JP5057629B2 - ペプチド足場での組織細胞のカプセル化およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、NIH助成金番号AR45779および同第AR33236の下で政府の援助によって行われた。従って政府は、本発明に一定の権利を有する。
過去の10年間の間に、種々の組織(特に、膝関節の軟骨組織)の修復および置換のための材料を開発することに、かなりの労力が費やされてきている。詳細には、軟骨、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、および神経系に関係している加齢性障害および変性疾患の数が増大しており、医薬品だけでは効果ではない場合には、有意な組織修復または置換が必要である。種々のポリマー性生体材料が、組織修復のために開発されているが、これらの有効性には時折、免疫不適合性および応力の不適切な分布によって欠陥が生じる。さらに、動物(例えば、ウシの皮、またはブタもしくはサメの軟骨)に由来する材料の使用は、プリオンのような感染性因子の混入の可能性の懸念を生じる。多くの細胞型が、体内の三次元環境で見出されている。しかし、三次元環境(例えば、コラーゲンまたはフィブロネクチンのような細胞外マトリックス成分を含む環境)の物理的および化学的な特性は変化し得、従って種々の細胞型の増殖を支持する環境の能力に影響を与える場合がある。
本発明の目的は、組織修復または置換のための改良された生体材料および方法を提供することである。本発明者らは、生細胞が予め決定された外形の三次元配置での足場での生体分解性ペプチド足場によってカプセル化され得ることを発見した。例えば、カプセル化された細胞による細胞外マトリックス成分の分泌は、足場の硬度を有意に増大させ、それによって足場が、軟骨のような損傷している内因性細胞を修復するかまたは置き換える能力を改善する。驚くべきことに、本発明者らは、軟骨組織の置換のためにもともと開発された本発明者らの足場システムが、広い範囲の細胞型(例えば、幹細胞、ニューロン、および肝細胞)を支持することができることを見出した。種々の細胞型を支持するこの能力は、並外れた多数の重要な治療適用について、組織および器官の置換を可能にする。
本発明者らは、本明細書中に記載されているペプチド足場が驚くべきことに、実質的に全ての細胞型のカプセル化のために機能するようであることを見出した。例えば、本来は、軟骨組織の置き換えのために開発された本発明者らの足場システムは、幹細胞、ニューロン、および肝細胞のような広い範囲の細胞型を支持することができる。従って、これらの足場は、種々の組織および器官の修復または置き換えに有用である。
それらの表現型を維持するためには、軟骨細胞は典型的には、三次元環境で培養される。このような配置内では、軟骨細胞は力学的に機能性である細胞外マトリックスを生じ、そして定位的および動的な圧縮荷重に適切に応答する。従って、軟骨の修復に適切な足場の選択における主要な難題は、軟骨細胞の速い増殖速度および表現型的に特異的な細胞外マトリックス(ECM)の高分子の速い速度での軟骨細胞合成を、修復が安定した状態になるまで維持することができる材料の同定である。
これらのペプチド足場は、種々の哺乳動物細胞型に対して無毒であることが以前に示されているので、本発明の方法はまた、他の組織型を含む適応のために他の細胞型に適応され得る(Zhangら、Biomaterials 16:1385−1393、1995)。若い男性の大腿部および前腕の皮(これらはそれぞれ、1.99と1.51kPaの平衡圧縮係数を有する)のような柔組織を修復または置き換えるために必要な足場の強度は、軟骨に必要な強度よりもはるかに低い。加えて、ペプチド足場の外表面上の単層中で増殖させたニューロンは、広範囲な神経突起の成長(outgrowth)を示すことが以前に示されている。従って、本発明の方法を使用してこれらのペプチド足場によってカプセル化されるニューロンは、カプセル化された細胞と近隣の内因性のニューロンとの間での細胞−対−細胞接触を可能にする軸策を突き出し得る。
さらに、前駆細胞または幹細胞は、本明細書中に記載されているペプチド足場のいずれかを使用してカプセル化され得る。所望される場合には、細胞はまた、細胞の分化を促進する試薬で処理され得る。
交互の親水性アミノ酸および疎水性アミノ酸からなる特定のペプチドは、電解質(例えば、1価のアルカリ陽イオン)の存在下で極めて安定なβ−シート型の肉眼で見ることができる足場を形成するように自律的に組み立てる(米国特許第5,955,343号、および同第5,670,483号;図1Aおよび1B)。例えば、5mMから5Mの間の濃度のNaClは、数分間で足場の組み立てを誘導する。より低いNaCl濃度もまた、より遅い速度ではあるが、組み立てを誘導し得る。足場中のペプチドの側鎖は、2つの面(荷電したイオン性側鎖を有する極性の面と、アラニンまたは他の疎水性基を有する非極性の面)に分けられる。これらのイオン性側鎖は、正に荷電したアミノ酸残基と負に荷電したアミノ酸残基が相補的なイオン対を形成することができる点で、互いに自己相補的である。従って、これらのペプチドは、イオン性自己相補的ペプチド、またはI型の自律的に組み立てるペプチドと呼ばれる。イオン性残基が1つの正に荷電した残基と1つの負に荷電した残基との交互である(−+−+−+−+)場合は、ペプチドは「モジュールI」と記載され、イオン性残基が2つの正に荷電した残基と2つの負に荷電した残基との交互である(−−++−−++)場合には、ペプチドは「モジュールII」と記載される。
アミノ酸配列n−KLDLKLDLKLDL−c(KLD12)を有しているペプチドを、ペプチド合成装置(Applied Biosystems)を使用して合成し、そして粉末になるように凍結乾燥させた。0.5%のペプチド鋳造溶液を、295mMのスクロースおよび1mMのHEPESの溶液中にKLD12を溶解させることによって得た。仔ウシの大腿膝蓋の溝軟骨(groove cartilage)から新しく単離した軟骨細胞を、鋳造溶液中に15×106細胞/mlの濃度で再懸濁した。この懸濁物を、濾紙と多孔性メッシュによって両方の面の上に支持された40×40×1.5mmのウィンドウから構成される鋳造フレーム中に注入した。鋳造フレームを、1×リン酸緩衝化生理食塩水(PBS、これはpH7.4で150mMのNaClおよび10mMのリン酸ナトリウムを含有している)浴中に、足場へのペプチドの自律的な組み立てを誘導するために15分間入れた。望ましくは、細胞を、PBSを添加する前に、5分未満、またはより好ましくは1分未満、スクロース溶液中でインキュベートする。所望される場合には、ペプチド足場の形成は、位相差顕微鏡を使用して確認され得る。コントロールとして、細胞をまた、暖かいアガロース(2%の溶液、w/w)中に懸濁し、鋳造フレーム中に注入し、そして冷却した1×PBS浴中に5分間入れた。ペプチドおよびコントロールのアガロースゲルの両方を、DMEM培地(Gifco)および10%のFBS(これは、一日おきに交換した)中で維持した。
インシュリン−トランスフェリン−セレン(ITS、これは、インシュリン、トランスフェリン、およびセレンを含有する)培地補充物は、通常の細胞機能を維持しながら血清濃度を低下させることを可能にする。細胞増殖、ならびにマトリックスの合成および蓄積の両方についての最適な条件を明らかにするために、ITSを補充した培地を、ペプチド足場中にカプセル化した軟骨細胞を培養するために使用した。詳細には、細胞増殖およびII型コラーゲンの産生を、10%のFBSと比較して、ITS培地+/−0.2%のFBS中で培養した接種したペプチド足場中で早い時間で評価した。コントロールとして、ITS培地中での十分に定義されたアガロース培養系中での細胞の生合成を、5週間にわたる10%のFBS培養物と比較して評価した。この研究のプロセスにおいて、本発明者らは、ペプチド足場中の生存可能な細胞の数を定量するための新規の方法を開発した。
軟骨を、屠殺後数時間以内に、1〜2週齢のウシの大腿膝蓋溝から回収した。組織を細かく切り刻み、そして軟骨細胞を、供給培地(10%のFBS(Hyclone,Logan UT)、0.1mMの非必須アミノ酸、0.4mMのプロリン、20μg/mlのアスコルビン酸塩、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを補充した高グルコースDMEM)中でのプロナーゼおよびコラゲナーゼでの連続的な処理によって抽出した。組織を最初に、20U/mlのプロナーゼ(Sigma Chemical,St.Louis,MO)培地中で2時間インキュベートし、PBS中で2回洗浄し、次いで200U/mlのコラゲナーゼ(Worthington、2型)中で一晩インキュベートした。細胞を、消化物を40μmの細胞ストレーナーに通すこと、それに次ぐ、100×gで8分間の遠心分離によって、細胞を単離した。細胞をPBS中で2回洗浄し、アスコルビン酸塩を含まない供給培地中に再懸濁し、そしてゲル鋳造の前に数時間、4℃で保存した。細胞数および生存性を、血球計でトリパンブルー排除法を使用して決定した。
