. Células coraram positivamente tanto para a actina do músculo liso como para a vimentina. Este padrão foi preservado através da passagem 11. Apenas algumas células (<5%) na passagem 0 coraram positivamente para a citoqueratina 18.

As células derivadas do cordão umbilical humano na passagem 0 foram sondadas para a produção de proteínas seleccionadas por imunocitoquímica. Imediatamente após o isolamento (passagem 0), as células foram fixadas com 4% de paraformaldeído e expostos a anticorpos para seis proteínas: fator de von Willlebrand, CD34, citoqueratina 18, desmina, actina do músculo liso e vimentina. As células derivadas umbilicais foram positivas para a actina alda do músculo liso e vimentina, com o padrão de coloração consistente através da passagem 11.

Resumo. Foi estabelecida concordância entre os níveis medidos de expressão de genes por micromatriz e PCR (tanto em tempo real como convencional) para quatro genes: um 139 receptor de LDL oxidada, renina, reticulon, e IL-8. A expressão destes genes foi regulada diferencialmente no nivel de mARNem PPDCs, com a IL-8 também diferencialmente regulada ao nivel da proteina. A presença de receptores de LDL oxidada não foi detectada ao nivel da proteina por análise FACS em células derivadas da placenta. A expressão diferencial de GCP-2 e ligando 3 CXC não foi confirmado ao nivel do mARN, no entanto, GCP-2, foi detectado ao nivel da proteina por análise FACS em células derivadas da placenta.

Embora este resultado não seja reflectido pelos dados originalmente obtidos a partir da experiência de micromatriz, isto pode ser devido a uma diferença na sensibilidade das metodologias.

Imediatamente após o isolamento (passagem 0), as células derivadas da placenta humana coraram positivamente tanto para a actina de músculo liso como para a vimentina. Este padrão foi também observado em células na passagem 11. Estes resultados sugerem que a vimentina e expressão de alfa-actina do músculo liso podem ser preservadas em células com passagem, no meio de crescimento e sob as condições utilizadas nestes procedimentos. As células derivadas do cordão umbilical humano na passagem 0 foram sondadas para a expressão de alfa-actina de músculo liso e vimentina, e foram positivas para ambos. O padrão de coloração foi preservado através da passagem 11. EXEMPLO 11

Avaliação imunológica in vitro das células derivadas do pós-parto

As células derivadas do pós-parto (PPDCs) foram avaliadas in vitro quanto â suas caracteristicas imunológicas num esforço para prever a resposta imunológica, se alguma, 140 estas células iriam provocar in vivo mediante transplante. Os PPDCs foram ensaiados por citometria de fluxo para detectar a presença de HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, e B7-H2. Estas proteínas são expressas por células apresentadoras de antígenos (APC) e são necessárias para a estimulação directa de células ingénuas CD4+ T (Abbas & Lichtman, CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 5 ed. (2003), Saunders, Philadelphia, p. 171). As linhagens de células também foram analisadas por citometria de fluxo para a expressão de HLA-G (Abbas e Lichtman, 2003, supra), CD 178 (Coumans, et al., (1999) Journal of Immunological Methods 224, 185-196) e PD-L2 (Abbas e Lichtman, 2003, supra; Brown, et. al. (2003) The Journal of Immunology 170, 1257-1266). A expressão destas proteínas pelas células residentes nos tecidos placentários é pensada para mediar o estado imuno-privilegiado de tecidos da placenta in utero. Para prever o grau em que as linhas celulares derivadas da placenta e umbilicais induzem uma resposta imune in vivo, as linhas de células foram testadas numa reacção linfocitária mista de uma via (MLR).

Materiais e Métodos

Cultura de células. As células foram cultivadas até à confluência em meio de crescimento contendo penicilina/ estreptomicina, em frascos T75 (Corning, Corning, NY) revestidos com 2% de gelatina (Sigma, St. Louis, MO).

Coloração de anticorpos. As células foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, CA) e isoladas com tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, MO). As células foram recolhidas, centrifugadas e novamente suspensas em 3% (v/v) de FBS em PBS a uma concentração de células de 1 x 107 por ml. O anticorpo 141 (Tabela 11-1) foi adicionado a cem microlitros de suspensão de células de acordo com as especificações do fabricante e incubadase no escuro durante 30 minutos a 4°C. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover o anticorpo não ligado. As células foram re-suspensas em quinhentos microlitros de PBS e analisadas por citometria de fluxo, utilizando um instrumento FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA).

Tabela 11-1. Anticorpos

Anticorpo Fabricante N° de catálogo HLA-DRDPDQ BD Pharmingen (San Diego, CA) 555558 CD8 0 BD Pharmingen (San Diego, CA) 557227 CD86 BD Pharmingen (San Diego, CA) 555665 B7-H2 BD Pharmingen (San Diego, CA) 552502 HLA-G Abcam (Cambridgeshire, UK) ab 7904-100 CD 178 Santa Cruz (San Cruz, CA) sc-19681 PD-L2 BD Pharmingen (San Diego, CA) 557846 Rato IgG2a Sigma (St. Louis, MO) F-6522 Rato IgClkapa Sigma (St. Louis, MO) P-4685

Reação mista de linfócitos. Frascos criopreservados da passagem 10 de células derivadas umbilicais rotulados como linha de células A e da passagem 11 de células derivadas da placenta rotulados como linhagem de células B foram enviados em gelo seco para CTBR (Senneville, Quebec) para realizar uma reação mista de linfócitos usando CTBR SOP No. CAC-031. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram recolhidas a partir de múltiplos doadores voluntários do sexo masculino e do sexo feminino. O 142 estimulador (dador) PBMC alogénico, PBMC autólogo e linhas de células pós-parto foram tratadas com mitomicina C. 0 autólogo e células estimuladoras tratadas com mitomicina C foram adicionados a respondedoras (receptor) PBMC e cultivadas durante 4 dias. Após a incubação, [3H]-timidina foi adicionada a cada amostra e cultivadas durante 18 horas. Após colheita das células marcadas radioactivamente 0 ADN extraído, e a incorporação de [ ]-timidina foi medida utilizando um contador de cintilações. 0 índice de estimulação para o doador alogénico (SIAD) foi calculado como a média da proliferação do receptor mais a mitomicina C tratada com dador alogénico dividido pela proliferação da linha de base do receptor. 0 índice de estimulação dos PPDCs foi calculado como a média da proliferação do receptor mais a linha de células pós-parto tratadas com mitomicina C dividido pela proliferação da linha de base do receptor.

Resultados

Reacção mista de linfócitos - células derivadas da placenta. Sete dadores de sangue voluntários humanos foram pesquisados para identificar um único doador alogénico que exibisse uma resposta de proliferação robusta numa reacção linfocitária mista com os outros seis dadores de sangue. Este dador foi seleccionada como dador alogénico de controlo positivo. Os restantes seis dadores de sangue foram seleccionados como destinatários. 0 doador alogénico de controlo positivo e as linhas celulares derivadas da placenta foram tratadas com mitomicina C e cultivadas numa reacção linfocitária mista com os seis receptores alogénicos individuais. As reações foram realizadas em triplicado utilizando duas placas de cultura de células com 143 três receptores por placa (Tabela 11-2). 0 índice médio de estimulação variou de 1,3 (placa 2) a 3 (placa 1) e os controlos positivos dos dadores alogénicos variaram entre 46,25 (placa 2) a 279 (placa 1) (Tabela 11-3).

Tabela 11-2. Dados da reação mista de linfócitos - Linha celular B (Placenta) DPM for Proliferation Assay ! [ I — Piate ID: Piatel i 1 I Anaiytical number Culture Repíicates System Λ 2 3 Mean i SD cv IM03-7789 Si (donor) Prolíferation baseííne of receiver 79 119 138 112.0 | 30.12 26.9 Cõntrõl õf sutosfimulatíon (Míornyeín C treated sutoíogous celts) 241 272 175 229.3 | 49.54 21.6 MLR aiiogenicdonor IM03-7788 (Mtomyoin C treated) 23971 22352 20921 22414.7 | 1525.97 6.8 MLR witf (Mtomyoin eeli ty ceil tine C treated pe B) 664 55S 1090 ......... 771.0 | 281.21 200 j 36.5 S! (ceí! líne) 7 i | 144

Analytical number Cuiture Replicates System 1 2 3 Mean SD cv IM03-7770 Proliferation baseiine of receiver 206 134 262 200.7 64.17 32,0 Control of autoatimuiation (Mtamycin C treated auíoiogous celis) 1091 602 524 739.0 307.33 41.6 MLR aliogenic donor ÍMQ3-7768 (Mtomycin C treated) 45005 43729 44071 44268.3 660,49 1.5 MLR with ceíl iíns (Mtomycin C treated celi type B) 533 2582 2376 1830.3 1128.24 61.6 Si (donor) 221 Sí (cell Iine) 9 IM03-7771 Proliferation baseiine of receiver 157 87 128 124.0 35.17 28.4 Control of autostimuiation (Mtomycin C treated auíoiogous celis) 293 138 508 313.0 185.81 59.4 MLR aliogenic dortor ÍM03-7768 (Mtomycin C treated) 24497 34343 31388 30077.7 5054.53 16.8 MLR with ceíl Iine (Mtomycin C treated celi type B) 601 643 3 622.0 29.70 4.8 Si (donor) 243 Si (cell Iine) 5 IM03-7772 Proliferation baseiine of receiver 56 98 51 68.3 25.81 37.8 Control of autostimuiation (Mtomycin C treated auíoiogous celis) 133 120 213 155.3 50.36 32.4 M:LR aliogenic donor M03-7768 (Mtomycin G treated) 14222 20076 22168 18822,0 4118.75 21.9 MLR with ceíl Iine (Mtomycin C treated celi type B) 8 3 a a a a SI (donor) 275 SI (celi Iine) _ a 145

Anaiyticai number Culture Replícates System 1 2 3 Mean SD CV IM03-7768 (allogenic donor) Proiiferation baseline of receiver 84 242 208 178.0 83.16 46.7 Conlrol of autostimulation {Mtomycin treated autologous cells) 361 817 304 427.3 166.71 39.0 Cell line type B Proiiferation baseline of receiver 126 124 143 131.0 10.44 8.0 Contro! of autostimulation {Mtomycin treated autologous cells) 822 1075 487 794.7 294.35 37.1 Piate ID: Piate 2 Anaiyticai number Culture System Replícates 1 2 3 Mean SD CV IM03-7773 Proiiferation baseline of receiver Controf of autostimulation (Mitomycin C treated autologous cells) MLR allogenic donor IM 03-7768 (Mitomycin C treated) MLR with call line (Mitomycin C treated ceil type B) 308 181 330 269 405 572 29151 28691 28315 567 732 905 473.0 415.3 28719.0 734.7 384.02 151.76 418.70 169.02 81.2 36.5 1.5 23.0 SI (donor) Si {celi line) 61 2 IMQ3-7774 Proiiferation baseline of receiver Contro! of autostimulation (Mitomycin C treated autologous cells) MLR allogenic donor IMQ3-7768 (Mitomycin C treated) MLR with cell line (Mitomycin C treated cell type B) 893 1376 185 261 381 568 53101 42839 48283 515 769 294 818.0 403.3 48074.3 532.7 599.03 154.71 5134.18 247.97 73.2 38,4 10.7 46.6 146

Plate ID: Plate 2

Analytical Culture 5 Repiicates rtumber System | 1 2 3 Mean SD CV SI {donor) 59 SI (cell íine) | 1 Proliferation basellne of receiver I 1272 300 544 705.3 505.69 71.7 Contraí of | auíostimulation (Mitomycin C treated I 232 199 484 305.0 155.89 51.1 1M03-7775 auloiogous cells) MLR allogenic donor IM03.7768 | 23554 10523 28965 21014.0 9479.74 45.1 (Mftomycin C treated) MLR with cell Iine (Mitomycln C treated | 768 924 563 751.7 181.05 24.1 cell type 8) I SI {donor} 30 Si (cell iine) 1 Proliferation basellne of receiver 1530 137 1046 904.3 707.22 78.2 Controf of auíostimulation (Mitomycin C treated 420 218 394 344.0 109.89 31.9 IM03-7778 autoiogous cells) MLR allogenic donor IM03-7768 | 28893 32493 34746 32044.0 2952.22 9.2 (Mftomycin C treated) MLR with cell Iine (Mitomycln C treated | â a a a a a cell type 8) SI {donor} 35 Sl (cell iine) a

Tabela 11-3. índice de estimulação média das células da placenta e de um dador alogénico numa reação mista de linfócitos com seis dadores alogénicos individuais índice de estimulação média Receptor Placenta Placa 1 (receptores 1-3) 279 3 Placa 2 (receptores 4-6) 46,25 1,3 147

Reacção mista de linfócitos - células derivadas umbilicais.

Seis dadores de sangue voluntários humanos foram pesquisados para identificar um único doador alogénico que exibisse uma resposta de proliferação robusta numa reacção linfocitária mista com os outros cinco dadores de sangue. Este dador foi seleccionada como dador alogénico de controlo positivo. Os restantes cinco dadores de sangue foram seleccionados como destinatários. 0 doador alogénico de controlo positivo e as linhas celulares derivadas da placenta foram tratadas com mitomicina C e cultivadas numa reacção linfocitária mista com os cinco receptores alogénicos individuais. As reações foram realizadas em triplicado utilizando duas placas de cultura de células com três receptores por placa (Tabela 11-4) . 0 indice médio de estimulação variou de 6,5 (placa 1) a 9 (placa 2) e os controlos positivos dos dadores alogénicos variaram entre 47,25 (placa 1) a 70 (placa 2) (Tabela 11-5). 148

Tabela 11-4. Dados da reação mista de linfócitos - Linhacelular A (Umbilical) DPM for Proliferatíon Assay Plaie ID: Ptaíel

Anaiytícai number

Cufture System

Replicates 2 3

Mean

SD

CV IM04-2478

Proliferatíon baseiine of receíver Control of autostímulation {Mitomycin C treated autologouscells) MLRaliogenic danor IM04-2477 {Mitomycin C treated) MLRwithcellíine {Mitomycin C treated celí type A) 1074 406 391 672 510 1402 43777 48391 38231 2914 5622 6109 623.7 861.3 43466.3 4881,7 390.07 475.19 5087.12 1721,36 62.5 55.2 11.7 35.3

Si (danor) SI (eeíl fine) 70 8 IM04-2479

Proliferatíon baseiine of receíver Control ot autostímulation {Mitomycin C treated autologouscelis) MLR allogenic donor IM04-2477 (Mitomycin C treated) MLRwithcellíine {Mitomycin C treated celí type A) 530 508 527 521.7 11.93 2.3 701 567 1111 793.0 283.43 35.7 25593 24732 22707 24344.0 1481.61 8.1 5086 3932 1497 3505.0 1832.21 52.3 S! (donor) SI (eeil iine) 47 7 149

Analytica! nurnber

Ctilture System DPM for Proliferation Assay Plate 10: Plate 1

Replloates 1 2 3

Mean

SD CV ÍM04-2480 SI (donor) SI (ceil line) 1M04-2481 SI (donor) SI (ceil line)

Proliferation baseline of recetver Contrai of autostimulatíon {Mitomycin C treated autologouscelis) MLR allogenic donor IM04-2477 {Mitomycin C treated) MLRwithcelIline {Mitomycin C treated ceil type A)

Proliferation baseline of receiver Contrai of autostimuiation {Mitomycin C treated autologouscelis) MLR allogenic donor IM04-2477 {Mitomycin C treated) MLRwithcelIline {Mitomycin C treated ceil type A) 1192 854 1330 2S63 993 2197 25416 29721 23757 2596 5076 3426 695 451 555 738 1252 464 13177 24885 15444 4495 3671 4674 1125.3 2051.0 26298.0 3699.3 567.0 818.0 17835.3 4280.0 31 8 244.90 21.8 993.08 48.4 3078.27 11.7 1262.39 34.1 122.44 21.6 400.04 48.9 6209.52 34.8 534.95 12.5 150

Plate ID: Plate 2 Anaiyticat Cuiture Replicates number System 1 2 3 j Mean SD cv Prolifera tion baseiine of 432 533 274 i 413.0 130.54 31,6 receiver Control of autosfimulation (Mitomycin C 14S9 633 598 i 896.7 487.31 54.3 treaíed autologous ceils) IM04-2482 MLR allogenic donor IM04-2477 (Mitomycin C 24286 30823 31346 j 28816.3 3933.82 13.7 treated) MLRwith cellline (Mitomycin C treated ceil type 2762 1502 6723 | 3662.3 2724.46 74.4 A) SI (donor) 70 SI (celi line} 9 IM04-2477 (allogenic donor) Prolíforation baseiine of receiver Control of autosiimulation 312 419 349 i 360.0 54.34 15.1 (Mitomycin 567 604 374 i 515.0 123.50 24.0 treated autologous ceils) Proliferation baseiine of 5101 3735 2973 ! 3936.3 1078.19 27.4 receivers Celllinetype Control of A autostimulation (Mitomycin 1924 4570 2153 | 2882.3 1466.04 50.9 treaíed autologous ceils)

Tabela 11-5. índice de estimulação média das células umbilicais e de um dador alogénico numa reação mista de linfócitos com cinco dadores alogénicos individuais índice de estimulação média Receptor Umbilical Placa 1 (receptores 1-4) 42,75 6, 5 Placa 2 (receptor 5) 70 9 151

Antigénios apresentando marcadores de células - células derivadas da placenta. Histogramas de células derivadas da placenta analisadas por citometria de fluxo mostraram expressão negativa de HLA-DR, DP, DQ, CD80, CD86, e B7-H2, tal como observado por fluorescência de valor consistente com a IgG de controlo, indicando que às linhas de células da placenta faltam as moléculas da superfície celular necessárias para estimular directamente células T CD4+'

Marcadores imunomoduladores - células derivadas da placenta. Histogramas de células derivadas da placenta analisados por citometria de fluxo mostraram expressão positiva de PD-L2, como observado pelo aumento do valor de fluorescência em relação ao controle de IgG e expressão negativa de CD178 e HLA-G, como observado por fluorescência de valor consistente com o controlo de IgG.

Antigénios apresentando marcadores de células - células derivadas umbilicais. Histogramas de células derivadas do cordão umbilical analisadas por citometria de fluxo mostraram expressão negativa de HLA-DR, DP, DQ, CD80, CD86, e B7-H2, tal como observado por fluorescência de valor consistente com a IgG de controlo, indicando que as linhas de células umbilicais não possuem as moléculas da superfície celular necessárias para estimular directamente células T CD4+.

Marcadores de células imunomoduladoras - células derivadas umbilicais. Histogramas de células derivadas umbilicais analisados por citometria de fluxo mostraram expressão positiva de PD-L2, como observado pelo aumento do valor de fluorescência em relação ao controle de IgG e expressão 152 negativa de CD178 e HLA-G, como observado pelo valor de fluorescência de acordo com o controlo de IgG.

Resumo. Nas reacções de linfócitos mistas, realizados com linhas celulares derivadas da placenta, o indice médio de estimulação variou de 1,3 a 3, e os controlos positivos alogénicos variaram de 46,25 a 279. Nas reacções de linfócitos mistas, realizados com linhas celulares derivadas umbilicais o indice de estimulação foi de 6,5 a 9 e a dos controlos positivos alogénicos variou entre 42,75 e 70. As linhas celulares derivadas da placenta e umbilicais foram negativas para a expressão das proteínas que estimulam o HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, e B7-H2, tal como medido por citometria de fluxo. As linhas celulares derivadas da placenta e umbilicais foram negativas para a expressão de proteínas imuno-moduladores HLA-G e CD178 e positivas para a expressão de DP-L2, tal como medido por citometria de fluxo. Os dadores alogénicos PBMC continham células apresentadoras de antigénio que expressam HLA-DR, DQ, CD8, CD86, e B7-H2, permitindo assim a estimulação de células ingénuas CD4+ T. A ausência de antigénio que apresentam moléculas da superfície celular nas células derivadas da placenta e umbilicais requeridas para a estimulação directa das células ingénuas CD4+ T e na presença de PD-L2, uma proteína imunomoduladora, que pode ser responsável pelo baixo índice de estimulação exibida por estas células numa MLR, em comparação com os controlos alogénicos. 153 EXEMPLO 12

Secreção de fatores tróficos por células derivadas do pós-parto A secreção de factores tróficos seleccionados a partir de células derivadas da placenta e cordão umbilical foi medida. Factores seleccionadas para a detecção incluiram: (1) os que são conhecidos como tendo atividade angiogénica, tais como o factor de crescimento de hepatócitos (HGF) (Rosen et al. (1997) Ciba Found. Symp. 212:215-26), proteína quimiotática 1 de monócitos (MCP-1) (Salcedo et al. (2000) Blood 96, 34-40), Interleucina-8 (IL-8) (Li et al. (2003) J. Immunol. 170:3369-76), factor de crescimento de queratinócitos (KGF), factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Hughes et al. (2004) Ann.

Thorac. Surg. 77:812-8), matriz de metaloproteinase 1 (TIMPl), angiopoietina 2 (ANG2), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB), trombopoietina (TPO), fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF) , fator derivado do estroma 1 alfa (SDF-lalfa); (2) aqueles que se sabe possuírem actividade neurotrófica/ neuroprotectora, tais como o factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) (Cheng et al. (2003) Dev. Biol. 258, 319-33), Interleucina-6 (IL-6), proteína quimiotáctica 2 de granulócitos (GCP-2), factor de crescimento transformante beta 2 (TGFbeta2) ; e (3) aqueles que se sabe possuírem actividade de quimiocinas, tais como a proteína 1 alfa inflamatória do macrófago (MlPla), proteína inflamatória de macrófagos 1 beta (MlPlbeta) , quimioatractiva 1 de monócitos (MCP-1), Rantes (regulada na activação de células T normais, expressas e segregadas), 1309, timo e quimiocina de activação regulada (TARC), eotaxina, macrófago derivado de quimioquina (MDC), IL-8. 154 Métodos e Materiais

Cultura celular. PPDCs de placenta e cordão umbilical, bem como fibroblastos humanos derivados de prepúcio neonatal humano foram cultivados em Meio de Crescimento com penicilina/estreptomicina em frascos T75 revestidos com gelatina. As células foram criopreservadas na passagem 11 e armazenadas em azoto líquido. Após o descongelamento das células, o Meio de Crescimento foi adicionado às células, seguido por transferência para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugação das células a 150 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi descartado. O sedimento celular foi ressuspenso em 4 ml de Meio de Crescimento, e as células foram contadas. As células foram semeadas num frasco a 375000 células/75 cm2 contendo 15 mililitros de Meio de Crescimento e cultivadas durante 24 horas. O meio foi mudado para um meio isento de soro (DMEM de baixa glucose (Gibco), 0,1% (p/v) de albumina de soro bovino (Sigma), penicilina/estreptomicina (Gibco)), durante 8 horas. O meio condicionado isento de soro foi recolhido no fim da incubação por centrifugação a 14.000 x g durante 5 minutos e armazenado a -20°C. Para estimar o número de células em cada frasco, as células foram lavadas com PBS e separadas usando 2 ml de tripsina/EDTA. A atividade da tripsina foi inibida pela adição de 8 ml de Meio de Crescimento. As células foram centrifugadas a 150 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e as células foram ressuspensas em 1 ml de Meio de Crescimento. O número de células foi estimado utilizando um hemocitómetro.

Ensaio ELISA. As células foram cultivadas a 37°C em 5% de dióxido de carbono e oxigénio atmosférico. As células derivadas da placenta (lote 101503) foram também cultivadas em 5% de oxigénio ou beta-mercaptoetanol (BME). A 155 quantidade de MCP-1, IL-6, VEGF, SDF-lalfa, GCP-2, IL-8, e TGF-beta 2 produzidas por cada amostra de células foi medida por um ensaio de ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) . Todos os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante.

Ensaio ELISA SearchLight multiplexado. Quimiocinas (MlPla, MlPlb, MCP-1, Rantes, 1309, TARC, eotaxina, MDC, IL8), BDNF, e factores angiogénicos (HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMP1, ANG2, PDGF-BB, TPO, HB-EGF foram medidos usando matrizes Proteome Searchlight (Pierce Biotechnology Inc.). As matrizes Proteome são multiplexados por ELISA para a medição quantitativa de duas a 16 proteinas por poço. As matrizes são produzidas através da identificação de um 2 x 2, 3x3 ou 4x4 padrão de quatro a 16 anticorpos de captura diferentes para cada poço de uma placa de 96 poços. Seguindo um procedimento ELISA em sanduíche, a totalidade da placa é trabalhada para capturar o sinal quimioluminescente gerado em cada ponto dentro de cada poço da placa. A quantidade de sinal gerado em cada ponto é proporcional à quantidade de proteína alvo no padrão original ou amostra.

Resultados

Ensaio ELISA. MCP-1 e IL-6 foram segregadas por células da placenta e cordão umbilical e fibroblastos derivados dérmicos (Tabela 12-1). SDF-lalfa foi segregada pelas células cultivadas derivadas da placenta em 5% de O2 e pelos fibroblastos. GCP-2 e IL-8 foram segregadas por células derivadas umbilicais e por células derivadas da placenta cultivadas na presença de BME ou 5% de 02. GCP-2 também foi segregada por fibroblastos humanos. TGF-beta2 não foi detectável por análise de ELISA. 156

Tabela 12-1. Resultados do ensaio ELISA (os valores apresentados são picograma/mililitro/milhão de células (n=2, sem)) MCP-1 ÍL-6 VEGF SDE-1» GCP-2 | il-8 J TGF-ftó Fibroblast 17.1.:1 6113 29x:2 19H 2111 I ND ND Placenta (042303) 60+3 41.12 ND ND ND | ND 1 i ND Umbilícus (022803) 1150-74 4234-289 ND ND 160-11 I 2058.1.145 ND Placenta (071003) 125116 10.l1 ND ND ND ND ND Umbilícus (071003) 2794 x84 1356 143 ND ND 2184.198 2369+23 ND Placenta (101503) BME 211:10 6713 ND ND 4419 1719 ND Placenta (101503) 5%Oa,VWO BME 771.16 339.121 ND 11491137 541.2 265110 ND Key: ND: Nat Detected.

Ensaio ELISA SearchLight multiplexado. TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MlPlb, MCP1, RANTES, 1309, TARC, MDC, e IL-8 foram segregadas a partir de células derivadas umbilicais (Tabelas 12-2 e 12- 3) . TIMP1, TPO, KGF, HGF, HBEGF, BDNF, MlPla, MCP-1, RANTES, TARC, Eotaxina, e IL-8 foram segregadas a partir de células derivadas da placenta (Tabelas 12-2 e 12-3). Nenhuma Ang2, VEGF ou PDGF-BB foram detectados.

Tabela 12-2. Resultados do ensaio ELISA Searchlight multiplexado TIMP1 ANG2 | PDGFbb TPO j KGF HGF FGF | VEGF I HBEGF BDNF Hfb 19306.3 ND I ND 230.5 I 5,0 ND ND ! 27.9 j 1.3 ND P1 24299.5 NO I ND 546.6 I 8.8 16.4 ND i ND I 3.81.3 ND LM 57718.4 ND I ND 1240.0 | 5.8 559.3 148.7 j ND ! 9.3 165.7 P3 14176.8 ND [ ND 568.7 I 5.2 10.2 ND ! ND I 1,9 33.6 157 ! TIMP1 ANG2 | PDGFbb TPO j KGF HGF j FGF VEGF HBEGF BDNF U3 ! 21850.0 ND ! ND 1134.5 j 9.0 195.6 | 30.8 ND 5.4 388.6

Key: tiFB (hutnan fibrobiasís.), P1 (placenta-derived celís (042303)), U1 (Limbiiicus-derived cells (022803)), P3 (placenta-derived ceíls (071003)), U3 (umbilicus-derived cefls (071003)). ND: Naí Deiected.

Tabela 12-3. Resultados do ensaio ELISA Searchlight multiplexado j MSP 1a MiP 1b MCP 1 RANTES 1309 TARC Eotaxin MDC IL8 hF8 ND ND 39.6 ND ND 0.1 ND ND 204.9 P1 79.5 ND 228.4 4.1 ND 3.8 12.2 ND 413.5 U1 | ND 8.0 1694.2 ND 22,4 37.6 ND 18.9 51930.1 P3 | ND ND 102.7 ND ND 0.4 ND ND 63.8 U3 | ND 5.2 2018.7 41.5 11,6 21,4 ND 4.8 10515.9 Key: hFB (human fibrobíasts), PI (placenta-derived PPDC (042303)), UI (umbilicus-derived PPDC (022803)), P3 (placenta-derived PPDC (071003}), U3 (umbilicus-derived PPDC (071003)). ND Not Detected.

Resumo. Células derivadas umbilicais e da placenta segregaram uma série de fatores tróficos. Alguns destes factores tróficos, tais como HGF, bFGF, MCP-1 e IL-8, desempenham papéis importantes na angiogénese. Outros factores tróficos, tais como FNEC e IL-6, têm papéis importantes na regeneração neural. EXEMPLO 13

Diferenciação neural a curto prazo de células derivadas do pós-parto

Foi examinada a capacidade das células derivadas da placenta e umbilicais (colectivamente células derivadas do pós-parto ou PPDCs) para se diferenciarem em células de linhagem neural.

Materiais e Métodos

Isolamento e expansão das células pós-parto. PPDCs a partir de tecidos da placenta e do cordão umbilical foram isolados e expandidos como descrito no Exemplo 1. 158

Protocolo Woodbury-Black modificado. (A) Este ensaio foi adaptado a partir de um ensaio realizado inicialmente para testar o potencial de indução neural De células estromais de medula óssea (Woodbury, D. et al. (2000) J. Neurosci. Res. 61 (4):364-370) (células derivadas umbilicais (022,803) P4 e células derivadas da placenta (042,203) P3 foram descongeladas e expandidas em cultura em meios de crescimento a 5000 células/cm2 até a sub-confluência (75%) ser atingida. As células foram então tripsinizadas e semeadas a 6000 células por poço numa placa de vidro Titretek II (VWR International, Bristol, CT) Como controlos, as células estaminais mesenquimais (P3; 1F2155; Cambrex, Walkersville, MD), osteoblastos (P5; CC2538; Cambrex), células derivadas do tecido adiposo (Artecel, US6555374 Bl) (P6; Dador 2) e fibroblastos dérmicos humanos neonatais (P6; CC2509; Cambrex) também foram semeadas sob as mesmas condições.