細胞外マトリックス高分子の細胞による合成速度を測定するために、培養の5、10、15、21、および28日目に、一群の直径3mm×厚み1.6mmの6個のプラグを、ステンレス鋼の表皮(dermal)パンチを使用して、細胞を接種したペプチドスラブおよびアガロースゲルスラブから打ち抜いた。プラグのそれぞれのグループを、2mlの供給培地および5μCi/mlの35S−硫酸塩および10μCi/mlの3H−プロリンを含有している12ウェル皿の1つのウェルに移した。上記のように、35S−硫酸塩および3H−プロリンの取り込みは、それぞれ、硫酸化プロテオグリカンおよび全タンパク質の合成速度の尺度である(Hascallら、Arch.Biochem.Biophys.224:206−223、1983)。20時間後、このプラグを放射標識培地から除去し、そして標準のPBSと1mMの未標識のプロリンおよび硫酸塩中で90分以上にわたって5回洗浄した。次いで、それぞれの細胞を接種したプラグを、1mlのプロテイナーゼK(Roche)TRIS HCl溶液に移し、そして60℃で一晩消化させた。放射標識の取り込みを、100μlの消化物を2mlのシンチレーション液(Ecolume−LCN)と混合すること、そしてあふれ出たものおよび希釈クエンチングを補正した放射活性(Rack−Beta 1211シンチレーションカウンター、LKB、Turku、Finland)を計数することによってアッセイした。全ての蓄積した硫酸化GAGの含有量を、20μlの消化物を200μlのジメチルメチレンブルー色素(DMB)溶液と96ウェルマイクロプレート中で反応させ、そして分光光度計(Vmaxプレートリーダー,Molecular Devices,Menlo Park,CA)によって分析することによって別々に評価した。標準曲線を、コンドロイチン硫酸(サメの軟骨、Sigma Chemical)を使用して作成した。
軟骨細胞の組織学的試験のために、選択した3mmの細胞を接種したペプチドプラグに穴を空け、そしてPBS(pH7)中の4%のパラホルムアルデヒド溶液中に一晩4℃で固定した。プラグをPBSで洗浄し、段階的な濃度(75%、96%、および100%)のイソプロパノールで脱水し、キシロールに移し、そしてパラフィン中に包埋した。切片(7μmの厚み)をスレッジマイクロトーム(Leitz,Wetzlar,Germany)を使用して作製し、そしてchromealaun−ゼラチン[4.5%(w/v)のゼラチン、300mMのカリウム硫酸クロム12水和物]でコーティングしたスライド上に広げた。ペプチド足場の選択したパラフィン切片を、キシロール中で脱パラフィンし、そしてエタノール濃度を低下させることを使用して蒸留水中に移した。これらの切片を、トルイジンブルー色素溶液[0.0714%のトルイジンブルー(Merck、No.15930)、0.0714%のピロニンY(Fluka,No.83200)、およびホウ砂(0.143%の四ホウ酸二ナトリウム,Merck、No.6306)]とともに6分間インキュベートし、蒸留水、96%のエタノール、3×プロパノール(それぞれ2分間)、3×キシロール(それぞれ15分間)で洗浄し、そしてDePeX(Serva,No.18243)を使用して顕微スライド上に固定した。
材料特性の測定のために、3個の6mmの直径の細胞を接種したペプチドプラグのグループを、10%のFBS培養物から0、6、および26日目に穴あけ機で切り取った。さらに、ペプチド足場に、30×106細胞/mlを接種し、そしてITS/FBS培地中で維持し、そして3個の3mmの直径のプラグのグループを、材料特性の評価のために穴あけ機で切り取った。それぞれのプラグの平衡圧縮係数および動的圧縮係数を、以前に記載されているように(Frankら、J.Biomech.20:615−627、1987)、Dynastat機械式分光光度計(IMASS、Hingham,MA)を使用して放射状に閉じ込めた一軸圧縮において測定した。簡潔には、それぞれのスペクトルを、拘束円筒チャンバーのウェル中に入れた。拘束円筒チャンバーを、Dynastatの口部にクランプした(clamp)。上部の口に取り付けた多孔性の圧板を、プラグに3%のランプアンドホールド圧縮ひずみを加えるために使用し(10秒間にわたる3%の圧縮、それに続く1分から5分間の保持)、これによって圧縮応力の最初の増大およびそれに続く弛緩を生じた。この順序を、4回から6回繰り返し(12〜30%までのひずみ)、そしてひずみの操作に対する弛緩した平衡応力の比を、平衡係数を算出するために使用した。18%の圧縮オフセットひずみでは、1%の振幅のシヌソイドひずみが、1.0Hzで加えられた。シヌソイド応力とひずみの信号を、コンピューターによって継続的に記録し、そして別々のフーリエ変換を、基本調和の振幅および4次の高い調和の振幅を計算するために実行した。動的圧縮硬度を、ひずみに対する応力の基本振幅の比として計算した。
ペプチド足場内での軟骨細胞の増殖をもまた測定した。Hoechst色素分析を使用した細胞を接種したペプチド足場のDNAの定量は、Kimらの方法(Anal.Biochem.,174:168−176、1988)を使用すると、ペプチド足場に関係する妨害に起因して不明瞭であった。それに代わるべきものとして、化合物(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム(MTS)(Promega Corp.,Madison,WI)に基づく生存可能な細胞キットを、接種したペプチド足場中の生存可能な細胞密度を決定するために使用した。MTSキットを用いて得た値を解釈するために、三次元培養物についての較正曲線を、最初に、アガロース培養物を使用して設定した(図14E)。5個のアガローススラブを、10〜30×106細胞/mlの間の範囲の細胞密度で接種した。サンプルを穴あけ機で切り出し、そして2、3、および5日目に分析した。11個のプラグのそれぞれのグループについて、6個を震盪板上で約2時間、MTS培地中でインキュベートした。SDSを、MTS反応を停止させるために2%の最終濃度で添加した。30分後、培地サンプルを光学密度について試験した。残りの5個のプラグを消化し、そしてDNA含有量について分析した。平均のMTS出力を、較正曲線を設定するために平均のDNA含有量に対してプロットした。次いで、MTSデータを、確立された方法を使用して細胞を接種したペプチドプラグについて得た。生存可能な細胞数を、MTS含有量から決定し、そして細胞密度を、生存可能な細胞数/プラグ容積として記録した。
それぞれのペプチド足場中の細胞対は、典型的な軟骨細胞の球形の形態の外形をとった。対照的に、ペプチド足場よりも約20倍硬い材料である2%のアガロース中の細胞対は、単一の鋳造細胞のほぼ容積において半球体の形態をとった。アガロースヒドロゲルの培養の間に、連続する単層が形成され、これは、35日までのサンプルの穴あけ機での切り取りの間に、ゲル表面から部分的に引き剥がされる。肉眼で見ることができる単層は、いずれのITS培地においても観察されなかった。
本明細書中に記載した鋳造手順は、高い細胞生存性(>80%)を維持したまま、ペプチド足場内での軟骨細胞の迅速でありそして十分なカプセル化を可能にする。スクロース中に溶解させたペプチドは、溶液の粘性を有意には増大させず、そして軟骨細胞は気泡を形成することなく迅速にそして均質に再懸濁され得る。結果として、カプセル化された細胞は、足場の隅々まで均質に分布させられる。この実験では、細胞を接種した足場を、生体力学的特性の定量化、ならびにECMの生合成および一定のプラグ容積に対する蓄積量の較正を可能にするために、平坦なスラブの外形に鋳造した。しかし、この鋳造技術は一般的には任意の外形の足場および他の細胞型について適応することができ、組織修復の適用の非常に重要な特徴である。本発明者らのアプローチはまた、すでに予め形成された足場の中に細胞を接種した場合に遭遇し得る問題点を回避する。ここでは、ペプチドは、約50〜200nmの繊維間空間を有する十分に規則正しいナノ繊維に自律的に組み立て、そして同時に、細胞−ペプチド溶液中のそれぞれの個々の軟骨細胞の周辺に肉眼で見ることができる足場ネットワークに組み立てる。この密接な細胞−足場構造は、ペプチド−細胞のシグナル伝達および細胞によって媒介されるペプチドの生体分解性に関して特有の利点を与え得る。