Todas as células foram inicialmente expandidas durante 4 dias em meio DMEM/F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) , contendo 15% (v/v) (FBS, Hyclone, Logan, UT) de soro fetal de bovino, factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF, 20 nanogramas/mililitro, Peprotech, Rocky Hill, NJ) , fator de crescimento epidérmico (EGF; 20 nanogramas/mililitro; Peprotech) e penicilina/estreptomicina (Invitrogen). Após quatro dias, as células foram lavadas em solução salina de tampão de fosfato (PBS; Invitrogen) e foram posteriormente cultivadas em meio DMEM/F12 + 20% (v/v) de FBS + penicilina/estreptomicina durante 24 horas. Após 24 horas, as células foram lavadas com PBS. As células foram então cultivadas durante 1-6 horas num meio de indução composto de DMEM/F12 (isento de soro) contendo 200 mM de hidroxianisol butilado, 10 μΜ de cloreto de potássio, 5 mg/ 159 ml de insulina, 10 μΜ de forscolina, 4 μΜ de ácido valpróico e 2 μΜ de hidrocortisona (todos os produtos químicos da Sigma, St. Louis, MO). As células foram então fixadas em metanol a 100% arrefecido com gelo e foi executada imunocitoquímica, (ver métodos a seguir) para avaliar a expressão da proteína humana nestina. (B) PPDCs (umbilicais (022,803) Pll; placenta (042,203) Pll) e fibroblastos dérmicos humanos adultos (1F1853, Pll) foram descongelados e expandidos em cultura em Meio de Crescimento a 5000 células/cm2 até a sub-confluência (75%) ser atingida. As células foram então tripsinizadas e semeadas a uma densidade semelhante à de (A) , mas em (1) cultura de tecidos de 24 poços tratados com placas (TCP, marca Falcon, VWR Internacional), (2) poços TCP + 2% (p/v) de gelatina adsorvida durante 1 hora à temperatura ambiente, ou (3) poços TCP + 20 pg/ml de laminina adsorvida de ratinho (adsorvido por um período mínimo de 2 horas a 37°C; Invitrogen).

Exactamente como em (A) , as células foram inicialmente ampliadas e ligadas ao meio pelos prazos acima mencionados. Um conjunto de culturas foi fixado, como antes, aos 5 dias e seis horas, desta vez com 4% de paraformaldeído gelado (p/v) (Sigma) durante 10 minutos à temperatura ambiente. No segundo conjunto de culturas, o meio foi removido e transferido para meio de expansão de progenitoras neurais (NPE), constituído por um meio Neurobasal A (Invitrogen) contendo B27 (suplemento B27; Invitrogen), L-glutamina (4 mM) e penicilina/estreptomicina (Invitrogen). O meio NPE foi ainda suplementado com ácido retinóico (RA, 1 μΜ; Sigma) . Este meio foi removido 4 dias mais tarde e as culturas foram fixadas com 4% de paraformaldeído gelado 160 (p/v) (Sigma) durante 10 minutos à temperatura ambiente e coradas para nestina, GFAP e expressão da proteina TuJl (ver Tabela Nl-1).

Tabela 13-1. Resumo dos anticorpos primários usados

Anticorpo Concentração Vendedor Rato 401 (nestina) 1:200 Chemicon, Temecula, CA Nestina humana 1:100 Chemicon TuJl (Tubulina Beta III) 1:500 Sigma, St. Louis, MO GFAP 1:2000 DakoCytomation, Carpinteria, CA Tirosina hidroxilase (TH) 1:1000 Chemicon GABA 1: 400 Chemicon Desmina (rato) 1:300 Chemicon Actina do músculo liso alfa 1:400 Sigma Proteina nuclear humana (hNuc) 1:150 Chemicon

Protocolo de diferenciação em dois estágios. PPDCs (umbilicais (042.203) Pll, placenta (022.803) Pll) , fibroblastos adultos dérmicos humanos (Pll; 1F1853; Cambrex) foram descongelados e a cultura expandida em meio de crescimento a 5000 células/cm 2 até a sub-confluência (75%) ser atingida. As células foram então tripsinizadas e semeadas a 2000 células/cm 2' mas em placas de 24 poços revestidas com laminina (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) , na presença de meio NPE suplementado com bFGF (20 nanogramas/mililitro; Peprotech, Rocky Hill, NJ) e EGF (20 nanogramas/mililitro; Peprotech) [toda a composição do meio 161 mais conhecida como NPE + F + E] . Ao mesmo tempo, progenitores neurais do rato adulto isolados do hipocampo (P4, (062603)), também foram plaqueadas em placas de 24 poços revestidas com laminina em meio NPE + F + E. Todas as culturas foram mantidas nestas condições durante um periodo de 6 dias (células foram alimentadas uma vez durante esse tempo) , ao fim do qual o meio foi transferido para as condições de diferenciação listadas na Tabela Nl-2, por um periodo adicional de 7 dias. As culturas foram fixadas com 4% de paraformaldeido gelado (p/v) (Sigma) durante 10 minutos à temperatura ambiente e coradas para a nestina humana ou de rato, GFAP, e expressão da proteína TuJl.

Tabela 13-2. Sumário das condições do Protocolo de diferenciação em dois estágios A B COND. # PRE-DÍFFERENTIATION 2«<* STAGE DIFF 1 NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/m!) NPE + SHH (200 ng/ml) + F8 (100 ng/ml) 2 NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/ml) NPE + SHH (200 ng/ml) + F8 (100 ng/ml) + RA(1 μΜ) 3 NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/m!) NPE + RA (1 ju.M) 4 NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/m!) NPE + F (20 ng/mi) + E (20 ng/ml) 5 NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/m!) Growth Médium 6 NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/m!) Condition 1B + MP52 (20 ng/m!) 7 NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/m!) Condition 1B + 8MP7 (20 ng/ml) 8 NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/m!) Condition 1B + GDNF (20 ng/ml) 9 NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/m!) Condition 2B + MP52 (20 ng/m!) 10 NPE + F (20 ng/ml) + E (20 ng/m!) Condition 2B + BMP? (20 ng/ml) 162 A B COND. # PRE-DiFFERENTIATtON 2”d STAGE DIFF 11 NPE + F (20 ng/mí) + E (20 ng/ml) Condition 2B + GDNF (20 ng/ml) 12 NPE * F (20 ng/mí) + E (20 ng/ml) Condition 3B + MP52 (20 ng/mí) 13 NPE * F (20 ng/mí) + E (20 ng/mí) Condition 3B + BMP7 (20 ng/ml) 14 NPE + F(20 ng/mí) + E{20 ng/ml) Condition 3B + GDNF (20 ng/ml) 15 NPE + F (20 ng/mí) + E(20 ng/ml) NPE + MP52 (20 ng/mí) 16 NPE + F (20 ng/mí) + E(20 ng/ml) NPE + BMP7 (20 ng/ml) 17 NPE + F (20 ng/mí) + E(20 ng/ml) NPE + GDNF (20 ng/ml)

Protocolo de factor de crescimento múltiplo. Células derivadas umbilicais (Pll, (042203)) foram descongeladas e expandidas em cultura em Meio de Crescimento a 5000 células/cm2 até a sub-confluência (75%) ser atingida. As células foram então tripsinizadas e semeadas a 2000 células/cm2, em placas de 24 poços revestidas com laminina (BD Biosciences) , na presença de NPE + F (20 nanogramas/ mililitro) + E (20 nanogramas/mililitro). Além disso, alguns poços continham NPE + F + E + FBS a 2% ou 10% de FBS. Após quatro dias de condições de "pré-diferenciação", todos os meios foram removidos e as amostras foram transferidas para meio NPE suplementado com hedgehog sónico (SHH, a 200 nanograma/ mililitro, Sigma, St. Louis, MO), FGF8 (100 nanogramas/mililitro; Peprotech), BDNF (40 nanogramas/mililitro, Sigma), GDNF (20 nanogramas/ mililitro, Sigma) e ácido retinóico (1 μΜ, Sigma). Sete dias após a mudança do meio, as culturas foram fixadas com 4% de paraformaldeido gelado (p/v) (Sigma) durante 10 minutos à temperatura ambiente e coradas para nestina humana, GFAP, TUJ1, desmina e expressão de alfa-actina do músculo liso.

Protocolo de co-cultura de progenitores neurais.

Progenitores do hipocampo de ratos adultos (062.603) foram plaqueados como neuroesferas ou células individuais (10000 163 células/poço) em placas de 24 poços revestidas com laminina (BD Biosciences) em NPE + F (20 nanogramas/mililitro) + E (20 nanogramas/mililitro).

Separadamente, as células derivadas do cordão umbilical (042.203 Pll) células derivadas da placenta (022.803) Pll foram descongeladas e a cultura expandida em NPE + F (20 nanogramas/mililitro) + E (20 nanogramas/mililitro) a 5000 células/cm 2 para um período de 48 horas. As células foram então tripsinizadas e semeadas a 2500 células/poço em culturas de células progenitoras neurais existentes. Nessa altura, o meio existente foi trocado por meio fresco. Quatro dias mais tarde, as culturas foram fixadas com 4% de paraformaldeído gelado (p/v) (Sigma) durante 10 minutos à temperatura ambiente e coradas para a proteína nuclear humana (hNuc; Chemicon) (Tabela NU1-1 acima), para identificar os PPDCs.

Imunocitoquimica. A imunocitoquimica foi realizada utilizando os anticorpos listados na Tabela NU1-1. As culturas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e expostas a uma solução de bloqueio de PBS contendo proteína, 4% (v/v) de soro de cabra (Chemicon, Temecula, CA) e 0,3% (v/v) de Triton (Triton X -100; Sigma) durante 30 minutos para aceder antigénios intracelulares. Os anticorpos primários, diluídos em solução de bloqueio, foram então aplicados às culturas por um período de 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, as soluções de anticorpos primários foram removidas e as culturas lavadas com PBS, antes da aplicação das soluções de anticorpo secundário (1 hora à temperatura ambiente) contendo solução de bloqueio juntamente com anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho - vermelho do Texas (1:250, Molecular Probes, 164

Eugene, OR) e IgG de cabra anti-coelho - Alexa 488 (1:250, Molecular Probes). As culturas foram então lavadas e 10 micromolar DAPI (Molecular Probes), aplicado durante 10 minutos para visualizar os núcleos das células.

Após a imunocoloração, a fluorescência foi visualizada usando o filtro de fluorescência apropriado num microscópio invertido de epi-fluorescência Olympus (Olympus, Melville, NY) . Em todos os casos, a coloração positiva representada pelo sinal de fluorescência de coloração acima do controlo, onde todo o processo descrito acima foi seguido com a excepção da aplicação de uma solução de anticorpo primário. Imagens representativas foram capturadas usando uma câmara de video digital a cores e software ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA) . Para amostras manchadas em triplicado, cada imagem foi tirada usando apenas um filtro de emissão de cada vez. Montagens de camadas foram preparadas utilizando o software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA).

Resultados

Protocolo Woodbury-Black. (A) Após a incubação nesta composição de indução neural, todos os tipos de células foram transformadas em células com morfologia bipolar e processos extensos. Outras morfologias não-bipolares maiores também foram observadas. Além disso, as populações de células induzidas coraram positivamente para a nestina, um marcador de células estaminais neurais multipotentes e progenitoras. (B) Quando repetido em pratos de plástico de cultura de tecido (TCP), a expressão da nestina não foi observada 165 senão quando a laminina foi pré-adsorvida para a superfície da cultura. Para avaliar ainda se as células expressando nestina poderiam então passar a gerar neurónios maduros, PPDCs e fibroblastos foram expostos ao NPE + RA (1 μΜ) , a composição do meio conhecida por induzir a diferenciação de células estaminais neurais e progenitoras em tais células (2, 3, 4). As células foram coradas para TuJl, um marcador de neurónios imaturos e maduros, GFAP, um marcador de astrócitos e nestina. Sob condições não foi detectado TuJl, nem foram observadas células com morfologia neuronal, sugerindo que os neurónios não foram gerados a curto prazo. Além disso, a nestina e GFAP já não eram expressos pelos PPDCs, conforme determinado por imunocitoquímica.

Diferenciação em duas fases. PPDC umbilicais e da placenta isolados (bem como os fibroblastos humanos e progenitoras neurais de roedores como tipos de células de controlo negativo e positivo, respectivamente), foram semeadas em pratos de laminina (promotor neural) revestidas e expostas a diferentes condições de crescimento 13 (e duas condições de controle) conhecidas para promover a diferenciação de progenitores neurais em neurónios e astrócitos. Além disso, adicionou-se duas condições para examinar a influência de GDF5 e BMP7 na diferenciação de PPDC. Geralmente, foi feita uma abordagem em duas fases da diferenciação, em que as células foram colocadas em primeiro lugar em condições de expansão das progenitoras neurais durante um período de 6 dias, seguido por condições de diferenciação completa durante 7 dias. Morfologicamente, tanto as células derivadas umbilicais e da placenta exibiram mudanças fundamentais na morfologia das células ao longo do tempo, durante este procedimento. No entanto, as células neuronais ou em forma de astrocítos 166 não foram observadas, excepto para as progenitoras neurais plaqueadas em condições de controlo. A imunocitoquimica, negativa para a nestin humana, TuJl e GFAP confirmou as observações morfológicas. Vários factores de crescimento. Seguindo-se à exposição de uma semana, para uma variedade de agentes de diferenciação neural, as células foram coradas para marcadores indicativos de progenitores neurais (nestina humana), neurónios (TuJl), e astrócitos (GFAP). As células cultivadas na primeira fase em meio não soro tiveram morfologias diferentes do que as células em meio contendo soro (2% ou 10%), indicando diferenciação neuronal potencial. Especificamente, na sequência de um processo de duas fases de exposição de células derivadas umbilicais para EGF e bFGF, seguido de SHH, FGF8, o GDNF, BDNF e ácido retinóico, as células mostraram longos processos extensos semelhantes para a morfologia dos astrócitos em cultura. Quando 2% de FBS e 10% de FBS foram incluídos no primeiro estágio de diferenciação, o número de células foi aumentado e a morfologia das células permaneceu inalterada a partir de culturas de controlo de alta densidade. A diferenciação neural potencial não foi evidenciada por imunocitoquimica para a nestina humana, TuJl ou GFAP.

Co-cultura de progenitoras neurais e PPDC. PPDCs foram semeados em culturas de células progenitoras neurais de ratos semeados dois dias antes em condições de expansão neural (NPE + F + E). Embora a confirmação visual de PPDCs plaqueados demonstrasse que estas células foram plaqueadas como células individuais, a coloração nuclear especifica humana (hNuc) 4 dias após a plaqueação (total de 6 dias) demonstraram que eles tendem a estragar-se e evitar o 167 contacto com as células progenitoras neurais. Além disso, quando os PPDCs são ligados, estas células espalham-se e parecem estar inervadas pelos neurónios diferenciados que eram de origem de rato, sugerindo os PPDCs se podem ter diferenciado em células musculares. Esta observação baseou-se na morfologia sob microscopia de contraste de fase. Outra observação foi que, normalmente, grandes corpos celulares (maiores do que os progenitores neurais) possuem morfologias semelhantes a progenitores neurais, com processos finos abrangendo várias direções. A coloração HNuc (encontrada em metade do núcleo da célula) sugeriu que, em alguns casos, estas células humanas podem ser fundidas com células progenitoras de rato e assumir o seu fenótipo. Poços de controlo contendo apenas progenitores neurais tiveram menos progenitores totais e células diferenciadas aparentes do que poços de co-cultura contendo PPDCs umbilicais ou da placenta, indicando, ainda, que ambas as células derivadas umbilicais e da placenta influenciaram a diferenciação e o comportamento dos progenitores neurais, seja pela liberação de quimiocinas e citoquinas, ou por efeitos mediados por contacto.

Resumo. Protocolos múltiplos foram conduzidos para determinar o potencial de curto prazo de PPDCs para se diferenciarem em linhagens de células neurais. Estes incluíam imagens de contraste de fase de combinação de morfologia com imunocitoquímica para nestina, TyJl e GFAP, proteínas associadas com células estaminais multipotentes e células progenitoras neurais, neurónios imaturos e maduros, e astrócitos, respectivamente. A evidência observada segere que a diferenciação neuronal em certos casos, ocorreu nestes protocolos de curto prazo. 168 Várias observações notáveis foram feitas em co-culturas de PPDCs com progenitores neurais. Esta abordagem, utilizando PPDCs humanos, juntamente com um tipo de células xenogénicas permitiu a determinação absoluta da origem de cada célula nestas culturas. Primeiro, algumas células foram observadas nestas culturas onde o citoplasma celular foi ampliado, com processos semelhantes a neurites que se estendem para longe do corpo da célula, mas apenas a metade do corpo marcado com proteina hNuc. Essas células podem ter sido PPDCs humanos que se tivessem diferenciado em células de linhagem neural ou podem ter sido PPDCs que se tivessem fundido com células progenitoras neurais. Em segundo lugar, verificou-se que as células progenitoras neurais estendiam as neurites para os PPDCs de uma maneira que indica que as células progenitoras se diferenciam em neurónios e inervaram os PPDCs. Em terceiro lugar, as culturas de células progenitoras neurais e PPDCs tinham mais células de origem de rato e maiores quantidades de diferenciação do que as culturas de células progenitoras neurais de controlo isoladamente, indicando ainda que PPDCs plaqueados forneciam factores solúveis e mecanismos dependentes de contacto que estimularam a sobrevivência, a proliferação e/ou diferenciação de células progenitoras neurais.

Referências para o Exemplo 13 (1) Woodbury, D. et al. (2000) J. Neurosci. Res. 61 (4) :364-370. (2) Jang, YK et al. (2004) J. Neurosci. Res. 75 (4) :573-584. (3) Jones-Villeneuve, EM et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3 (12):2271-2279. 169 (4) Mayer-Proschel, M. et al. (1997) Neuron. 19 (4):773- 785. EXEMPLO 14

Diferenciação neural de longo prazo de células derivadas do pós-parto A capacidade das células derivadas de placenta e do cordão umbilical (colectivamente designadas por células derivadas do pós-parto ou PPDCs) para se submeterem a diferenciação de longo prazo nas células da linhagem neural foi avaliada.

Materiais e Métodos

Isolamento e expansão de PPDCs. Os PPDCs foram isoladas e expandidos conforme descrito nos exemplos anteriores.

Plaqueamento de células PPDC descongeladas. Alíquotas congeladas de PPDCs (umbilicais (022.803) Pll, (042.203) Pll, (071.003) P12; placenta (101.503) P7) previamente cultivadas em Meio de Crescimento foram descongeladas e semeadas a 5000 células/cm2 em frascos T-75 revestidos com laminina (BD, Franklin Lakes, NJ) e um meio Neurobasal-A (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo B27 (suplemento B27, Invitrogen), L-glutamina (4 mM) e penicilina/ estreptomicina (10 mililitros), a combinação do que é aqui referida como meio de expansão de progenitores neurais (NPE). 0 meio NPE foi complementado com bFGF (20 nanogramas/mililitro, Peprotech, Rocky Hill, NJ) e EGF (20 nanogramas/mililitro, Peprotech, Rocky Hill, NJ), aqui referido como NPE + bFGF + EGF.

Controlo das células plaqueadas. Além disso, fibroblastos dérmicos humanos adultos (Pll, Cambrex, Walkersville, MD) e células estaminais mesenquimais (P5, Cambrex) foram 170 descongeladas e colocadas em placas à mesma densidade de sementeira de células em frascos T-75 revestidos com laminina em NPE + bFGF + EGF. Como mais um controlo, os fibroblastos, PPDCs umbilicais e da placenta foram cultivados em Meio de Crescimento durante o período especificado para todas as culturas.

Expansão celular. 0 meio de todas as culturas foi substituído por meio novo, uma vez por semana e as células observadas para a expansão. Em geral, cada cultura foi passada uma vez ao longo de um período de um mês devido a um crescimento limitado em NPE + bFGF + EGF.

Imunocitoquimica. Após um período de um mês, todos os frascos foram fixadas com 4% de paraformaldeído a frio (p/ v) (Sigma) durante 10 minutos à temperatura ambiente. A imunocitoquimica foi efectuada utilizando anticorpos dirigidos contra TuJl (BIII Tubulina; 1:500, Sigma, St. Louis, MO) e GFAP (proteína glial fibrilar ácida; 1:2000; DakoCytomation, Carpinteria, CA). Resumidamente, as culturas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e expostas a uma solução de bloqueio de proteína contendo PBS, 4% (v/v) de soro de cabra (Chemicon, Temecula, CA) e 0,3% (v/v) de Triton (Triton X-100, Sigma) durante 30 minutos para aceder aos antigénios intracelulares. Os anticorpos primários, diluídos em solução de bloqueio, foram então aplicados às culturas por um período de 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, as soluções de anticorpos primários foram removidos e as culturas lavadas com PBS, antes da aplicação das soluções de anticorpo secundário (1 hora à temperatura ambiente) contendo bloco, juntamente com anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho - vermelho do Texas (1:250, Molecular Probes, 171

Eugene, OR) e de cabra anti-IgG de coelho - Alexa 488 (1:250, Molecular Probes). As culturas foram então lavadas e 10 micromolar DAPI (Molecular Probes) aplicado durante 10 minutos para visualizar os núcleos das células.

Tabela 14-1. Resumo dos anticorpos primários usados

Anticorpo Concentração Vendedor TuJl (Tubulina Beta III) 1:500 Sigma, St. Louis, MO GFAP 1:2000 DakoCytomation, Carpinteria, CA

Resultados O meio NPE + bFGF + EGF retarda a proliferação de PPDCs e altera a sua morfologia. Imediatamente a seguir ao plaqueamento, um subconjunto de PPDCs foi ligado a frascos de cultura revestidas com laminina. Isto pode ter sido devido à morte celular como uma função do processo de 172 congelamento/descongelamento ou por causa das novas condições de crescimento. As células que se ligaram adoptaram morfologias diferentes daquelas observadas no meio de crescimento.

Após a confluência, as culturas foram repicadas e observadas para o crescimento. Muito pouco expansão ocorreu dessas células que sobreviveram à passagem. Neste ponto, muito pequenas células sem morfologia de propagação e com caracteristicas de fase brilhante começaram a aparecer nas culturas de células derivadas umbilicais. Estas áreas do frasco foram seguidas ao longo do tempo. A partir destas células pequenas, emergiram processos bifurcantes com varicosidades ao longo dos seus comprimentos, caracteristicas muito semelhantes aos progenitores neuronais PSA-NCAM+ descritos anteriormente e neurónios imaturos TuJl+ derivadas do cérebro e da medula espinhal (1, 2) . Com o tempo, estas células tornaram-se mais numerosas, mas ainda só foram encontradas em clones.

Os clones de células derivadas umbilicais expressam proteínas neuronais. As culturas foram fixadas em um mês após o descongelamento/plaqueamento e coradas para a proteína neuronal TuJl e GFAP, um filamento intermediário encontrado em astrócitos. Embora todas as culturas de controlo cultivadas em Meio de Crescimento e fibroblastos humanos e MSCs cultivadas em meio NPE + bFGF + EGF foram consideradas TuJl-/GFAP-, TuJl foi detectado nos PPDCs umbilicais e da placenta. A expressão foi observada nas células com e sem morfologias do tipo neuronal. Nenhuma expressão de GFAP foi observada em qualquer cultura. A percentagem de células que expressam TuJl com morfologias do tipo neuronal foi inferior ou igual a 1% do total da 173 população (η = 3 célula derivadas umbilicais isoladas testadas). Embora não quantificados, a percentagem de células TuJl+ sem morfologias neuronais foi maior em culturas de células derivadas do cordão umbilical do que em culturas de células derivadas da placenta. Estes resultados que aparentavam ser específicos como controles pareados pela idade em Meio de Crescimento Médio não expressavam TuJl.

Resumo. Foram desenvolvidos métodos para gerar neurónios diferenciados (com base na expressão TUJ1 e morfologia neuronal) a partir de células derivadas umbilicais. Enquanto a expressão de TuJl não foi examinada anteriormente a um mês, in vitro, é evidente que, pelo menos, uma pequena população de células derivadas umbilicais pode dar origem a neurónios, quer através da diferenciação por defeito ou por meio da indução de longa duração, após a exposição de um mês a um meio mínimo suplementado com L-glutamina, FGF básico, e EGF.

Referências para o Exemplo 14 (1) Mayer-Proschel, M. et al. (1997) Neuron 19 (4):773- 785.

(2) Yang, H. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97 (24) :13366-13371. EXEMPLO 15

Fatores tróficos de PPDC para suporte de progenitores neurais A influência das células derivadas do cordão umbilical e da placenta (coletivamente células derivadas do pós-parto ou 174 PPDCs) na estaminais mecanismos examinada. sobrevivência e diferenciação em células adultas e células progenitoras através de dependentes do não-contato (tróficos) foi

Materiais e Métodos

Isolamento de células estaminais neurais adultas e progenitoras. Ratos adultos Fisher 344 foram sacrificados por asfixia com C02, seguido por deslocamento cervical. Os cérebros inteiros foram removidos intactos utilizando fórceps e o tecido do hipocampo foi dissecado baseado em incisões posteriores coronais às regiões do cérebro motoras e somatossensoriais (Paxinos G. e Watson, C. 1997. THE RAT BRAIN IN STEREOTAXIC COORDINATES). Os tecidos foram lavados em meio Neurobasal-A (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo B27 (suplemento B27; Invitrogen), L-glutamina (4 mM, Invitrogen), e penicilina/estreptomicina (Invitrogen), a combinação dos quais é aqui referida como meio de expansão de progenitores neurais (NPE) . 0 meio NPE foi complementado com bFGF (20 nanogramas/mililitro, Peprotech, Rocky Hill, NJ) e EGF (20 nanogramas/mililitro, Peprotech, Rocky Hill, NJ), aqui referido como NPE + bFGF + EGF.

Após a lavagem, as meninges sobrepostas foram removidas, e os tecidos picados com um bisturi. O tecido triturado foi recolhido e adicionada tripsina/EDTA (Invitrogen) como 75% do volume total. ADNse (100 microlitros por volume total de 8 ml, Sigma, St. Louis, MO) foi também adicionada. Em seguida, o tecido/meio foi passado sequencialmente através de uma agulha de calibre 18, uma agulha de calibre 20 e, finalmente, uma agulha de calibre 25 uma vez cada (todas as agulhas a partir de Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). A mistura foi centrifugada durante 3 minutos a 250 g. O 175 sobrenadante foi retirado, NPE + bFGF + EGF fresco foi adicionado e o sedimento foi ressuspenso. A suspensão celular resultante foi passada através de uma célula de filtro de 40 micrómetros (Becton Dickinson) , semeadas em placas revestidas com laminina frascos T-75 (Becton Dickinson) ou em placas de 24 poços com pouca fragmentação (Becton Dickinson) , e cultivadas em meio NPE + bFGF + EGF até ser obtido o número de células suficientes os estudos indicados.

Plaqueamento de PPDC. Células derivadas do pós-parto (umbilicais (022.803) P12 (042.103) P12 (071.003) P12; placenta (042.203) P12) previamente cultivadas em Meio de Crescimento foram semeadas a 5000 células/poço de inserção (dimensionado para 24 poços por placa) e cultivadas por um período de uma semana em meio de crescimento em pastilhas para atingir a confluência.

Plaqueamento de células progenitoras neurais adultas.

Progenitores neurais, cultivados como neuroesferas ou como células individuais, foram semeados em placas de 24 poços revestidas com laminina a uma densidade aproximada de 2000 células/poço em NPE + bFGF + EGF durante um período de um dia para promover a adesão celular. Um dia depois, as inserções contendo células pós-parto foram adicionadas de acordo com o seguinte esquema: (1) Poço de inserção (células derivadas umbilicais em meio de crescimento, 200 microlitros) + progenitores neurais (NPE + bFGF + EGF, 1 mililitro) 176 (2) Poço de inserção (células derivadas da placenta em meio de crescimento, 200 microlitros) + progenitores neurais (NPE + bFGF + EGF, 1 mililitro) (3) Poço de inserção (fibroblastos dérmicos humanos adulto s [1F1853; Cambrex, Walkersville, MD] P12 em meio de crescimento, 200 microlitros) + progenitores neurais (NPE + bFGF + EGF, 1 mililitro) (4) Controlo: progenitores neurais isoladamente (NPE + bFGF + EGF, 1 mililitro) (5) Controlo: progenitores neurais isoladamente (apenas NPE, 1 mililitro)

Imunocitoquimica. Após 7 dias de co-cultura, todas as condições foram fixadas com 4% de paraformaldeido a frio (p/v) (Sigma) durante um período de 10 minutos à temperatura ambiente. A imunocitoquimica foi efectuada utilizando anticorpos dirigidos contra os epítopos listados na Tabela 15-1. Resumidamente, as culturas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e expostas a uma solução de bloqueio de proteína contendo PBS, 4% (v/v) de soro de cabra (Chemicon, Temecula, CA) e 0,3% (v/v) de Triton (Triton X-100, Sigma) durante 30 minutos para aceder aos antigénios intracelulares. Os anticorpos primários, diluídas em solução de bloqueio, foram então aplicados às culturas por um período de 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, as soluções de anticorpos primários foram removidos e as culturas lavadas com PBS, antes da aplicação das soluções de anticorpo secundário (1 hora à temperatura ambiente com solução de bloqueio juntamente com anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho - vermelho do Texas (1:250, Molecular Probes, Eugene, OR) e de cabra anti-IgG de coelho 177 - Alexa 488 (1:250, Molecular Probes). As culturas foram então lavadas e 10 micromolar DAPI (Molecular Probes) aplicado durante 10 minutos para visualizar os núcleos das células.

Após imunocoloração, a fluorescência foi visualizada usando um filtro de fluorescência apropriado num microscópio invertido de epi-fluorescência Olympus (Olympus, Melville, NY) . Em todos os casos, a coloração positiva representada pelo sinal de fluorescência de coloração acima do controlo, onde todo o processo descrito acima foi seguido com a excepção da aplicação de uma solução de anticorpo primário. Imagens representativas foram capturadas usando uma câmara de video digital a cores e software ImagePro (Media Cybernetics, Carlsbad, CA) . Para amostras manchadas em triplicado, cada imagem foi tirada usando apenas um filtro de emissão de cada vez. Montagens de camadas foram preparadas utilizando o software Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA).

Tabela 15-1. Resumo dos anticorpos primários usados

Anticorpo Concentração Vendedor Rato 401 (nestina) 1:200 Chemicon, Temecula, CA TuJl (Tubulina Beta III) 1:500 Sigma, St. Louis, MO Tirosina hidroxilase (TH) 1:1000 Chemicon GABA 1:400 Chemicon GFAP 1:2000 DakoCytomation, Carpinteria, CA Proteína de mielina básica (MBP) 1: 400 Chemicon 178

Análise quantitativa da diferenciação de células progenitoras neurais. A quantificação da diferenciação de células progenitoras neurais do hipocampo foi examinada. Um minimo de 1000 células foram contadas por condição ou se inferior, pelo número total de células observadas nessa condição. A percentagem de células positivas numa dada mancha foi determinada dividindo-se o número de células positivas pelo número total de células, como determinado por coloração com DAPI (nuclear).