軟骨の修復のための適切な足場の選択における主要な難題は、速い速度での軟骨細胞の増殖を刺激することができ、同時に表現型特異的なECM高分子の速い速度での軟骨細胞による合成を刺激することができる材料の同定である。ペプチド足場マトリックスは、両方に好都合と見られる。カプセル化された軟骨細胞の増殖は、アガロースコントロール培養物と比較して、ペプチド足場中で実質的に高かった。細胞分裂を経験している豊富な細胞対を、培養物中で3日目のような早い時期に、足場内で観察した(図15B〜15D)。アガロースと比較したペプチド足場中でのより早い増殖は、細胞−ペプチド相互作用、物理的環境、または他の因子に関係し得る。増殖している軟骨細胞は、アガロースよりも大きな範囲にまでペプチド足場マトリックスにとってかわった。
放射標識の取り込みおよび全GAGの蓄積データ(図11Aおよび12A)を、もとのスラブゲルから穴あけ機で切り出した、プラグあたりの規準で標準化した。この様式では、生合成を、所定の最初の足場の外形と細胞接種密度についての修復応答の代表として報告する。DNA含有量による細胞あたりの規準に基づく直接の標準化は、Hoechst色素アッセイを用いたペプチド消化の妨害に起因して、不明瞭である。放射標識の取り込み(図11A)は、初代ウシ軟骨細胞によるプロテオグリカンおよび全タンパク質の合成が、3−Dアガロースおよび3−Dペプチド足場培養物中で同様であったことを示した。従って、ペプチドとアガロース足場との間での足場組成と微視的物理学的環境における特異的な差異は、ECM高分子の細胞による合成の正味の速度には有意な影響を与えなかった。
II型コラーゲンについての免疫組織化学的分析は、持続的な様式でペプチド足場の隅々までにわたるポジティブ染色を示したが、I型コラーゲンの染色は、ゲル内の細胞周辺でバックグランドのレベルでのみ現れた。10%のFBSを補充した培地を用いた場合には、ポジティブなI型コラーゲン染色を、ゲルの外表面上でのみ培養物中で時間とともに細胞数が増大を示した、線維芽細胞様の細胞の薄層中で観察した。興味深いことに、ITS/FBA培地中で培養した細胞を接種したペプチド足場は、表面上では非常に少ない脱分化および線維芽細胞様細胞の蓄積を有することを観察した(図15A〜F)。従って、細胞サンプルを、コラーゲン含有量の分析のためにITS/FBS培養物から選択した。SDS−ゲル電気泳動によって、細胞を接種したペプチド足場培養物中での圧倒的なII型コラーゲンの蓄積を確認した(図12D)。
接種したペプチド足場中でのGAGの蓄積は、細胞を伴う空間およびテリトリー間の空間の両方において、足場の隅々までにわたって分布した(図12B)。持続的なECMの発生は、培養物中での時間の関数としての圧縮硬度の増大において反映された(図13)。15×106細胞/mlを接種したペプチド足場の0日目の力学的特性は非常にこわれやすく、極端に低い圧縮抵抗性(自然界の軟骨よりも100〜1000倍低い)を有した。培養の6日後、プラグの取り扱い特性は顕著に改善され、平衡係数はほぼ一桁増大した。26日目までには、試験サンプルを自由に扱うことができ、そして26kPaの平衡係数(0日目と比較して30倍の増大)に達した。比較のために、約125×106細胞/mlで初代仔ウシ軟骨細胞を接種し、そして自由に膨張する条件下で培養したGPA足場の平衡係数は、42日後には約52kPaであり(Vunjak−Novakovicら、J.Orthop.Res.17:130−138、1999)、そしてITS/FBS中の30×106細胞/mlを用いたペプチド足場の係数は93kPaであった(図13)。アガロースヒドロゲルについては、FBS培養物の平衡係数(44kPa)とITS培養物の平衡係数(42.8kPa)は、ITS/FBS培養物の平衡係数(59.8kPa)よりも有意に低かった(p=0.012)。
移植の前の細胞を接種した組織を操作した足場のインビトロでの馴化は、自由に膨張する培養物と比較して、生合成を増大させそしてマトリックスの蓄積を加速させる、長期間(例えば、24時間以上)の力学的荷重により利点を得る場合がある。動的圧縮荷重の種々のデューティ(duty)サイクルを、軟骨細胞を接種した自己構築ペプチド足場において、そしてアガロース培養系において試験した。
軟骨細胞をカプセル化したペプチド足場の形成のために、ウシの軟骨細胞を、プロナーゼとコラゲナーゼでの連続的な消化によって、1〜2週齢のから仔ウシから単離した。細胞を、本明細書中に記載したように、15×106細胞/mlの濃度で1.6mmの厚みの平坦なスラブ構造として、2%のアガロースまたは自己構築ペプチド足場に接種した。ペプチド足場は、0.5%の濃度で、12アミノ酸の配列n−KLDLKLDLKLDL−cから構成される。接種したゲルを、1%のITS+0.2%のFBSを補充したDMEM中で培養した。
実験によって、アガロースゲル培養物を使用して、1時間の「オン」/1から7時間の「オフ」の反復的なデューティサイクルプロトコールを研究した。それぞれのデューティサイクルについて、サンプルを、荷重の前の鋳造後の0〜28日間に、自由に膨張する条件で維持した。荷重を、4〜8日間加え、荷重期間の終わりに20時間、放射標識を取り込ませた(3H−プロリンまたは35S−硫酸塩の放射標識の取り込み)。
軟骨細胞を接種したペプチド足場に、自由に膨張する培養の21日後に、図19の別の日に荷重をかけるプロトコールを使用して荷重をかけた。サンプルを、荷重期間(32日目)ならびに非荷重期間(27日目および33日目)の間に放射標識した。硫酸塩の取り込みは、全ての時点で(特に荷重期間の間に)、自由に膨張するコントロールサンプルよりも高かった。プロリンの取り込みは、コントロールの値と同様であるかまたはそれよりも少なかった。全GAG含有量を、32日目および33日目に測定した。いずれの場合も、GAG含有量は、荷重をかけたサンプルよりも9%高かった(p=0.005、0.035)。この差異は、12日および13日の荷重期間の間のGAG含有量における約20〜30%の増大を示す。培地を、全ての時点で、硫酸塩およびプロリンで標識した高分子の放出について分析した。荷重をかけたサンプルとコントロールサンプルの両方について、35S−高分子の放出は、足場が取り込んだ硫酸塩標識の約1〜3%であった。3H−高分子の放出は、荷重をかけたサンプル中で足場が取り込んだ標識の4〜6%であり、そして自由に膨張するコントロールについての放出の10〜12%であった。足場が蓄積した放射標識の分析を、33日目に行った。測定した値は、荷重をかけたグループとコントロールのグループの両方において同様であり、足場の中の高分子硫酸塩の約95%および高分子プロリンの約86%であった(図20)。
軟骨細胞を接種したペプチド足場培養物のモデルシステムとして、アガロースゲルは、自由に膨張する培養物を上回って硫酸塩の取り込みを増大させるために、別の日の荷重を必要とした。しかしプロリンの取り込みは、コントロールサンプルと同様に最大であり、そしてLeeら(J.Orthop.Res.15(2),1997)と一致して約50%未満までであった。アガロース培養物についての結果と比べて、接種したペプチド足場中への硫酸塩の取り込みは荷重期間の間に最大となり、そして全GAGの蓄積は、自由に膨張するコントロールと比較して高かった。プロリンの取り込みは荷重に伴って減少したが、アガロース培養物中よりもその程度は少なくなった。35S−高分子の放出は最少であり、そして荷重の影響は受けなかった。しかし、3H−プロリン高分子の放出は、荷重をかけた培養物中では低く、自由に膨張するコントロールと比較して全タンパク質(足場が取り込んだもの+放出された高分子)の生合成は減少した。足場の中に取り込まれた標識された高分子の割合は、アガロースゲル中(Buschmannら、J.Cell Sci.108、1995)および外移植培養物中(Sahら、前出)での割合と同様である。細胞を接種したペプチド足場は、プロテオグリカンの合成をさらに増大させるため、およびタンパク質合成を増大させるかまたは維持するための、より頻繁なまたは毎日の荷重サイクルに有利に応答し得る。