Espectrometria de massa e análise de electroforese em gel 2D. Para identificar factores únicos, segregados, como resultado da co-cultura, as amostras de meio condicionado tiradas antes da fixação da cultura foram congeladas até à temperatura de -80°C durante a noite. As amostras foram então aplicadas a dispositivos de rotação de ultrafiltração (peso molecular de corte de 30 kD) . O retentado foi aplicado a cromatografia de imunoafinidade (anti-Hu-albumina; IgY) (a imunoafinidade não remove a albumina a partir das amostras). O filtrado foi analisado por MALDI. A passagem foi aplicada através de cromatografia de afinidade Blue Cibachron. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e electroforese em gel 2D.

Resultados A co-cultura de PPDC estimula a diferenciação de células progenitoras neurais adultas. Após a cultura com células derivadas do cordão umbilical ou da placenta, a co-cultura de células neurais progenitoras derivadas do hipocampo de rato adulto exibiram significativa diferenciação ao longo de todas as três linhagens principais do sistema nervoso central. Este efeito foi claramente observado após cinco dias de co-cultura, com numerosas células elaborando 179 processos complexos e perdendo as suas características de fase brilhante característica da divisão de células progenitoras. Por outro lado, os progenitores neuronais cultivados isoladamente, na ausência de bFGF e EGF aparentavam estar pouco saudáveis e a sobrevivência foi limitada.

Após a conclusão do procedimento, as culturas foram coradas para marcadores indicativos de células estaminais indiferenciadas e progenitoras (nestina), neurónios imaturos e maduros (TUJ1) , astrócitos (GFAP), e oligodendrócitos maduros (MBP). A diferenciação ao longo de todas as três linhagens foi confirmada, enquanto as condições de controlo não exibiram diferenciação significativa tal como evidenciado pela retenção de coloração positiva para a nestina entre a maioria das células. Embora ambas as células derivadas umbilicais e da placenta induziram a diferenciação celular, o grau de diferenciação em todas as três linhagens foi menor em co-culturas com células derivadas da placenta que em co-cultura com as células derivadas umbilicais. A percentagem de células progenitoras neurais diferenciadas após a co-cultura com as células derivadas umbilicais foi quantificada (Tabela 15-2) . As células derivadas umbilicais aumentaram significativamente o número de oligodendrócitos maduros (MBP) (24.0% vs 0% em ambas as condições de controlo). Além disso, a co-cultura aumentou o número de astrócitos GFAP + e neurónios TuJl+ em cultura (47,2% e 8,7%, respectivamente). Estes resultados foram confirmados pela coloração de nestina, indicando que o estado do progenitor foi perdido após a co-cultura (13,4% vs 71,4% no estado de controlo 4). 180

Embora a diferenciação também pareça ser influenciada por fibroblastos humanos adultos, tais células não foram capazes de promover a diferenciação de oligodendrócitos maduros nem foram capazes de gerar uma quantidade considerável de neurónios. Embora não quantificados, os fibroblastos pareceram, no entanto, melhorar a sobrevivência das células progenitoras neurais.

Tabela 15-2. Quantificação da diferenciação de progenitores de controlo vs. Co-cultura em poços de inserção de células derivadas umbilicais

Anticorpo F+E/Umb [Cond.l] F+E/F+E [Cond. 4] F+E/removido [Cond. 5] TuJl 8,7% 2,3% 3, 6% GFAP 47,2% 30, 2% 10, 9% MBP 23, 0% 0% 0% Nestina 13,4% 71, 4% 39, 4%

Identificação de compostos originais. Meios condicionados a partir de co-culturas derivadas do cordão umbilical e da placenta, juntamente com os controles adequados (meio NPE ± 1,7% de soro, meio de co-cultura com fibroblastos), foram examinados pelas diferenças. Potencialmente, os compostos originais foram identificados e excisados a partir dos seus respectivos géis 2D.

Resumo. A co-cultura de células progenitoras neurais adultas com PPDCs umbilicais ou placenta resultou na diferenciação dessas células. Os resultados apresentados neste exemplo indicam que a diferenciação de células progenitoras neurais adultas após co-cultura com as células derivadas do cordão umbilical é especialmente profunda. 181

Especificamente, uma percentagem significativa de oligodendrócitos maduros foi gerada em co-culturas de células derivadas do cordão umbilical. Em vista da falta de contacto entre as células derivadas umbilicais e os progenitores neuronais, este resultado parece ser uma função de factores solúveis libertados pelas células derivadas umbilicais (efeito trófico). Várias outras observações foram feitas. Em primeiro lugar, houve muito poucas células na condição de controlo onde EGF e bFGF foram removidos. A maioria das células morreu e, em média, havia cerca de 100 células por poço ou menos. Em segundo lugar, é de esperar que houvesse pouca diferenciação na condição de controlo onde EGF e bFGF foi mantido em todo o meio, uma vez que este é normalmente um meio de expansão. Apesar de aproximadamente 70% das células foram observadas como mantendo o seu estado de progenitor (nestinaf), cerca de 30% eram GFAP+ (indicativo de astrócitos) . Isto pode ser devido ao facto de tal expansão significativa ocorrer durante o curso do processo que o contacto entre progenitores induziu esta diferenciação (Song, H. et al. 2002. Nature 417:29-32). EXEMPLO 16

Transplante de células derivadas do pós-parto Células derivadas do cordão umbilical e da placenta pós-parto são úteis para terapias regenerativas. 0 tecido produzido pelas células derivadas do pós-parto (PPDCs) transplantado em ratinhos SCID com um material biodegradável foi avaliado. Os materiais avaliados eram esteiras não tecidas feitas de fibras compostas de de polimero poli (ácido láctico-ácido co-glicólico) (10/90 182 PLGA), doravante referido como VNW, 35/65 de espuma PCL/PGA e 16 RAD de péptidos de hidrogel de automontagem. Métodos e Materiais

Cultura de Células. Células derivadas da placenta e umbilicais foram cultivadas em Meio de Crescimento (DMEM baixa glucose (Gibco, Carlsbad CA), 15% (v/v) de soro fetal bovino (Cat. # SH30070.03, Hyclone, Logan, UT) , 0,001% (v/ v) de beta-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO), penicilina/estreptomicina (Gibco)) em frascos revestidos com gelatina.

Preparação de Amostras. Um milhão de células viáveis foram semeadas em 15 microlitros de Meio de Crescimento em estruturas VNW de 5 mm de diâmetro, 2,25 mm de espessura (64,33 miligramas/cc; Lot # 3547-47-1) ou de espuma 35/65 PCL/PGA de 5 mm de diâmetro (Lot # 3415-53) . As células foram deixadas a ligar durante duas horas antes de adicionar mais Meio de Crescimento para cobrir as estruturas. As células foram cultivadas durante a noite em estruturas. As estruturas sem células também foram incubadas em meio.

Os 16 RAD de péptidos de automontagem (matriz 3D, Cambridge, MA sob um acordo de transferência de material) foram obtidos na forma de uma solução estéril a 1% (p/v) em água, que foi misturada a 1:1 com 1 x 106 células em 10% (p/v) de sacarose (Sigma, St. Louis, MO), 10 mM de HEPES, em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco), imediatamente antes de usar. A concentração final das células em hidrogel RAD16 é 1 x 106 células/100 microlitros. 183

Material de teste (N = 4 / Rx) 1. VNW + 1 x 106 células derivadas umbilicais 2. Espuma 35/65 PCL/PGA + 1 x 106 células derivadas do cordão umbilical 3. 16 RAD de péptidos de automontagem + 1 x 106 células derivadas umbbilicais 4. VNW + 1 x 106 células derivadas da placenta 5. Espuma 35/65 PCL/PGA + 1 x 106 células derivadas da placenta 6. 16 RAD de péptidos de automontagem + 1 x 106 células derivadas da placenta

7. Espuma 35/65 PCL/PGA 8 . VNW

Preparação dos animais. Os animais foram tratados e mantidos de acordo com as actuais exigências da Lei de Bem-Estar Animal. O cumprimento das leis públicas acima foi realizado pela adesão aos regulamentos do Bem-Estar Animal (9 CFR) e em conformidade com as normas vigentes promulgadas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, 7a Edição.

Ratinhos (Mus musculus), Fox Chase SCID/machos (Harlan Sprague Dawley, Inc., Indianapolis, Indiana), 5 semanas de idade. Toda a manipulação dos ratinhos SCID ocorreu sob um capuz. Os ratinhos foram pesados individualmente e anestesiados com uma injecção intraperitoneal de uma mistura de 60 miligramas/kg de Ketaset (cloridrato de 184 cetamina, Aveco Co., Inc., Fort Dodge, Iowa) e 10 miligramas/Kg de Rompun (xilazina, Mobay Corp, Shawnee, Kansas) e solução salina. Após a indução da anestesia, a totalidade da parte de trás do animal a partir da região cervical dorsal para a área lombossacral dorsal foi depilada usando cortadores eléctricos. A área foi, em seguida, esfregada com diacetato de clorhexidina, lavada com álcool, seca e pintada com uma solução iodófora aquosa de 1% de iodo disponivel. Pomada oftálmica foi aplicada nos olhos para evitar a secagem do tecido, durante o período anestésico. Técnica de implante subcutâneo. Quatro incisões cutâneas, cada uma aproximadamente de 1,0 cm de comprimento, foram produzidas no dorso dos ratinhos. Dois sítios cranianos foram localizados transversalmente ao longo da região torácica lateral dorsal, cerca de 5 mm caudal até à borda inferior palpável da escápula, um à esquerda e outro à direita da coluna vertebral. Outros dois foram colocados transversalmente ao longo da área do músculo glúteo ao nível sacro-lombar caudal, cerca de 5 mm, caudal à cristã ilíaca palpável, um em cada lado da linha mediana. Os implantes foram aleatoriamente colocados nestes locais, de acordo com o desenho experimental. A pele foi separada do tecido conjuntivo subjacente para fazer um pequeno bolso e o implante colocado (ou injectado para RAD16) cerca de 1 cm caudal em relação a incisão. O material de teste adequado foi implantado no espaço subcutâneo. A incisão na pele foi fechada com grampos metálicos.

Alojamento dos animais. Os ratinhos foram alojados individualmente em gaiolas microisolator durante todo o curso do estudo, dentro de um intervalo de temperatura de 64°C - 79°C e humidade relativa de 30% a 70%, e mantidos 185 num valor aproximado de ciclo de 12 horas dia/12 horas noite. A temperatura e a humidade relativa do ar foram mantidas dentro dos limites estabelecidos durante a maior parte do trmpo possível. A dieta era composta de Irradiated Pico Rato Chow 5058 (Purina Co.) e água ad libitum.

Os ratinhos foram sacrificados nos seus intervalos designados por inalação de dióxido de carbono. Os locais de implantação subcutânea com sua pele sobrejacente foram retirados e congelados para histologia.

Histologia. A pele retirada com o implante foi fixada com 10% de formalina tamponada neutra (Richard Allan, Kalamazoo, MI) . As amostras com tecido sobrejacente e adjacente foram cortadas centralmente, processadas com parafina e incorporados na superfície do corte usando métodos de rotina. Cortes de tecido de cinco mícrons foram obtidos por micrótomo e corados com hematoxilina e eosina (Poly Scientific Bay Shore, NY) , utilizando métodos de rotina.

Resultados

Houve um crescimento mínimo de tecido em espumas (sem células) implantadas subcutaneamente em ratinhos SCID após 30 dias. Em contraste, houve enchimento de tecido extenso em espumas implantados com células derivadas do cordão umbilical ou de células derivadas da placenta. Algum crescimento interno de tecido foi observado em estruturas VNW. Estruturas não tecidas semeadas com células derivadas umbilicais ou da placenta mostraram um aumento da deposição de matriz e de vasos sanguíneos maduros. 186

Resumo. Discos não tecidos sintéticos absorviveis/discos de espuma (5,0 mm de diâmetro x 1,0 mm de espessura) ou péptido de hidrogel de automontagem foram semeados com células derivadas umbilicais ou da placenta humana ou implantados bilateralmente por via subcutânea na região da espinha dorsal de ratinhos SCID. Os resultados demonstraram que as células derivadas do pós-parto podem aumentar drasticamente a qualidade de formação do tecido em estruturas biodegradáveis. EXEMPLO 17

Uso de células derivadas do pós-parto em reparação neural

Lesões de células ganglionares da retina (RGC) têm sido amplamente utilizadas como modelos para diversas estratégias de reparação no sistema nervoso central de mamíferos adultos. Demonstrou-se que a secção retrobulbar de axónios de roedores adultos RGC resulta em germinação abortiva (Zeng et al., 1995) e a morte progressiva da população de células-mãe (Villegas-Perez et al., 1993).

Numerosos estudos demonstraram os efeitos estimuladores de vários factores exógenos e endógenos na sobrevivência de axotomia do RGC e regeneração dos seus axónios (Yip e So, 2000; Fischer et al., 2001). Além disso, outros estudos demonstraram que o transplante de células pode ser utilizado para promover a regeneração dos axónios dos nervos cortados (Li et al., 2003; Ramon-Cueto et al., 2000) . Assim, estes e outros estudos demonstraram que a terapia baseada em células pode ser utilizada para o tratamento de distúrbios neurais que afectam a medula espinhal, os nervos periféricos, os nervos pudendos, os nervos ópticos ou outras doenças/traumas devido a uma lesão em que pode ocorrer danos nervosos. 187

Peptídeos de automontagem (PuraMatrix™, Patentes US 5670483, 5955343, Pedidos PCT US2002/0160471, WO02/062969) têm sido desenvolvidos para actuar como uma estrutura para células de fixação para encapsular células, em 3-D, placa de células em revestimentos em 2-D ou como microtransportadores em culturas em suspensão. A cultura celular tridimensional tem exigido tanto de materiais de origem animal (extrato de sarcoma de rato), com a reprodutibilidade inerente e problemas de sinalização celular, ou muito maiores estruturas sintéticas, que não se conseguem aproximar da escala nanométrica dos atributos fisicos e quimicos da ECM nativa. RAD 16 (NH2-(RADA)3 -COOH) e KLD (NH2-(KLDL)3-COOH) são sintetizados em pequenos (RAD16 é de 5 nanómetros) fragmentos de oligopeptídeos de automontagem em nanofibras de magnitude semelhante à matriz extracelular in vivo (ECM) (matriz 3D, Inc. Cambridge, MA). A automontagem é iniciada por catiões mono- ou di- valentes encontrados em meios de cultura ou em ambiente fisiológico. Nos protocolos descritos neste exemplo, RAD 16 foi usado como um microveiculo para a implantação de células pós-parto no defeito ocular. Neste exemplo, demonstra-se que os transplantes de células derivadas do pós-parto PPDCs) podem proporcionar uma eficácia no modelo de regeneração do nervo óptico axonal de ratos adultos. Métodos e Materiais Células. Culturas de PPDCs humanos adultos (umbilicais e placenta) e células de fibroblastos (passagem 10) foram ampliadas para a passagem 1. Todas as células foram inicialmente semeadas a 5000 células/cm2 em frascos T75 revestidas com gelatina em Meio de Crescimento com 100 unidades de penicilina por mililitro, 100 microgramas de estreptomicina por mililitro, 0,25 microgramas por mililitro de anfotericina B (Invitrogen, Carlsbad, CA). Na 188 passagem 11 as células foram tratadas com tripsina e a viabilidade foi determinada utilizando coloração por azul de tripano. Resumidamente, 50 microlitros de suspensão de células foram combinados com 50 microlitros de 0,04% p/v de azul de tripano (Sigma, St Louis, MO) e o número de células viáveis, foi estimado utilizando um hemocitómetro. As células foram então lavadas três vezes em meio L-15 com suplemento livre de Leibovitz (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células foram então suspensas a uma concentração de 200000 células em 25 microlitros de RAD-16 (3DM Inc., Cambridge, MA) a qual foi tamponada e tornada isotónica como as recomendações do fabricante. Cem microlitros de meio L-15 com suplemento livre de Leibovitz foram adicionados às células/matriz de suspensão acima para a manter húmida até à utilização. Estas células/culturas de matrizes foram mantidas sob condições atmosféricas normais até ocorrer o transplante. No momento da transplantação o excesso de meio foi removido.