足場の硬度を増大させるために、剪断荷重をもまた加えた(Jinら、Arch Biochem Biophys 395(1):41−8、2001)。剪断荷重を加えそして剪断による変形を生じるためには、牽引力を生じるために十分な摩擦が、サンプルと荷重圧板との間に存在しなければならない。次いで、牽引力は、表面を置き換え、剪断による変形を生じる。圧縮荷重を加えることによって、サンプルと圧板との間の摩擦を増大させる。この摩擦は、サンプルと圧板との間でのすべりを防ぐために必須であり得る。特に、剪断荷重は典型的には、圧縮オフセットがサンプルと圧板との間での適切な摩擦に到達させられた後に、加えられる。周波数は、剪断荷重または圧縮荷重について同じ範囲にある。動的剪断荷重は、動的圧縮荷重を伴わずに加えられ得るか、あるいは、動的圧縮と動的剪断の別の期間が加えられるか、あるいは特定のシステムを用いて同時に加えられる。
2つの自己構築ペプチドに対するインビボでの免疫応答および炎症性応答を分析した。RAD16ペプチドまたはEAK16ペプチドの両方ともが、単独で、またはBSAのような他の高度に免疫原性のタンパク質と組み合わせても、ウサギまたはヤギに注射した場合に、検出可能な免疫学的応答を誘発しなかった(Holmesら(2000)、前出)。有意な抗体力価も得られなかった。これらペプチドによって誘発される炎症性応答を測定するために、このペプチドをラットの脚の筋肉および脳に注射した(Holmesら、(2000)前出)。注射後2週間の間、これらまたは近隣の領域では炎症は観察されなかった。他の自己構築ペプチドを、それらが生じる免疫応答および炎症性応答を測定するために同様に試験することができる。
いくつかの以前の研究では、関節軟骨の欠損の中で形成される再生組織を比較するために、イヌモデルを使用した(例えば、Brittbergら、New England J.of Med.331:889−894、1994;Breinanら、J.Bone Jt.Surg.79−A:1439−1451、1997;Breinanら、Tiss.Engr.4:101−114、1998;Nehrerら、Biomaterials 19:2313−23128、1998を参照のこと)。最初の実験のために、4匹のイヌをそれぞれのペプチド足場について試験した。2つの欠損をそれぞれの膝に作成し、そしてそれぞれの欠損を軟骨細胞をカプセル化しているペプチド足場で満たす。以前の研究では未処置のコントロールのグループについてのデータが得られているので、未処置のコントロールのグループはこの実験には必要がない(Breinanら(1997)前出)。しかし、所望する場合には、1つ以上の膝の欠損が足場で満たされていないかまたは細胞を含まない足場で満たされているイヌを、コントロールとして使用することができる。
(概要)
幹細胞を、自己再生する(すなわち、分裂しそしてさらなる幹細胞を生じる)こと、および特殊化された経路(単数または複数)に沿って分化を受けることができる細胞をもまた生じることの両方が可能である細胞として定義されている(例えば、Fuchs,E.およびSegre,J.,「Stem Cells:A New Lease on Life」、Cell,100、143−155、2000;Weissman,I.,「Stem Cells:Units of Development,Units of Regeneration,and Units in Evolution」、Cell、100、157−168、2000を参照のこと)。従って、幹細胞自体は未分化の状態にあるが、体内で特異的な機能を有する1つ以上の特殊化された細胞型を生じることが可能である。分化は、新しい遺伝子産物の合成の結果である細胞の表現型の質的変化をいう(Loeffler,M.およびPotten,C.、「Stem cells and cellular pedigrees − a conceptual introduction」、Stem Cells,Potten,C.(編)、Academic Press,San Diego,1997)。
あらゆるタイプの前駆細胞が、本発明での使用に適切である。これらの細胞の供給源にはまた、胎児または成体の哺乳動物、あるいは確立された細胞株も含まれ得る。多数の確立された細胞株が当該分野で公知であり、それらの多くは、これらの細胞株を記載している参考文献をもまた提供するAmerican Type Culture Collection(http://www.atcc.org)を通じて入手することができる。細胞、前駆細胞、幹細胞、および細胞株の議論においては、句「由来する」は、細胞が特定の供給源から得られること、または細胞がその供給源から得られた細胞の末孫であることを示す。例えば、肝臓由来の細胞は、肝臓から得られる細胞であるか、あるいはそのような細胞の子孫または末孫である。用語「子孫」が本明細書中で使用される場合は、これは、細胞分裂の中間産物だけではなく、引き続く細胞分裂の産物、すなわち、特定の細胞の末孫である細胞をもまたいう。細胞株に由来する細胞は、その細胞株のメンバーであるか、あるいはその細胞株のメンバーである細胞の子孫または末孫である。器官、組織、個体、細胞株などに由来する細胞は、それを得た後にインビトロで改変され得る。このような細胞は、なお、もとの供給源に由来すると考えられる。
当該分野で周知であるように、多数の環境因子が、細胞の分化および分化転換において重要な役割を果たすようである。これらには、圧縮力、基質との接触などのような、物理的または機械的な因子が含まれ得る。細胞外マトリックスは、細胞の発達に重大な効果与えることが公知である。さらに、細胞−細胞接触が重要な役割を果たし得る。さらに、多数の特異的増殖因子および/または分化因子が記載されている。これらには、上皮増殖因子(EGF)、神経成長因子(NGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、インシュリン様増殖因子−I(IGF−I)、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)などがある。上記のリストは、単なる代表例である。2000を超える増殖因子が同定されており、そして当業者は所望される分化または分化転換の特性に基づいてこれらの因子を適切に選択しそして試験することができる。増殖因子は、純粋な形態で、または血清のようなより複雑な生物学的混合物の成分として、提供され得る。増殖因子は、その中で細胞がカプセル化され、そして/またはそれ自体の構造の中にカプセル化され得る、ペプチドヒドロゲル構造の培養培地中に存在し得る。さらに、種々の濃度の特定の増殖因子が、標的細胞に対して種々の作用を発揮し得ることが、当該分野で周知である。当業者は、所望される効果を達成するために、濃度の範囲および組み合わせを試験し得る。
当該分野で周知であるように、細胞分裂をモニターし、そして細胞の挙動および表現型の種々の局面を評価するための多数の方法が存在する。一般的には、任意の適切な方法が、本明細書中に記載されるペプチド構造中またはその上での培養細胞の影響を研究しそして評価するために使用され得る。さらに、細胞/ヒドロゲルアセンブリの全体の組成および特性に対する細胞の影響がモニターされ得る。タンパク質含有量、強度などのような特徴が試験され得る。
本発明は、細胞の分化および/または分化転換を促進するために使用され得るキットを提供する。このキットは、乾燥形態または凍結乾燥形態で提供され得る、本発明のペプチドヒドロゲルを備える。このキットはさらに、1つ以上の、以下のエレメントを含み得る:ペプチドヒドロゲル構造中に細胞をカプセル化するため、およびシステムの他の用途についての説明書、足場内で細胞が分化または分化転換するように誘導するための説明書、カプセル化が行われ得る容器、ペプチドが溶解させられ得る液体、ペプチドの自己組み立てを開始するための電解質、組織培養のための培地、カプセル化され得る細胞、分化促進因子など。さらなるエレメントもまた含まれ得る。
以下に記載する方法を、ペプチド足場に成体ラットの肝臓前駆細胞をカプセル化するために使用した。これらの方法は、任意の他の細胞型に適用し得る。
肝臓前駆細胞の単離および調製は、2001年7月10日に出願された、米国特許仮出願「Methods for Ex Vivo Propagation of Somatic Stem Cells」に詳細に記載されている。本発明者らのうちの一人(James Sherley博士)が共同発明者である。簡潔には、キサントシン(Xs)を、組織幹細胞によって通常示されるデフォルト非対称動態からの指数動態へのスイッチを可能にする薬理学的試薬として使用した。キサントシンを除去した場合に、非対称の細胞動態によって分裂する能力を保持している、クローンであるラットの肝臓上皮幹細胞株を単離した。インサイチュでコラゲナーゼを灌流した肝臓から遠心分離した細胞の低速での上清中で見出したラットの肝臓上皮細胞を、Xsの非存在下または存在下での限界希釈クローニングによって単離した。この作業で使用した細胞株(本明細書中の別の場所、および上記の仮特許出願において、LPC−8,LPC−8.1(LPC−8のサブクローン)、またはXs−D8、またはD8と呼ばれる)は、現在、80倍を超える細胞の倍加のために、培養物中で継続して維持されている。初期の継代細胞を液体窒素中で凍結保存し、そして融解後に培養物に再建し得る。
細胞を、10%の透析したウシ胎仔血清(FBS)、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したDMEMを用いて、プラスチックの培養皿中で維持した。細胞が80%のコンフルエンスに達した場合、それらをトリプシンでの処理によって回収した。細胞懸濁物を、DMEM/10%のFBS/pen/strepで洗浄し、次いで10%スクロースの水溶液中に再懸濁した。細胞を、血球計を使用して計数した。
LPC−8.1細胞のコントロール培養を、細胞/スクロース懸濁物の一部を使用してカプセル化と同時に開始した。細胞を、DMEM/10%のFBS/pen/strep中でのプラスチック製の培養皿上で、5%のCO2で平衡化した加湿チャンバーを備える標準的なインキュベーター内で37℃で維持した。細胞の生存性を、標準的な技術に従ってトリパンブルーでの染色によって測定した。プレーティングの24時間後の生存性は、典型的には90%より大きかった。
組み立てたペプチドヒドロゲル内での細胞分裂を、5’−ブロモデオキシウリジン(BrdU)の取り込みをモニターすることによって評価した。BrdUを、18時間の期間にわたって10μMの最終濃度で培養培地に添加した。インキュベーション後、ヒドロゲル培養物を、2時間、BrdUを含まない培地中でインキュベートした。次いで、ヒドロゲルをPBS中で洗浄し、続いて2時間、室温で、PBS(pH7.4)中の2%のパラホルムアルデヒドで固定した。固定後、ヒドロゲルをPBS中で数回洗浄し、次いで室温で2時間、PBS中の0.1%のTriton X−100で処理した。次いで、DNA変性を行うために、ヒドロゲルをPBS中の2NのHClで37℃で30分間処理した。この処理後、PBSでの数回の洗浄を、洗浄溶液中のpHが7.4に達するまで行った。次いで、ヒドロゲルを、ゆっくりと震盪させながら室温で4時間、ブロッキング緩衝液(PBS中の20%のFBS、0.1%のTriton X−100、1%のDMSO)中でインキュベートした。
コントロールの細胞およびヒドロゲルを、Hamamatsuビデオカメラを取り付けたOpenlab獲得システムを使用して、位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いて、Nikon顕微鏡TE300下で観察した。得られた写真は、位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いて観察した1つの光学平面を示す。
カプセル化した細胞およびコントロールの細胞を、光学顕微鏡で毎日観察した。組み立てたペプチド構造の透明度によって、カプセル化した細胞の観察および写真撮影は容易に可能である。カプセル化の直後は、細胞は実質的には、グループまたはクランプの中ではなくむしろ単離された単一の細胞として、ゲルの隅々までにわたって均質に分散させられていた。図22Aは、カプセル化の直後のカプセル化されたLPCを示し、これは均質な単一細胞の分散を示す。細胞が三次元で対称に分裂すると、これらはコンパクトなスフェロイドクラスターを形成する傾向にある。しかし、細胞分裂が非対称である場合には、最初のクラスターの1つの細胞のみが分裂するので、直線状のクラスターまたは時折は分枝したクラスターが形成される。図22Bは、カプセル化の2日後のカプセル化したLPCを示す。図22Bに示すように、培養の最初の2日間に、カプセル化した細胞は小さい直線状のクラスターの形成を開始し、このことは、いくらか非対称な有糸分裂活性を示唆している。次の2〜3日にわたって、クラスターは伸長し、そして球形の形状をとる。図22Cは、カプセル化の4〜5日後のスフェロイド形成を示す。
以下に記載するように、カプセル化した細胞の分化特性を評価した。
細胞を、標準的なプラスチック製の培養皿中で培養し、そして先のセクションに記載したようにペプチドヒドロゲル中にカプセル化した。コントロールおよびカプセル化した細胞を最初に、同一の培地(DMEM/10%FBS/pen/strep)中で、そして同一の培養条件下で維持した。一部の実験については、DMEM/10%FBS/pen/strep中で1週間培養した細胞を、定義された肝細胞増殖培地に移した(HGM:Base meduim;Gibco社製のDMEM、#11054−020(500ml)、0.015gのL−プロリン、Sigma#P4655、0.05gのL−オルニチン、Sigma#O−6503、0.305gのナイアシンイミド、Sigma#N−0636、0.5gのD−(+)−グルコース、Sigma#G−7021、1gのD−(+)−ガラクトース、Sigma#G−5388、1gのウシ血清アルブミン、fraction V、Sigma#A−9647;500mlの微量金属溶液:ZnCl2;0.0272g、ZnSO4−7 H2O:0.0375g、CuSO4−5 H2O:0.01g、MnSO4:0.00125g:12.5mlのL−グルタミン、最終濃度[5mM]、Gibco#25030−081、0.5mlのインシュリントランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム、Roche#1074547、0.4mlのデキサメタゾン、最終濃度[0.1μM]、Sigma#D−8893、5mlのペニシリン/ストレプトマイシン(100×溶液)、上皮増殖因子(EGF)、最終濃度[20ng/ml]、Collaborative#40001)。他の実験のために、DMEM/10%FBS/pen/strep中で1週間培養した細胞を、1%のFBSを含有しているDMEM/pen/strepに移した。一部の実験については、LPC−8.1細胞を、106細胞/30mLの密度でガラス製のスピナーフラスコ中にトリプシン化した細胞を再懸濁することによって、浮遊するスフェロイドを形成するように誘導した。
2週間後、培養物を、その切断によって蛍光残基レソフリン(resofurin)(励起:574nm、発光:596nm)を生じる酵素の特異的基質である7−エトキシレソフリンの存在下でインキュベートした。このインキュベーションを、37℃で30分間行った。インキュベーション後、ヒドロゲルを培養培地で3回洗浄した。次いで、細胞を、Hamamatsuビデオカメラを取り付けたOpenlabデータ獲得システムを使用して、位相差および蛍光を用いる、Nikon顕微鏡TE300下で観察した。得られた写真は、位相差および蛍光を用いて観察した単一の光学平面を示す。全ての実験について、複数のクラスターを観察し、そして結果は典型的な観察を示す。
細胞が肝臓系統に分化していたかどうかを決定するために、完全に分化した肝細胞の特徴であるチトクロームP450 1A1(CYP1A1)酵素活性を、視覚的、ならびにプラスチック製培養皿上で増殖させた細胞中、およびペプチドヒドロゲル構造内にカプセル化した細胞中での定量的アッセイの両方を使用して経時的に分析した。図23Aに示すように、標準的なプラスチック製培養皿上で単層として増殖しているLPCは、プレーティングの2週間後では検出可能なEROD活性を示さなかった。対照的に、図23Bに示すように、組み立てたペプチド構造中で同じ期間の間増殖させたスフェロイド中のLPCは、細胞内で見られる赤色の染色によって示されるように、2週間で豊富なEROD活性を示した。試験した全てのスフェロイドが、ERODポジティブ細胞を含んだ。クラスター内のポジティブ細胞の割合は、約50から80%の間の範囲であった。
以下に記載するように、カプセル化された細胞の分化に対する成長因子(増殖因子)の作用をもまた決定した。
LPC−8.1細胞を、上記のDMEM/10%FBS/pen/strep中、または肝細胞増殖培地中のいずれかで増殖させた。一部の実験については、20ng/mLの最終濃度の表皮成長因子(EGF)(R&D Systems,カタログ番号:236−EG−200)、5ng/mLの最終濃度のラットのβ−神経成長因子(β−NGF)(R&D Systems,カタログ番号:556−NG−100)、および10ng/mLの最終濃度のヒト血小板由来成長因子(PDGF)(R&D System,カタログ番号:120−HD−001)を、培地(DMEMまたはHGMのいずれか)に添加した。