Animais e cirurgia. Foram utilizados ratos fêmeas Long Evans (220-240 gramas de peso corporal). Sob anestesia intraperitoneal com tribromoetanol (20 miligramas/100 gramas de peso corporal), o nervo óptico foi exposto, e a bainha do nervo óptico foi incisada intraorbitalmente a aproximadamente 2 milímetros a partir do disco óptico, o nervo foi levantado a partir da bainha para permitir a transsecção completa com uma tesoura fina (Li et al., 2003). A conclusão da transsecção foi confirmada através da observação visual da separação completa dos cotos proximal e distai. O grupo de controlo consistiu em ratos lesionados sem transplantes. Em ratos transplantados foram inseridas culturas células pós-parto semeadas em RAD-16 entre os cotos proximal e distai, utilizando um par de micropinças. 189

Aproximadamente 75000 células em RAD-16 foram implantadas no nervo óptico separado. A célula/matriz foi untada no corte cortado usando um par de microfórceps finos. A bainha do nervo óptico decepado foi fechada com monofilamento 10/0 de nylon preto (Ethicon, Inc., Edinburgh, UK) . Assim, a abertura foi fechada nas extremidades proximal e distai do corte do nervo na proximidade uma da outra.

Após serem executadas injecções de células, os animais foram injectados com a dexametasona (2 mg/kg) durante 10 dias pós-transplante. Para o periodo de duração do estudo, os animais foram mantidos com ciclosporina A oral (210 mg/litro de água de beber, concentração no sangue resultante: 250-300 microgramas/litro) (Bedford Labs,

Bedford, Ohio) desde 2 dias de pré-transplante até ao final do estudo. Comida e água estavam disponíveis ad libitum. Os animais foram sacrificados em cada 30 ou 60 dias pós-transplante .

Aplicação CTB. Três dias antes de os animais serem sacrificados, sob anestesia, uma micropipeta de vidro com uma ponta de 30-50 milímetros foi introduzida tangencialmente através da esclera por trás da lente, e duas alíquotas de 4-5 microlitros de 1% de solução aquosa do traçador retrógrado da toxina B da cólera (CTB) (List Biologic, Campbell, CA), foram injectadas no vítreo. Os animais foram perfundidos com fixador e os nervos ópticos foram recolhidos no mesmo fixador por 1 hora. Os nervos ópticos foram transferidos para a sacarose durante a noite. Vinte secções criostáticas micrómetras foram incubadas em 0,1 molar de glicina, durante 30 minutos e bloqueadas em solução de PBS contendo 2,5% de albumina de soro bovino (BSA) (Boeringer Mannheim, Mannheim, Alemanha) e 0,5% de triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO), seguindo-se uma 190 solução contendo anticorpo de cabra anti-CTB (List Biologic, Campbell, CA) diluído 1:4000 em PBS contendo 2% de soro normal de coelho (NRS) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2,5% de BSA, e 2% de Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO) em PBS, e incubadas em anticorpo de coelho biotinilado de IgG de anti-cabra (Vector Laboratories, Burlinghame, CA) , diluída a 1:200 em 2% de Triton-X100 em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente. Isto foi seguido por coloração em 1:200 de estreptavidina-verde (Alexa Flour 438, Molecular Probes, Eugene, OR) em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente. Secções coradas foram depois lavadas em PBS e contrastadas com iodeto de propídio por microscopia confocal.

Preparação para a histologia. Resumidamente, 5 dias após a injecção de CTB, os ratos foram perfundidos com paraformaldeído a 4%. Aos ratos foram dados quatro centímetros cúbicos de uretano e, em seguida, foram perfundidos com PBS (0,1 molar) e depois com 4% de paraformaldeído. A medula espinal foi cortada e retirada do osso da cabeça para expor o colículo. O colículo foi então removido e colocado em 4% de paraf ormaldeído. O olho foi removido por meio de corte em torno do exterior do olho e indo o mais para trás possível. Foi tido cuidado para não cortar o nervo óptico, que se situa na parte inferior do olho. Os olhos foram removidos e os músculos foram cortados expondo o nervo óptico e, em seguida, colocados em 4% de paraformaldeído.

Resultados

Lesões isoladas. Um mês depois da secção retrotubular do nervo óptico, foram identificados um número de axónios CTB marcados no segmento do nervo ligado à retina. Nos 200 191 micrómetros mais próximos do corte, os axónios foram observados a emitir uma série de colaterais em ângulos rectos em relação ao eixo principal e terminarem como um emaranhado neuromatoso na superfície de corte. Neste corte entre os cotos proximal e distai, observou-se que o intervalo era progressivamente reduzido por um segmento de 2-3 milímetros de tecido conectivo vascularizado; no entanto, não foram observados axónios para avançar para esta área em ponte. Assim, nos animais que receberam somente lesão axonal nenhum crescimento foi observado para chegar ao coto distai.

Transplante RAD-16. Após transplante de RAD-16 para dentro do corte, foi observado o crescimento interno visível do tecido conectivo vascularizado. No entanto, nenhum crescimento axonal foi observado entre os cotos proximal e distai. Os resultados demonstram que a aplicação de RAD-16 isoladamente não é suficiente para induzir a regeneração axonal nesta situação.

Transplante de células derivadas do pós-parto. 0 transplante de células derivadas do pós-parto para o nervo óptico decepado estimulou o recrescimento do nervo óptico. Algum recrescimento também foi observado em condições em que as células fibroblásticas foram implantadas, embora tenho sido mínimo em comparação com o crescimento observado com as células derivadas da placenta transplantadas. A regeneração do nervo óptico foi observada em 4/5 animais transplantados com células derivadas da placenta, 3/6 animais transplantados com fibroblastos dérmicos adultos e em 1/4 animais transplantados com células derivadas umbilicais. Em situações em que se observou regeneração, a marcação com CTB confirmou a regeneração de axónios de 192 retina, células ganglionares da retina, que se demonstrou penetrarem através da área do transplante. A marcação com GFAP também foi realizada para determinar o grau de cicatriz glial. A expressão GFAP foi intensificada no coto proximal com alguma imunocoloração sendo observado pelo enxerto reinervado.

Resumo. Estes resultados demonstram que as células derivadas do pós-parto adultas humanas transplantadas são capazes de estimular e orientar a regeneração de axônios das células ganglionares seccionadas da retina.

Referências para o Exemplo 17 1) Zeng, BY, Anderson, PN, Campbell, G, Lieberman, AR (1995) J. Anat. 186:495-508. 2) Villegas-Perez, MP, Vidal-Sanz, M, Bray, GM, Aguayo, AJ (1988) J. Neurosci. 8:265-280. 3) Yip, HK, So, KF (2000) Prog. Retin. Eye Res. 19:559-575. 4) Fischer, D Heiduschka, P, Thanos, S. (2001) Exp.

Neurol. 172:257-272. 5) Ramon-Cueto, A, Cordero, MI, Santos-Benito, FF, Avila, J. (2000) Neuron 25:425-435. EXEMPLO 18

Uso de células derivadas do pós-parto na reparação neural dopaminérgica Células derivadas do pós-parto umbilicais e da placenta foram testadas quanto à sua capacidade para conferir 193 melhorias funcionais em roedores lesionados com 6-hidroxidopamina (6-OHDA), como um modelo para o tratamento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson. Métodos e Materiais

Modelo Animal e Agrupamento. Lesão intraparenquimatosa neuroquimica do estriato, SNC, ou via nigroestriatal por 6-hidroxidopamina (6-OHDA) é comumente utilizada como um modelo de roedor de confiança para a doença de Parkinson. 6-OHDA destrói os neurónios dopaminérgicos, e que conduz ao desenvolvimento da doença de Parkinson. Ratos com dois meses de idade do sexo feminino Sprague-Dawley (275-300g), que estavam a ser lesionados com 6-OHDA no feixe do cérebro anterior medial, induzindo um fenótipo parkinsoniano, foram comprados directamente a partir de Charles River Laboratories (Montreal, Canadá).

Após a chegada, os animais tiveram um periodo de uma semana de habituação antes de se submeterem a transplante, e foi permitido alimentar ad libitum durante todo o periodo experimental excepto durante o jejum exigido pelos peritos para o ensaio descrito abaixo. Os ratos foram alojados dois por gaiola, monitorizados diariamente para a variação de peso e testados durante o ciclo 12:12 de fase de luz e de fase de escuro. Os cuidados com os animais e as experiências foram conduzidos de acordo com o Guia Canadiano para o cuidado e uso de animais de laboratório e todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care Committee da Universidade de Lavai. Déficits comportamentais associados com a or lesão 6-OHDA foram avaliados duas e meia semanas de pós-operatório pela apomorfina. 194

As pontuações rotativas foram utilizadas para distribuir os animais em quatro grupos. 0 enxerto foi realizado aleatoriamente por dois investigadores envolvidos neste estudo. Três grupos foram enxertados com diferentes tipos de células (n = 18 por cada tipo celular; desconhecido para o grupo de pesquisa) e um grupo recebeu o veiculo (meio de cultura de células) e serviu como controlo (n = 6) . Os ratos foram sacrificados às 4, 8 e 16 semanas após o transplante (n = 6 por tipos de células e n = 2 de controlo em cada ponto de tempo) . Antes de cada sacrifício, os ratos foram avaliados periodicamente por meio de três medidas comportamentais: desafio apomorfina, teste de pata hábil e movimento da cabeça.

Transplantes de células. Culturas células derivadas umbilicais de adulto humano, derivadas da placenta e fibroblastos (original) (passagem 10) foram ampliadas para uma passagem. Todas as células foram inicialmente semeadas a 5000 células/cm 2 sobre frascos T75 revestidos com gelatina em Meio de Crescimento. Para as passagens subsequentes, todas as células foram tratadas como se segue. Após a tripsinação, as células viáveis foram contadas após coloração com azul de tripano para a viabilidade. Resumidamente, 50 microlitros de suspensão de células foi combinado com 50 microlitros de azul de tripano (Sigma, St. Louis, MO) e o número de células viáveis, foi estimado usando um hematocitrómeto. As células foram tripsinizadas e lavadas três vezes em meio DMEM: baixa glucose (Invitrogen, Carlsbad, CA), (este meio é livre de soro e de suplemento). Culturas de células do pós-parto humano e fibroblastos (passagem 11) foram tripsinizadas e lavadas duas vezes em meio L-15 de Leibovitz, (Invitrogen, Carlsbad, CA) . As células (2 x 105 células por injeção) 195 foram ressuspensas em 2 microlitros de meio L-15 de Leibovitz, (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Cirurgia animal. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo IACUC (Centre de Recherche du CHUL, local RC-9800, 2705 Boulevard Laurier,

Ste-Foy, Quebec, Canadá G1V 4G2) . O transplante foi efectuado com anestesia de cetamina/xilazina (75/10mg/kg ip) , com os animais montados numa pequena moldura estereotáxica para animais (modelo 900, David Kopf Instruments, Tujunga, CA) . Cada transplante foi realizado através da infusão das células através de uma agulha biselada de aço inoxidável de calibre 26 (45de °) ligada a uma micro-seringa 5μ1 (Hamilton Company, Reno, NV) montadas numa unidade de bomba de infusão de micro-injecção motorizada (Modelo UMPII, David Kopf Instruments, Tujunga, CA) . As células (ou meio de cultura) foram infundidas no estriado, a uma taxa de 1,0 μΐ/min/sítio a uma concentração média de 100000 células/ml para um total de 2 μΐ por animal, de acordo com as seguintes coordenadas (se a concentração era mais baixa, o volume da injeção foi ajustado para transplantar consistentemente o mesmo número de células em todos os animais): A = 0,5 mm anterior ao bregma, L = 3,0 mm lateral à linha média, V = -4,7 mm (local 1) e -4,5 mm (local 2 ) vertical abaixo da dura, com a barra incisiva definida -2,5 mm abaixo da linha interaural. Após a conclusão da injeção das células, a agulha foi deixada no local durante mais 3 min, para permitir a difusão das células antes da retracção da agulha. Os ratos foram tratados com 30mg/kg de Ciclosporina A (CsA 25mg/ml diluída em azeite, Bedford Laboratories, Bedford, OH) um dia antes do transplante e dados 15mg/kg/dia de CsA para o restante período da experiência, 196 por via de injeção subcutânea (sc). Os animais que serviram como controlo não receberam CsA. Todos os animais receberam 10 mL de lactato e 0,03 mg/kg de buprenorfina antes da cirurgia como tratamento pré-operatório e duas vezes por dia (de lactato, uma vez por dia), durante três dias após a cirurgia.

Teste de comportamento da rotação da apomorfina. Os ratos foram inicialmente desafiados duas semanas e meia antes do transplante e, posteriormente, dois dias antes dos vários momentos de sacrifício (4, 8 e 16 semanas pós-transplante). Cada rato recebeu uma dose de 0,05 mg/kg por injecção ip e foi imediatamente colocado no aparelho de apomorfina (bacia esférica). Um equipamento constituído por um elástico colocado em torno do peito do rato logo atrás dos cotovelos é preso por um encaixe de velcro a uma corda de aproximadamente 16 polegadas equipado com um rotometer ligado a um computador para o registo do número total de voltas totais do corpo feitas por rato e a direção da rotação (Rotometer Sistema, San Diego Instruments, San Diego, CA) . O resultado utilizado para análise foi obtido subtraindo o número total de rotações ipsilaterais do número total de voltas contralaterais. A análise estatística foi realizada por medidas repetidas usando ANOVA (programa de estatísticas SAS).

Rotação da cabeça. Os animais foram ensaiados antes da transplantação para estabelecer a linha de base, e em seguida desafiados a cada duas semanas após o transplante. Cada rato foi testado no que se refere à posição da cabeça em relação ao corpo durante 60 segundos a cada cinco minutos, três vezes por desafio. O número total de desvio da cabeça da sua cabeça (um desvio superior a 10° foi 197 considerado como uma volta da cabeça) foi registado para os lados esquerdo e direito e o número médio de volta por minuto durante três minutos foi calculado para ambos os lados. A avaliação foi feita independentemente da actividade do rato, incluindo a criação e preparação. A diferença entre o número médio de voltas para a esquerda e para a direita foi calculado para determinar a recuperação do comportamento e medidas repetidas ANOVA foram realizadas como para o desafio com apomorfina.