免疫染色実験を、以下のニューロンマーカー:ニューロン前駆体についてのネスチンおよびβ−チューブリンIII、有糸分裂後のニューロンについてのNeuN、ならびにグリア細胞(星状細胞)についてのGFAPを使用してラミニンでコーティングしたカバーガラス上の、ヒドロゲル培養物上でまたは細胞培養物中で行った。サンプル(ヒドロゲルまたは培養細胞を含有しているラミニンでコーティングしたカバーガラス)を最初に、PBS(pH7.4)中の2%のパラホルムアルデヒド中に室温で2時間固定し、続いて、PBS中で数回洗浄した。次いでこれらを、PBS中の0.1%のTriton X−100で室温で2時間処理した。処理後、サンプルを、ゆっくりと震盪させながら、ブロッキング緩衝液(PBS中の20%のウシ胎児血清;0.1%のTriton X−100;1%のDMSO)中で最低2時間インキュベートした。それぞれの場合の一次抗体を、室温で1時間、ブロッキング緩衝液中で予めインキュベートし(通常は、1μg/mlの最終濃度で)、次いでサンプルに添加し、そしてゆっくりと震盪させながら4℃で一晩インキュベートした。使用した一次抗体は、以下であった:ヤギポリクローナルIgG抗GFAP(Santa Cruz Biotechnology,CA、カタログ番号:sc−6170);マウスモノクローナルIgG1抗NeuN(CHEMICON International,Inc.,カタログ番号:MAB377);マウスモノクローナルIgG1抗ネスチン(CHEMICON International,Inc.,カタログ番号MAB353);およびマウスモノクローナル抗β−チューブリンIII(CHEMICON International,Inc.)。インキュベーション後、サンプルをブロッキング緩衝液で数回洗浄し、続いて適切な二次抗体(ブロッキング緩衝液中で1/500希釈)とともに、ゆっくりと震盪させながら4℃で一晩インキュベートした。使用した二次抗体は以下であった:ローダミン結合体化ヤギ抗マウスIgG(Santa Cruz Biotechnology);FITC結合体化ヤギ抗マウスIgG(Santa Cruz Biotechnology);およびFITC結合体化ロバ抗ヤギ(Santa Cruz Biotechnology)。次いで、サンプルを、ブロッキング緩衝液で2時間かけて3回洗浄した。さらに1時間のPBSでの1回の最後の洗浄で処理を終わらせた。次いで、ヒドロゲルを、Hamamatsuビデオカメラを取り付けたOpenlabデータ獲得システムを使用して、位相差および蛍光を用いてNikon顕微鏡TE300下で観察した。全部で約100個の細胞を含む3個の別々のクラスターを、それぞれの染色について観察した。得られた写真は、FITCおよびローダミンについての位相差および蛍光を用いて観察した単一の光学平面を示す。
BrdU染色を、上記のように行った。
カプセル化したLPC−8.1細胞を肝細胞増殖培地に移した後の24時間までに、細胞の有意な割合(10〜20%)が、細胞の形態において劇的な変化を獲得した。これは、非常に長くなった細胞体からなり、ニューロン系統に似ている未発達のプロセスを有する。図24A〜24Gは、種々のニューロンマーカーについての染色後の、組み立てられたペプチド構造中で増殖しているLPC−8.1細胞を示す。ニューロン様の細胞形態は、図の左側のパネル(24A、C、D,およびG)の位相差顕微鏡写真において明確に見ることができる。対照的に、標準的な組織培養プレート上の培養物中で維持した細胞は、HGMに移した場合に、同様の形態の変化は示さなかった。
細胞を、以下に記載するようにペプチドヒドロゲルから回収し得る。
ヒドロゲル培養物から細胞およびスフェロイドを単離するために、これらを、顕微鏡下での視覚的試験によって判断した場合に、約50%の細胞/クラスターが抽出されるまで、数回吸い上げたり戻したりすることによって、パスツールピペットで機械的に破壊した。抽出した混合物を、ラミニンでコーティングしたカバーガラス(Becton & Dickinson)上に置き、そしてそれらが培養されている同じ培地中で一晩インキュベートした。抽出後次の日に、残っているヒドロゲルの断片を、新しい培地でカバースライドを洗浄することによって除去し、そして付着した細胞/クラスターを、5%のCO2で平衡化した37℃のインキュベーター中で1週間インキュベートした。典型的には、ヒドロゲル中に残っている細胞の数を計数し(血球系を使用する)、そしてカバーガラス上に付着した細胞を計数することによって判断した場合に、約50%の細胞/クラスターが、ヒドロゲルから除去された。
ペプチドにカプセル化された細胞の性質および表現型をより詳細に研究し、そしてヒドロゲルの効果が可逆的であるかどうかを調査するために、EFGおよびNGFを含有しているHGM中のペプチドヒドロゲル構造中で1週間増殖させたLPC−8細胞を、機械的な破壊を用いてヒドロゲルから抽出し、そしてヒドロゲルとともに使用した同じ培地および成長因子の組み合わせを用いてラミニンでコーティングしたプレート上にプレートした。プレート上の細胞は、1週間の経過にわたって2つの基本的な形態を獲得した:(1)拡大した細胞体、および1または2つの核を有する外形を有する伝統的な肝細胞の形状(図26A);(2)いくつかのプロセスを伴った平坦に拡大した形状(図26B)。プレーティングの1週間後、プレート上の全ての細胞が、ネスチンおよびβ−チューブリンIIIについてネガティブに染色された。クラス1の細胞(肝細胞様形態)は、NeuNおよびGFAPの両方についてネガティブに染色されたが、CYP1A1活性は示さなかった。対照的に、クラス2(グリア様)の細胞は、GFAPについてはポジティブに染色され(図26Dおよび26F)、そしてNeuNについてはネガティブに染色され、そしてCYP1A1活性は示さなかった。大量の細胞分裂がプレート上で生じ、このことはおそらく、未分化の前駆細胞の分裂を示しているが、完全に分化した肝細胞またはグリア細胞ではない。
カプセル化したLPC−8の増殖速度をまた、以下に記載するように測定した。
LPC8.1細胞を、10%のウシ胎仔血清(FBS)およびXs(400μM)を含有するDMEM中で培養し、そして4日間モニターした。コントロール細胞を、従来のポリスチレン製組織培養皿上で増殖した。細胞を、上記のように、RAD16−Iヒドロゲル(0.5%w/v)中にカプセル化した。一部の実験については、細胞を機械的な破壊によってヒドロゲルから除去し、そして従来の組織培養皿に移し、これらを同じ培地中で維持した。酵素消化を使用しなかったので、スフェロイドを、分析を容易にするほぼ完全にインタクトな状態で、従来の組織培養皿に移すことに成功した。細胞を、血球計を使用して計数した。
BrdU染色を、本明細書中に記載するように行った。
培養の最初の24時間の後、従来の培養皿上で増殖したコロニー中の細胞の数(コントロール)は、24時間の適切な倍加時間で指数的に増大した。細胞分裂を、コロニーあたりの細胞の平均集団が24時間ごとに倍増する相対的増殖率(Rgr)を計算することによって定量した。コントロール培養物については、細胞数は、1日目には5.3±1.8細胞/コロニーから11.0±2.0細胞/コロニーに増大し(Rgr=2.1)、そして3日目には40.6±5.4に増大し(Rgr=7.7)、平均集団は、ほぼ8倍に増大した(表5)。ペプチドヒドロゲル培養物中では、細胞増殖速度論は極めて異なっていた。最初に、3から6個の細胞の小さいクラスターを、培養の24時間後に観察した(4.14±1.9細胞/クラスター)(図27Aおよび27Bならびに表5)。翌日、クラスターは増殖を続け、そしてスフェロイド形態をとった(図27Cおよび27D)。スフェロイド中の細胞の平均数は、コントロール培養物と比較してゆっくりと増大した(表5)。ヒドロゲルで培養したスフェロイドについては、細胞密度は、24時間後に、4.14±1.9細胞/クラスターから6.33±1.9細胞/クラスター(Rgr=1.5)に、そして3日後には15±3.8細胞/クラスター(Rgr=3.6)に増大した(表5)。増殖速度論におけるこの劇的な差異は、世代時間がペプチドヒドロゲル培養物中で有意に増大したことか、またはスフェロイドあたりの減少した数の細胞のみが有糸分裂活性を維持し、残りは細胞周期の停止を受けたことかのいずれか、あるいはこれらの両方であることを示唆した(表5)。LPC−8の増殖に対するヒドロゲルの作用は、Xsの存在にはかかわらずに生じ、このことは、異なる細胞分裂制御の機構が、三次元足場との相互作用によって生じたことを示唆する。
ペプチドヒドロゲルから抽出した細胞をまた、以下に記載するように特徴付けた。