Alcance hábil da pata. A capacidade para chegar ao membro anterior foi avaliada em 4, 8 e 16 semanas pós-transplante através de um protocolo publicado anteriormente (Moore et al. 2001, Exp. Neurol. 2001 172 (2) :363-76) . O aparelho é constituído por um recipiente de vidro plexiforme que tem dois compartimentos. A câmara principal (300 mm X 115 mm de altura χ 103 mm de largura), na qual o rato é colocado, tem um outro componente deslizante com orifícios de ar. Uma secção mais estreita conduz para fora desta câmara (185 mm x 115 milímetros x 60 mm) e contém uma plataforma central de 22 mm de largura, que corre ao longo do seu comprimento, a uma altura de 62 mm. Em ambos os lados da plataforma existe uma calha 19 mm, no qual uma escada de sete passos está localizada. O rato sobe para a plataforma e recolhe grânulos alimentares de 45 mg de pequenas cavidades dentro de cada passo. A plataforma sobre a qual o rato sobe é estreita o suficiente para impedir rato de se virar e chegar à calha através da pata esquerda ou vice-versa. Para garantir que o roedor não raspa simplesmente os grânulos alimentares para cima do lado da plataforma, o topo das saliências da plataforma são levantados em 5 milímetros em ambos os lados (Moore et al., 2001). Esta versão do teste ocorre ao longo de 12 dias, divididos em quatro 198 componentes: alojamento, treino, privação de alimentos e testes. Alojamento: (dias 1-3) os ratos são colocados em caixas vazias por 20 minutos todos os dias, após os quais são retirados das caixas e retornam às suas gaiolas. Treino: (dias 4 e 5) os ratos são colocados em gaiolas de teste, com escada com 2-6 degraus com isca de grânulos do alimento de 6x45 mg por passo para um total de 30 pastilhas de cada lado para cada sessão de teste. Os ratos são deixados no dispositivo durante 20 minutos, após o que são devolvidos à gaiola de origem. Privação de alimento: (dias 6 e 7) Os ratos são privados de alimentos e é-lhes permitido comer durante quatro horas diretamente depois do teste/treino todos os dias (a água permanece durante o tempo todo). Teste: (dias 8-12) cada rato é testado, durante 20 minutos, durante cinco dias. Escadas 2-6 são iscadas, como no protocolo de treino. Após o teste, os ratos são removidos das suas gaiolas, voltam à sua gaiola de origem e deixada livremente alimentar durante quatro horas. O número de grânulos tomados e comidos por cada rato é calculado e registado para as patas direita e esquerda separadamente. Os índices foram calculados para os últimos 5 dias de testes, gerando uma pontuação precisão média para cada rato a analisar através de medidas repetidas ANOVA.

Histologia. No momento do sacrifício, os animais foram profundamente anestesiados com uma injecção ip de pentobarbital (60mg/ml, [0,1 ml/lOOg]) intracardialmente e perfundidos com 0,9% de solução salina contendo 0,1% de heparina seguido por 4% de paraformaldeído (PFA) em 0,1 M de tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4. Após a perfusão, os cérebros foram recolhidos e pós-fixados durante seis horas em 4% de PFA e, em seguida, colocado em 20% de sacarose em PBS. Os cérebros foram seccionados com 35pm de espessura 199 num micrótomo de congelamento (Leica Microsystems, Montreal, Canadá) recolhidos e armazenados em anticongelante, posteriormente recuperados e lavados em PBS para cada experiência.

Para a imunohistologia, as secções foram lavadas três vezes em PBS (0,1 M de pH 7,4) e pré-incubadas numa solução contendo 0,4% de Triton X-100, 5% de NGS em PBS durante 60 min. As secções foram então incubadas durante a noite a 4°C, nos anticorpos primários de acordo com as seguintes combinações: coelho anti-Iba-1 (Wako Pure Chemicals

Industries, Richmond, VA; 1:1000) e ratinho anti-EDl (Serotech, Raleigh, NC, 1:1000), coelho de proteína acidica fibrilar anti-glial (GFAP, DakoCytomation, Mississauga, ON, 1:4000) e mitocôndrias de ratinho anti-humano (Chemicon, Temecula, CA; 1:500) ou de coelho anti-GABA (Chemicon, Temecula, CA; 1:200) (também combinado com mitocôndrias anti-humanas), diluídos em PBS com 0,4% de Triton X-100. Após as lavagens em PBS, as secções foram incubadas em anticorpos secundários; anticorpo de cabra anti-coelho cruzada adsorvido Alexa Fluor 488 (Molecular Probes,

Eugene, OR; 1:200) e cabra anti-ratinho altamente cruzado adsorvido Rodamina Vermelho-X (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA; 1:200) em PBS durante duas horas e meia à temperatura ambiente (RT) . Após as lavagens, as secções foram incubadas em PBS contendo 0,022% DAPI (Molecular Probes, Eugene, OR) , lavadas e montadas em lâminas revestidas com gelatina, cobertas com lamelas com meios de montagem caseiros DABCO (álcool polivinílico, DABCO, 1,0 M de Tris-HCl pH 8,0, água destilada, glicerol) e seladas com verniz das unhas. A coloração de fluorescência foi avaliada utilizando um microscópio de fluorescência i90 Nikon acoplado a uma câmara monocromática Hamamatsu 1394 200 ORCA-285 e exploradas por software Simple PCI, versão 5.3.0.1102 (Compix Imaging Systems Inc, PA, EUA).

No caso de imunofluorescência dupla em que ambos os anticorpos primários foram feitos nos mesmos hospedeiros, as secções foram lavadas em 0,1 M de PBS e pré-incubadas em 0,1 M de PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,4% de Triton X-100 (ambos da Sigma, St. Louis, MO). Seguido de uma hora de incubação à temperatura ambiente com o primeiro anticorpo primário; rato anti-vimentina (1:5000 Sigma, St. Louis, MO); anti-tubulina isoforma βΙΙΙ (Chemicon, Temecula, CA); ou proteina nuclear de rato anti-Neuron especifico (NeuN, Chemicon, Temecula, CA; 1:5000); as secções foram lavadas e incubadas uma hora numa solução contendo o anticorpo secundário FITC de cabra conjugado com anti-ratinho IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; 1:400) em 0,1 M de PBS, 1% de BSA e 0,4% de Triton X-100. Após lavagens em PBS, as secções foram incubadas durante uma hora com 5% de soro normal de rato (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) , e depois lavadas de novo antes de serem incubadas com um excesso de fragmentos de anticorpo Fab contra as espécies hospedeiras de anticorpos primários (20pg/mL, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) durante uma hora, e, ainda, enxaguadas novamente com PBS. As secções foram depois incubadas uma hora à TA com o segundo anticorpo primário, de mitocôndrias de ratinho anti-humano (Chemicon, Temecula, CA; 1:500) em PBS contendo 1% de BSA e 0,4% de Triton X-100. Após algumas lavagens em PBS, as secções foram finalmente incubadas com rodamina de cabra anti-rato IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; 1:400) em 0,1 M de PBS, 1% de BSA, 0,4% de Triton X-100 durante uma hora. As secções foram então lavadas e incubadas com DAPI durante 7 min (Molecular Probes, Eugene, 201 como descrito OR) , montadas e cobertas com uma lamela acima.

Para a imuno-coloração de tirosina hidroxilase (TH), as secções foram lavadas três vezes em 0,1 M de PBS, pH 7,4 e colocadas em 3% de peróxido durante 30 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram subsequentemente lavadas em 0,1 M de PBS e, em seguida, pré-incubadas numa solução contendo 0,1 M de PBS, 0,1% de Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO) e 5% de soro normal de cabra (NGS, Wisent Inc., St-Jean Baptista de Rouville; QC) durante 30 min à TA. As secções foram incubadas durante a noite a 4°C com anti-TH (Pel-Freez, Rogers, AR; 1:5000) em PBS, 0,1% de Triton X-100 e 5% de NGS. Após a incubação durante a noite, as secções foram lavadas em 0,1 M de PBS e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente numa solução de PBS contendo 0,1% de Triton X-100, 5% de NGS e cabra biotinilada anti-coelho (Vector Laboratories, Burlington, ON) 1:1500. Após três lavagens em 0,1 M de PBS, as secções foram colocadas numa solução de complexo de peroxidase de avidina-biotina (ABC Elite Kit, Vector Laboratories, Burlington, ON) durante 1 h à TA. Os anticorpos foram revelados através da colocação das secções em solução tampão de Tris contendo 0,05% de 3,3'-diaminobenzidina (DAB, Sigma, St.Louis, MO) e 0,1% de 30% de peróxido de hidrogénio à TA. A reacção foi terminada por lavagem em 0,05 M de tampão Tris e subsequentes lavagens com PBS. As lâminas foram montadas em lâminas revestidas com gelatina, secas ao ar durante a noite, desidratadas em graus ascendentes de etanol e cobertas com lamelas com meio de montagem DPX (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA) . 202

Resultados

Monitorização do peso. 0 peso dos animais foi monitorizado diariamente. Como mostrado na Figura 1, os ratos demonstraram ganho de peso lento e constante 2 semanas após a transplantação. A perda de peso registada em 3-4, 7 e 15 semanas pós-transplante foi viável devido ao jejum exigido para o teste de escada. A continuação de uma ligeira perda de peso após o primeiro desafio de apomorfina foi provavelmente devido à perda temporária de apetite. Dois animais do tipo de célula 1, programados para serem sacrificados em 8 semanas, foram trocados com dois ratos programados para serem sacrificados em quatro semanas, devido à sua perda de peso progressiva (Ratos # 27,49). Às 8 semanas pós-transplante, o rato # 60 do tipo de célula 1 teve que ser sacrificado um dia mais cedo do que o previsto por razões semelhantes. Às 10 semanas pós-transplante, um adicional n = 2 animais do tipo de célula 2 sofria de diarreia e demonstrou perda de peso significativa. Esses animais receberam injeções diárias de lactato, mas foram encontrados mortos na gaiola 24 horas após estas precauções adicionais. Outros dois ratos do grupo 2 começaram a apresentar problemas de saúde semelhantes e foram preventivamente sacrificadas. Os restantes n = 2 no grupo 2 foram finalmente sacrificados (24 horas após a última perfusão de animais do grupo 2) . O rato # 40 do grupo 3 também foi sacrificado durante a semana 13 do protocolo experimental, devido a problemas de saúde semelhantes aos observados no grupo 2. O rato # 66 do grupo 1 foi encontrado morto na sua gaiola em 15 semanas. Sintomas prévios semelhantes foram observados em animais saudáveis dos grupos 2 e 3. Em resumo, os animais do grupo 2 (n = 6 restante) foram sacrificados às 10 semanas após o transplante, os animais dos grupos 1 e 3 foram sacrificados às 16 semanas pós-transplante, como previsto (n = 5 para 203 cada grupo). Abreviações: BB: linha de base comportamental; TP: o transplante.

Desafio com apomorfina. Foram analisados todos os quatro grupos (células 1,2,3, veiculo), utilizando medidas repetidas ANOVA (variável: número de rotações), que revelou que apenas o fator "tempo" foi significativo (p = 0,0048), indicando um "efeito do tempo" para todos os grupos. Comparações múltiplas demonstraram uma recuperação funcional significativa (redução em número de rotações) de todos os grupos entre o ponto de tempo "0" (linha de base) e 4 semanas após o transplante (Figura 2) . Esta redução manteve-se ao longo do tempo após o ponto de tempo de 4 semanas. O último ponto de tempo de 16 semanas pós-transplante não pode ser analisado usando medidas repetidas ANOVA uma vez que o grupo 2 foi sacrificado antes deste ponto do tempo (Figura 2).

Um grupo de cinco animais, independentemente lesionados com 6-OHDA, mas que não foi submetido a qualquer intervenção cirúrgica (transplante) , adicionou-se à análise de variância de medidas repetidas ANOVA. Quando este grupo é adicionado aos cálculos das medidas repetidas ANOVA, somente a interação do grupo/tempo tem uma forte tendência à significância (p = 0,0985). É possível que um número mais significativo de animais fosse reforçar esta tendência de resultados significativos. Considerando-se que esta tendência era indicativo da recuperação funcional ao longo do tempo, uma análise mais profunda revelou que apenas as células umbilicais (células 1) induziram efeitos benéficos significativos ao longo do tempo (p = 0,0056) e que os animais lesionados que não foram submetidos a intervenções cirúrgicas intracranianas mostraram uma tendência no 204 sentido de nenhuma recuperação funcional ao longo do tempo (este resultado não é significativo a p = 0,0655).

Rotação da cabeça. A rotação da cabeça representa o número total de rotações ipsilaterais realizadas por animais após o transplante de células. Nos pontos testados (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16 semanas após o transplante) não foram observadas diferenças significativas entre os animais transplantados com células ou animais que receberam somente o veiculo (Figura 3) . A rotação da cabeça é puramente subjetiva e determina a tendência natural do rato para rodar a cabeça para a esquerda ou para a direita após a lesão. Todos os grupos foram analisados por meio de medidas repetidas ANOVA (variável: diferença entre o número de voltas de cabeça para a esquerda e direita). Conforme o tempo aumentou neste estudo foi observada uma melhoria em termos de não enviesarem a rotaçãso da cabeça, no entanto, isto foi evidente em todos os grupos.

Teste da escada. Diferenças significativas entre os grupos transplantados ou de controlo foram identificados utilizando este teste. O teste da escada mede a ingestão de alimentos em periodos de teste de 20 minutos, o que requer movimentos finos para pegar a comida nas escadas. Todos os grupos foram analisados por meio de medidas repetidas ANOVA (variável: os indices de grânulos comidos para os tomados). Utilizando este ensaio, foi determinado que, ao longo do tempo uma diferença de comportamento alimentar foi observada, no entanto, não houve diferença significativa a ser determinada entre os grupos (Figura 4). 205

Imunocoloração. As seções Η & E demonstraram bom enxerto celular um dia após o transplante. As células foram identificadas nos locais de transplante até 8 semanas pós-transplante por coloração do antigénio nuclear humano, embora os números de células humanas tenham diminuído em resposta ao tempo de enxerto. Actualmente, não foi constatado que as células derivadas do pós-parto se tenham diferenciado num fenótipo neuronal após o transplante in vivo, neste sistema de modelo.

Enxertos de células foram analisados quanto à presença do marcador de microglia Iba-1. Como mostrado na Figura 5a, Iba-1 foi abundantemente expressa por cada tipo de célula, em especial em relação aos controlos de veiculo. A expressão de Iba-1 foi encontrada tender a declinar ao longo do tempo (Figura 5a) . Avaliação de ED-1 em animais transplantados demonstrou que uma resposta de macrófagos era evidente após o transplante, o nivel de coloração de ED-1 diminuiu em todos os grupos, excepto nos animais transplantados com fibroblastos ao longo do tempo (Figura 5b) . A coloração DAPI permaneceu geralmente constante ao longo do período de duração do estudo (Figura 5c).

De igual modo, a determinação dos níveis de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) em enxertos para determinar o número de astrócitos reactivos após a enxertia demonstrou inicialmente que os astrócitos reactivos foram identificados na sequência da transplantação ou da administração do veículo, um efeito que diminui ao longo do tempo (Figura 6a). Consistente com outras observações que mostram a diferenciação das células do enxerto, a Vimentina foi encontrada ser abundantemente expressa nas células 206 quatro semanas após o enxerto, mas a expressão diminuiu constantemente durante as próximas 12 semanas (Figura 6b). A coloração para a tirosina hidroxilase humana foi negativa. Por conseguinte, nem células umbilicais nem placentárias se diferenciaram em células dopaminérgicas sob as condições de tratamento utilizadas.

Resumo

Os resultados demonstraram que o implante de células umbilicais forneceu melhoria funcional ao longo do tempo num modelo de 6-OHDA de Parkinson, tal como avaliado pela capacidade de resposta comportamental à apomorfina. Tanto o teste de escada como o de virar a cabeça foram realizados para determinar os efeitos sobre a ativação de diferentes circuitos e/ou mecanismos neuronais. Não foram identificadas diferenças usando estes parâmetros de teste, assim, como mais um mecanismo relativo ao beneficio positivo visto em 4 e 8 semanas em animais que receberam transplantes de cordão umbilical continua por resolver. A coloração imuno-histoquímica não mostrou nenhuma evidência de diferenciação celular após o enxerto de células. Nenhuma diferenciação neuronal, ou, mais especificamente, nenhuma diferenciação dopaminérgica pode ser demonstrada por estes estudos. Assim, não há evidências de diferenciação celular no local do enxerto que pudesse ser verificada. Isto sugere ainda que as melhorias observadas no comportamento pela desafio da apomorfina seguinte ao transplante de células umbilicais são provavelmente devido a uma resposta trófica e não como resultado do potencial regenerador da célula. 207

As células imunopositivas TH não foram observadas em qualquer tipo de célula, em nenhum ponto de tempo. No entanto, TH não é a única via celular para a produção de dopamina. A dopamina pode ser produzida de forma independente a partir de hidroxilase de tirosina, pela via da tirosinase. Além disso, a dopamina, na presença da tirosinase, modifica covalentemente e inactiva a hidroxilase de tirosina. Além disso, as células transplantadas podem permitir o processamento de DOPA (aminoácido dos alimentos) no plasma após uma refeição para DOPA

Referências para o Exemplo 18 (1) Graeme E et al. (2003) FASEB J. 17L1248-1255. (2) Rios M et al. (1999) J. Neurosci. 1999:3519-26. (3) Xu Y et al. (1998) J. Neurosci. Res. 54:691-7. EXEMPLO 19

Matrizes de citoquinas RayBio e BD Powerblot

Matriz de anticorpo de citoquinas RayBro® humanas C Series 1000 foi usada para analisar a expressão de 120 proteínas em células derivadas do pós-parto e lisados . Essa análise possibilitou uma caracterização dos PPDCs e identificou um espectro de expressão de factores tróficos chave para estas células.

Materiais e Métodos

Crescimento Celular e colheita. Células derivadas umbilicais do pós-parto foram semeadas a 5000 células por cm quadrado, em frascos revestidos de gelatina com meio de crescimento e expandidas durante 3 a 4 dias (densidade 208 colheita alvo 25000 células por centímetro quadrado). As células foram semeadas com tripsina, recolhidas e centrifugadas a 300 rcf durante 5 minutos. A tripsina/meio foi removido por aspiração e as células foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS).

Lavagem de célulae e aliquotagem. Após a lavagem, as células foram re-suspensas em 107 células/ml em PBS e entregues como aliquotas de 1 ml em tubos siliconizados de 1,5 ml de micro-centrifuga estéreis. As células foram centrifugadas a 300 rcf durante 5 minutos e o PBS foi removido por aspiração. As células foram lisadas e analisadas tanto pela matriz, ou lisadas e liofilizadas para análise.

Preparação de amostras liofilizadas. Três lotes de células (PPDC Lotes L040405, L052505, L050505) foram preparados para eventual liofilização por imersão em azoto liquido (LN2) por 60 segundos. Os tubos foram então removidos de LN2 e imediatamente imersos num banho de água a 37 °C durante 60 segundos ou até ao descongelamento (tempo máximo de 3 minutos de incubação). Este processo foi repetido adicionalmente duas vezes. As amostras de congelamento-descongelamento foram centrifugadas durante 10 minutos a 13000 rcf, a 4°C e colocadas em gelo. O fluido sobrenadante de cada tubo foi removido. Para determinar o conteúdo de proteína total, o ligado foi diluído em PBS e a diluição foi analisada pelo ensaio de Bradford. de 1,5 ml bloco de Aliquotas

Para a liofilização, vários criotubos estéreis rotulados com lisado foram carregados num transferência de calor autoclavado e resfriados. 209 do líquido sobrenadante lisado a uma concentração de proteína total definidas foram carregadas nos criotubos. 0 bloco de calor contendo criotubos novos foram carregados assepticamente numa bolsa de auto-clavagem não utilizada. A bolsa foi carregada no liofilizador.

Materiais de teste com lisado aplicado foram carregados num sistema de secador de bandejas FTS Dura-Stop MP Stoppering e liofilizados usando o seguinte programa. Todos os passos tiveram uma taxa de rampa de 2,5°C/minuto e um vácuo de 100 mT.

Passo Temperatura de Tempo de retenção prateleira (°C) (minutos) cL -40 180 b -25 2160 c -15 180 d -5 180 e 5 120 f 20 120 g 20 60

Preparação de sedimentos de células. Sedimentos celulares congelados (PPDC lotes 063004B, 050604B, 022,803, 072,804, 120,304, 090,304, 071404C) foram lisadas utilizando uma mistura 1:1 de tampão RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio e 0,1% de SDS) e tampão de lise celular fornecido no kit de matriz de citoquina 1000.1 RayBio (Raybiotech Inc.Norcross, GA). Os grânulos de vidro (Sigma, MO) foram usados para alcançar a lise celular completa. A concentração de proteínas foi 210 medida utilizando o kit de ensaio de proteínas BCA (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL).

Análise da matriz RayBio. As matrizes VI e VII RayBio, que constituem a matriz 1000.1, foram sondadas durante a noite com quantidades iguais de proteína de cada amostra. O protocolo restante foi seguido conforme as orientações do fabricante. As manchas na membrana foram qualitativamente analisadas para determinar proteínas de interesse. Para comparação quantitativa entre as amostras, estes pontos podem ser analisados por densitometria e as alterações na expressão confirmadas por ELISA.

Resultados

Um total de dez diferentes populações PPDC foi analisado. Quarenta e oito proteínas foram identificadas e qualitativamente listadas na Tabela 20-1. Algumas proteínas foram expressas em concentrações relativamente elevadas em todas as amostras testadas, enquanto outras foram expressas em determinadas amostras.

Tabela 20-1. Proteínas PPDC qualitativamente identificadas

Número Factor trófico Abreviatura 1 Factor neurotrófico derivado do cérebro BDNF 2 Factor de crescimento de fibroblasto básico bFGF 3 Proteína 4 morfogenética do osso BMP-4 4 Proteína 6 morfogenética do osso BMP-6 5 MPIF-1 CK b 8-1 6 Factor neurotrófico ciliar CNTF 7 CCL27 (quimiocina atractiva de célula T cutânea) CTACK 211

Numero Factor trófico Abreviatura 8 Factor de crescimento da epiderme EGF 9 CCL2 6 Eotaxina-3 10 Antigénio Fas Fas/TNFRSF6 11 Factor 6 de crescimento de fibroblastos FGF 6 12 Tirosina quinase 3 relacionada com FMS FIT-ligando 3 13 Quimiocina CS3C Fractalquina 14 Factor estimulador de uma colónia de granulócitos GSFC 15 Proteína relacionada com o receptor de TNF da superfamília de glucocorticoides induzidos Ligando GITR 16 Factor estimulador de uma colónia de granulócitos macrófagos GM-CSF 17 Factor de crescimente de hepatócitos HGF 18 CCL1 1-309 19 Moléculas 1 de adesão intercelular ICAM-1 20 Proteína 1 de factor de ligação semelhante à insulina IGFBP-1 21 Proteína 2 de factor de ligação semelhante à insulina IGFBP-2 22 Proteína 3 de factor de ligação semelhante à insulina IGFBP-3 23 Proteína 4 de factor de ligação semelhante à insulina IGFBP-4 24 Interleucina-10 IL-10 25 Interleucina-13 IL-13 26 Interleucina-la IL-la 212 Número Factor trófico Abreviatura 27 Interleucina-lRa IL-lRa 28 Interleucina-3 IL-3 29 Interleucina-5 IL-5 30 Interleucina-6 IL-6 31 Interleucina-7 IL-7 32 Interleucina-8 IL-8 33 Célula T quimioatrativa induzível por IFN I-TAC 34 Proteína 1 quimiotáctica de monócitos MCP-1 35 Factor inibidor da migração MIF 36 Proteína i inflamatória de macrófagos MlP-la 37 Oncostatina M Oncostatina M 38 Glicano F fosfatidilinositol PIGF 39 Cadeia de transdução de sinal de gp-130 solúvel sgpl30 40 Factor BI de crescimento transformante TGF-bl 41 Factor B3 de crescimento transformante TGF-b3 42 Trombopoietina Trombopoietina 43 Inibidor de tecido de metaloprotease 2 TIMP-2 44 Factor de necrose tumoral alfa TNF-cx 45 Factor de necrose tumoral beta TNF- β 46 Receptor 3 do ligando de apoptose induzida relacionada com TNF TRAIL-R3 47 Receptor 4 do ligando de apoptose induzida relacionada com TNF TRAIL-R4 213

Número Factor trófico Abreviatura 48 Ativador do receptor de plasminogéneo semelhante à uroquinase uPAR

Resumo A matriz RayBio confirma a expressão de proteínas previamente identificadas pela matriz genética e/ou análises de ELISA. Vários factores tróficos benéficos para o tratamento específico da doença têm sido identificados. Por exemplo, FGF, TGF-b e G-CSF foram identificados em PPDCs, e estes factores de crescimento têm sido previamente identificados, com melhorias em modelos animais de acidente vascular cerebral agudo e de recuperação de acidente vascular cerebral. Além disso, o BDNF, a BMP-4, BMP-6, e TGF-B1, que estão associados positivamente com a doença de Parkinson, foram identificados em PPDCs. Todos os dados apresentados são avaliadas qualitativamente, a análise quantitativa do nível de expressão das proteínas de interesse está pendente. A presente invenção não está limitada às concretizações descritas e exemplificadas acima. Sendo capaz de modificação e variação dentro do âmbito das reivindicações anexas.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Ethicon, Incorporated Messina, Darin J.

Mistry, Sanjay Hong, LS Klaudyne 214

Kramer, Brian C.

Romanko, Michael J.

DESORDENS PÓS-PARTO

<120> TRATAMENTO DA DOENÇA DE PARKINSON RELACIONADAS USANDO CÉLULAS DERIVADAS DO <130> CBAT-0037 (ETH-5073 NP3 CIP1 PCT) <150> US 60/638,966 <151> 2004-12-23 <160> 10

<170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção sintética <4 0 0> 1 gagaaatcca aagagcaaat gg 22 <210> 2

<211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial 215 <22 0> <223> Construção sintética <4 0 0> 2 agaatggaaa acíggaatag g 21 <210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção sintética <4 0 0> 3 tcttcgatgc ttcggattcc 20 <210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção sintética <4 0 0> 4 gaattctcgg aatctctgtt g 21 <210> 5 216 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção sintética <4 0 0> 5 ttacaagcag tgcagaaaac c 21 <210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção sintética <4 0 0> 6 agíaaacatt gaaaccacag cc 22 <210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção sintética <4 0 0> 7 217 20 tctgcagctc tgtgtgaagg

<210> 8 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção sintética <4 0 0> 8 cttcaaaaac ttctccacaa cc <210> 9 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção sintética <4 0 0> 9 cccacgccac gctctcc 17 <210> 10 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Construção sintética <4 0 0> 10 tcctgtcagt tggtgctcc 19 219

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Células derivadas do pós-parto obtidas por digestão enzimática da placenta humana ou do tecido do cordão umbilical substancialmente livre de sangue com colagenase, dispase e hialuronidase, em que as células são capazes de autorrenovação e de expansão em cultura e têm o potencial para se diferenciarem em células de pelo menos um fenótipo neural; em que as células necessitam de L-valina, para o crescimento e podem crescer em pelo menos cerca de 5% de oxigénio; em que as células compreendem ainda as seguintes características: a) a produção de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, FraCDP , PD-L2 e HLA-A, B, C; e b) a falta de produção de CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD 178, H2-B7, HLA-G, e HLA-DR, DP, DQ, tal como detectado por citometria de fluxo, para utilização no tratamento de um doente possuindo uma condição neurodegenerativa da substantia nigra ou do estriado, em que a condição é parkinsonismo, parkinsonismo pós-encefalítico, tremor essencial ou pseudo-parkinsonismo vascular.
2. Células para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas células são obtidas a partir de tecido do cordão umbilical.
3. Células para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que as células foram induzidas in vitro, para se diferenciarem em células de linhagem neural.
4. Células para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que as células são geneticamente 1 modificadas para produzir um produto genético que promove o tratamento da doença neurodegenerativa.
5. Células para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que as células estão em combinação com pelo menos um outro tipo de célula.
6. Células para utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o outro de célula é astrócitos, oligodendrócitos, neurónios, células progenitoras neurais, células estaminais neurais ou outras células estaminais multipotentes ou pluripotentes.
7. Células para utilização de acordo com a reivindicação 5, em que, pelo menos, um outro tipo de célula é adequado para administração em simultâneo com, ou antes, ou depois, das células derivadas do pós-parto.
8. Células para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que as células estão em combinação com pelo menos um outro agente.
9. Células para utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o pelo menos um outro agente é adequado para administração em simultâneo com, ou antes, ou depois, as células derivadas do pós-parto.
10. Células para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que as células são adequadas para administração a um sitio pré-determinado no sistema nervoso central ou periférico do paciente.
11. Células para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que as células são formuladas para administração por injeção ou infusão. 2
12. Células da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que as células são encapsuladas dentro de um dispositivo implantável.
13. Células para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, no qual as células estão contidas dentro de uma matriz ou estrutura que contém as células.
14. Células para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que as referidas células exercem um efeito trófico no sistema nervoso do paciente.
15. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de um doente possuindo uma condição neurodegenerativa da substantia nigra ou estriado, que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e as células derivadas do pós-parto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, 8 ou 11-14, em que a condição é parkinsonismo, parkinsonismo pós-encefalitico, tremor essencial ou pseudo-parkinsonismo vascular.
16. Preparação feita a partir das células derivadas do pós- parto da reivindicação 1 ou da reivindicação 2 numa quantidade eficaz para tratar a doença neurodegenerativa, em que a preparação compreende um lisado de células das células derivadas do pós-parto, uma matriz extracelular das células derivadas do pós-parto, ou um meio condicionado, em que as células derivadas do pós-parto foram cultivadas, para utilização no tratamento de um doente possuindo uma condição neurodegenerativa da substantia nigra ou estriado, em que a condição é parkinsonismo, 3 parkinsonismo pós-encefalítico, tremor essencial ou pseudo-parkinsonismo vascular.
17. Composição farmacêutica para utilização no tratamento de um doente possuindo uma condição neurodegenerativa da substantia nigra ou estriado, que compreende um veiculo farmaceuticamente aceitável e uma preparação feita a partir das células derivadas do pós-parto da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a preparação compreende um lisado de células das células derivadas do pós-parto, uma matriz extracelular das células derivadas do pós-parto, ou um meio condicionado, em que as células derivadas do pós-parto foram cultivadas, em que a condição é parkinsonismo, parkinsonismo pós-encef alítico, tremor essencial ou pseudo-parkinsonismo vascular.
18. Preparação de células compreendendo as células derivadas do pós-parto isoladas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, 8 ou 11-14 para utilização no tratamento de parkinsonismo, parkinsonismo pós-encef alítico, tremor essencial ou pseudo-parkinsonismo vascular num doente.
19. Preparação de células para utilização de acordo com a reivindicação 18, em que a referida preparação de células compreende um lisado celular não fraccionado.
20. Preparação de células para utilização de acordo com a reivindicação 18, em que a referida célula compreende a preparação de um lisado celular livre de membrana. 4 5