LPC−8.1細胞を、上記のように、DMEM/10%FBS/pen/strep中で増殖させた。細胞を、上記のようにRAD16−Iヒドロゲル中にカプセル化した。
LPC−8.1細胞を、通常の(すなわち、従来の)細胞培養皿上で、約10,000細胞/cm2の密度で48時間(コントロール)、または約100,000細胞/mlの密度でRAD16−Iヒドロゲル(0.5% w/v)へのカプセル化後96時間培養した。カプセル化した細胞は、通常の細胞培養皿上で増殖させた細胞よりもゆっくりと増殖するので、通常のプレート上で48時間の培養後に存在する細胞数は、カプセル化した細胞を96時間培養した後に存在する細胞数とほぼ同じである。スフェロイド構造を、機械的破壊によってヒドロゲル培養物から抽出し、そして上記で使用した同じ培地を含有する通常のプレート上に置いた。このプロセスでは酵素処理を使用しないので、ほとんどのスフェロイドをほぼ完全にインタクトな状態で単離され得る。懸濁物を一晩インキュベートしてスフェロイドコロニーを形成させた。
免疫染色を、4%のパラホルムアルデヒドを使用したことを除いて、上記の通り実施した。使用した一次抗体は以下の通りであった:ウサギポリクローナル坑ラットチトクロームP450酵素CYP1A1およびCYP1A2(CHEMICON International、カタログ番号:AB1255)、ウサギIgG坑ラットアルブミン−HRP(Accurate Chemicals,YNGRAALBP)、ウサギIgG坑ラットC/EBPα(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号:sc−61);マウスIgG1モノクローナル坑サイトケラチン18(Santa Cruz Biotechnology:sc−6259);マウスIgG1モノクローナル坑サイトケラチン19(Santa Cruz Biotechnology,CA、sc−6278)。使用した二次抗体は以下の通りであった:ヤギ坑マウスIgGローダミン結合体(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号:sc−2029);ロバ坑ウサギローダミン結合体(Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号:sc−2095)。
CYP1A1活性の測定を、本質的には上記の通りに行った。
光学顕微鏡および顕微鏡写真撮影を、上記の通りに行った。
上記のデータは、増殖環境中の種々の成長因子の存在が、ヒドロゲル中で培養した細胞の分化および分化転換特性に影響を与えることを示唆した。この現象をさらに研究するために、LPC−8細胞を、従来の組織培養皿(コントロール)上のDMEM/FBS中でか、またはRAD16−Iペプチドヒドロゲル中でのいずれかで、48時間(コントロール)または96時間(カプセル化)のいずれかの間培養した。この時点で、細胞数はほぼ等しかった、次いで、細胞を、トリプシン処理によって(コントロール培養物について)、または機械的破壊によって(ヒドロゲルから単離したスフェロイドについて)のいずれかで、それらのそれぞれの培養環境から取り出した。次いで、細胞を、従来の組織培養皿上で一晩、同じ培地中で培養し、スフェロイドコロニーを形成させた。次いで、スフェロイドを、種々のマーカーの発現について免疫染色した。
本明細書中で言及した全ての刊行物は、個々の刊行物の各々が、詳細かつ個々に、参考として援用されることが意図されているのと同程度に、本明細書中で参考として援用される。
Claims (73)
- 両親媒性ペプチドおよび培地を含有する、肉眼で見ることができる足場であって、ここで、該ペプチドは、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、これらは相補的かつ構造的に適合性であり、そしてβ−シート型の肉眼で見ることができる足場に自律的に組み立てられ;そしてここで、該足場は、生存細胞をカプセル化し、該細胞は三次元配置で該足場に存在し、該足場は、インシュリン、トランスフェリン、およびセレニウム、ならびに少なくとも0.1%のウシ胎仔血清を含む溶液を含み、該細胞は軟骨細胞である、足場。
- 前記足場の平衡圧縮係数が少なくとも40kPaである、請求項1に記載の足場。
- 前記足場の平衡圧縮係数が少なくとも90kPaである、請求項2に記載の足場。
- 前記溶液が、少なくとも0.01mg/Lのインシュリンを含有する、請求項1に記載の足場。
- 前記溶液が、少なくとも0.005mg/Lのトランスフェリンを含有している、請求項1に記載の足場。
- 前記溶液が、少なくとも0.005mg/Lのセレニウムを含有している、請求項1に記載の足場。
- 前記ペプチドが、哺乳動物中の細胞、組織、器官、器官系、または部位への標的化を提供する接着部位、成長因子結合部位、成長因子、または配列を含む、請求項1に記載の足場。
- 前記細胞が細胞外マトリックス成分を分泌する、請求項1に記載の足場。
- 前記細胞外マトリックス成分の分泌によって、前記足場の平衡圧縮係数が少なくとも50倍増大する、請求項8に記載の足場。
- 前記カプセル化された細胞の少なくとも60%が、別のカプセル化された細胞または前記足場の外側の細胞と細胞−細胞接触の状態にある、請求項1に記載の肉眼で見ることができる足場。
- 肉眼で見ることができる足場を形成する方法であって、以下:
(a)等浸透圧性溶質を含有する水溶液中で、ペプチドおよび生存細胞をインキュベートする工程であって、ここで、該ペプチドは、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、そしてこれらは相補的かつ構造的に適合性であり、そして該等浸透圧性溶質は炭水化物またはグリセロールを含む、工程;および
(b)β−シート型の肉眼で見ることができる足場への該ペプチドの自律的な組み立てを開始するのに十分な電解質を該溶液に添加する工程であって、それによって該細胞は該足場の形成によりカプセル化され、そして三次元配置で該足場に存在し、該溶液は、インシュリン、トランスフェリン、およびセレニウム、ならびに少なくとも0.1%のウシ胎仔血清を含む、工程、
を包含し、該細胞は軟骨細胞である、方法。 - 前記足場を予め決定された圧縮機構に供する工程(c)をさらに包含する、請求項11に記載の方法。
- 前記溶液が、少なくとも0.01mg/Lのインシュリンを含有する、請求項11に記載の方法。
- 前記溶液が、少なくとも0.005mg/Lのトランスフェリンを含有する、請求項11に記載の方法。
- 前記溶液が、少なくとも0.005mg/Lのセレニウムを含有する、請求項11に記載の方法。
- 前記溶液が、前記足場の容積または形状を決定する寸法の、予め形成された鋳型の中に含まれ;それによって予め決定された形状または容積の、肉眼で見ることができる足場を形成する、請求項11に記載の方法。
- 細胞を培養する方法であって、以下:
(a)等浸透圧性溶質を含有する水溶液中で、ペプチドおよび生存細胞をインキュベートする工程であって、ここで、該ペプチドは、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、そしてこれらは相補的かつ構造的に適合性であり、そして該等浸透圧性溶質は炭水化物またはグリセロールを含む、工程;
(b)β−シート型の肉眼で見ることができる足場への該ペプチドの自律的な組み立てを開始するのに十分な電解質を、該溶液に添加する工程であって、それによって該細胞は該足場の形成によってカプセル化され、そして三次元配置で該足場に存在し、該溶液は、インシュリン、トランスフェリン、およびセレニウム、ならびに少なくとも0.1%のウシ胎仔血清を含む、工程;ならびに
(c)該細胞を培養する工程、
を包含し、該細胞は軟骨細胞である、方法。 - 前記足場を、予め決定された圧縮機構に供する工程(d)をさらに包含する、請求項17に記載の方法。
- 前記溶液が、少なくとも0.01mg/Lのインシュリンを含有する、請求項17に記載の方法。
- 前記溶液が、少なくとも0.005mg/Lのトランスフェリンを含有する、請求項17に記載の方法。
- 前記溶液が、少なくとも0.005mg/Lのセレニウムを含有する、請求項17に記載の方法。
- 請求項1に記載の足場を含む、組織を再生するための組成物であって、該組成物は、哺乳動物に投与されることを特徴とする、組成物。
- 組織を再生するための組成物であって、
該組成物は、両親媒性ペプチド、生存細胞、等浸透圧性溶質を含有する溶液を含み、そして哺乳動物に投与されることを特徴とし、ここで該溶液は、インシュリン、トランスフェリン、およびセレニウム、ならびに少なくとも0.1%のウシ胎仔血清を含み、ここで、該ペプチドは、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、そして相補的かつ構造的に適合性であり、ここで該ペプチドは、該投与前には実質的には自律的に組み立てられず、該ペプチドは、該投与後にβ−シート型の肉眼で見ることができる足場へと自律的に組み立てられ、それによってインビボで該細胞をカプセル化し、該細胞は三次元配置で該足場に存在し、ここで該等浸透圧性溶質は炭水化物またはグリセロールを含み、該細胞は軟骨細胞である、組成物。 - 軟骨の欠損、結合組織の欠損、神経組織の欠損、表皮内層の欠損、内皮内層の欠損、糖尿病、または関節炎を処置または予防するためのものである、請求項22または23に記載の組成物。
- 前記足場が予め決定された圧縮機構に供されることを特徴とする、請求項22に記載の組成物。
- 前記圧縮機構が、前記細胞による細胞外マトリックス成分の分泌を誘導する、請求項12または18に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックス成分の分泌が、前記足場の平衡圧縮係数を少なくとも50倍増大させる、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックス成分の分泌が、前記足場の平衡圧縮係数を少なくとも100倍増大させる、請求項27に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックス成分の分泌が、前記足場の平衡圧縮係数を少なくとも150倍増大させる、請求項28に記載の方法。
- 前記肉眼で見ることができる足場の1Hzでの動剛性が、少なくとも1.0MPaである、請求項26に記載の方法。
- 前記圧縮機構が、前記足場に可変圧をかける工程を包含する、請求項12または18に記載の方法。
- 前記圧縮機構が、静的オフセット圧縮に重ねられた、全体で0.01Hzと3Hzとの間の動的圧縮に前記足場を供する工程を包含する、請求項12または18に記載の方法。
- 前記圧縮機構が、全体で0.1Hzと1Hzとの間の動的圧縮に前記足場を供する工程を包含する、請求項32に記載の方法。
- 前記圧縮機構が、全体で0.01%と10%との間のひずみの大きさを有する、請求項12または18に記載の方法。
- 前記ひずみの大きさが、全体で1%と5%との間である、請求項34に記載の方法。
- 前記圧縮機構が、少なくとも1週間の間、前記足場に可変圧または定圧をかける工程を包含する、請求項12または18に記載の方法。
- 前記圧縮機構が、少なくとも3週間の間、前記足場に可変圧または定圧をかける工程を包含する、請求項36に記載の方法。
- 前記圧縮機構が、1時間の間、前記足場に圧力をかける工程、および全体で1時間と7時間との間、圧力をかけずに該足場をインキュベートする工程を包含する、請求項12または18に記載の方法。
- 前記圧縮機構が少なくとも4回繰り返される、請求項38に記載の方法。
- 前記圧縮機構が、45分間、該足場に圧力をかける工程、および全体で1時間と7時間との間、圧力をかけずに該足場をインキュベートする工程を包含する、請求項12または18に記載の方法。
- 前記足場が、全体で5時間と6時間との間、圧力をかけずにインキュベートされる、請求項40に記載の方法。
- 前記圧縮機構が少なくとも4回繰り返される、請求項41に記載の方法。
- 前記足場を予め決定された剪断荷重機構に供する工程をさらに包含する、請求項12または18に記載の方法。
- 前記カプセル化された細胞の少なくとも60%が、別のカプセル化された細胞と細胞−細胞接触の状態にある、請求項11または17に記載の方法。
- 前記工程(a)の溶液が10mM未満の電解質を含み、そして前記ペプチドが工程(b)の前に実質的に自律的に組み立てられない、請求項11または17に記載の方法。
- 患者の組織の欠損を処置するためのキットであって、以下:
(a)交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、そしてこれらは相補的かつ構造的に適合性である、ペプチド;
(b)炭水化物またはグリセロールを含む、等浸透圧性溶質;
(c)β−シート型の肉眼で見ることができる足場への該ペプチドの自律的な組み立てを開始するのに十分な電解質であって、それによって、細胞は、該足場の形成によりカプセル化され、そして三次元配置で該足場に存在する、電解質;
(d)インシュリン、トランスフェリン、およびセレニウム;
(e)少なくとも0.1%のウシ胎仔血清;ならびに
(f)該ペプチドの該足場への自律的な組み立てを開始するための指示書、
を備え、該細胞は軟骨細胞である、キット。 - 前記足場の平衡圧縮係数が少なくとも40kPaである、請求項46に記載のキット。
- 前記ペプチドが、哺乳動物中の細胞、組織、器官、器官系、または部位への標的化を提供する接着部位、成長因子結合部位、成長因子、または配列を備える、請求項46に記載のキット。
- 前記ペプチドを含有する溶液への添加のために前記細胞を調製する手段を備える、請求項46に記載のキット。
- 前記足場に圧力をかける手段を備える、請求項46に記載のキット。
- 所望される外形および/または容積に前記足場を形成するための鋳型を備える、請求項46に記載のキット。
- 所望される細胞型の細胞および軟骨細胞を含み、ここで前記足場における軟骨細胞の存在が、該足場の硬度の増大を導く、請求項1に記載の足場。
- 前記足場が所望される細胞型の細胞および軟骨細胞を含み、ここで該足場における軟骨細胞の存在が、該足場の硬度の増大を導く、請求項11または17に記載の方法。
- 前記圧縮機構が、前記細胞による細胞外マトリックス成分の分泌を誘導する、請求項25に記載の組成物。
- 前記細胞外マトリックス成分の分泌が、前記足場の平衡圧縮係数を少なくとも50倍増大させる、請求項54に記載の組成物。
- 前記細胞外マトリックス成分の分泌が、前記足場の平衡圧縮係数を少なくとも100倍増大させる、請求項55に記載の組成物。
- 前記細胞外マトリックス成分の分泌が、前記足場の平衡圧縮係数を少なくとも150倍増大させる、請求項56に記載の組成物。
- 前記肉眼で見ることができる足場の1Hzでの動剛性が、少なくとも1.0MPaである、請求項54に記載の組成物。
- 前記圧縮機構が、前記足場に可変圧をかける工程を包含する、請求項25に記載の組成物。
- 前記圧縮機構が、静的オフセット圧縮に重ねられた、全体で0.01Hzと3Hzとの間の動的圧縮に前記足場を供する工程を包含する、請求項25に記載の組成物。
- 前記圧縮機構が、全体で0.1Hzと1Hzとの間の動的圧縮に前記足場を供する工程を包含する、請求項60に記載の組成物。
- 前記圧縮機構が、全体で0.01%と10%との間のひずみの大きさを有する、請求項25に記載の組成物。
- 前記ひずみの大きさが、全体で1%と5%との間である、請求項62に記載の組成物。
- 前記圧縮機構が、少なくとも1週間の間、前記足場に可変圧または定圧をかける工程を包含する、請求項25に記載の組成物。
- 前記圧縮機構が、少なくとも3週間の間、前記足場に可変圧または定圧をかける工程を包含する、請求項64に記載の組成物。
- 前記圧縮機構が、1時間の間、前記足場に圧力をかける工程、および全体で1時間と7時間との間、圧力をかけずに該足場をインキュベートする工程を包含する、請求項25に記載の組成物。
- 前記圧縮機構が少なくとも4回繰り返される、請求項66に記載の組成物。
- 前記圧縮機構が、45分間、該足場に圧力をかける工程、および全体で1時間と7時間との間、圧力をかけずに該足場をインキュベートする工程を包含する、請求項25に記載の組成物。
- 前記足場が、全体で5時間と6時間との間、圧力をかけずにインキュベートされる、請求項68に記載の組成物。
- 前記圧縮機構が少なくとも4回繰り返される、請求項69に記載の組成物。
- 前記足場が、予め決定された剪断荷重機構に供されることを特徴とする、請求項22に記載の組成物。
- 前記カプセル化された細胞の少なくとも60%が、別のカプセル化された細胞と細胞−細胞接触の状態にある、請求項22または23に記載の組成物。
- 前記足場が所望される細胞型の細胞および軟骨細胞を含み、ここで該足場における軟骨細胞の存在が、該足場の硬度の増大を導く、請求項22または23に記載の組成物。
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